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    Molgramostim (GM-CSF No Glicosilado)

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    Presentación a cerca de un medicamento biotecnológico y lo correspondiente a su legislación en México.

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    Molgramostim (GM-CSF No Glicosilado)

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    Molgramostim (GM-CSF No

    Glicosilado)
    Maximiliano Mondragn| Enrique Pineda| Anlisis de Medicamentos
    Qu es el Molgramostin?
    Es un factor estimulante de colonias de
    granulocitos y macrfagos (GM-CSF),
    constituido por 127 aminocidos y no
    glicosilado.
    Datos

    Compuesto por: 127 aminocidos


    Frmula : C639H1007N171O196S8
    Peso Molecular: 14 477 Da
    Descripcin

    Polvo blanco,
    Libre de
    Liofilizado partculas
    extraas

    Contiene como
    mnimo 2.0 mg Solucin
    de Protena/mL
    Solucin incolora Libre de
    o ligeramente partculas
    amarilla extraas
    Produccin

    Aprobacin:

    Protenas del hospedero

    ADN residual
    Ensayos de Identidad:
    Ensayo Especificacin
    act. biolgica esperada: 10 x 106
    Resultado
    Actividad biolgica esperada
    A. Potencia (MPB 0340)
    UI/mg de protena
    B. Enfoque Isoelctrico Barra principal de muestra Las barras corresponden
    corresponde con la barra PI:
    principal de la referencia. PI no Muestra: 5.0
    ms de 0.2 unidades de dif. Referencia 5.1

    C. Impurezas con Masa La posicin de las bandas es Posicin de bandas similares


    molecular diferente a la del similar: s-ref FEUM y muestra tanto s-ref FEUM como en
    molgramostim (MGA 0311). evaluada. muestra evaluada.

    D. Mapeo de Pptidos (MGA Corresponde con el Corresponde con el


    0241: CLAR) cromatograma de referencia cromatograma de referencia

    E. Secuencia N-terminal 16 primeros Aa N-terminal Los 16 primeros Aa N terminal


    debern ser Ala-Pro-Ala-Arg-Ser- Ala-Pro-Ala-Arg-Ser-Pro-Ser -
    Pro-Ser -Pro-Scr-Thr -GIn-Pro- Pro-Scr-Thr -G In-Pro-Trp-Glu-
    Trp-Glu-His-Val His-Val corresponden.

    Endotoxinas bacterianas (MGA No ms de 5 UI/mg 3 UI/mg


    0316)
    Protenas relacionadas (MGA Mximo para cada impureza: Por impureza: 1.01%
    0241: CLAR) 1.5%
    Mximo, impurezas totales (e 5- Para impurezas totales: 3%
    30) : 4%
    Ensayo de Identidad

    Alternativa 1 Alternativa 2

    A A

    B B

    C C

    D D

    - E
    A. Potencia

    MPB 0340. BIOANLISIS EN CLULAS TF-1 DE FACTOR ESTIMULADOR


    DE COLONlAS DE GRANULOCITOS Y MACROFAGOS

    Fundamento:

    Se basa en la estimulacin de la proliferaci6n de celulas TF-I, dnde la sal de


    tetrazolio reacciona por la enzima deshidrogenasa mitocondrial para obtener
    formazn, el cual se mide espectrofotomtricamente. Comparacin 50 % vs 50
    %.
    B. Enfoque Isolctrico
    C. Electroforesis en Gel de Poliacrilamida-SDS
    D. Mapeo de pptidos

    Identificacin de una protena, as como el producto final de varios procesos


    que proporcionan una comprensin completa de la protena que se analiza.

    Divisin selectiva de enlaces


    Aislamiento y Purificacin
    peptdicos

    Separacin cromatogrfica de
    Anlisis Validado
    pptidos
    E. Secuencia N-terminal
    Hay que hacer una degradacin de Edman en un equipo secuenciador de fase
    solida.
    Cargar 1mmol de material a probar en el cartucho del secuenciador
    Correr 16 ciclos

    El procedimiento de separacin se calibra usando:


    Mezcla de a.a-PTH
    Una mezcla del primer ciclo de secuenciacin en blanco
    MGA 316 Determinacin de Endotoxinas
    Bacterianas
    Endotoxinas/ Lipopoliscaridos
    La tcnica de cuantificacin ocupa el lisado de Limulus polyphemus o Tachypleus tridentatus
    Metodo A: Formacion de un gel
    Metodo B: Turbidimetrico y cromogenico

    Material y reactivos
    Control Estndar de Endotoxina (CEE) = preparacin de endotoxina de E. coli caracterizada
    Lisado de amebocitos (LAL)
    *El material empleado debe estar libre de endotoxinas (material de vidrio y termorresistente ciclos
    de 250C x 30min)
    Impureza molecular diferente al Molgramostim
    Analizar por electroforesis gel poliacrilamida-SDS (14% acrilamida, espesor 0,75mm), en el ensayo se realiza en
    condiciones reductoras y no reductoras.
    Solucin amortiguadora muestra A: 50% agua, 50% sol concentrada de muestra R
    Solucin amortiguadora muestra B: 50% agua, 50% sol concentrada de muestra para condiciones reductoras R
    Muestra 1 control muestra + H20 C= 1,0mg/ml + sol. Amortiguadora concentrada de muestra R
    Muestra 2 control 2% Diluir 20uL de la muestra 1 con 980 uL de sol. Amortiguadora de muestra A
    Muestra 3 control 1% 0,2 mL de la muestra 2 + 0,2mL de sol. Amortiguadora A
    Muestra 4 control 0,5% **
    Muestra 5 control 0,25% **
    Muestra 6 control 0,1 **
    Muestra 7 control 0,05 **
    Muestra 8 control 0,025 **
    Muestra 9 Preparar igual que la muestra 1, pero con sol. Amortiguadora condiciones reductoras
    Muestra 10-16 Preparar igual que muestra 2-8 pero con solucin amortiguadora de muestra B
    Impureza molecular diferente al Molgramostim
    Prep. Ref 1 Diluir ref. molgramostim en agua C= 0,02 mg/ml + Sol. Amortiguadora concentrada muestra R
    Prep, Ref 2 ** + Sol. Amortiguadora concentrada para condiciones reductoras de muestra R
    Prep. Ref 3 Marcadores de peso molecular 14,400- 94,000 Da
    *Calentar las muestras a ebullicin x 3min
    Colocar 50uL de muestra en condiciones reductoras o no, en geles separados segn corresponda
    Sumergir el gel toda la noche en una mezcla 10:40:50 COOH, H20, MetOh.
    Transferir el gel a una sol de 100g/L de glutaraldehido 30min.
    Remplazar el glutaraldehido por agua x 20 min.
    Transferir el gel a una mezcla 0,75 g/L NaOH, 14 g/L NH4OH y 8 g/L AgNo3.
    Colocar en un agitador oscuridad x 5min, Lavar cada 30 seg con agua
    Agitar el gel es una mezcla 0,05 g/Lde acido ctrico, formaldehido 0,05% (v/v), MetOh + H20 0,005% (v/v)
    Impureza molecular diferente al Molgramostim
    *Las bandas de protenas se harn visibles en esta etapa
    Comprar la intensidad de cada una de las bandas al Molgramostim, el nivel de impurezas se
    estima con la dilucin

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