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    Séquençage d'ADN

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    Le document décrit plusieurs méthodes de séquençage d'ADN telles que les méthodes de Maxam et Gilbert et de Sanger ainsi que les améliorations apportées comme l'automatisation et le séquençage par shotgun.

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    Séquençage d'ADN

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    Description originale:

    un résumé de deux méthodes de séquençage

    Titre original

    séquençage d'ADN

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    Séquençage d'ADN

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    sur 27

    Méthodes de séquençage

    d’ADN
     Rappel : ADN, Clonage, Électrophorèse
     Méthode chimique de Maxam et Gilbert
     Méthode enzymatique de Sanger
     Détails des techniques utilisées au début des
    années 1990
     Séquençage de grands fragments : marche sur le
    chromosome, sous-clonage, etc.
     Automatisation
     Méthode Shotgun

    BIN1001, H2005, Hervé Philippe, Université de Montréal 1


    Rappel sur l’ADN

    Désoxyribose Base azotée Phosphate

    http://www.dgpc.ulaval.ca/bio90192/chap4/notesadn/notesadn1.htm

    BIN1001, H2005, Hervé Philippe, Université de Montréal 2


    Enzymes de restriction

    http://www.dil.univ-mrs.fr/~vancan/optionBio1/documents/1ercours2003_4.pdf

    BIN1001, H2005, Hervé Philippe, Université de Montréal 3


    Clonage d’ADN

    http://www.sesep.uvsq.fr/formation/strucplasm.JPEG

    BIN1001, H2005, Hervé Philippe, Université de Montréal 4


    Clonage d’ADN

    http://www.sesep.uvsq.fr/formation/princlon1.JPEG http://www.fhcrc.org/education/courses/cancer_course/basic/approaches/screening.html

    BIN1001, H2005, Hervé Philippe, Université de Montréal 5


    Principe de l’électrophorèse

    http://www.inrp.fr/Acces/biotic/biomol/techgen/html/electro.htm

    BIN1001, H2005, Hervé Philippe, Université de Montréal 6


    Exemple d’électrophorèse

    BIN1001, H2005, Hervé Philippe, Université de Montréal 7


    Méthode de Maxam et Gilbert

    BIN1001, H2005, Hervé Philippe, Université de Montréal 8


    Méthode de Maxam et Gilbert

    BIN1001, H2005, Hervé Philippe, Université de Montréal 9


    Méthode de Maxam et Gilbert

    BIN1001, H2005, Hervé Philippe, Université de Montréal 10


    ADN polymérase
    5’

    3’

    BIN1001, H2005, Hervé Philippe, Université de Montréal 11


    Méthode de Sanger

    http://www.finnzymes.fi/products/pcr/phusion_high_fidelity_dna_polymerase.htm

    BIN1001, H2005, Hervé Philippe, Université de Montréal 12


    Méthode de Sanger
    • Préparation d’une grande quantité d’ADN (~1µg via miniprep)
    Dénaturation et ajoût de l’amorce, des 4 dNTP (dont 1
    radioactif, S35 ou P32) et de l’ADN polymérase
    Faire 4 aliquots et mettre un peu de ddNTP dans chaque tube
    Elongation et terminaison par incorporation de
    didéoxynucléotides spécifiques

    BIN1001, H2005, Hervé Philippe, Université de Montréal 13


    Méthode de Sanger
    ddG ddA ddT ddC 1. Préparation du gel du
    polyacrylamide
    Dénaturation et dépôt sur gel
    Migration par électrophorèse

    BIN1001, H2005, Hervé Philippe, Université de Montréal 14


    Méthode de Sanger
    1. Transfert du gel sur papier filtre
    (Whatman 3MM)
    Séchage du gel
    Cassette autoradiographique (+ écran
    amplificateur)
    Développement du film autoradiographique
    Lecture sur table lumineuse
    Saisie sur ordinateur

    Longueur typique de lecture : 400 nucléotides


    Durée totale de l’expérience : environ 3
    jours

    BIN1001, H2005, Hervé Philippe, Université de Montréal 15


    Séquençage de grands
    fragments 10 kpb

    Marche sur le chromosome

    Synthèse de 2 * 10 amorces
    Durée totale du séquençage : > 11 * 3 jours
    Qualité des séquences  Lecture double brin  ~
    3 mois

    BIN1001, H2005, Hervé Philippe, Université de Montréal 16


    Séquençage de grands
    fragments 10 kpb

    Sous-clonage
    BamHI PstI BamHI SmaI BamHI PstI BamHI SmaI BamHI BamHI SmaI EcoRI BamHI

    ~ 5 enzymes de restriction à 6 nucléotides (HindIII, EcoRI,


    BamHI, PstI, SmaI)
    Carte de restriction pour décider quelles enzymes
    retenir
    Sous-clonage avec BamHI des 8 fragments

    Durée totale du séquençage : ~ 5 * 3 jours

    BIN1001, H2005, Hervé Philippe, Université de Montréal 17


    Séquençage de grands
    fragments 10 kpb

    Polylinker
    Insert

    Plasmide

    2 enzymes de restriction (5’ sortant et 5’ rentrant)

    Digestion avec une exonucléase

    ………

    Prélévements toutes les ~30’’, ligation, clonage, séquençage  ~10 jours

    BIN1001, H2005, Hervé Philippe, Université de Montréal 18


    Étapes limitantes du
    séquençage
    Temps, coûts, difficulté de robotiser :

     Obtention de l’ADN (miniprep)


     Autoradiographie : 12h à des jours
     Couler les gels
     Détermination et fabrication des amorces
    (marche sur le chromosome)
     Sous-clonage

    BIN1001, H2005, Hervé Philippe, Université de Montréal 19


    Polymerase Chain Reaction
    PCR

    http://www.rit.edu/~gtfsbi/IntroBiol/images/CH11/figure-11-21.jpg

    BIN1001, H2005, Hervé Philippe, Université de Montréal 20


    Utilisation des fluorochromes

    Cycle sequencing
    http://www.bioteach.ubc.ca/Bioinformatics/GenomeProjects/

    BIN1001, H2005, Hervé Philippe, Université de Montréal 21


    Utilisation des fluorochromes

    http://www.genotype.de/d/p/d_gel_plasmid_prep.htm

    BIN1001, H2005, Hervé Philippe, Université de Montréal 22


    Capillaires

    http://www.genomenewsnetwork.org/resources/whats_a_genome/Chp2_2.shtml

    http://www.aecom.yu.edu/cancer/new/cores/sequencing/abi3700.htm

    BIN1001, H2005, Hervé Philippe, Université de Montréal 23


    Séquençage par shotgun

    http://www.kisac.ki.se/education/slides/data/genomedbs/shotgun.html

    BIN1001, H2005, Hervé Philippe, Université de Montréal 24


    Séquençage par shotgun

    BIN1001, H2005, Hervé Philippe, Université de Montréal 25


    Evolution de la vitesse de
    séquençage
    Année #réactions/pers Longueur #nucléotides/personne/semaine
    onne/semaine moyenne de
    lecture
    1977 4 50 200

    1980 20 100 2 000

    1990 60 300 18 000

    1997 180 500 90 000

    1999 500 650 325 000

    2000 5000 600 3 000 000

    BIN1001, H2005, Hervé Philippe, Université de Montréal 26


    Construction d’une carte de
    restriction

    http://www.cbs.dtu.dk/staff/dave/roanoke/genetics980211.html

    BIN1001, H2005, Hervé Philippe, Université de Montréal 27

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