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Allium test para evaluar el efecto citotóxico y genotóxico de extractos naturales

en células meristemáticas de Allium cepa

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Diana Milena Muñoz Solarte

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 Desarrollo humano

Allium test para evaluar el efecto citotóxico y

genotóxico de extractos naturales en células
meristemáticas de Allium cepa
Diana M. Muñoz-Solarte*, Nancy Guerrero-Pepinosa**

Resumen
Introducción: el uso de diferentes compuestos de origen natural para el tratamiento primario de enfer-
medades se ha incrementado; la mayoría de estos compuestos no cuentan con suficientes estudios de
toxicidad que validen su uso terapéutico. Los bioensayos son considerados pruebas efectivas para evaluar
efectos tóxicos de diferentes sustancias con el empleo de plantas. Allium test es un bioensayo para detectar
contaminantes y sustancias potencialmente tóxicas para la salud. Diversos estudios han demostrado su
potencialidad diagnóstica significativa. Metodología: estudio experimental. Para estandarizar el bioensayo
Allium test, fue necesario organizar tres réplicas, con cuatro Allium cepa con meristemos apicales de dos
centímetros de diámetro. Se realizaron los cortes y el montaje de cada muestra para el posterior análisis al
microscopio. Resultados: al usar Allium test, el mayor porcentaje de células se encuentran en interfase con
un 45%, seguido de un 42% de profase, lo cual evidencia una actividad normal del ciclo celular. Conclu-
siones: la estandarización del bioensayo Allium test en el laboratorio permitirá evaluar la citotoxicidad y
genotoxicidad de extractos de origen natural usados para el tratamiento primario de enfermedades.
Palabras clave: Allium cepa, bioensayo, citotoxicidad, fitotoxicidad, genotoxicidad.

Allium Test to Evaluate the Cytotoxic and Genotoxic Effect of Natural Extracts in Me-
ristematic Cells of Allium strain
Abstract
Introduction: The use of different natural compounds for the primary treatment of diseases has increa-
sed; most of these compounds do not have sufficient toxicity studies that validate their therapeutic use.
The bioassays are considered effective tests to evaluate toxic effects of different substances with the use
of plants; Allium is a bioassay test to detect pollutants and potentially toxic substances to health. Seve-
ral studies have demonstrated significant diagnostic potential. Methodology: Experimental study. To
standardize the Allium test bioassay was necessary to organize three replicates, with 4 apical meristems
Allium strain with two centimeters in diameter, cuts and assembly of each sample were made for subse-
* Magíster (c) en Biología, quent microscopic analysis. Results: By using Allium test, the highest percentage of cells are in interpha-
Universidad de Antioquia. se with 45%, followed by 42% of prophase, which shows a normal activity of the cell cycle. Conclusions:
Coordinadora del Laboratorio de Allium bioassay standardization in the laboratory test will assess the cytotoxicity and genotoxicity of
Ciencias, Fundación Universitaria natural extracts used for the primary treatment of diseases.
María Cano, sede Popayán.
Keywords: Allium strain, bioassay, cytotoxicity, phytotoxicity, genotoxicity.
Correo-e:
dianamilenamunozsolarte@fumc.
edu.co
Allium test para avaliar o efeito citotóxico e genotóxico de extratos naturais em células
** Magíster en Biología, Universidad de
meristeméticas de Allium cepa
Antioquia. Docente investigadora,
Fundación Universitaria María Resumo
Cano, sede Popayán.
Introdução: o uso de diferentes compostos de origem natural para o tratamento primário de enfermi-
Correo-e: dades vem aumentando; a maioria desses compostos não conta com suficientes estudos de toxicidade
nancyyadiraguerreropepinosa@ que validem seu uso terapêutico. Os bioensaios são considerados provas efetivas para avaliar efeitos
fumc.edu.co tóxicos de diferentes substâncias com o emprego de plantas, Allium test é um bioensaio para detectar
contaminantes e substâncias potencialmente tóxicas para a saúde. Diversos estudos vêm demonstran-
Recibido: 15 de junio del 2012
do sua potencialidade diagnóstica significativa. Metodologia: estudo experimental. Para padronizar o
Aprobado: 10 de octubre del 2012
bioensaio Allium test, foi necessário organizar três réplicas, com 4 Allium cepa com meristemas apicais
Cómo citar este artículo: Muñoz-Solarte, de dois centímetros de diâmetro, realizaram-se os cortes e a montagem de cada amostra para a posterior
D. M. y Guerrero-Pepinosa, N. (2013). Allium análise ao microscópio. Resultados: ao usar Allium test, a maior porcentagem de células se encontra em
test para evaluar el efecto citotóxico y interfase com 45%, seguido de 42% de profase, o que evidencia uma atividade normal do ciclo celular.
genotóxico de extractos naturales en células Conclusões: a padronização do bioensaio Allium test no laboratório permitirá avaliar a citotoxicidade
meristeméticas de Allium cepa. Memorias, e genotoxicidade de extratos de origem natural usados para o tratamento primário de enfermidades.
11(19), 83-86.
Palavras-chave: Allium cepa, bioensaio, citotoxicidade, fitotoxicidade, genotoxicidade.
84 Desarrollo humano Memorias / Volumen 11, Número 19 / enero - junio 2013

Introducción1 cierto tiempo mediante respuestas individuales (reac-

ciones fisiológicas, etológicas, morfológicas, bioquí-
Actualmente el uso masivo de sustancias a base de ex- micas (Fiskesjö y Dutka, 1996). En este contexto las
tractos de origen natural con propiedades antiinflamato- pruebas con plantas vasculares, entre ellas Allium cepa
rias, antihistamínicas y antisépticas se ha incrementado, (Fiskesjö, 1988), han demostrado potencialidad diag-
y en la mayoría de casos este tipo de sustancias se comer- nóstica significativa (Kristen, 1997). La determinación
cializan sin previos estudios de toxicidad, lo que pone en de dichos efectos se realiza a partir de la observación
riesgo la salud de las personas que las utilizan (Alfredo, del crecimiento, el flujo del ciclo celular y las muta-
Anaruma, Pião, João y Casarotto, 2009). ciones cromosómicas del ápice radical de la cebolla
Los estudios de citotoxicidad y genotoxicidad cons- (Allium cepa). Las plantas vasculares son ampliamente
tituyen un paso importante en la evaluación toxicológica reconocidas como excelentes modelos genéticos para
de los medicamentos de origen vegetal que son mezclas evaluar y detectar compuestos con potencial citotóxico
complejas con una o más acciones terapéuticas, en las y genotóxico. Allium cepa es usada para evaluar daños
que también pueden estar presentes compuestos muta- del adn, como alteraciones cromosómicas y mitóticas
génicos relacionados con el desarrollo de procesos carci- (Leme y Marin, 2009).
nogénicos y teratogénicos (Nunes et al., 2012). Algunas pruebas biológicas tienen la capacidad
En los últimos años, los bioensayos han cobrado para detectar el efecto tóxico, citotóxico y genotóxi-
interés en el campo de la investigación para evaluar los co de compuestos utilizados como tratamiento prima-
potenciales efectos fitotóxicos, citotóxicos y genotóxi- rio de diferentes enfermedades. Además, son simples,
cos de diferentes compuestos como los extractos de rápidos, económicos y pueden ser ejecutados con di-
origen natural que se utilizan ampliamente para tratar ferentes especies. El Allium test ofrece información va-
diferentes enfermedades como la hipertensión y los do- liosa para evaluar el mecanismo que tiene un agente y
lores musculares (Asare et al., 2012). los efectos sobre el material genético como los efectos
La actividad farmacológica de los extractos de ori- clastogénicos (inducción de rupturas cromosómicas en
gen vegetal se asocia con su toxicidad, y el efecto indu- la división celular) y aneugénicos (alteración en las es-
cido depende de la vía de administración, la dosis y la tructuras de la célula, como el huso mitótico) (Fenech,
susceptibilidad genética individual. 2000). La efectividad de Allium test se puede evidenciar
El objetivo del presente estudio es estandarizar la con el estudio de Andrioli, Wulff y Mudry (2006), en el
técnica de Allium test para observaciones microscópi- que evaluaron la toxicidad del metronidazol, un agen-
cas de los ápices radicales de Allium cepa, con el fin de te terapéutico usado para infecciones de tipo intestinal
evaluar el efecto fitotóxico, citotóxico y genotóxico de cuyo efecto tóxico fue identificado con la evaluación
compuestos de origen natural que se usan en tratamien- con varias técnicas.
tos terapéuticos de uso tópico. Además, con este tipo de Las células de los meristemos apicales de cebolla
estrategias investigativas, los investigadores jóvenes del muestran fácilmente un amplio rango de alteraciones
Programa de Fisioterapia de la Fundación Universitaria citológicas, lo que constituye el trabajo con raíces de
María Cano, profundizarán y apropiarán el conocimien- esa especie vegetal en material biológico sensible para
to de la estructura y los mecanismos celulares que son detectar sustancias potencialmente peligrosas tanto
fundamentales para la comprensión y el análisis de la para la salud humana como para el medio ambiente en
función del cuerpo humano (Ramírez, 2011). general. Se han reportado estudios en los que se han
evaluado los efectos citotóxicos del algunos extractos
utilizados para fines terapéuticos, como el del totumo
Fundamento teórico
(Crecentia cujete) y la chuchuguaza (Maytenus laevis
reiss), en los cuales se evidencian efectos citotóxicos y
Los organismos biológicos tienen la capacidad de ex-
genotóxicos después de 24 horas de exposición (Espitia
presar las alteraciones más sutiles que operan durante
et al., 2011; Freyre, Estrada y Bolaños, 2009).
Las pruebas de citotoxicidad son utilizadas para de-
1 Artículo resultado del proyecto de investigación “Evaluación ci- terminar la proporción de células que mueren después
totóxica y genotóxica del extracto de calendula (Calendula oficinallis) de un proceso como la exposición a compuestos de di-
en células meristemáticas de Allium cepa”, desarrollado en el 2012 en la
Fundación Universitaria María Cano, sede Popayán, por el grupo de in- ferente naturaleza. Existen varias pruebas para medir
vestigación “Fisioterapia, cuerpo y movimiento (Ficmos)”. el daño en el material genético (adn), entre las que se
 Allium test para evaluar el efecto citotóxico y genotóxico de extractos naturales en células meristemáticas de Allium cepa 85

encuentran las pruebas citogenéticas como la cuantifi- el programa estadístico spss 15.0. Para el cálculo del im
cación de Alteraciones Cromosómicas (ac) y el Inter- y la duración de cada fase del ciclo celular se emplea-
cambio de Cromátidas Hermanas (ich), que han sido ron las siguientes fórmulas:
fuente de referencia por su alto grado de resolución, y
que se pueden visualizar y analizar con la prueba Allium % IM No cel mitosis (P+M+A+T) x 100
test. No Total cel.
Las alteraciones cromosómicas se caracterizan
por presentar cambios estructurales y numéricos en los % IM No cel mitosis (P+M+A+T) x 100
cromosomas de células que han sido expuestas a agen- No Total cel.
tes físicos, químicos y biológicos. Este tipo de altera-
ciones también pueden ocurrir de manera espontánea. Resultados

Metodología Al estandarizar Allium test en condiciones de labo-

ratorio se observaron claramente algunas organelas
Para estandarizar Allium test se hizo necesario selec- celulares. Se identificaron los núcleos, los cromo-
cionar cuatro bulbos de Allium cepa de dos cm de diá- somas teñidos de color violeta y las membranas ce-
metro aproximado (tres réplicas), los cuales fueron lulares claramente definidas. En todas las células se
asignados al medio agua destilada. Al cabo de las pri- pudo diferenciar el núcleo densamente teñido (figura
meras 72 horas, se retiraron las cebollas de sus respec- 1). Para el análisis al microscopio se escogieron los
tivos tratamientos y se procedió a preparar entre dos y campos en los que mayoritariamente hubiera células
tres raíces de dos cm de longitud de cada cebolla para meristemáticas y se procedió a su recuento, para pos-
análisis al microscopio. Se realizó la tinción y fijación teriormente calcular el porcentaje de células por cada
de células con base en el procedimiento de Fiskesjö y fase de la mitosis según recomendaciones de Urteaga
Dutka (1996). Se tuvo en cuenta solamente la parte y Lallana (2005). El procedimiento de conteo se re-
apical de entre uno y dos cm y se añadieron dos go- pitió en otros campos cuidando que no se solaparan,
tas de la solución de fijación Carnoy hasta cubrirlas. hasta obtener los datos de al menos 100 células. A su
Se fijaron durante diez minutos. El exceso de fijador se vez, y asumiendo que la duración total del ciclo ce-
eliminó con pipeta y papel de filtro, e inmediatamente lular de Allium cepa es de 12 horas (Bishop y Klein,
después se añadió el colorante (orceína acético-clorhí- 1973), también se estimó la duración en minutos de
drica). Se flameó hasta la emisión de vapores, evitando cada fase del ciclo (tabla 1).
la ebullición. Se dejó enfriar y se repitió entre dos y
tres veces durante 15 minutos. Posteriormente se rea-
lizaron cortes finos del ápice de la raíz de la cebolla, se
hizo el “squash” del tejido y se sellaron los bordes del
cubreobjeto con barniz de uñas transparente para evi-
tar la deshidratación celular.

Observaciones microscópicas

Los preparados fueron observados a través de un mi-

croscopio óptico binocular. Se calculó el índice mitóti-
co (im) que estima el porcentaje de células en división
que existen en un tejido y que por tanto es una medida
de su potencial proliferativo. Teniendo en cuenta que Nota: Nótese Pared celular (pc) y núcleo (n).
es una prueba de estandarización, para el análisis de Figura 1. Panorámica de células meristemáticas apicales (40X)
los datos se tuvo en cuenta el protocolo descrito, y se Fuente: elaboración propia
aplicó estadística descriptiva para determinar las fre-
cuencias de células en cada una de las fases del ciclo De acuerdo con la tabla 1, al usar Allium test en con-
celular. La estadística descriptiva se realizó utilizando diciones normales, el mayor porcentaje de células se en-
 86 Desarrollo humano Memorias / Volumen 11, Número 19 / enero - junio 2013

cuentran en interfase, con un 45%, seguido de un 42% de Referencias

profase. Es evidente una actividad normal del ciclo celular,
resultado que era de esperarse pues las células meristemá- Alfredo, P. P., Anaruma, C. A., Pião, A. C., João, S. M. y Ca-
ticas del ápice de cebollas en el proceso de estandarización sarotto, R. A. (2009). Effects of phonophoresis with Ar-
solo estuvieron expuestas a agua destilada. nica montana onto acute inflammatory process in rat
skeletal muscles: An experimental study. Ultrasonics,
Tabla 1. Porcentaje de células en cada fase del ciclo celular y esti- 49(4-5), 466-471.
mación de la duración (min) de las fases correspondientes a los Andrioli, N. B., Wulff, A. F. y Mudry, M. D. (2006). Allium
segmentos radicales de Allium cepa cepa como monitor de toxicidad y genotoxicidad de
metronidazol. Theoria, 15(2), 9-16.
Fases % Tiempo (min)
Interfase 45 324
Asare, G. A. et al. (2012). Genotoxicity, cytotoxicity and
toxicological evaluation of whole plant extracts of the
Profase 42 302
medicinal plant Phyllanthus niruri (Phyllanthaceae).
Metafase 8 57,6 Genetic Molecular Research, 11(1), 100-111.
Anafase 3 21,6
Bishop, R. C. y Klein, R. M. (1973). Inate and photo-con-
Telofase 2 14,4 trolled mitotic rhithms in onion root-tip cells. Cana-
Fuente: elaboración propia dian Journal of Genetics and Cytology, 15(4), 667-670.
Espitia J. E. et al. (2011). Química y biología del extracto
Muchos investigadores han usado las plantas su- etanólico del epicarpio de Crescentia cujete L. (totumo).
periores en estudios de toxicidad, citotoxicidad y geno- Revista Cubana de Plantas medicinales, 16(4), 337-346.
toxicidad, las cuales constituyen gran valor presuntivo. Fenech, M. (2000). The in vitro micronucleus technique. Mu-
Se sugiere incluir los bioensayos con plantas superio- tation Research, 455(1-2), 81-95.
res, específicamente Allium cepa en pruebas de rutina Fiskesjö, G. (1988). The allium test. An alternative in envi-
para evaluar el daño cromosómico inducido por sus- ronmental studies: The relative toxicity of metal ions.
tancias químicas (Grant, 1992). Por estas razones, la Mutation Research, 197(2), 243-260.
aplicación de los bioensayos en la evaluación del efec- Fiskesjö, G. y Dutka, B. (1996). Toxicological monitoring of
to de sustancias cobra importancia en el campo de la drinking waters in developing countries. Proceedings of
biología, y para evaluar previamente los compuestos y WaterTox Workshop, (pp. 89-153). Ottawa: Burlington
extractos de origen natural usados en tratamiento pri- National Water Research Institute.
marios de algunas enfermedades. Freyre, S., Estrada, M. y Bolaños, H. (2009). Estudio preliminar de
la citotoxicidad y la genotoxicidad de un extracto de origen
vegetal conocido como palmo rosado en células meristemá-
Conclusiones ticas de Allium cepa. Revista Memorias, 5(12), 12-17.
Grant, W. F. (1992). Cytogenetics studies of agricultural che-
Allium cepa es un organismo que ofrece un modelo micals in plants. Basic Life Science. 21, 353-378.
experimental factible de implementar en el laborato-
Kristen, U. (1997). Use of higher plants as screens for toxicity
rio para evaluar la toxicidad de diferentes sustancias. assessment. Toxicology in Vitro, 11(1-2), 181-191.
El bioensayo Allium test en células meristemáticas fue
Leme. D. M. y Marin-Morales, M. A. (2009). Allium cepa test
estandarizado en el Laboratorio de Ciencias integradas in environmental monitoring: a review on its applica-
de la Universidad Cooperativa de Colombia y la Fun- tion. Mutation Research, 682(1), 71-81.
dación Universitaria María Cano, Extensión Popayán, Nunes, L. G. et al. (2012). The mutagenic, dna-damaging and
que servirá para realizar posteriores evaluaciones de antioxidative properties of bark and leaf extracts from
toxicidad de compuestos y extractos de origen natural Coutarea hexandra (Jacq.) K. Schum. Environmental
como árnica y caléndula. Toxicology Pharmacology, 33(2), 297-303.
Cabe resaltar la pertinencia de los estudios experi- Ramírez, C. (2011). Importancia de la biología molecular para
mentales en biología celular que deben tener en cuenta la fisioterapia moderna. Revista Salud uis, 43(3), 317-320.
los programas de ciencias de la salud, específicamente Urteaga, F. y Lallana, V. (2005). Optimización de una técnica
fisioterapia, para brindar un abordaje más analítico a de tinción para determinación de efectos citogenéticos
los procesos biológicos relacionados directamente con en ápices radicales de Allium cepa. Revista Científica
el funcionamiento del cuerpo humano. Agropecuaria, 9(1), 63-70.

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