Microbiología, Universidad del Tolima

METODOS DE CONTEO MICROBIANO

Docente: Maryeimy Varón López
Barrero CI, Gaitán JII, Orjuela JIII, Pérez AIV

INTRODUCCIÓN las plantas los nutrientes contenidos en los

restos microbianos (Jenkinson y Ladd, 1981).
El suelo es un recurso natural definido
generalmente como la capa superior de la Existen diferentes técnicas para definir el
corteza terrestre, está formado por partículas número de microorganismos presentes en una
de minerales, materia orgánica, agua, aire y muestra (Tortora et. Al., 2007). Estos
allí nacen y se desarrollan miles de seres métodos y técnicas en general se agrupan en
vivos, desde microorganismos hasta plantas y directos o indirectos.
animales superiores (COM, 2002).
Los métodos directos son básicamente la
El suelo es un ambiente muy apropiado para medida del número de células de los
el desarrollo de los microorganismos tanto microorganismos presentes en una
eucariotas (algas, hongos, protozoos) como determinada muestra, y comprende diferentes
procariotas (bacterias y arqueas). También metodologías como la determinación peso
encontramos virus y bacteriófagos. Todos húmedo y seco, la técnica micro-Kjeldahl que
estos organismos establecen relaciones entre calcula la determinación de nitrógeno total, el
ellos en formas muy variadas y complejas y recuento en cámara de Petroff-Hauser o
también contribuyen a las características Neubauer que permite registrar el número de
propias del suelo por su papel en la células vivas, o la determinación de
modificación de las fases sólida, líquida y componentes característicos de las células,
gaseosa que lo conforman. Los como los ácidos nucleicos, el ATP, el
microorganismos desempeñan funciones de peptidoglicano, entre otros (Rojas, 2011).
gran importancia en relación con procesos de
edafogénesis, ciclos biogeoquímicos de Los métodos indirectos permiten medir los
elementos como el carbono, el nitrógeno, productos de metabolismo o el consumo de
oxígeno, el azufre, el fósforo, el hierro y otros nutrientes, como el método óptico de
elementos, fertilidad de las plantas y turbudimetría que mide la cantidad de luz
protección frente a patógenos, degradación de dispersa o trasmitida, la escala o patrones de
compuestos xenobióticos, entre otros McFarland el cual se basa en la capacidad de
(Nogales, 2005). precipitación de cloruro de bario junto al
ácido sulfúrico o el recuento en placa estándar
La biomasa microbiana es el componente más o recuento de microorganismos viables
activo del suelo forma parte del “pool” de la (Tortora et. Al., 2007).
materia orgánica y cumple una función muy
importante en el humus, ya que interviene en Es importante el correcto uso de los métodos
los procesos de mineralización de nutrientes de conteo y aprender a diferenciar entre ellos
(Duchafour, 1984), una vez muertos ponen a para seleccionar el mejor, según la muestra
disposición de otros microorganismos y de estudiada. El procedimiento de conteo de

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microorganismos es una herramienta disolver completamente el medio y evitar la

significativa en la microbiología. El objetivo formación de grumos, después se llevó a la
del trabajo es presentar los fundamentos para autoclave a una temperatura de 121 ° C
el proceso de conteo, métodos empleados y durante 15 minutos. Una vez finalizado el
análisis de las muestras de suelo estudiadas. proceso, se dejó reposar el medio de cultivo,
y en cámara de flujo laminar, previamente
desinfectada se procedió a servir 20 ml de
MATERIALES Y METODOS medio de cultivo en cada caja Petri.
Primero se procedió a realizar un lavado y Se obtuvieron dos muestras de suelo de
posteriormente esterilización por autoclavado diferentes sectores para analizar la cantidad
de los materiales necesarios para el proceso de microorganismos presentes:
de siembra.
La muestra de Suelo A fue recolectada cerca
Para la preparación de los medios, se adicionó de un cultivo de Zamias, con las coordenadas
9,4g de medio PDA a 240 ml de agua Latitud 4° 42’ 65’’ y Longitud 75° 21’ 39’’, a
destilada, se realizó la agitación con calor una altura de 1116msnm en el Jardín
para disolver completamente el medio y
Botánico de la Universidad del Tolima. El
evitar la producción de grumos;
terreno es irregular y con poca cantidad de
posteriormente, se realizó la adición de 3,4 ml
de una solución estéril de ácido tartárico, para materia orgánica del bosque y presencia de
obtener un pH de 3,5, el cual garantiza la abono para el cultivo (Ver Grafica 1).
inhibición del crecimiento de bacterias en el Por otro lado, la muestra de Suelo B fue
medio, y favorecer el crecimiento de hongos, recolectada las coordenadas Latitud 4° 42’
se llevó al autoclave a una temperatura de 64’’ y Longitud 75° 21’ 37’’, a 1180msnm,
121°C durante 15 minutos para garantizar que
en suelo cubierto por grandes cantidades de
el medio de cultivo estuviera inocuo. Una vez
materia orgánica, alejada de cultivos, sin
finalizado el proceso, se dejó reposar el medio
presencia de abono en el Jardín Botánico de
de cultivo, y en cámara de flujo laminar
previamente desinfectada, se procedió a la Universidad del Tolima (Ver Grafica 2).
servir 20 ml de medio de cultivo en las cajas
Petri.
Para la preparación del medio BRILA, se
pesó 7g del medio y se depositaron en 180ml
de agua destilada, se aumentó la temperatura
y se agitó para eliminar los grumos y lograr
una dilución uniforme del medio de cultivo;
después se sirvieron aproximadamente entre
8 y 9 ml de medio de cultivo en 18 tubos de
ensayo, y se llevó al autoclave a una
temperatura de 121°C durante 15 min.
Se pesó 6g de Agar Nutritivo y se
suspendieron en 240 ml de agua destilada, y Grafica 1. Punto de extracción de la muestra
se aumentó la temperatura con agitación para de suelo A.

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Siembra por extensión o por superficie, en la

cual se adicionó 0,1ml de cada dilución 10-1,
10-2 y 10-3 a cajas de Petri respectivamente
ya servidas con el medio de cultivo PDA
solidificado, obteniendo tres cajas de Petri y
se procedió a realizar el esparcimiento de la
muestra por todo el medio haciendo una
extensión y siembra uniforme en película con
ayuda de un asa de Drigalsky.
Para la siembra de bacterias, se utilizaron
también dos tipos de siembra:
Siembra sumergida, en la cual se adicionó
1ml de cada dilución 10-2, 10-3 y 10-4 a cajas
Grafica 2. Punto de extracción de la muestra de Petri vacías y estériles respectivamente,
de Suelo B. consiguiendo así tres cajas de Petri y se
procedió a agregar 20 ml del Agar Nutritivo
Se tomaron 10g de suelo de la muestra de
licuado, a una temperatura de 45°C
suelo A y se adicionaron a 90 ml de solución
aproximadamente en la que no se produjera la
salina con agua peptonada, para realizar una
muerte de los microorganismos.
dilución en series de 10. El proceso realizado
se presenta en la Grafica 3. Cada tubo de Siembra por extensión o por superficie, en la
ensayo contenía 9ml de solución salina, para cual se adicionó 0,1ml de cada dilución 10-2,
finalmente obtener cuatro diluciones seriadas. 10-3 y 10-4 en cajas de Petri respectivamente
ya servidas con Agar Nutritivo solidificado,
obteniendo tres cajas de Petri y se procedió a
realizar el esparcimiento de la muestra por
todo el medio, haciendo una extensión con
ayuda de un asa de Drigalsky.
Para la siembra por Microgoteo, se tomó una
caja Petri con Agar Nutritivo solidificado, y
Grafica 3. Procedimiento de dilución usado
se realizaron cuatro divisiones en la base de
para las muestras de Suelo A y B. la caja con un marcador Sharpie, para
Para la siembra de hongos, se utilizaron dos delimitar el área en el que se agregaron las
tipos de siembra: microgotas de la solución. Con la
Micropipeta, se procedió a tomar 5µl de la
Siembra sumergida, en la cual se adicionó dilución 10-1 para adicionar 5 gotas en el
1ml de cada dilución 10-1, 10-2 y 10-3 a una primer cuadrante; se tomó 5µl de la dilución
caja Petri vacía y estéril respectivamente, 10-2 para adicionar 5 gotas en el segundo
obteniendo así tres cajas de Petri con la cuadrante; luego se tomaron 5µl de la
muestra y se procedió a agregar 20 ml del dilución 10-3 y se adicionó 5 gotas en el tercer
medio PDA licuado, a una temperatura cuadrante y finalmente se tomó 5µl de la
aproximada de 45°C, en la que no se dilución 10-4 para adicionar 5 gotas en el
produjera la muerte de los microorganismos. cuarto cuadrante.

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Para el Caldo Verde Brillante Bilis de Lactosa RESULTADOS

(BRILA), se realizó la siembra directa en
Se realizó la siembra y cultivo de los
cada uno de los medios, utilizando tres tubos
para la siembra de 1ml de dilución 10-1, tres microorganismos de las muestras de suelo en
tubos para sembrar 1ml de la dilución 10-2 y los diferentes medios, obteniendo los
tres tubos para la siembra de 1ml de la siguientes resultados:
dilución 10-3. Conteo de células vivas
Finalmente, todos los medios de cultivo La presencia de colonias en el medio PDA
sembrados fueron puestos en una incubadora
indica el crecimiento de hongos, mohos y
a 37°C durante 3 días aproximadamente, para
levaduras. Por otro lado, la presencia de
garantizar el crecimiento de los
microorganismos esperados. El colonias en el medio Agar Nutritivo es un
procedimiento se repitió con la muestra de indicador del crecimiento de bacterias. El
Suelo B desde las diluciones hasta la siembra conteo de las mismas indica los resultados en
en los diferentes medios. Al transcurrir el cada tipo de siembra en las diferentes
periodo de incubación, se realizó el conteo de diluciones trabajadas. Los datos obtenidos en
células viables en los medios Agar Nutritivo la muestra de Suelo A y B se presentan en las
y PDA, y realizaron los cálculos para NMP en Tablas 1 y 2, respectivamente.
los caldos BRILA y el microgoteo.
Tabla 1. Resultados obtenidos del conteo de células vivas en la muestra de Suelo A.
Medio Tipo de siembra 10-1 10-2 10-3 10-4
Repetición 1 - 202 181 9
Sumergido
Agar Repetición 2 - 213 205 11
Nutritivo Repetición 1 - Incontable 0 9
Superficie
Repetición 2 - Incontable 0 11
Repetición 1 164 76 1 -
Sumergido
Repetición 2 79 50 14 -
PDA
Repetición 1 81 41 3 -
Superficie
Repetición 2 140 10 0 -

Tabla 2. Resultados obtenidos por conteo de células vivas en la muestra de Suelo B

Medio Tipo de siembra 10-1 10-2 10-3 10-4
Repetición 1 - 168 18 8
Sumergido
Agar Repetición 2 - 71 14 3
Nutritivo Repetición 1 - 204 21 16
Superficie
Repetición 2 - 110 9 9
Repetición 1 129 50 9 -
Sumergido
Repetición 2 184 48 22 -
PDA
Repetición 1 Incontable 50 42 -
Superficie
Repetición 2 Incontable 52 35 -

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En todos los medios fue posible ver el

crecimiento de microorganismos, como se
observa en las Gráficas 4, 5, 6 y 7.

Grafica 7. Resultados de siembra sumergida

en medio Agar Nutritivo en diluciones de
10-2, 10-3 y 10-4.
Grafica 4. Resultados de siembra por Según los resultados de las Tablas 1 y 2, se
superficie en medio PDA en diluciones de calcularon los promedios de los valores de las
10-1, 10-2 y 10-3. repeticiones en cada dilución según el tipo de
siembra. Así, se obtuvieron las unidades
formadoras de colonias (UFC) por medio de
la siguiente fórmula:
Número de colonias ∗ Inverso de dilución
UFC =
Alicuota

Se calcularon las unidades formadoras de

colonias de cada suelo y se presentan en la
Tabla 3 y 4.
Tabla 3. Unidades formadoras de colonias de
Grafica 5. Resultados de siembra sumergida las muestras de Suelo A.
en medio PDA en diluciones de 10-1, 10-2 y
10-3. Medio Tipo de siembra 10-1 10-2
Agar Sumergido - 2,07x104
Nutritivo Superficie - -
Sumergido - 6,3x103
PDA
Superficie 1,1x104 -

Tabla 4. Unidades formadoras de colonias de

las muestras de Suelo B.
Medio Tipo de siembra 10-2
Agar Sumergido 1,19x104
Grafica 6. Resultados de siembra por Nutritivo Superficie 1,57x105
superficie en medio Agar Nutritivo en Sumergido 5.3x103
PDA
diluciones de 10-2, 10-3 y 10-4. Superficie 5,1x104

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Número más probable Densidad poblacional = NMP * Factor de

correlación de volumen * Reciproco del factor de
La presencia de gas o efervescencia en los dilución menos inoculado
tubos de BRILA indican un test positivo para
Según la fórmula planteada y el dato de NMP
coliformes. En el suelo A no se presentó en
obtenido del Anexo 1 según los datos
ninguna concentración ni en las repeticiones
obtenidos, el resultado para el Suelo B fue
la presencia de gas y/o turbidez (Ver Grafica
3,5x104 NMP/ ml. Por otro lado, en el suelo
7), mientras que en el suelo B cada
A no se puede desarrollar la fórmula de
concentración presento turbidez y gas en dos
densidad poblacional debido a que los valores
de las tres repeticiones realizadas (Ver
obtenidos en la Tabla 5 indican que no hubo
Grafica 8). El suelo A y suelo B dieron los
un crecimiento considerable de bacterias
resultados presentes en la Tabla 5.
coliformes en los tubos y su valor de NMP
Tabla 5. Resultados obtenidos por método equivale < 3.
del número más probable para muestras de
Microgoteo
suelo A y B.
La presencia de crecimiento alrededor de los
Concentración de dilución
Suelo inóculos sembrados sobre el medio es un
10-1 10-2 10-3
resultado positivo para el microgoteo. Los
A 0 0 0
resultados obtenidos son presentados en la
B 2 2 2
Tabla 6. Tanto el suelo A como el suelo B
presentaron un alto crecimiento microbiano
(Ver grafica 7).
Tabla 6. Resultados obtenidos por método de
microgoteo para muestras de suelo A y B.

Concentración de la dilución
Suelo
10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6
A 5 5 4 2 0 0
Grafica 7. Resultados de siembra en medio B 5 5 5 1 0 0
BRILA para metodología del número más
probable de la muestra de Suelo A.

Grafica 7. Resultados de siembra por

Grafica 8. Resultados de siembra en medio microgoteo en medio Agar Nutritivo en
BRILA para metodología del número más diluciones de 10-1, 10-2, 10-3 y 10-4.
probable de la muestra de Suelo B.

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Usando la fórmula empleada para calcular el bacterias es la descomposición y

número más probable planteada mineralización de los residuos orgánicos, de
anteriormente, los valores otorgados por el donde obtienen su fuente energética y
Anexo 2 y los datos obtenido en laboratorio, alimenticia. Las bacterias liberan al medio en
se calcula la densidad poblacional con los el que se encuentran a través de su
datos presentados en la Tabla 6, obteniendo metabolismo, especialmente en el suelo,
1,05x108 NMP/ µl en el Suelo A y 1,65x108 sustancias tales como enzimas, proteínas,
NMP/ µl en el Suelo B. reguladores de crecimiento, metabolitos y
algunos nutrientes. Los beneficios de las
DISCUSIÓN bacterias para los cultivos se relacionan con
un incremento en la cantidad de raíces y un
El suelo constituye la capa superior de la
aporte importante de elementos básicos para
Tierra, la cual ha sido influenciada por
el desarrollo y producción (Acuña et. Al.,
factores biológicos y en muchos casos
2006).
antropogénicos. Su formación depende de
una serie de factores como el material Los hongos poseen un amplio intervalo de
parental, el tiempo, el clima y la vegetación, funciones en el suelo, incluyendo su papel
entre otros (Támara, 2000). Los usos del como simbiontes de plantas, patógenos de
suelo son el resultado de la actividad humana, plantas y animales, oligótrofos, e incluso
sumado o relacionado específicamente a las carnívoros, sin embargo su papel más
características geológicas y naturales del importante en el suelo desde el punto de vista
terreno y determinado también por el ecológico, es la descomposición de la materia
propósito o actividad desarrollada por el ser orgánica desde los azúcares simples y
humano en dicho territorio (Pérez, 2007). aminoácidos hasta polímeros muy resistentes
como la lignina y complejos de ácidos
El suelo es generalmente un hábitat favorable
húmicos del suelo. Gracias a su gran
para la proliferación de microorganismos y en
tolerancia a la acidez, comparado con las
las partículas que lo forman se desarrollan
bacterias heterótrofas, la descomposición de
microcolonias. En esos hábitats, los
la materia orgánica en suelos ácidos en su
microorganismos son por lo general mucho
mayoría es realizada por hongos. El papel de
más abundantes que en otros de agua dulce o
los hongos como simbiontes, específicamente
marinos. Típicamente, en los hábitats del
en micorrizas, es de gran importancia para el
suelo se encuentran de 10 6 a 10 9 bacterias
desarrollo de plantas, por su papel en la toma
por gramo de suelo. Los microorganismos
de nutrientes, resistencia a enfermedades y
aislados del suelo comprenden virus,
relaciones hídricas favorables. Dentro de los
bacterias, hongos, algas y protozoos (Atlas &
hongos representativos tenemos como
Bartha, 2002).
ejemplos: Glomus, Fusarium, Gigaspora,
Las bacterias son un indicador que refleja la Trichoderma, Pythium, Penicillum y
población potencial de microorganismos en Aspergillos (Alexander, 1980).
un determinado suelo, especialmente aquellas
Las comunidades microbianas presentes en
que ocupan diferentes nichos o hábitats en
suelos contaminados tienden a estar
forma saprofítica. La función básica de las

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dominadas por aquellas bacterias que pueden Conteo de células vivas

sobrevivir a la toxicidad presente en el
Un método usado para la determinación del
ambiente siendo capaces de utilizar al
número de bacterias presentes en una muestra
contaminante para crecer; en este sentido el
es el método de conteo de células vivas o
contaminante “desbalancea”, más que
viables. Con este método se puede distinguir
toxifica, las comunidades ecológicas del
entre las células vivas y muertas, sembrando
suelo (Contreras, 2005). Estudios de Beelen y
diluciones en cajas de Petri, incubando y
Doelman (1997) sobre toxicidad, han
posteriormente realizando el conteo de las
expuesto que algunos grupos de
colonias visibles. Se busca realizar
microorganismos tienen la capacidad de ser
suficientes repeticiones para reducir el error
más resistentes a contaminantes que otros,
estadístico. El conteo debe realizarse en cajas
por ejemplo las bacterias Gram negativas son
que contengan entre 30 – 300 colonias para
más resistentes en comparación a las Gram
bacterias y entre 20 – 200 colonias para
positivas, en particular ante la presencia de
hongos. Los reportes de esta metodología dan
metales.
el resultado en Unidades formadoras de
La presencia de contaminantes en el suelo se colonia “UFC”, unidad que corresponde
refleja de forma directa sobre la vegetación como mínimo a una bacterias formando una
induciendo su degradación, la reducción del colonia, así como, también a un grupo de
número de especies presentes en ese suelo, y estas que han sido formadas de la misma
más frecuentemente la acumulación de (Rojas, 2011).
contaminantes en las plantas, sin generar
Teniendo como referente los resultados
daños notables en éstas; cuando estas
presentados en la Tabla 3 y 4, se puede
sustancias son bioacumulables el riesgo se
evidenciar una mayor cantidad de hongos en
amplifica al incrementarse las
la muestra de suelo B mientras que hay mayor
concentraciones de contaminantes a medida
presencia de bacterias en la muestra de suelo
que ascendemos en la cadena trófica, en cuya
A. De igual forma, hay mayor cantidad de
cima se encuentra el hombre (Lenoir &
organismos anaerobios y microaerofilios en
Tornari, 2004).
el Suelo A que en el suelo B, ya que hubo
Para realizar el análisis e identificación de mayor crecimiento de estos en los medios de
bacterias presentes en las muestras de suelo forma Sumergida. Estos resultados pueden
estudiadas, se requeriría otra metodología, deberse a las diferencias entre las muestras
iniciando con el cultivo de las muestras en analizadas, ya que el Suelo A era un suelo
agar nutritivo y posteriormente el aislamiento pobre en materia orgánica y rico en abono, a
de colonias, para realizar pruebas iniciales comparación del Suelo B que presentaba
como la tinción de Gram, SIM y Ziehl mayor cantidad de materia orgánica pero con
Neelsen, entre otras, complementado con ausencia de abono. También se considera el
pruebas secundarias o Baterías químicas. nivel de contaminación de los suelos, y los
resultados son concomitantes con lo
planteado por Montaner (2011), quien dice
que en suelos con un porcentaje de humedad

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entre 4 – 8 y pH neutro (6 – 7,8), la carga (2008), son aquellos producidos por los
bacteriana varía entre 4,15x105 y 1,42x106 humanos, como es el conteo erróneo de las
UFC/g de suelo para muestras impactadas por colonias visibles (Contar más de una vez la
contaminación y entre 6,57x105 y 1,13x106 misma colonia o simplemente no contarla),
UFC/g de suelo para muestras control sin confusión al contar y perder la cuenta, errores
contaminación; la carga fúngica varía entre 0 provocados cuando diferentes personas
y 7x104 UFC/g de suelo para las muestras realizan el conteo (Cada individuo realiza el
impactadas por contaminación y entre proceso diferente, y puede tener en cuenta
1,37x105 y 4,8x105 UFC/g de suelo para las colonias que otras personas no), errores en la
muestras control no contaminadas (Ver Tabla aplicación de la formula y estimar un número
7). de microorganismos equivocado y errores en
la siembra, al inocular una mayor o menor
Tabla 7. Resultados promedio de UFC/g de
cantidad de muestra en los medios, o por una
suelo de hongos, bacterias y
mala extensión de la muestra en los mismos
microorganismos fijadores de nitrógeno,
(Esta última produce colonias unidas que
según Montaner (2011).
difícilmente pueden ser contadas). Otros
errores constituyen malas diluciones,
agregando mayor o menor cantidad de
muestra en la primera dilución, errores al
dejar los medios abiertos permitiendo que se
contaminen o errores en la manipulación
cuando demasiadas personas están en
contacto con los medios.
Otro factor que afecta la cantidad de
microorganismos presentes en las muestras es
la presencia del abono. Algunos abonos y
biofertilizantes son insumos formulados con
uno o varios microorganismos, los cuales, de
una forma u otra, proveen o mejoran la
disponibilidad de nutrientes cuando se
Se puede considerar los errores en la aplican a los cultivos (AVS, 2015). Se
metodología. Según Celeromics a. (2008), se desconoce el abono o fertilizante que se
pueden presentar diferentes problemas, como encontraba en el Suelo A, sin embargo se
los errores en la adquisición de la muestra, ya recomienda realizar un análisis del mismo
que al solo extraer una cantidad reducida del para ver su efecto en la tasa de crecimiento de
suelo esta tendrá una concentración diferente los microorganismos presentes en el suelo.
que el suelo en general. Se recomendaría
realizar diferentes tomas de muestra del También se debe considerar la humedad del
mismo suelo, realizar una mezcla de ellas, y suelo, ya que según Ramos & Zuñiga (2008)
de esta mezcla final realizar los ensayos en los UFC para bacterias asciende para
laboratorio. Otro error, según Celeromics a. porcentajes de humedad del suelo de 5.0 % y

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18.0 %, en tanto que los hongos se hongos, los cuales se encontraban en mayor
incrementan en menor proporción para los proporción en los cultivos. Esto se debe a que
mismos porcentajes de humedad. la mayor parte de los hongos se encontraban
en asociación con las plantas del terreno, a
Un efecto que también influye en la cantidad
diferencia de las bacterias. Esto no es
de microorganismos es la temperatura. Según
concordante con los resultados, ya que el
Ramos & Zuñiga (2008), los
Suelo A se encontraba en uso para el cultivo
microorganismos encontrados en los suelos
de Zamias y por ende debería tener mayor
de bosques presentan mejor desarrollo en
presencia de Hongos, a diferencia del Suelo B
temperaturas de 28 – 37 °C que a
que era un suelo no agrícola, perteneciente al
temperaturas bajas de 8 – 21 °C.
bosque en el cual se encontraban diferentes
Es relevante considerar el pH como factor que especies de plantas en él. Este resultado puede
determina la cantidad de microorganismos, deberse a la manipulación de la tierra
debido que los hongos se desarrollan mejor a encontrada en el Suelo A, ya que la plantación
pHs ácidos, mientras que las bacterias de Zamias en dicha zona fue reciente, y pudo
encontradas en los suelos son más neutrofilas alterar la microbiota del lugar. El Suelo B
(Ramos & Zuñiga, 2008). pudo presentar mayor cantidad de hongos
gracias a la variedad de especies que se
Tanto la humedad, temperatura y pH no
encontraban en el lugar de toma de la muestra
fueron considerados en este estudio, así que
analizada.
se recomienda en futuras repeticiones tener en
cuenta estos factores para analizar su Los resultados de la cantidad de
influencia en el crecimiento microbiano. microorganismos encontrados en la muestra
de suelo B corrobora que la cantidad de
Según diferentes autores (Alexander, 1977;
microorganismos de los bosques es mayor
Contreras, 2005; Beelen y Doelman, 1997;
que las de un cultivo por la relación de estos
Montaner, 2011) la cantidad de
con la cantidad de materia orgánica
microorganismos presentes en el suelo es
disponible en el suelo y factores como el pH,
variable según las condiciones del mismo,
humedad y temperatura (Evan, 1999;
cantidad de humedad y precipitación sobre
Rigobelis, 2004).
este, cantidad de materia orgánica, niveles
altitudinales de los sectores de suelo y nivel Número más probable
de contaminación. Por tanto, no se puede
Una técnica diferente para la determinación
determinar que siempre un suelo deba
del número de bacterias presentes en una
contener una mayor o menor cantidad de
muestra es el método del número más
bacterias o hongos, si no que se requiere
probable (NMP), que se basa en el hecho de
análisis de otras variables para obtener las
que cuanto mayor sea el número de bacterias
proporciones.
en una muestra mayor será la dilución
Por otro lado, según Silvila & Angulo (2006), necesaria para reducir la densidad hasta el
indican que hay un mayor número de punto en el cual no se desarrolle ninguna
bacterias en etapas de sucesión del descanso bacteria en los tubos de una serie de
en parcelas agrícolas a diferencia de los diluciones. El método de NMP es el más útil

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cuando los microorganismos por contar no detectadas en la turbidez, arrojando

crecen en medios solidos (como las bacterias resultados no exactos.
quimioautótrofas nitrificantes). También es
El grupo de bacterias coliformes totales
útil cuando se utiliza el crecimiento en un
comprende todos los bacilos Gram negativos
medio líquido diferencial para identificar el
aerobios o anaerobios facultativos, no
microorganismo (Tortora et. Al., 2007).
esporulados, que fermentan la lactosa con
Algunas de las ventajas del NMP son: producción de gas en un lapso máximo de 48
h. a 35°C ± 1ºC. En conjunto los coliformes
 La capacidad de estimar tamaños
están representados por cuatro géneros de la
poblacionales basados en atributos
familia Enterobacteriaceae: Citrobacter,
relacionados a un proceso
Enterobacter, Escherichia, y Klebsiella. Se
(selectividad); por ejemplo se puede
encuentran en el intestino del hombre y de los
determinar la densidad poblacional de
animales, y también en el suelo, las plantas y
organismos que pueden nodular
el agua. Se utilizan como indicadores de
leguminosas en una muestra de suelo
contaminación fecal y son buenos indicadores
usando el método de infección de
de un proceso o de un estado sanitario poco
plantas.
satisfactorio. Su facilidad de cultivo y de
 Provee una recuperación uniforme de
diferenciación los hace casi ideales como
las poblaciones microbianas de suelos
indicadores (Camacho et. Al., 2009). La
diversificados.
determinación de microorganismos
 Determina sólo organismos vivos y coliformes totales por el método del Número
activos metabólicamente. más Probable (NMP), se fundamenta en la
 Suele ser más rápido e igual de capacidad de este grupo microbiano de
confiable que los métodos fermentar la lactosa con producción de ácido
tradicionales de esparcimiento en y gas al incubarlos a 35°C ± 1°C durante 48
platos de cultivo, entre otros (Fuentes horas, utilizando un medio de cultivo que
& Massol-Deya, 2002). contenga sales biliares. En un recuento de
Los errores metodológicos en el proceso de coliformes es conveniente determinar la
NMP pueden provocar falsos positivos. incidencia de E. coli dado que es la especie
Según Soler (2006), algunos errores son la más indicativa de una contaminación fecal
adición incorrecta del volumen de muestra en (Cano, 2006).
los caldos BRILA o inocular más de 5µl en el Según la Tabla 5, para la muestra de Suelo A
microgoteo, contaminación de los medios por no hay crecimiento de microorganismos,
manipulación de diversas personas, uso de mientras que el Suelo B presentó un
medios en mal estado, errores en la aplicación crecimiento satisfactorio. Esto puede deberse
de la formula y errores en las diluciones a la ausencia de coliformes en la Muestra de
usadas para los medios. También, según Suelo A (Cabrera & García, 2006). Como se
ICMSF (2000), el total de células presentes en mencionó anteriormente, el suelo A fue
los medios no presentan una misma tasa de recientemente manipulado y alterado para la
crecimiento por lo que algunas no pueden ser siembra de Zamias, lo que pudo ocasionar un

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cambio en los microorganismos presentes. identificar la cantidad de microbios presentes

Errores en la metodología también pudieron en los ensayos (OMS, 2009).
ocasionar el no crecimiento de los
Una técnica diferente es la cámara de
microorganismos. Se sugiere realizar más
Neubauer, la cual consiste en una gruesa
análisis de los microorganismos presentes en
placa de Cristal con forma de portaobjetos, de
los suelos con valores de NMP, debido a que
nos 30x70mm y unos 4mm de grosor. Es una
regularmente se presentan en valores de UFC.
cámara simple, y la porción central donde se
Según la bibliografía (Soler, 2006), los
realiza el conteo se encuentra dividida en tres
valores de NMP pueden ser subjetivos ya que
partes. Requiere de al menos una dilución de
solo permite hacer una aproximación
10-6 con colorante de azul de metileno para
mediante la turbidez que presentan los
ser observada al microscopio y ser leída
medios, y no permite hacer un verdadero
posteriormente. Aquellas células teñidas de
conteo de las posible colonias que se
azul son inviables o muertas, mientras que las
encuentren en la muestra. Sin embargo, sigue
transparentes corresponderán a células
siendo un método accesible y fácil para el
viables o vivas. El conteo se realiza como se
análisis de microorganismos que puede ser
presenta en la Grafica 8. Sin embargo,
usado para futuros trabajos.
algunos errores son comunes en esta
Por otro lado, el microgoteo presentó mayor metodología, como uso de muestras con
cantidad de microorganismos en la muestra diferentes diluciones obteniendo muestras
de Suelo B. Según los resultados obtenidos, poco representativas, indebida manipulación
es concomitante con Alexander (1980), quien y cálculos erróneos (Celeromics b., 2008).
plantea que en suelos no usados para
Grafica 8. Recuento de microorganismos en
actividades agrícolas puede encontrarse una
cámara de Neubauer, según Celeromics b.
mayor cantidad de microorganismos. Se
(2008).
requieren más estudios para analizar la
cantidad de especies que se podrían encontrar
en las muestras y se sugiere realizar más
investigaciones con el uso del método del
microgoteo, ya que gran cantidad de
bibliografía solo usan los valores de UFC.
Otros métodos que pueden ser empleados
para el análisis de las muestras trabajadas son
el uso de Escalas de McFarland que consiste
en la mezcla de agua, cloruro de bario y ácido
sulfúrico que precipitan para dar una turbidez.
Los patrones de McFarland de turbidez se
utilizan en la preparación de suspensiones de
microorganismos y comparación de estos.
Según la cantidad de turbidez que dé en las
muestras, se compara con la escala para

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CONCLUSIONES
BIBLIOGRAFIA
Los métodos de conteo son una herramienta
muy usada para estimar la cantidad de Acuña, O., Peña, W., Serrano, E.,
microorganismos presentes en una muestra y Pocasangre, L., Rosales, F., Delgado, E.,
medir el grado de contaminación, sin Trejos, J. y Segura, A. (2006). La importancia
embargo, solo permite calcular cantidad pero de los microorganismos en la calidad y salud
no identificar los microbios presentes, por de los suelos. Trabajo expuesto en
ende lo mejor es acompañarlos con pruebas ACORBAT. Joinville-Santa Catrina. Brasil.
bioquímicas para reconocer las diferentes
Alexander, M. (1977). Introduction to soil
especies que se encuentren, analizar las
microbiology, 2nd edition. New York: John
causas de la presencia y buscar métodos de
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control si es necesario.
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Atlas, R. M. y Bartha, R. (2002). Ecología
microgoteo que el Suelo B presentó mayor
microbiana y Microbiología ambiental. 4ª
cantidad de microorganismos, sobre todo de
Edición. Pearson Educación. Madrid. Págs.
hongos, mohos y levaduras, a diferencia del
366-368, 522.
Suelo A que presentó menor cantidad de
microorganismos, predominando las AVS. Asociación Vida Sana. (2015).
bacterias. Sin embargo la cantidad de hongos, Microorganismos del suelo y biofertilización.
mohos, levaduras y bacterias pueden variar European Commision. Enviorenment Life
según el tipo de suelo estudiado y las Programme.
condiciones en las que este se encuentre.
Beelen, P. V. & Doelman, P. (1997).
Significance and application of microbial
Algunos métodos de conteo de
toxicity tests in assessing ecotoxicological
microorganismos pueden llegar a ser
risks of contaminants in soil and sediment.
subjetivos según el investigador, pero dan
Chemosphere 34 (3), 455–499.
aproximaciones de la cantidad de
microorganismos presentes. Cabrera, M. A. & García, O. E. (2006).
Identificación de microorganismos
Errores en la metodología pueden llevar a indicadores y determinación de puntos de
inconsistencias y lecturas incorrectas de los contaminación en aguas superficiales
datos, dando falsos positivos para el conteo. provenientes del cementerio Jardines del
Recuerdo ubicado en el norte de Bogotá.
Para las muestras de suelo es recomendable Pontificia Universidad Javeriana. Facultad de
realizar un análisis completo de suelo para Ciencias. Microbiologia Industrial. Bogotá
identificar los compuestos presentes y así, D.C.
con ayuda de pruebas bioquímicas, conocer
Camacho, A., Giles, M., Ortegón, A., Palao,
de primera mano los microorganismos
M., Serrano, B., & Velázquez, O. (2009).
presentes.

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ANEXOS
Anexo 1. Resultados para series de 3 tubos con diluciones de 10-1, 10-2 y 10-3. NMP por gramo con
un 95% de confianza, de ISP (2012).

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Anexo 2. Resultados de número más probable para series de diluciones en réplicas de cinco por
nivel de dilución, de Woomer (1994).

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