Bibliotecas de ADN

Una biblioteca de ADN es esencialmente una representación de todo el conjunto de ADN (ya sea genómico
o complementario a los ARN).

Una biblioteca de ADN genómico se puede definir como la representación de todo el ADN genómico de un
organismo, incluyendo regiones codificantes y no codificantes por igual.

La biblioteca de ADNc, por otro lado, se construye mediante la transcripción inversa

(retrotranscripción) de los ARNm, y por lo tanto solo representa las regiones codificantes de
proteínas (CDS) del genoma.

Por lo tanto, las dos bibliotecas se utilizan para diferentes propósitos que se describirán en
detalle. Según el tipo de biblioteca,

(a) la fuente de ADN,

(b) el tipo de vector utilizado,

(c) las metodologías experimentales

El principio básico de todas las bibliotecas
de ADN implica:

• Preparación de fragmentos de ADN representativos;

• Preparación del vector apropiado;

• Clonado y transformación;

• Selección y screening.
 Bibliotecas de ADN genómico
Los fragmentos de ADN genómico contendrán no solo secuencias de codificación, pero también intrones,
regiones promotoras, otros tipos de regiones reguladoras, varios elementos repetitivos etc. Por lo
tanto, tales bibliotecas serían útiles en la detección de regiones no codificantes de ADN.

Figura 3.1. Una representación esquemática de las

bibliotecas de ADN genómico. Esencialmente, todo el
genoma se utiliza para la fragmentación y clonado
en diferentes vectores. Los productos fragmentados
se ligan en los vectores y éstos se transforman en
bacterias. Idealmente, cada clon bacteriano debe
incluir un diferente fragmento genómico.

Cómo se fragmenta el ADNg???

 Bibliotecas de ADN copia o complementario
El ADNc es la abreviatura de ADN complementario o copia,
es decir, ADN que ha sido sintetizado como
complementario al ARNm maduro, representando solo las
regiones de codificante o exones. Por lo tanto, la
biblioteca de ADNc se refiere a una representación de la
mayoría, o todas, las transcripciones de ARNm maduras
aisladas de un tipo de célula, o en otras palabras,
representativo de todos los genes expresados en una
célula dada en un momento dado y un condición dada.
Figura 3.2. Representación de la síntesis de ADNc y la
biblioteca de ADNc.
Para clonar solo los genes expresados, primero se debe
convertir el ARNm (que es altamente susceptible a la
degradación por RNasas) a cDNA (que es resistente a la
degradación de Rnasas -que son mucho más abundantes
que las DNAsas) mediante el uso de una transcriptasa
inversa (existen 2, la más utilizada es la del virus
MLMV) y primers (cuales??). El procedimiento de
síntesis de ADNc podría comenzar a partir de ARN total
o de un enriquecimiento de ARNm (como??).
 Screening de bibliotecas

Una vez que se obtiene la biblioteca es necesario encotrar un gen particular de interés, generalmente
usando un ADN homólogo como sonda, que debe “marcarse”.

Esta sonda podría ser el homólogo del fragmento de ADN de una especie diferente (como la región de
codificante de un gen humano usado como una sonda para seleccionar una biblioteca de ADNc de ratón del
tejido de interés), o parte de una región de codificación para "buscar" un región promotora, o parte
de un gen de un tejido para detectar homólogos en un tejido diferente, etc. El principio detrás del
screening basado en sondas es que las especies de ADN o ARN monocatenarias se hibridarán a secuencias
con cierto porcentage de identidad en la biblioteca.
 PCR de transcripción inversa (RT-PCR)
ES CUALITATIVA
no debe confundirse con la PCR en tiempo real; qPCR

Como el ARN es bastante menos estable que el ADN, en otras palabras, es más susceptible a la
degradación por RNasas que son muy abundantes, es más difícil trabajar con las especies de ARNm para
comparar los niveles de expresión. Por lo tanto, los investigadores a menudo se utilizan el ADNc que
se sintetiza a partir del ARNm por transcripción inversa para comparar de niveles de expresión entre
diferentes muestras. Como con cualquier otro experimento, se requiere un control interno para mantener
cierto nivel de cuantificación: se utiliza genes que se llaman estandares (antiguamente llamados
housekeeping como la gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH o G3PDH) o el gen b-tubulina se
utilizan para la normalización entre diferentes muestras. La mezcla de ADNc (generalmente la 1ª cadena
es suficiente para este propósito) generada a partir de ARNm de diferentes muestras luego se someten a
amplificación por PCR mediante primers específicos para el gen de interés.

Actualemente se sabe que todos los genes pueden variar dependiendo del fenómeno biológico que se
estudie, por lo que hay que determinar experimentalmente que gen será el correcto estandard en cada
experimento y no dar por sentado que GAPDH o b-tubulina serán los adecuados.
Figura 3.3. Reacción en cadena de la polimerasa de transcripción inversa (RT-PCR). (a) Un resumen
esquemático de la RT-PCR (b) un ejemplo hipotético de un resultado de RT-PCR en gel de agarosa, que
muestra amplificaciones con primers específicos para control interno GAPDH y transcripción del gen P53
en tres muestras de tejido diferentes.
 Primers degenerados a partir de alineamientos
Si no hay una secuencia de genes disponible para tu proteína favorita, pero, por ejemplo, las
secuencias de proteínas están disponibles en varias especies, por ejemplo, se pueden construir
primers degenerados para "extraer" el gen de la mezcla de ADNc sin la necesidad de una construcción y
screening de una biblioteca (pero advertencia: con falsos positivos bastante altos, entonces ¡son
necesarios ensayos de seguimiento exhaustivos!)
Northern blots La transferencia Northern es una técnica utilizada
para el análisis de ARN,y más comúnmente ARNm, entre
muestras, y fue desarrollado por James Alwine,
George Stark y David Kemp.
Figura 3.6.

Un esquema simplificado de estrategias de preparación de sondas.

(a) Preparación de la sonda de ARN por transcripción in vitro. Para el marcado radiactivo, uno de los
nucleótidos que se incorpora a la transcripción debe contener un radioisótopo.
(b) marcado final de un fragmento de ADNc. El fosfato gamma del ATP se transfiere al fragmento de ADN.
(c) Generación de la sonda basada en PCR usando desoxinucleótido biotinilado. La afinidad de la
biotina/estreptavidina es cercana a la de un enlace covalente. Una enzima como la fosfatasa alcalina se
puede conjugar a estreptavidina, que luego convierte un sustrato incoloro en un precipitado coloreado para
la detección.
 Análisis de microarrays
Tanto en RT-PCR como en Northern blots, uno debe tener una idea sobre qué gen podría expresarse para
poder preparar las sondas específicas para el ARNm en estudio. Sin embargo, si se desea abordar un
tema más general e imparcial cuestión de "qué genes se pueden expresar de manera diferente entre las
muestras", es necesario un método más general. La tecnología de microarrays o chips de ADN es
bastante útil para este propósito y se ha convertido en un estándar para estudiar perfiles globales
de expresión génica.
Figura 3.7. Una visión general del análisis
de microarrays para perfiles de expresión de
genes. Por lo general, ARN de dos diferentes
muestras se aíslan y se transcriben de forma
inversa usando desoxinucleótidos marcadps
fluorescentemente (con Cy3 (verde) y Cy5
(rojo)). Estos ADNc marcados se mezclan e
hibridan con el microarrays. Cada punto en
microarrays corresponde a un gen diferente
(mostrado aquí como líneas onduladas grises
en el inset), y dependiendo de qué genes se
transcriben en cada muestra (y en qué
cantidad), los ADNc etiquetados hibridizan
de manera diferente a cada lugar. Cuando la
matriz se escanea para cada fluorescencia y
se combina la información, cada punto no
solo mostrará un color diferente (diferentes
escalas de rojo, verde o amarillo), pero
también tienen una medición de intensidad
diferente registrada en un archivo Excel o
similar para un análisis posterior.
qPCR (a) Selección de
dirigidos al gen de interés
primers

(son muy diferentes a los

de PCR comunes).

(b) región de ADN de

interés.

(c) Condiciones de
amplificación y curva de
melting.

(d) resultados de la curva

de melting y de
amplificación

(e) Cq
 qPCR
●
Cuantitativa absoluta vs relativa (más usada)
●
SybrGreen vs Taqman
●
Cálculo de Cq (umbral vs 2da derivada)
●
Cálculo de la eficiencia
●
Genes de referencia
Cuantificación relativa.

La cuantificación relativa no requiere estándares con concentraciones determinadas. Esta técnica se utiliza para obtener la
magnitud de los cambios en los niveles de expresión genética de un gen en estudio en comparación con uno o más genes de
referencia. Los cálculos en cuantificación relativa de expresión genética se basan en la comparación de los valores Ct
utilizando la eficiencia de la reacción de la PCR como factor de corrección. Sin embargo, hay un modelo que no requiere la
eficiencia de la reacción para acceder a un factor de corrección. Este modelo supone una eficiencia óptima e idéntica
(correspondiente al 100%) en la eficiencia de reacción en las PCR en tiempo real tanto del gen en estudio como del gen de
referencia. Este es el método delta-delta Ct que sólo es aplicable para una estimación rápida de la proporción relativa de
la expresión genética en estudio. El método delta-delta Ct expresa la proporción obtenida de la relación entre los valores
Ct de la muestra y los valores Ct del control tal y como se muestra en la siguiente ecuación:

Otro modelo. Las diferentes eficiencias de la PCR tanto para los genes en estudio como para los genes de referencia se
toman en cuenta como se muestra en la siguiente ecuación:

En esta ecuación la diferencia del gen en estudio se expresa en una muestra frente a un control en comparación con un gen
de referencia. Etarget representa la eficiencia de la PCR en tiempo real del amplicon en estudio; Eref representa la
eficiencia de la PCR en tiempo real del gen de referencia; ΔCPtarget  es la desviación en Ct del control menos la muestra CPtarget es la desviación en Ct del control menos la muestra
del gene en estudio; y ΔCPtarget  es la desviación en Ct del control menos la muestra CPref es la desviación en Ct del control menos la muestra del gen de referencia.

Como se mencionó, en este modelo también es necesario conocer la eficiencia de PCR de cada gen estudiado. Las eficiencias
de la PCR en tiempo real se calculan a partir de las pendientes de la curva estándar obtenidas después de realizar
diluciones seriadas con las reacciones de la PCR en tiempo real de acuerdo a la siguiente fórmula: E=10[-1/slope]-1.

Se ha observado que la cuantificación relativa de ARNm tiene algunas limitaciones. En primer lugar, se puede introducir un
sesgo estadístico importante cuando hay grandes diferencias en los niveles de expresión del gen en estudio (Ctmin 20 Ctmax
30) y del gen normalizador lo que pueden conducir a una interpretación biológica equivocada y en segundo lugar, es difícil
encontrar genes de referencia adecuados. Por estas razones es recomendable la utilización de más de un gen de referencia.

Cuantificación absoluta.

Las curvas de amplificación se comparán con las curvas donde el número exacto de móleculas del ADN
target son utilizadas para la amplificación. Como requiere tener esto último casi no es utilizado.
Digital PCR

El principio básico implica la dilución y la división

extrema de la muestra en millones de unidades separadas
que idealmente no contienen partículas o una sola
partícula. Cada unidad contiene todos los reactivos
necesarios para una reacción de PCR, y básicamente
funciona como un reactor de micro-PCR. Si la unidad
contiene la plantilla de interés, la amplificación por
PCR produce una señal positiva. Si no hay una
plantilla, no hay señal. La cuantificación es binaria,
de ahí el término "digital". Si se conoce el número de
unidades de partición, la cantidad inicial de moléculas
objetivo puede estimarse conociendo el número total de
señales positivas a negativas [2]. En una dilución
extrema, esto simplemente representa la relación de las
unidades positivas a negativas, ya que no hay plantilla
o una plantilla única dentro de la unidad.
Next Generation Sequencing/Deep Sequencing/NGS
Pirosecuenciación

En la pirosecuenciación, la reacción de secuenciación se controla

mediante la liberación del pirofosfato durante la incorporación de
nucleótidos. Se agrega un solo nucleótido al chip de secuenciación que
conducirá a su incorporación de una manera dependiente del molde. Esta
incorporación dará como resultado la liberación de pirofosfato que se
utiliza en otras reacciones químicas cuyo producto generan luz. La
emisión de luz es detectada por una cámara. Cualquier base no
incorporada es degradada por la pirofosfatasa antes de la adición del
siguiente nucleótido. Este ciclo continúa hasta que se completa la
reacción de secuenciación. Desventajas: Alto costo de los reactivos y
alta tasa de error en cadenas de 6 o más nucleótidos iguales.
Secuenciación por síntesis:

La secuenciación por síntesis utiliza la incorporación de a una vez de nucleótidos fluorescentes y

modificados específicamente para que solo se incorpore 1 nucleotido por vez en la reacción de
secuenciación de ADN. Es utilizada por las plataformas Illumina NGS. Los nucleótidos utilizados en
este método se han modificado de dos maneras:

1) cada nucleótido se une de forma reversible a una molécula fluorescente única con longitudes de onda
de emisión únicas

2) cada nucleótido también se bloquea de forma reversible asegurando que solo se incorporará un solo
nucleótido por ciclo. Los cuatro nucleótidos se agregan al chip de secuenciación y después de la
incorporación de nucleótidos, las bases de ADN restantes se eliminan por lavado. La señal fluorescente
es fotografiada (literalmente); tanto la molécula fluorescente como el grupo terminador se escinden y
se lavan. Este proceso se repite hasta que se completa la reacción de secuenciación. Este sistema
puede superar las desventajas del sistema de pirosecuenciación, pero igual tiene desventajas: A medida
que avanza la reacción de secuenciación, la tasa de error de la máquina también aumenta. Esto se debe
a la eliminación incompleta de la señal fluorescente que conduce a niveles más altos de ruido de
fondo. Por lo general no se puede generar lecturas de más de 100 o 120 nt. Entonces como leo un
genoma? O ARNm de más de 120nt?
Secuenciación por ligación. Antes de la secuenciación, el ADN se amplifica por PCR en emulsión. Las
perlas resultantes, cada una con copias individuales de la misma molécula de ADN, se depositan en un
portaobjetos de vidrio. Aquí, un grupo de todos los oligonucleótidos posibles de una longitud fija se
y marcados de colores específicos se ponen en contacto con el ADN a secuenciar y un primer
complementario a un secuencia común adicionada durante la construcción de la boblioteca. Los oligos
son reconocidos y ligados. La ligación (por la ADN ligasa) solo se da para secuencias coincidentes y
da como resultado una señal informativa del nucleótido en esa posición. Luego se corta el ADN en la
posisicón +5 y se repite el proceso. Finalmente se replaza el primer por otro en posición -1 y se
repite todo el proceso. 5 rondas completan el proceso.

Se ha informado que este tipo de secuenciación tiene problemas para secuenciar secuencias
palindrómicas.

Paired-End Sequencing:

Secuencia desde ambos extremos de un fragmento mientras se realiza un seguimiento de los datos
emparejados. Con este método, la reacción de secuenciación comenzará desde un extremo del fragmento.
Una vez completado, el fragmento se desnaturaliza y un primer de secuenciación se hibrida a la otra
hebra. El fragmento se secuencia de nuevo. El uso de este método permitirá una confirmación adicional
de la precisión de la secuencia o podría usarse para aumentar la longitud total de la lectura.
Secuenciación de semiconductores iónicos. La secuenciación de semiconductores de iones utiliza la
liberación de iones de hidrógeno durante la reacción de secuenciación para detectar la secuencia de un
grupo. Cada grupo está ubicado directamente encima de un transistor semiconductor que es capaz de
detectar cambios en el pH de la solución. Durante la incorporación de nucleótidos, se libera un solo H
+ en la solución y el semiconductor lo detecta. La reacción de secuenciación en sí procede de manera
similar a la pirosecuenciación pero a una fracción del costo. Desventajas: Alta tasa de error sobre
tramos homopoliméricos.