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    Herramientas en Bilogía Molecular (PCR)

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    Julio César Acevedo
    Este documento describe diversas herramientas moleculares como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), electroforesis, enzimas de restricción y PCR en tiempo real, y sus usos en genética, diagnóstico médico e identificación.

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    Herramientas en Bilogía Molecular (PCR)

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    Este documento describe diversas herramientas moleculares como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), electroforesis, enzimas de restricción y PCR en tiempo real, y sus usos en genética, diagnóstico médico e identificación.

    Descripción original:

    Diapositivas de la clase de genética de la Dra. Adriana Lucía Pico Romero -UIS-

    Derechos de autor

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    HERRAMIENTAS EN BIOLOGIA MOLECULAR

    GENETICA Y BIOLOGIA MOLECULAR ADRIANA LUCIA PICO ROMERO


    Msc. CIENCIAS BASICAS BIOMEDICAS

    AVANCES MOLECULARES

    AVANCES MOLECULARES

    REACCIN EN CADENA DE LA POLIMERASA PCR


    Proceso que semeja in vitro la replicacin del ADN y que permite obtener millones de copias iguales de un fragmento de ADN, despus de realizar 30 o ms ciclos.

    REPLICACION ADN
    y mutaciones puntuales

    PCR
    Buffer Primers ADN molde dNTPs (dATP, dGTP, dTTP y dCTP) ADN Polimerasa (Taq polimerasa) Cloruro de Magnesio (MgCl2)

    PCR
    1. DENATURACIN 90 a 95 c

    CICLO

    2. ANILLAMIENTO 55 a 65 c 3. EXTENSIN 72 c

    PCR

    PCR

    ELECTROFORESIS

    USOS DE LA PCR
    Pruebas de identificacin (STRs) Deteccin de enfermedades hereditarias Mutagnesis dirigida Genotipificacin de mutaciones especificas (SNPs) Deteccin de enfermedad viral Clonacin de genes

    USOS DE LA PCR
    Microbiologa clnica: 1. Diagnostico etiolgico 2. Control de tratamiento antimicrobianos 3. Caracterizacin gentica de agentes infecciosos.

    PRUEBAS DE IDENTIFICACIN
    Autosmicos:
    D3S1358, VWA, FGA, THO1, TPOX, CSF1PO, D5S818, D13S317, D7S820, D8S1179, D21S11, D18S51, D16S539.

    PCR
    STRs

    Cromosoma Y: DYS19, DYS385,


    DYS389 I, DYS389 II, DYS391, DYS390, DYS392, DYS393.

    DIAGNSTICO DE ENFERMEDAD GENTICA


    ENZIMAS DE RESTRICCIN
    Tambin conocidas como endonucleasas, son enzimas que cortan los enlaces fosfodiester del ADN a partir de una secuencia que reconocen (palindrmica). Son extradas de organismos procariticos (bacterias), donde actan como un mecanismo de defensa, para degradar material gentico extrao que entre en la clula.

    ENZIMAS DE RESTRICCION
    Tipo I : a. Tienen actividad de restriccin (cortan) y modificacin (metilan). b. Cortan lejos de la secuencia de reconocimiento, ya sea ro arriba o ro abajo.. c. Necesitan ATP para moverse a travs de la molcula de DNA, desde el lugar de reconocimiento hasta el sitio del corte.

    ENZIMAS DE RESTRICCION
    Tipo II: a. Slo tienen actividad de restriccin. b. Cortan de manera consistente y predecible dentro de la secuencia que reconocen. c. No necesitan ATP. slo requieren Mg++ como cofactor.

    ENZIMAS DE RESTRICCION
    Tipo III : a. Tienen actividad de restriccin y metilacin. b. Cortan de 5-8 bases antes o despes de la secuencia que reconocen c. Necesitan ATP para moverse a travs de la molcula de DNA, desde el lugar de reconocimiento hasta el sitio del corte.

    PCR MISMATCH

    PCR EN TIEMPO REAL


    El proceso de amplificacin y deteccin se producen de manera simultanea. Deteccin por fluorescencia o agentes intercalantes Cuantificacin en cada momento de la cantidad de ADN sintetizado

    UTILIDAD DE RT-PCR RTDiagnostico de agentes infecciosos HIV, VHB, VHC, CMV Bordetella, Bartonella, Mycobacterium Tuberculosis (crecimiento lento) Aspergillus ssp. (micosis invasivas) Toxoplasma gondii

    PCR nested
    Dos amplificaciones con distintos pares de primers Incrementa la sensibilidad de deteccin.

    RTRT- PCR (REVERSA)


    Deteccin y amplificacin de ARN. Permite estudiar la expresin de determinados genes (su traduccin a protenas). 1. El ARNm se transcribe a ADN( transcriptasa reversa), 2. Por cada molcula de ARNm se sintetiza una molcula de cADN monocatenaria. 3. Mediante ADN polimerasa se convierte el cADN en ADN de doble cadena 4. A partir de aqu se aplica la tcnica de PCR clasica lo que permite una deteccin de la expresin de ARNm mucho ms sensible.

    PCR multiplex
    Permite amplificar varias secuencias de ADN en una misma reaccin. Marcaje fluorescente de los primers
    DXS8378
    10/11

    DXS9898
    12/15

    DXS8377
    45/47

    HPRTB
    14

    GATA172D05
    10

    DXS7423
    14/15

    DXS6809
    31/34

    DXS7132
    12

    DXS101
    24/26

    DXS6789
    21/22

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