“PRUEBAS DE IDENTIFICACIO

BACTERIANA”
INTEGRANTES:
MARUJA MONTELLANO SUSANA
MÉNDEZ V. ROGER
MURGA LAIME SILVIA
ORELLANA ALA MARÍA ALEJANDRA
CARRERA: BIOQUÍMICA Y FARMACIA
ASIGNATURA: BACTERIOLOGÍA
DOCENTE: DRA. CLAUDIA LUNARIO SILES
FECHA: 20/06/2022
SUBSEDE: COCHABAMBA
UNIVERSIDAD: UDABOL
 INTRODUCCIÓN
 Una de las tareas fundamentales del laboratorio de microbiología es la aplicación de una metodología
precisa que permita la identificación certera de los microorganismos implicados en procesos clínicos
asociados a infecciones o de aquellos que tienen relación con el hombre.
 De manera rutinaria, el laboratorio de microbiología aplica técnicas fenotípicas, genotípicas y de cultivo
que permiten lograr la identificación de bacterias de distinto origen.
 Capítulo 1. Planteamiento del Problema
1.1. Formulación del Problema
¿Es importante saber identificar a las bacterias y realizar antibiogramas para identificar
enfermedades infecciosas y de esta manera poder aplicar tratamientos precisos y oportunos y así vencer a
la infección?
1.2. Objetivos
1.2.1. Objetivo general
 Desarrollar los métodos de pruebas de identificación bacteriana en un antibiograma
1.2.2. Objetivos específicos
• Describir los diferentes métodos de pruebas de identificación bacteriana
• Justificar la importancia de aprender los diferentes tipos de identificación bacteriana
• Conceptualizar los siguientes pasos que nos lleva a este estudio como estudiantes de bioquímica
y farmacia
1.3. Justificación

 Una de las tareas fundamentales del laboratorio de microbiología es la aplicación

de una metodología precisa que permita la identificación de los microorganismos
implicados en procesos clínicos asociados a infecciones o de aquellos que tienen
relación con el hombre.
 El estudio de la sensibilidad a antimicrobianos de las diferentes bacterias aisladas
en muestras biológicas tiene 2 objetivos fundamentales: guiar al clínico en la
elección del mejor tratamiento individual, y monitorizar la evolución de la
resistencia bacteriana con objeto de revisar el espectro del antimicrobiano y poder
actualizar los tratamientos empíricos.
 Es en este sentido que la identificación bacteriana en ciertas patologías es
importante
Capítulo 2. Marco Teórico

 2.1 Área de estudio campo de investigación:

 Bioquímica y Farmacia – Bacteriología.

 En este documento se presentan tres maneras diferentes de abordar la identificación

bacteriana:
 • Métodos fenotípicos o tradicionales,
 • Métodos moleculares
 • Métodos basados en proteómica.
 Aunque no son los ˙únicos, son los más importantes y los que mayor impacto tienen
o tendrán en el trabajo diario del microbiólogo clínico.
 IDENTIFICACION
BACTERIANA

GENOTIPIC CULTIVOS
FENOTIPICAS AS

El cultivo, continúa siendo el método

Se basan en las características diagnóstico de elección; permite el
observables de las bacterias, aislamiento del microorganismo implicado,
como su morfología, desarrollo, y su identificación, el estudio de sensibilidad a
los antimicrobianos . En el cultivo es esencial
propiedades bioquímicas y
la correcta elección del medio de crecimiento
metabólicas. y las condiciones de incubación
 2.1. Fundamentos de la identificación
fenotípica
Se establecen tres niveles de procesamiento:
a) Todas las características fenotípicas conocidas son importantes y hay que tenerlas en
cuenta cuando se inicia el proceso de identificación, pero en principio se seleccionan aquellas
que se consideran pruebas primarias, que son rápidas y sencillas de realizar, como la
morfología en la tinción de Gram u otras tinciones, crecimiento en diferentes atmosferas de
incubación, crecimiento en varios tipos de medios de cultivo, oxidasa y catalasa.
 b) El segundo nivel de identificación debe especificar el género al que pertenece
el microorganismo.La probable identidad de un microorganismo se apoya en las
características del cultivo y en pruebas primarias. Las pruebas primarias son: Tinción
de Gram, morfología, catalasa, oxidasa, oxidación-fermentación, fermentación de
glucosa, producción de esporas, crecimiento en aerobiosis y anaerobiosis y
movilidad. También deben tenerse en cuenta los datos clínicos.
 c) Por ˙último, la conclusión debe hacerse
con la identificación a nivel de especie. El empleo
de ciertas pruebas bioquímicas permite identificar
con un alto grado de precisión las mayorías de las
bacterias clínicamente significativas.
 2.2. Identificación
2.2.1. Características microscópicas
 El estudio microscópico en fresco y tras tinción revela la forma, la manera de agruparse, la
estructura de las células y su tamaño. Las tinciones son el primer paso, y ocasionalmente el único,
para la identificación bacteriana. Las tinciones más utilizadas e imprescindibles son la del azul de
metileno y la de Gram.

Tinción de azul
Tinción de Gram de metileno
2.2.2. Características macroscópicas
2.2.2.1. Morfología
 Para la observación morfológica es preferible examinar
colonias de cultivos frescos crecidas en medios no
selectivos. En este paso de la identificación es muy
importante el aislamiento de las bacterias en cultivo
puro ya que esta debería estar compuesta por un solo
tipo de microorganismos y procedería de una única
célula. Las colonias de una única especie, cuando
crecen en medios específicos y bajo condiciones
idóneas se describen por sus características de tamaño,
forma, consistencia, y a veces por su color. El tamaño
de las colonias bacterianas es generalmente uniforme
entre una misma especie. La forma está determinada
por los bordes y el grosor de la colonia. El borde puede
ser liso o rugoso e irregular; la colonia, abultada o
plana. La textura de la colonia es también importante.
Puede variar desde seca a viscosa, con superficie lisa o
granular
2.2.2.2. Hemólisis.

 Algunas bacterias producen hemolisinas que causan la lisis de los hematíes en

medios que contienen sangre. Esta hemólisis puede ser beta (zona clara alrededor
de la colonia) o alfa (halo de color verdoso alrededor de la colonia).
 Cultivo

Las bacterias se multiplican y es necesario esperar al menos 18-24

Tienen unos requerimientos nutricionales imprescindibles para su
crecimiento

Necesitan una fuente de energía, una fuente de carbono, una fuente

de nitrógeno, algunas sales, oligoelementos y agua.
Medios de
cultivo En los medios líquidos las sustancias nutritivas se encuentran
disueltas.
Los medios sólidos suelen consistir en una base de agar, polímero
de origen vegetal.
Se clasifican en medios básicos o generales, de enriquecimiento,
selectivos y diferenciales.
a) Medios básicos: son medios ricos en nutrientes que permiten el crecimiento de la gran
mayoría de las bacterias. Se utilizan en la siembra primaria de las muestras clínicas. Uno de
los medios más utilizados en los laboratorios es el agar sangre.
b) Medios de enriquecimiento: están desarrollados para recuperar bacterias exigentes en sus
requerimientos nutricionales. Se utilizan para bacterias que no crecen en medios básicos.
Los más utilizados suelen ser medios líquidos como es el caldo de tioglicolato o el caldo
cerebro corazón (BHI).
Medios selectivos: contienen sustancias como cloruro sódico a dosis elevadas, citrato sódico,
cristal violeta, sales biliares o antibióticos y antisépticos que fomentan el crecimiento de
algunas bacterias y evitan el de otras. Son de gran utilidad para el aislamiento bacteriano a
partir de una población bacteriana mixta.
Medios diferenciales: se utilizan para poner de manifiesto características distintivas de las colonias. Son
medios que distinguen entre distintos grupos bacterianos en función casi siempre del color de sus colonias.
Por ejemplo, el agar MacConkey es un medio salido que permite el crecimiento de bacilos gramnegativos
fermentadores y no fermentadores de lactosa.
Medios cromogénicos: en Estos se incorporan sustancias cromo génicas para detectar distintas enzimas
producidas por los microorganismos. Cuando la bacteria produce el enzima, hidroliza el sustrato y se
libera un compuesto cromo génico que adquiere un color intenso, dando color a la colonia. Estos
enzimas pueden ser específicas de un género, una especie o de un grupo reducido de especies
 Requisitos de
crecimiento.

• Aerobias estrictas, que crecen solo en presencia de oxígeno.

• Anaerobias estrictas, que solo crecen en ausencia de oxígeno.
Las bacterias se • Facultativas, que crecen tanto en aerobiosis como en
clasifican en
Atmosfera. anaerobiosis.
función de sus
requerimientos • Microaerofílicas, que crecen mejor en una atmósfera con
atmosféricos
reducida concentración de oxígeno.
• Capnofílicas, que requieren CO2 adicional para crecer.
 .
• Psicrofílicas, pueden crecer a bajas temperaturas
entre 2-5ºC (Óptimo 10-30ºC).
Se clasifican además en
• Mesofílicas, crecen a temperaturas entre 10- 45ºC
función de la temperatura
Temperatura
(Óptimo 30-40ºC).
necesaria para su
• Termofílicas, crecen muy poco a 37ºC (Óptimo
crecimiento:
50-60ºC).

Nutrición.
El estudio de los requerimientos nutricionales de un microorganismo se usa
en la identificación. Tal es el caso de la capacidad para crecer en medios
ordinarios, o con la adicción de sangre, suero o glucosa.
 Pruebas bioquímicas.
Las pruebas bioquímicas permiten determinar las características metabólicas de las
bacterias objeto de identificación

Catalasa. La catalasa es un enzima presente en la mayoría de los

microorganismos que poseen citocromos. Las bacterias que sintetizan
catalasa hidrolizan el peróxido de hidrógeno en agua y oxigeno gaseoso
que se libera en forma de burbujas. El principal objetivo de esta prueba
es separar Staphylococcus spp. (positiva) de Streptococcus spp. y
Enterococcus spp. (negativa).

Oxidasa. Esta prueba sirve para determinar la presencia de enzimas

oxidasas. La reacción de la oxidasa se debe a la presencia de un sistema
citocromo oxidasa que activa la oxidación del citocromo el cual es
reducido por el oxígeno molecular produciéndose agua o peróxido de
hidrógeno según la especie bacteriana.
 Pruebas rápidas, con lectura en menos de 6h2.

 Hidrólisis del hipurato. Demuestra la capacidad de algunas bacterias para hidrolizar el hipurato de sodio a ácido
benzoico y glicina por la acción de la enzima hipuricasa. Esta prueba se utiliza en la identificación de
Campylobacter jejuni, Listeria monocytogenes, Gardnerella vaginalis y Streptococcus agalactiae.

 β-galactosidasa (ONPG). Esta prueba demuestra la presencia de la enzima βgalactosidasa. Para conocer si un
microorganismo es productor de β-galactosidasa, basta añadir el compuesto orgánico O-nitrofenil β-D-
galactopiranósido (ONPG) que es incoloro. Si la bacteria posee las enzimas hidrolizantes (β -galactosidasa), el
compuesto se transforma en ortonitrofenol, un derivado cromo génico de color amarillo. Todas las bacterias
fermentadoras lentas de la lactosa son β -galactosidasa positivas.
• Aminopeptidasa: PYR. La L- pirrolidonil-β-naftilamida sirve como sustrato para la detección de
pirrolidonil peptidasa. Se utiliza principalmente en la identificación de Streptococcus pyogenes y
Enterococcus spp. También en la diferenciación de Staphylococcus lugdunensis de otros estafilocos
coagulasa negativa.

• LAP. Se utiliza para la detección de la enzima leucina aminopeptidasa (LAP) y es una de las pruebas
para la identificación de cocos grampositivos catalasa negativa; diferencia específicamente los
géneros Aerococcus y Leuconostoc de Streptococcus, Enterococcus, Lactococcus, y Pediococcus.
• Ureasa. Determina la capacidad de un organismo de desdoblar la urea formando dos moléculas de
amoniaco por acción del enzima ureasa. Esta actividad enzimática es característica de todas las especies de
Proteus y se usa sobre todo para diferenciar este género de otras enterobacterias que dan negativo o
positivo retardado.

• Indol. Mediante esta prueba se detecta la liberación de indol en un cultivo bacteriano. Dicha liberación se
debe a la degradación del aminoácido triptófano mediante el enzima triptofanasa.
 Agar hierro de Kligler: Mediante esta  Fermentación de azúcares. Las bacterias anaerobias o
prueba se puede determinar: anaerobias facultativas a menudo fermentan carbohidratos a
 a) La capacidad de un •ácidos orgánicos y gas (H2 o CO2). Estos pueden detectarse
incluyendo en el medio un indicador de pH.
microorganismo de metabolizar un
 Hidrólisis de la esculina. Hay microorganismos con capacidad de
hidrato de carbono específico (en este
hidrolizar la esculina en esculetina y glucosa. La esculetina
caso glucosa, lactosa o ambas)
reacciona con una sal de hierro para formar un compuesto castaño
incorporado en un medio de crecimiento oscuro o negro. cuagulasa.
básico. Permite determinar la capacidad de coagular el plasma por la
 acción de la enzima coagulasa. Se utiliza para diferenciar S.
b) Producción o no de gases: aureus (coagulasa positiva) de otras especies de Staphylococcus.
CO2 e H2 como productos finales del
 La prueba de la Fenilalanina-desaminasa. Esta prueba
metabolismo de los hidratos de carbono.
determina la capacidad de un microorganismo para desaminar el
c. Producción de ácido sulfhídrico aminoácido fenilalanina en ácido fenilpirúvico por la actividad
(SH2). El medio de Kligler contiene enzimática de la fenilalanina desaminasa, con la consiguiente
como hidratos de carbono la glucosa y la acidez resultante..
lactosa. Existe otro  ADNasa. Se basa en la capacidad que poseen ciertas bacterias
para hidrolizar enzimáticamente el ADN produciendo una mezcla
de mono y polinucleótidos.
 Hidrólisis de la gelatina. Esta prueba muestra la capacidad de
ciertos microorganismos para hidrolizar la gelatina a péptidos y
aminoácidos, mediante la acción de enzimas específicas
denominadas gelatinasas.
 Métodos moleculares de
identificación bacteriana

 Prueba de CAMP. Sirve principalmente para determinar la capacidad de

un microorganismo para producir una proteína conocida como factor
CAMP.
 Lipasa. Se basa en la capacidad que tienen ciertas bacterias de descomponer las  Métodos moleculares de identificación bacteriana
grasas en •ácidos grasos y glicerol, por acción de la enzima lipasa.  Los sistemas de identificación fenotípicos (no todas las cepas de una
 misma especie muestran características homogéneas, una misma cepa
Lecitinasa. La prueba de la lecitinasa pone de manifiesto la producción de dicha
enzima por determinados microorganismos, capaces de actuar sobre la lecitina,
puede generar diferentes patrones en ensayos repetidos y también las
sustancia orgánica nitrogenada y fosfatada, contenida principalmente en la yema de limitaciones en las bases de datos, entre otros.
huevo.  Genes empleados como dianas moleculares para la identificación de
bacterias
 Utilización de citrato. Esta prueba sirve para determinar si un microorganismo es  16S-23S ARNr Espacio intergénico del 16S-23S ARNr (ITS). Estas
capaz de utilizar citrato como ˙nica fuente de carbono y compuestos amoniacales
ITS se presentan en un número variable en función del número de
como ˙nica fuente de nitrógeno en su metabolismo, provocando una alcalinización
operones ARNr . Este elevado grado de diversidad observado en las
del medio. Entre las enterobacterias estas características se dan en los siguientes
ITS en diferentes géneros, diferentes especies, diferentes cepas, y en
géneros: Enterobacter, Klebsiella, Serratia, Citrobacter y algunas especies de
Salmonella. Sin embargo, Escherichia, Shigella, Yersinia, Salmonella typhi y
una misma cepa producido por variaciones en el número, tamaño y
Salmonella paratyphi son incapaces de crecer utilizando citrato como ˙nica fuente composición de las ITS del 16S-23S ARNr, constituye la base para su
de carbono. utilización en identificación, filogenia y/o tipificación.
 ARNr 23S
 Utilización de malonato. Pone de manifiesto la capacidad que poseen  Puede ser una buena alternativa en los casos en los que la fracción 16 s
determinadas bacterias de utilizar el malonato de sodio como ˙nica fuente de
no proporciona resultados concluyentes. Un aumento en el coste y
carbono, con la consiguiente liberación del catión,
alguna dificultad técnica en la amplificación de fragmentos más
grandes pueden limitar su uso, aunque ser utilizado en la actualidad
como un método auxiliar útil con fines taxonómicos y filogenéticos.
 rpoB (subunidad de la ARN polimerasa)
 La ARN polimerasa (RNAP) es una enzima imprescindible en el
proceso de transcripción y constituye la diana final de las diferentes
rutas que controlan la expresión génica en los organismos vivos.
 gyrB (subunidad ß de la ADN girasa)
 Es el gen codificante de la subunidad de la ADN girasa o topoisomerasa
II y está implicado en la replicación del ADN
 Métodos moleculares de
identificación bacteriana

 Prueba de CAMP. Sirve principalmente para determinar la capacidad de

un microorganismo para producir una proteína conocida como factor
CAMP.
 Lipasa. Se basa en la capacidad que tienen ciertas bacterias de descomponer las  Métodos moleculares de identificación bacteriana
grasas en •ácidos grasos y glicerol, por acción de la enzima lipasa.  Los sistemas de identificación fenotípicos (no todas las cepas de una
 misma especie muestran características homogéneas, una misma cepa
Lecitinasa. La prueba de la lecitinasa pone de manifiesto la producción de dicha
enzima por determinados microorganismos, capaces de actuar sobre la lecitina,
puede generar diferentes patrones en ensayos repetidos y también las
sustancia orgánica nitrogenada y fosfatada, contenida principalmente en la yema de limitaciones en las bases de datos, entre otros.
huevo.  Genes empleados como dianas moleculares para la identificación de
bacterias
 Utilización de citrato. Esta prueba sirve para determinar si un microorganismo es  16S-23S ARNr Espacio intergénico del 16S-23S ARNr (ITS). Estas
capaz de utilizar citrato como ˙nica fuente de carbono y compuestos amoniacales
ITS se presentan en un número variable en función del número de
como ˙nica fuente de nitrógeno en su metabolismo, provocando una alcalinización
operones ARNr . Este elevado grado de diversidad observado en las
del medio. Entre las enterobacterias estas características se dan en los siguientes
ITS en diferentes géneros, diferentes especies, diferentes cepas, y en
géneros: Enterobacter, Klebsiella, Serratia, Citrobacter y algunas especies de
Salmonella. Sin embargo, Escherichia, Shigella, Yersinia, Salmonella typhi y
una misma cepa producido por variaciones en el número, tamaño y
Salmonella paratyphi son incapaces de crecer utilizando citrato como ˙nica fuente composición de las ITS del 16S-23S ARNr, constituye la base para su
de carbono. utilización en identificación, filogenia y/o tipificación.
 ARNr 23S
 Utilización de malonato. Pone de manifiesto la capacidad que poseen  Puede ser una buena alternativa en los casos en los que la fracción 16 s
determinadas bacterias de utilizar el malonato de sodio como ˙nica fuente de
no proporciona resultados concluyentes. Un aumento en el coste y
carbono, con la consiguiente liberación del catión,
alguna dificultad técnica en la amplificación de fragmentos más
grandes pueden limitar su uso, aunque ser utilizado en la actualidad
como un método auxiliar útil con fines taxonómicos y filogenéticos.
 rpoB (subunidad de la ARN polimerasa)
 La ARN polimerasa (RNAP) es una enzima imprescindible en el
proceso de transcripción y constituye la diana final de las diferentes
rutas que controlan la expresión génica en los organismos vivos.
 gyrB (subunidad ß de la ADN girasa)
 Es el gen codificante de la subunidad de la ADN girasa o topoisomerasa
II y está implicado en la replicación del ADN
 2. Métodos basados en proteómica

La proteómica es el estudio y caracterización del conjunto de proteínas expresadas por un genoma (proteoma). Las técnicas de proteómica
abordan el estudio de este conjunto de proteínas y las más usadas se basan en la electroforesis y en la espectrometría de masas. La
espectrometría de masas es una técnica analítica que permite analizar con gran precisión la composición de diferentes elementos químicos al
permitir la medición de iones derivados de moléculas separándolos en función de su relación masa/carga (m/z).

Los tres componentes básicos de un espectrómetro de masas son los siguientes:

- FUENTE DE IONIZACIÓN. ES EL ELEMENTO DEL ESPECTRÓMETRO QUE IONIZA EL MATERIAL QUE VA SER ANALIZADO. LAS
TÉCNICAS PARA LA IONIZACIÓN, EL PROCESO FÍSICO O QUÍMICO MEDIANTE EL CUAL SE PRODUCEN IONES, HAN SIDO
DETERMINANTES PARA ESTABLECER QUÉ TIPOS DEMUESTRAS SE PUEDEN ANALIZAR POR ESPECTROMETRÍA DE MASAS.

- ANALIZADOR DE MASAS. UTILIZA UN CAMPO ELÉCTRICO O MAGNÉTICO PARA ACELERAR LOS IONES Y SEPARARLOS EN
FUNCIÓN DE SU RELACIÓN MASA/CARGA (M/Z).

- DETECTOR. LOS IONES QUE LLEGAN AL DETECTOR PRODUCEN UNA SEÑAL ELÉCTRICA QUE ES PROCESADA, AMPLIADA Y
ENVIADA A UN ORDENADOR. EL REGISTRO OBTENIDO ES EL ESPECTRO DE MASAS.
 Capítulo 3. Método
3.1 Tipo de Investigación

Investigación documentada

3.2 Operacionalización de variables

Variable dependiente: Identificación bacteriana.

Variable independiente: Antibiograma

3.3 Técnicas de Investigación

Se realizo revisión bibliográfica de páginas de internet para poder elaborar el tema

3.4 Cronograma de actividades por realizar

Tabla 1: Cronograma de actividades

 Actividades semana Semana Seman Semana Semana Semana Semana7 Semana
1 2 a3 4 5 6 8

Elección del
tema x
Inicio
revisión X
bibliográfica

redacción del
tema X X X X X
Fin de la
revisión X
bibliográfica

Presentacion
y defensa del X
trabajo

Capitulo 4. Resultados
 Para la identificación de las bacterias en el laboratorio es importante conocer sus características morfológicas,
la reacción a la tinción de Gram, agrupación, propiedades, morfología colonial, reacciones metabólicas como
producción de enzimas y reacciones de óxido-fermentación.
 La identificación se fundamenta en la comparación del microorganismo que deseamos identificar con los
microorganismos de identidad conocida.
 Capítulo 5. Conclusiones
 La investigación en el laboratorio de las enfermedades bacterianas es necesaria para
identificar al agente etiológico. Algunas veces, para determinar la susceptibilidad
antimicrobiana de los patógenos
 En conclusión, podemos decir que las diferentes técnicas y métodos de identificación
bacteriana son muy útiles en los análisis clínicos para poder identificar a las bacterias
y de esta manera ayudar al paciente con un tratamiento oportuno y fidedigno.