CENTRO DE ESTUDIOS TECNOLOGICOS

INDUSTRIAL Y DE SERVICIOS NUMERO 48

3B TÉCNICO LABORATORISTA QUÍMICO

METODOS
FENOTIPICOS
IDENTIFICACION PREELIMINAR BIOQUIMICA - CON
LECTURA INMEDIATA HASTA 18H
INTEGRANTES
• ANDREA PAOLA MIRANDA OBREGON
• ROBERTA MICHELLE LOPEZ PEDROZA
• ANGEL EMANUEL DIMAS VARELA
• ANGELA GISELE GARCIA ACEVEDO
• MARIANA SAMANIEGO TOVAR
INTRODUCCIÓN
Una de las tareas fundamentales del laboratorio de
microbiología es la aplicación de una metodología
precisa para la identificación de microorganismo.
El objetivo es identificar el agente etiológico
responsable del proceso infeccioso y para conocer
las implicaciones patogénicas/patológicas.
De manera rutinaria el laboratorio de microbiología
aplica técnicas fenotípicas que permiten lograr los
objetivos expuestos.
 Métodos Fenotípicos
Los esquemas tradicionales de identificación fenotípica
bacteriana se basan en las características «observables»
de las bacterias, como su morfología, desarrollo, y
propiedades bioquímicas y metabólicas. Actualmente, la
identificación bacteriana se realiza por medio de
métodos convencionales, basados en las características
fenotípicas, puesto que su realización y coste los hace
más accesibles. Algunos de estos son:

• Morfología celular y característica de las colonias

• Pruebas inmediatas (segundos a pocos minutos)
• Pruebas rápidas (hasta 4-6 horas)
• Pruebas lentas (18-48 horas)
• Pruebas de inhibición o sensibilidad
 Las pruebas bioquímicas consisten en
¿QUE SON LAS distintos test químicos aplicados a medios
PRUEBAS biológicos en los cuales es conocida su
reacción, nos permiten identificar distintos
BIOQUIMICAS? microorganismos presentes

RESULTADOS DE UNA PRUEBA

IMVIC
¿Qué son las pruebas bioquímicas de l e c t u r a i n m e d i a t a ?

Las pruebas bioquímicas inmediatas evalúan la presencia de

una enzima (proteínas que producen un cambio físico y
específico en el cuerpo) preformada, y su lectura puede variar
unos segundos hasta unas pocas horas.

A continuación se mostraran las diferentes técnicas utilizadas en lectura

inmediata
 CATALASA
La catalasa es una enzima presente en los peroxisomas de las células de todos los
tejidos animales y vegetales. Actúa sobre el peróxido de hidrógeno (agua
oxigenada) descomponiéndolo en agua y oxígeno, y liberando energía en forma de
calor.

PRUEBA
NEG AT I VA PRUEBA
No se observa ningún cambio al P O S I T I VA
momento de agregar H2O2 a la Se observa un burbujeo
bacteria intenso que significa la
producción de oxigeno
al agregar H2O2 a la
bacteria
VIDEO DE REALIZACION DE LA
TECNICA
 DIAGRAMA DE FLUJO

En un portaobjetos
se depositan una o La muestra se recoge con el asa de
Se pone en contacto con
dos gotas de agua siembra y se toma preferentemente
ella una colonia de los
oxigenada al 30% microorganismos a estudiar. el centro de una colonia pura de
18-24 horas
 EJEMPLOS DE MICROORGANISMOS
(+) Y (-)
La prueba se utiliza para comprobar la presencia de la enzima catalasa que se encuentra
en la mayoría de las bacterias aerobias y anaerobias facultativas que contienen el
citocromo oxidasa. La principal excepción son los estreptococos (Streptococcus).
Originariamente, esta prueba era utilizada para diferenciar entre los siguientes
géneros:
• Estreptococos (catalasa -) de Micrococos (catalasa +) y/o Staphylococcus
(catalasa
• +). Bacilos (+) de Clostridio (-). Lysteria monocytogenes (+) y/o Corynebacterium
• (+, con las excepciones de las especies C. pyogenes y C. haemolyticum, ambas -)
de Erysipelothrix (-)
• OXIDASA
La oxidasa es una enzima
que activa el oxígeno y lo
fija al hidrógeno o a otros
cuerpos.

FUNDAMENTO DE
LA OXIDASA
Determina la presencia del
citocromo C, el cual oxida al NNN'N'
(tetrametilmetanodiamina). La
oxidación se detecta como color azul.
 Hidrolisis del
hipurato
MICROORGANISMOS
Demuestra la capacidad de algunas bacterias
para hidrolizar el hipurato de sodio a ácido POSITIVOS Y
benzoico y glicina por la acción de la enzima NEGATIVOS
hipuricasa. Como indicador de la reacción se
utiliza ninhidrina.
•Cuando la prueba da un color púrpura intenso es
que se manifestó la presencia de la glicina, esto da
FUNDAMENTOS un resultado de una prueba positiva.​
•Tienen la capacidad de detectar la bacteria
•Si la prueba no da un cambio de color cuando se
al hidrolizar el hipurato mediante la enzima le agrega la ninhidrina es que esta prueba es
Hipuricasa.​ negativa.
•La hidrolisis del hipurato creará glicina que
reaccionara con Ninhidrina provocando un
cambio de color.​
DIAGRAMA DE FLUJO
B-GALACTOSILASA Microorganismos
La β-galactosidasa (Lactasa) es la positivos y negativos
enzima que degrada lactosa, el azúcar
que se encuentra en la leche. La Cuándo agregamos onpg como sustrato, la
degradación de lactosa genera B-galactosidasa hidroliza al sustrato
monosacáridos de glucosa y galactosa liberando o-nitrofenol qué esté en medio
en una reacción de hidrólisis, y también alcalino produce una coloración amarilla.​
genera galactooligosacáridos (GOS)
por reacción de transgalactosilación de •La B-galactosidasa no tiene pruebas
la lactosa. negativas.
Es útil para demostrar la presencia o
ausencia de la enzima β-galactosidasa FUNDAMENTOS
utilizando el compuesto orgánico o –
nitrofenil–β-D galactopiranósido Es posible una prueba rápida de galactosidasa,
(ONPG) y para diferenciar los utilizando ONPG, debido a que ésta entra
organismos con reacción retardada a la rápidamente en las células. La beta galactosidasa
lactosa de los organismos lactosa hidroliza al reactivo ONPG (incoloro), liberando o-
negativos nitrofenol que en medio alcalino produce una
coloración amarilla
AMINOPEPTIDASA
Microorganismos positivos y
La aminopeptidasa es un tipo de
proteína llamado enzima.
negativos
Normalmente podemos Aminopeptidasa: PYR. La Lpirrolidonil-β-naftilamida sirve
encontrarla en el intestino como sustrato para la detección de pirrolidonil peptidasa.
delgado, normalmente se utiliza Se utiliza principalmente en la identificación de
para medir la cantidad de Streptococcus pyogenes y Enterococcus spp. También en la
proteína en la orina (también diferenciación de Staphylococcus lugdunensis de otros
puede encontrarse la proteína en estafilocos coagulasa
la sangre). negativa.
Realizan funciones celulares
esenciales como por ejemplo en
la regularización de los niveles
hormonales .

FUNDAMENTOS
.
La prueba del “PyR” permite la identificación presuntiva de ciertas bacterias en base a la actividad
enzimática i-pirrolidonilarilamidasa (PYRasa). Los microorganismos que contienen este enzima hidrolizan
de forma rápida el sustrato presente en los discos y liberan un grupo pirrólico que reacciona con el reactivo
cinamaldehído originándose un compuesto de color rosado-rojizo
 DIAGRAMA DE FLUJO

PASA LA PINZA PUNTA ROMA POR EL

CON UNA PINZA PREVIAMENTE ESTERILIZADA UNA VEZ PUESTOS LOS DISCOS EN EL DICO AYUDANDOTE CON LA PINZA PARA
CUIDADOSAMENTE SACAMOS UN DISCO Y LO PORTA OBJETOS SE ESTERILIZA EL PINZA QUENO SE MUEVA
COLOCAMOS EN EL PORTAOBJETO PUNTA ROMA PARA PICAR LAS PLACAS
CON MICROORGANISMOS CON EL ASA

DESPUES AGREGAR 1 GOTA DE

PYR PARA ACTIVAR EL REACTIVO

PASADOS LOS 5 MINUTOS REVELAS

DEJAR ACTUAR 5 MINUTOS
CON UNA GOTA DE SOLUCION
 Microorganismos positivos y
LAP(Proteínas Asociadas en la Lámina nuclear)
negativos
Son pruebas bioquímicas que se utilizan para la Positivo: presencia de actividad enzimática
detección de la enzima leucina aminopeptidasa, es una leucinoaminopeptidasa: disco color rosado a rojo.
de las pruebas para la identificación de los cocos, étc. Negativo: ausencia de actividad enzimática
Algunos exámenes podrían ser por ejemplo de la leucinoaminopeptidasa: disco y/o solución color
sangre en el cual se mide cuanto de enzima tiene, amarillo o incoloro
también la orina se puede analizar. En general, las especies Streptococcus
pneumoniae y Streptococcus pyogenes,
Pediococcus, Lactococcus y Enterococcus son
LAP positivas, mientras que otras especies de
Streptococcus beta-hemolíticos, Aerococcus y
Leuconostoc son LAP negativas, lo que ayuda en
su identificación.
La prueba de aminopeptidasa se ha utilizado para
realizar un análisis de Gram de bacterias aisladas
de micorrizas de Scleroderma citrinum, la
micorrizosfera y el suelo a granel.
 Diagrama de flujo

Con un aplicador de
Antes de la incubación,
humedezca ligeramente el
madera, frote una pequeña Incubar a temperatura
cantidad de varias colonias ambiente durante 5 minutos.
disco LAP con agua de grado de un cultivo puro de 18 a
reactivo. No sobresature el Después del período de
24 horas en un área
disco. pequeña del disco lad incubación, agregue 1 gota de
reactivo de cinamaldehído
 Coagulasa
Es una proteína producida por varios microorganismos que permite la
j
conservación del fibrinógeno en fibrina

• FUNDAMENTOS
La coagulosa reacciona con la protrombina en la sangre el complejo resultante se llama
estafilotrombina y permite que la enzima proteasa convierta el fibrinógeno en fibrina
 Microorganismos positivos y negativos
• Prueba de portaobjetos.

Si es positivo: Se podrá observar aglutinación macroscópica en el plasma en los 10 segundos, mientras que no se observará
aglutinación en la gota de solución salina.
Si es negativo: No se observara aglutinación. NOTA: Si la prueba de la coagulasa de portaobjetos fuera negativa, deberìa
hacerse una prueba de tubo como confirmación. El aglutinamiento en las dos gotas es un indicativo de auto aglutinación y
por lo tanto debemos descartar la prueba de tubo.

• Prueba del tubo de ensayo.

Si sale positivo (por ejemplo, la colonia problema es S. aureus), el suero coagulará,2​dando como resultado un coágulo (a
veces el coágulo esta tan desarrollado que el líquido se solidifica completamente).
Si sale negativo, el plasma permanece líquido. Un resultado negativo podría indicar que se podría tratar de S. epidermidis
pero solo con unas pruebas más precisas se puede confirmar este hecho, como por ejemplo el API o métodos de BBL
CRYSTAL.

Lista de staphylococci coagulasa positivo : Staphylococcus aureus subsp. anaerobius, Staphylococcus aureus subsp. aureus,
Staphylococcus delphini, Staphylococcus hyicus, Staphylococcus intermedius, Staphylococcus lutrae, Staphylococcus schleiferi
subsp. coagulans.
Lista de' 'staphylococci coagulasa negativo de relevancia clínica: S.saprophyticus, S.cohnii subsp. cohnii, S.cohnii subsp.
urealyticum, S.captitus subsp. captitus, S.warneri, S.hominis, S.epidermidis, S.caprae.
 Diagrama de flujo
(portaobjetos)

HACER GIRAR EL TUBO

RECOGER CON EL SUAVEMENTE PARA
EN UN TUBO DE ENSAYO ASA UNA BUENA LOGRAR LA SUSPENSIÓN
DE VIDRIO ESTERILIZADO COLONIA DE LA DEL MICROORGANISMO
AGREGAR O.5 ML DE UN PLACA DE AGAR
CULTIVO EN CALDO PURO
DE 8 A 24 HORAS

OBSERVAR SI HAY FORMACION DE INCUBAR LA MEZCLA DE 35- 37°

COAGULO INCLINANDO LENTAMENTE (EN BAÑO MARIA DE
EL TUBO PREFERENCIA) POR 4 HORAS
 INDOL Microorganismos positivos
El indol es un compuesto
orgánico heterocíclico, con
y negativos
estructura bicíclica que consiste Los resultados positivos originan anillos de
en un anillo de seis miembros Liesegang de un color rojo o rojo-violeta en la
unido a otro de cinco miembros superficie de la capa de alcohol en el cultivo. Un
resultado negativo se muestra amarillo. Un

Fundamento resultado variable puede ocurrir cuando se

muestra un color anaranjado

Es una prueba bioquímica realizada con Positivo:Escherichia coli, Flavobacterium spp.,

especies bacterianas para determinar la Haemophilus influenzae, La mayoría de los
habilidad del organismo de romper el Proteus spp.
indol del aminoácido triptófano; esta
división molecular es logrado por una Negativa:Actinobacillus spp., Aeromonas
serie de enzimas intracelulares diferentes salmonicida, Alcaligenes spp., La mayoría de los
Bacillus spp.,Bordtella spp.,
Diagramade flujo

Se inocula un Con el asa se

tubo del transfiere Y se incuba a
medio con el una porción 37° por 40 a
asa de de cultivo 48 horas
platino puro

Luego se añade
0.5ml del reactivo
de kovac y se agita
suevemente
 TABLADE ACTIVIDADES REALIZADAS DE CADA INTEGRANTE

ANDREA PAOLA ANGELA GISELE MARIANA ROBERTA ANGEL

MIRANDA GARCIA ACEVEDO SAMANIEGO MICHELLE LOPEZ EMMANUEL
OBREGON TOVAR PEDROSA DIMAS VARELA

Realización de la Recopilación de Recopilación de Recopilación de Recopilación de

presentación información información información información
Recopilación de
información
Realización de la
actividad en clase
 Referencias bibliográficas
1.Clinical Microbiology Procedures Handbook, Fourth Edition. (2016). In Clinical
Microbiology Procedures Handbook, Fourth Edition. American Society of Microbiology.
https://doi.org/10.1128/9781555818814
2.Color Atlas and Textbook of Diagnostic Microbiology, Koneman, 5th edition
3.https://www2.ulpgc.es/hege/almacen/download/35/35729/
pruebas_bioquimicas_de_identificacion_de_bacterias.pdf