Presentación 9. Inmunofluorescencia

Quiz
1. Mencione 3 caractersticas de una muestra
para ser clasificada como muestra apta para ser procesada 2.En general, en una inmunoflorescencia como se debera ver una muestra negativa y una positiva?
LABORATORIO DE VIROLOGA
Semana 12: Prctica 9: Inmunofluorescencia. (Adenovirus)
Adenovirus
DIAGNSTICO DE VIRUS RESPIRATORIOS
Diagnstico de Virus Respiratorios
Diagnstico clnico(Dx) Anamnesis (sgnos, sntomas, antecedentes) Exploracin fsica
Dx presuntivo (ej IRA)
Diagnstico por laboratorio

Se busca: La deteccin, identificacin y tipificacin del agente etiolgico
Como?
Pruebas Directas: Evidencian el antgeno (agente infeccioso)
Cultivo. Gold Standard Imnunofluorescencia Directa (kits)
Inmunoensayos en placa o membrana (ELISA Directa )

Pruebas moleculares (PCR-hidridacin)
Pruebas Indirectas: Evidencian presencia de anticuerpos

Poco tiles (dependiendo de la muestra) Pruebas de ms de un paso
MUESTRAS
Perodo ideal para tomar muestra

Las mejores muestras por lo general son las que se obtienen en un estadio temprano de la enfermedad (durante los primeros tres a cuatro das de evolucin), cuando el virus se excreta en concentraciones relativamente elevadas y todava no se ha unido con anticuerpos. Transcurridos 7 das o ms habitualmente no vale la pena tomar muestras para realizar un diagnstico de Infecciones respiratorias.
Muestras adecuadas (criterios)
Tomado de http://www.saludhoy.com/imagen/image%20nin/Articulos/farif1.jpg
Toma de muestra
Virocult o Sistema similar
Contiene: Esponjita con medio de cultivo adecuado: Medio Stuart con estabilizante (Protena). Conservacin: T a menos de 20oC (mximo 48hs) -70C.
oPara Fluorescencia: Se usa el sedimento. Conservacin: -20C. oPara Cultivo: Transvasar el sobrenadante a un medio apropiado ej BHI suplementado (Antibiticos + Antimicticos). Conservacin: -70C.
Las muestras que se reciben en el laboratorio se deben determinar como:

Muestras Aptas Para Ser Procesadas (MAPSP)
Criterios para establecer la aptitud de la muestra
Muestras No Aptas Para Ser Procesadas
Procesamiento de la Muestra: Celularidad

Obtencin de un sedimento rico en clulas
Recuento < 10 clulas 10 15 clulas
Celularidad MME Aceptable No apropiada
15 25 clulas
> 40 clulas
Buena
Excelente
Apropiada
LA TCNICA
Inmunofluorescencia
Es una tcnica de laboratorio empleada para identificar
anticuerpos o antgenos especficos.

La identificacin de los anticuerpos por lo general se
realiza en la sangre (suero).
Inmunofluorescencia
Fluorocromos
Los fluorocromos son molculas que al ser
excitadas con la energa de una determinada longitud de onda son capaces de emitir energa de una longitud de onda mayor.
FITC
Mtodos directos Vs. indirectos
LECTURA DE RESULTADOS
Deteccin viral: Positivo
Control negativo del paciente Muestra (pte) +Ac de ratn normal Buena celularidad
Positivo en el mismo paciente Muestra (pte) +Acs monoclonales virus Buena celularidad
Deteccin viral: Negativo
Control negativo del paciente Celularidad adecuada
Screening negativo en el mismo paciente Muestra (pte) +Acs monoclonales virus celularidad adecuada
Deteccin viral: MME
Control negativo del paciente Pocas clulas (restos)
Screening negativo en el mismo paciente Baja celularidad (Restos)
Reporte de la Prueba
Celularidad adecuada Muestra homognea
Controles de la prueba
Control negativo del paciente
Informe de muestras positivas

La positividad de la prueba se determina por la presencia de tres o ms clulas intactas que presenten fluorescencia, en la preparacin respectiva. Aunque no siempre se encuentran patrones especficos en las pruebas, los patrones descritos a continuacin pueden ser de cierta ayuda:
RSV: fluorescencia en el citoplasma de la clula. Las tinciones citoplasmticas se ven punteadas con pequeas inclusiones. Influenza A y B: Fluorescencia nuclear, citoplasmtica o ambas. La tincin nuclear brilla uniformemente. La citoplasmtica es generalmente punteada con inclusiones largas. Parainfluenza tipo 1, 2 y 3: Fluorescencia en el citoplasma, es punteada con inclusiones irregulares. Adenovirus: Fluorescencia nuclear, citoplasmtica, o ambas, la tincin brilla uniformemente. Las clulas tienden a redondearse.
Pozo 1
Muestra muy escasa (MME)
Pozo 2
Pozo 3
Pozo 4
Pozo 5
Pozo 6
Pozo 7
CN
Screening
Pozo 1
Muestra no homognea
Pozo 2
Pozo 3
Pozo 4
Pozo 5
Pozo 6
Pozo 7
CN
Screening
Pozo 1
IFI negativa
Pozo 2
Pozo 3
Pozo 4
Pozo 5
Pozo 6
Pozo 7
CN
Screening
Control negativo paciente 1 Control positivo para VSR
La prueba: IFD EJEMPLO

Celularidad adecuada Muestra homognea
Controles de la prueba
Control negativo del paciente Screening del paciente Reporte: IFD negativa
OK
OK Negativo
PROCEDIMIENTO
Procedimiento: Toma de muestra
Con la ayuda de un bajalenguas estril, realizar un raspado de la parte posterior de la farnge; detrs de la vula, acercando el hisopo lo ms que se pueda a la nasofarnge (clulas mucosa virus).
Colocar el hisopo en un vial plstico, el cual debe contener 1 ml de PBS o un medio apropiado para el transporte y mantenimiento de las partculas virales presentes.
Procedimiento: Toma de muestra
Cierre el vial y aplicar vortex durante 30 segundos. Tome el palito del hisopo y trate de recuperar de l lo ms que pueda de muestra (clulas).
Descarte el hisopo en un recipiente adecuado.
Procedimiento
Centrifugar a 4 C a 1.900 rpm por 10 minutos para
separar en dos fases:

Sobrenadante
Sedimento celular
Virus Agregar el sobrenadante en un vial estril bien identificado, tapando rpidamente y cuidando evitar cualquier contaminacin. Mantener a 70oC CULTIVO
Clulas + Virus El sedimento (botn celular) ser usado para realizar la INMUNOFLUORESCENCIA
Procedimiento: Lavado
Descartar el sobrenadante en hipoclorito CON CUIDADO,
dejar 100 l de sobrenadante y realizar vortex (distribucin homognea de las clulas).

Si hay mucosidad en la muestra: Resuspender el botn celular
con 1 mL de PBS 1X usando el vortex. Centrifugar a 4 C a 1.900 rpm por 10 minutos para separar en dos fases. Descartar el sobrenadante en un recipiente con Hipoclorito.
Procedimiento: Montaje de las lminas

Limpiar (alcohol antisptico) y marcar las laminas.
1
PD Grupo X
Tomar 12 L del sedimento y servir en pozo 1 y 2

Dejar secar las lminas (puede ayudarse por ejemplo con el flujo de aire de la
cmara) o de un ventilador.
Introducir las lminas bien secas en acetona fra (guardada a 20oC) por 10
minutos.
Sacar las lminas y djelas secar.
Procedimiento: Inmunofluorescencia
Preparar la cmara hmeda (para no dejar secar la muestra, NO dejar
excedente de agua) y atemperar los reactivos (conjugado: At + FITC).

Colocar una gota del conjugado en cada
pozo (No tocar la muestra).
Incubar en la cmara hmeda a 37 oC por 30 min.

PD Grupo X
Eliminar el excedente de conjugado
sobre papel secante (SUAVEMENTE, perpendicular la lamina, dejar rodar).
Colocar la lmina en el tarro de lavado con PBS tween (detergente para
eliminar exceso de conjugado)

Agitar 3 min (dependiendo de la mucosidad inicial).
Procedimiento: Inmunofluorescencia
Sacar la lamina y adicionar PBS-tween sobre
la misma pero no apuntar directamente sobre los pozos.

Secar el excedente con papel secante en la
margen de los pozos (Cuidado NO tocar las muestras).
Dejar secar la lamina (3-5 min).
Realizar el montaje:
Colocar una gota de montaje de fluido Colocar la laminilla encima Retirar el excedente con papel secante
Procedimiento: Lectura de lminas

Ubicar el microscopio de fluorescencia en el objetivo 20x. De esta
manera se puede tener una idea de la cantidad de clulas en cada preparacin as como de la distribucin celular.
Para la lectura de la fluorescencia y su reporte el objetivo a usar es 40x.
Clulas de la mucosa infectadas con virus (Verde) Clulas de la mucosa (Rojas)
Negativo
Positivo
La prueba: IFD
Montaje de reaccin
Lminas Control (Lminas testigo) Pozo del paciente + control negativo (Ab ratn no expuesto al Agente + Azul de Evans) Pozo del paciente + Anticuerpo contra el agente (+ Azul de Evans)
Identificacin bajo el Microscopio Celularidad adecuada

Distribucin homognea
Control negativo adecuado

Resultados del test con Anticuerpos contra el agente
Ejercicio Panel Respiratorio

Bsqueda de ms de un agente por muestra. 9 Pozos: Misma muestra fijada en todos los pozos
Pozos 1 7: Anticuerpos distintos por pozo. Anticuerpos contra un solo agente. Pozo 8: Control negativo: Anticuerpos de ratn no expuesto a ningn agente. Pozo 9: Screening: Anticuerpos aadidos del pozo 1 al 7, juntos en un solo tubo.
Pozo 1
Reporte la IFD del paciente DJ

Pozo 3 Pozo 4 Pozo 5
Pozo 2
Pozo 6
Pozo 7
CN
Screening
Control negativo paciente 1
Pozo 1
Reporte la IFD del paciente SD

Pozo 2
Pozo 6
Pozo 7
CN
Screening
Pozo 1
Reporte la IFD del paciente AM

Pozo 2
Pozo 6
Pozo 7
CN
Screening
Pozo 1
Reporte la IFD del paciente AM

Pozo 2
Pozo 6
Pozo 7
CN
Screening
Pozo 1
Reporte la IFD del paciente TR

Pozo 2
Pozo 6
Pozo 7
CN
Screening
Pozo 1
Reporte la IFD del paciente ES

Pozo 2
Pozo 6
Pozo 7
CN
Screening

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DIAGNSTICO DE VIRUS RESPIRATORIOS

Diagnstico de Virus Respiratorios

Diagnstico clnico(Dx) Anamnesis (sgnos, sntomas, antecedentes) Exploracin fsica

Dx presuntivo (ej IRA)

Diagnstico por laboratorio

Inmunoensayos en placa o membrana (ELISA Directa )

Pruebas Indirectas: Evidencian presencia de anticuerpos

Perodo ideal para tomar muestra

Muestras adecuadas (criterios)

Las muestras que se reciben en el laboratorio se deben determinar como:

Criterios para establecer la aptitud de la muestra

Muestras No Aptas Para Ser Procesadas

Procesamiento de la Muestra: Celularidad

Recuento < 10 clulas 10 15 clulas

Celularidad MME Aceptable No apropiada

anticuerpos o antgenos especficos.

realiza en la sangre (suero).

Mtodos directos Vs. indirectos

Deteccin viral: Positivo

Deteccin viral: Negativo

Control negativo del paciente Celularidad adecuada

Deteccin viral: MME

Control negativo del paciente Pocas clulas (restos)

Screening negativo en el mismo paciente Baja celularidad (Restos)

Informe de muestras positivas

Muestra muy escasa (MME)

Control negativo paciente 1 Control positivo para VSR

La prueba: IFD EJEMPLO

Procedimiento: Toma de muestra

Procedimiento: Toma de muestra

Descarte el hisopo en un recipiente adecuado.

separar en dos fases:

dejar 100 l de sobrenadante y realizar vortex (distribucin homognea de las clulas).

Procedimiento: Montaje de las lminas

Tomar 12 L del sedimento y servir en pozo 1 y 2

Sacar las lminas y djelas secar.

excedente de agua) y atemperar los reactivos (conjugado: At + FITC).

pozo (No tocar la muestra).

Incubar en la cmara hmeda a 37 oC por 30 min.

Eliminar el excedente de conjugado

sobre papel secante (SUAVEMENTE, perpendicular la lamina, dejar rodar).

Colocar la lmina en el tarro de lavado con PBS tween (detergente para

eliminar exceso de conjugado)

la misma pero no apuntar directamente sobre los pozos.

margen de los pozos (Cuidado NO tocar las muestras).

Dejar secar la lamina (3-5 min).

Procedimiento: Lectura de lminas

Clulas de la mucosa infectadas con virus (Verde) Clulas de la mucosa (Rojas)

Identificacin bajo el Microscopio Celularidad adecuada

Control negativo adecuado

Ejercicio Panel Respiratorio

Reporte la IFD del paciente DJ

Control negativo paciente 1

Reporte la IFD del paciente SD

Reporte la IFD del paciente AM

Reporte la IFD del paciente AM

Control negativo paciente 1