Westen Blot y

Western Blot
y Radioinmunoensayo
ES UNA TCNICA ANALTICA, AMPLIAMENTE UTILIZADA

PARA EL ESTUDIO DE PROTENAS.
Que es la tcnica de western blot
Permite la deteccin de una sola protena en una muestra

biolgica un extracto en crudo mediante el uso de anticuerpos
(inmunoglobulinas) que son capaces de detectar protenas ajenas
(antgenos) y unirse especficamente a ellas.
https://scykness.wordpress.com/2013/07/16/entendi
endo-un-western-blot-o-al-menos-intentandolo/
Pasos del western blot
1. Preparacion de la muestra
2. Electroforesis en Acrilamida
a) Gel de electroforesis
b) Elaboracin del gel
c) Inicio de electroforesis
3. Transferencia a una membrana
4. Hibridacion del anticuerpo
5. Deteccion
1. Preparacin de la muestra
Se necesita una adecuada preparacin de la

muestra. En la mayora de los ensayos las
protenas se extraen mediante procesos
mecnicos o qumicos.
El mtodo elegido depender del tipo de
muestra de partida, de la localizacin
subcelular de la protena y de las condiciones
optimas que requiera el anticuerpo para
reconocer el epitopo proteico.
2. Electroforesis en gel de
Acrilamida
Las protenas del extracto se separan mediante
electroforesis en gel poliacrilamida (PAGE). Se usa
primero Dodecilsulfato Sodico (SDS) detergente que
reviste la protenas con carga negativa asi se pueden
separar mediante su tamao.
Se debe de hacer una medicin de protena total para
asegurar la carga de la cantidad correcta de protenas
en el gel.
Se puede usar un mtodo para medir la protena total
de la muestra entre ellos tenemos Lowry, Bradford y
acido bincocinico (BCA).
a) Gel de electroforesis
Si se requiere condiciones naturales para que el

anticuerpo pueda detectar el epitopo en la
electroforesis no se aadir SDS ni en el gel ni en
el tampn de electroforesis
En estas condiciones las protenas mantienen
sus condiciones estructurales y la migracin en
el gel depende depende de su masa relacin
de carga de protena por encima de su
tamao.
Anlisis de DNA por electroforesis en gel de agarosa -
Comparativa de patrones de banda PUCPR
http://carrepa70.blogspot.pe/2012/10/ https://www.youtube.com/watch?v=NQ-c6Dp6v
Elaboracin del gel
Colocar los espaciadores de la parte
inferior y laterales entre los cristales.
Tras fijacin de los lados, verter el gel
resolutivo y esperar que el gel se
polimerice.
Colocar el peine en la parte superior
del gel.
Verter el stacking gel y quitar el
peine una vez el gel haya
polimerizado.
Lavar los pocillos con ddH20. El gel
est listo para cargar las muestras y
la electroforesis.
Inicio de Electroforesis
Las muestras se cargan en los
pocillos del gel mediante una
pipeta. Normalmente se cargan
de 20 a 40 g de protena total
por carril. Es importante conocer
de antemano, el volumen que
se puede cargar por pocillo,
para as evitar sobrecargas que
pueden dar lugar a la prdida
de muestra o derrames en
pocillos adyacentes. Una vez
finalizada la carga, el gel se
somete a un campo elctrico
generado por una fuente de
alimentacin.
El tampn utilizado durante la electroforesis,
contiene Tris (mantiene el pH), Glicina
(conductor electricidad) y SDS (mantiene las
protenas cargadas negativamente). El progreso
en el gel se monitoriza observando el frente
coloreado por el coloran-te presente en el
tampn de carga y la posicin de los
marcadores de tamao siempre que estos estn
teidos.
Transferencia a una membrana
La membrana es un soporte solido que une e inmoviliza
las protenas permitiendo asi que la hibridacin de una
protena de un anticuerpo las pueda detectar.
La mayora de las membranas utilizan la generacin de
un campo elctrico para conducir a las protenas desde
el electrodo negativo al positivo
La membrana PVDF ofrece una mayor resistencia
mecnica resistencia a la SDS y una mayor unin que la
nitrocelulosa
La membrana de nitrocelulosa tiene la ventaja de
proporcionar un menor ruido de fondo y que no
requiere un pretratamiento con metanol.
Previamente a la tranferencia tanto el gel como la
membrana se equilibran en una solucin tampn pre-
enfriada.
Sugerencias en la transferencia
Evitar la manipulacin de membranas con las manos

desnudas
Evitar burbujas de aire entre el gel y la membrana
No permitir un sobrecalentamiento durante la
transferencia
Ajustar las condiciones de transferencia al tamao de la
protena
La aparicin de marcadores de tamao preteidos en
la membrana es indicacin que se ha completado la
transferencia
Uso del colorantes.
Bloqueo
Usado para reducir los lugares de unin no

especficos al anticuerpo. A menudo son
soluciones a base de protenas como la leche
descremada en polvo o la albumina de suero
bovino.
Una incubacin durante una hora suele ser
suficiente para un bloqueo de los lugares de
unin no especficos del anticuerpo.
Hibridacin del Anticuerpo
Despus del proceso de
bloqueo, la membrana se
incuba con el anticuerpo
primario. En general los
anticuerpos reconocen una
secuencia de aminocidos
pequea (epitopo) que
queda expuesta al eliminar la
estructura tridimensional de la
protena en condiciones
desnaturalizantes
a) Anticuerpos primarios
Monoclonal vs Policlonal
Se pueden usar tanto anticuerpos primarios
monoclonales como policlonales tienen ventajas y
desventajas y se diferencian segn a la forma como se
sintetizan.
Mientras que los anticuerpos policlonales reconocen
multiples eptopos del antgeno y en cambio los
monoclonales reconocen un nico epitopo de la
protena.
Incubacion
El anticuerpo primario se diluye en tampn de
bloqueo.
Luego se procede a la eliminacin del
excedente mediante tampones de lavado.
Deteccin
La deteccin de la protena se puede hacer mediante

mtodos directos o indirectos cada uno con ventajas e
inconvenientes. Los mtodos directos utilizan un
anticuerpo primario conjugado con un marcaje
detectable como una enzima, biotina o molecula
fluorescente.
Los mtodos indirectos utilizan dos anticuerpos un
anticuerpo primario y un anticuerpo secundario, es el
anticuerpo secundario el que esta conjugado con un
marcaje detectable.
Mtodos de deteccin
1. Quimioluminiscencia
usados comnmente para anticuerpos secundarios
conjugados con peroxidasa (HRP).
La reaccin entre la encima y el substrato produce luz que
puede ser detectada mediante la exposicin de la
membrana a una pelcula de rayos x o usando una
cmara CCD.
2. Fluorescencia
El anticuerpo exitado se une a un fluoroforo que cuando
es exitado emite luz el cual se detecta mediante un
dispositivo capaz de medir la fluorescencia.
Colorimetra
usan un anticuerpo secundario que ha sido
conjugado previamente a una enzima (peroxidasa o
fosfatasa alcalina). La enzima convierte el colorante
en un producto insoluble que es visible en la
membrana.
La cantidad de colorante convertido es proporcional
al cantidad en la muestra. La intensidad de la tincin
puede ser medida por espectrofotometra o por un
densitmetro
Preparacin de la Electroforesis en gel de Transferencia electrofortica a
muestra Acrilamida una membrana
Hibridacin del anticuerpo
Deteccin de las bandas

Aplicaciones de Western blot
Investigacin
Biologa molecular.
Inmunologa.
Diagnstico
Prueba de VIH.
Enfermedad de las vacas locas.
Enfermedad de Lyme.
Enfermedades infecciosas.
Radioinmunoensayo
ES UNA DE LAS TCNICAS MAS SENSIBLES PARA DETECTAR ANTGENO O
ANTICUERPO FUE DESARROLLADO EN 1960 POR DOS ENDOCRINLOGOS
S.A. BERSON Y ROSALYN YALOW.
Es una tcnica competitiva en la que la molecula
antignica que se quiere determinar compite por unirse
a un anticuerpo especifico con un trazador radioactivo.
Es un mtodo radioinmunometrico y fue la primera de

las tcnicas de unin competitiva de protenas
desarrolladas. Se basa en la unin especifica de los
complejos antgeno-anticuerpo (Ag-Ac), lo que le
confiere una gran especificidad unido a la sensibilidad
de los mtodos radiolgicos.
Pasos
1. Se mezcla una cantidad constante de antgeno marcado
radioactivamente y una cantidad constante de un anticuerpo
para ese antgeno.
2. Se produce la reaccin entre antgeno ( Ag) y anticuerpo (Ac)
3. Se separa la fraccin de antgeno que se ha unido de la que
permanece libre (hay varias formas de hacerlo).
4. Se determina la radioactividad.
5. Si la muestra contiene adems antgeno frio (no marcado), este
competir con el marcado para unirse al anticuerpo, y se
observara un descenso en la medida de la radioactividad.
6. Este descenso es proporcional a la concentracin de antgeno
frio en la muestra.
Condiciones para el
radioinmunoensayo
1. Que el anticuerpo se encuentre en
concentracin limitada ( para que haya
concurrencia entre antgeno marcado y no
marcado por sus sitios de unin).
2. Que exista similar avidez de ambos antgenos,

por los sitios de unin del anticuerpo.
El desarrollo de anticuerpos monoclonales mejor de manera
notable la eficiencia de las tcnicas isotpicas y disminuy, en
mucho, el efecto de reaccin cruzada entre protenas, el cual se
presentaba con los antisueros policlonales cuando haba cadenas
comunes entre el antgeno que se iba a determinar y otros
presentes en la muestra. Estos anticuerpos reconocen un eptope
especfico de la protena que se desea detectar, y pueden utilizarse
en combinacin fijando uno a la superficie, y marcando el otro,
como se aprecia en las tcnicas sndwich y en el ensayo
inmunorradiomtrico.
Tipos de radioinmunoensayos
1. Radioinmunoensayo directo
Se basa en la competencia existente entre el antgeno no marcado y una
cantidad conocida del antgeno marcado
2. Radioinmunoensayo sndwich
se inmoviliza una concentracin fija del Ac ( anticuerpo no marcado) en
un soporte solido. Tras lo que se satura el soporte.
3. Radioinmunoensayo de inhibicion
Usado cuando no se puede marcar el antgeno.
La formacin de complejos radioactivos (Ag Ac) varia
en funcin de la concentracin del antgeno no
marcado a mayor concentracin del antgeno no
marcado, mayor formacin de complejos antgeno-
anticuerpo no marcados, y menor formacin de
complejos radioactivos y viceversa.
Separador de las fases ligada y no
ligada
Tras la reaccin Ag Ac en el tubo encontraremos:
Fracciones libres, constituidas por antgeno frio y antgeno

maracado
Fracciones ligadas formadas por complejos antgeno

anticuerpo y antgeno marcado anticuerpo.
Tras la reaccin Ag-Ac, en el tubo de reaccin
encontraremos:
SEPARAR
Radiactividad
Adsorcin:
con carbn activado, dextrano o resinas.
Precipitacin qumica:
con etanol, propilenglicol o el sulfato amnico.
Precipitacin inmunolgica:
con un segundo Ac contra el Ac del sistema.
Contador Gamma y contador
Beta
El contador gamma se utiliza si el isotopo
utilizado como marcaje es I125
Contador beta si el contador fue con tritio 3H
Se construye una curva de calibrado (color rojo)
que relacione la medida de radioactividad (cpm)
con la concentracin de antgeno fro en la
muestra
Si se realiza el ensayo con una muestra que
contiene una cantidad desconocida del antgeno
no marcado y se mide la radioactividad asociada
a los anticuerpos, por interpolacin sobre la curva
de calibrado se puede estimar la concentracin
del antgeno fro en la muestra.
Aplicacin de la
radioinmunoensayo
El RIA se utiliza en la actualidad para determinar
hormonas, vitaminas, neuropptidos,
monoaminas y otras sustancias que se
encuentran en pequeas concentraciones en
los fluidos biolgicos y en otros muchos medios.

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Permite la deteccin de una sola protena en una muestra

Se necesita una adecuada preparacin de la

Si se requiere condiciones naturales para que el

Evitar la manipulacin de membranas con las manos

Usado para reducir los lugares de unin no

La deteccin de la protena se puede hacer mediante

Hibridacin del anticuerpo

Deteccin de las bandas

Es un mtodo radioinmunometrico y fue la primera de

2. Que exista similar avidez de ambos antgenos,

Fracciones libres, constituidas por antgeno frio y antgeno

Fracciones ligadas formadas por complejos antgeno

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