UNIVERSIDAD MICHOACANA DE SAN NICOLS DE HIDALGO

PROGRAMA INSTITUCIONAL DE MAESTRA EN CIENCIAS BIOLGICAS TEMTICA: BIOTECNOLOGA ALIMENTARIA

Tutor D.C. RAFAEL SALGADO GARCIGLIA Co- tutor D.C. Rodolfo Lpez Gmez Morelia, Michoacn; 30 de Octubre del 2011

RESUMEN El objetivo de la presente investigacin ser desarrollar un sistema eficiente para la generacin de plantas transgnica de zarzamora (Rubus fruticosus Cv. Tupi), realizando el establecimiento de un sistema ptimo de micropropagacin y transformacin gentica. La propagacin in vitro ser conseguida mediante la siembra de yemas apicales y axilares de esquejes de tallos jvenes, siguiendo mtodos de asepsia y cultivo in vitro ya reportados. La transformacin gentica se realizar utilizando callos de hoja y tallo de brotes micropropagados, mediante el sistema de transformacin por Agrobacterium tumefaciens. Se insertar el gen de la protena E3 de aguacate (defensina) utilizando el plsmido LBA4044, para generar plantas transgnicas. Las plantas transgnicas sern caracterizadas molecularmente para verificar su transformacin y se evaluar la actividad antifngica sometiendo a las plntulas a pruebas de resistencia al hongo (Colletotrichum acutatum). INTRODUCCIN El mejoramiento gentico por mtodos biotecnolgicos para la produccin de plantas transgnicas comnmente se asocia con la ingeniera gentica, sin embrago el significado es mucho ms amplio. Con la biotecnologa moderna la manipulacin gentica abarca desde el cultivo de protoplastos (clulas sin pared celular), clulas y tejidos in vitro hasta la manipulacin directa del ADN, que incluyen diferentes tcnicas como el cultivo y fusin de protoplastos, micropropagacin, seleccin in vitro frente a agentes biticos o abiticos adversos, cultivo de vulos fecundados u ovarios de embriones para el rescate de embriones e insercin de genes por transformacin gentica (Prez-Ponce, 1998). Entre las especies frutales con potencial de ser modificadas genticamente estn algunas variedades o cultivares de pltano, mango, aguacate, ciruela, mamey, papayo y zarzamora, entre otras muchas, por poseer caractersticas que requieren ser cambiadas o manipuladas como la resistencia a patgenos, diferentes tipos de estrs, calidad nutrimental y vida de anaquel (CamBiotec, 2003). En Mxico se ha identificado un gran nmero de enfermedades en las plantas causadas por hongos patgenos, que con diversa intensidad afectan a los diferentes cultivos. Entre las enfermedades ms importantes podemos mencionar la roya o chahuixtle del ciruelo, ocasionada por el hongo Tranzchelia discolor, la antracnosis del mango, ocasionada por el hongo Colletotrichum gloesporioides y la mancha foliar en el arroz, causada por el hongo Cercospora oryzae (Mendoza-Zamora, 1991). El control de este tipo de enfermedades se realiza mediante control qumico y control biolgico. El control qumico se realizar principalmente utilizando plaguicidas sintticos. Por diseo, los plaguicidas son sustancias txicas cuya aplicacin deber ser controlada (Cortinas et al., 1996). Se estima que si no se utilizaran los plaguicidas para detener el efecto que los patgenos tienen sobre los cultivos, habra prdidas de hasta un 45% en la cosecha total. An con el uso intensivo de fungicidas, las prdidas en las cosechas a causa de los hongos es un grave problema en el mbito mundial. De ah que cualquier metodologa que ayude en la resolucin de este problema puede tener repercusiones tanto alimenticias como econmicas, especialmente si se ayuda tambin a disminuir las fuertes cantidades de fungicidas sintticos aplicados en el campo (Herrera y Carsolio, 1998).

Las alternativas actuales del control de plagas, incluidas todas en el MIPE (Manejo integral de plagas y enfermedades), son el control cultural, el uso de plantas resistentes a las plagas, el control va uso de feromonas, atrayentes, repelentes, control microbiano, entre otros (Badii et al., 1996). Las tcnicas modernas de mejoramiento brindan la posibilidad de obtener plantas resistentes, un ejemplo de ello, es la transformacin gentica de plantas con resistencia a hongos, las cuales ahora expresan genes de enzimas u otras protenas y muestran resistencia a diversos hongos fitopatgenos. Se ha logrado la insercin de estos genes en plantas como tabaco, arroz, trigo, petunia, papa, etc. (Malik, 1999). Dentro de algunos cultivos importantes para Mxico, que requieren mejoramiento gentico, sobre todo para la generacin de plantas resistentes a hongos, est la zarzamora. E nuestro pas, la superficie dedicada al cultivo de zarzamora se ha disparado en los ltimos aos, en el ao 2007 dicha superficie abarcaba 3,270 hectreas y se registraba una produccin de 44,135 toneladas, mientras que en el 2008 la superficie ascendi a 8,193 hectreas y 118,421 toneladas de produccin. El mayor incremento en superficie cultivada se produjo en el estado de Michoacn (160%), el cual aporta el 95% de la superficie de cultivo de este producto. Estados Unidos es el principal mercado de exportacin para la zarzamora procedente de Mxico, seguido de Reino Unido y Blgica. Por la necesidad de encontrar nuevas alternativas para el mejoramiento de zarzamora, en el presente trabajo se propone la obtencin de plantas transgnicas de zarzamora (Rubus fruticosus L. Cv. Tupi) resistentes al hongo Colletotrichum acutatum, mediante la insercin del gene de la protena E3 de aguacate. ANTECEDENTES Defensinas de plantas Un grupo importante de pptidos antimicrobianos (PA) identificados en plantas estn estructuralmente relacionados con las defensinas de insectos y las de mamferos, por lo que se les ha nombrado "defensinas vegetales" (Broekaert et al., 1997). Considerando que la mayora de los PA de los animales tienen actividad antibacteriana, las defensinas de plantas tienen una alta actividad antifngica, que refleja la importancia relativa de los hongos frente a los patgenos bacterianos en el mundo vegetal (Hanckoc, 1999). Las defensinas de plantas (DP) tienen una importante similitud entre sus estructuras, las cuales estn generalmente compuestas por hlices- y lminas-. A diferencia de las tioninas, las DP tienen similitudes tanto a nivel de estructura secundaria como terciaria, adems de que muestran similitud con otras defensinas de insectos. Esta homologa entre las defensinas sugiere una alta conservacin durante la evolucin, lo que podra confirmar su importante papel en la defensa de las plantas contra patgenos (Franco y Pelegrini 2005). Estos PA pueden ser divididos en dos grupos: 1) las que inhiben el crecimiento de los hongos a travs de distorsiones morfolgicas, y 2) los que actan mediante interacciones electrostticas con las cargas negativas de la membrana provocando la formacin de poros (Hanckoc, 1999). Se han aislado DP en diversos tejidos, principalmente en los que se encuentran expuestos al contacto con los patgenos como las semillas, hojas, vainas, tubrculos, frutos, races y cortezas (Graca-Olmedo et al., 1998). Debido a esto, se ha estudiado la

funcin especfica de los PA en los diferentes rganos; por ejemplo, la defensina Rs-AFPs se encuentra expresndose en semillas de rbano cuando sta se encuentra perforada, ya sea por la geminacin o artificialmente, la cantidad de DP que se expresa en esa rea es suficiente para inhibir el crecimiento de hongos protegiendo la semilla y asegurando as la supervivencia de las plntulas (Broekaert et al., 1995). Protena E3 de aguacate Recientemente, Lpez-Gmez y colaboradores elaboraron un banco de ADNc de fruto y semilla de aguacate (comunicacin personal). A travs de tcnicas de secuenciacin identificaron dos clonas cuyas protenas putativas tienen similitud con protenas de defensa, una mostr identidad con la familia de PA tioninas. Mediante el uso de la herramienta BLAST del NCBI, encontraron que la secuencia E3 presenta el dominio caracterstico de las -thioninas (defensinas), con porcentajes de similitud superiores al 80%. Sin embargo, hasta el momento no se ha demostrado su expresin y actividad en plantas. Mtodos de transformacin gentica Existen diferentes mtodos empleados en la transformacin gentica de plantas basados en el sistema natural, o utilizando medios qumicos, fsicos o elctricos. Entre los ms comunes estn la transferencia directa de ADN, microinyeccin de ADN, mtodo de las fibras de silicn carbonadas, agitacin con microesferas de vidrio, electroporacin y vectores biolgicos. Tambin se han empleado otros mtodos alternativos de transferencia directa de ADN a clulas vegetales con diferentes grados de xito, entre los que se encuentran la incubacin con polietilenglicol y cloruro de calcio (CaCl2), la electroporacin y el bombardeo de micropartculas o llamada comnmente biobalstica o biolstica, siendo stos los ms usados. No obstante, no son los nicos, ya que existen otros como la fusin de liposomas a vacuolas o protoplastos, aunque stos no son tan utilizados debido a la comprobada poca eficacia y reproducibilidad, comparados con las ventajas que otros ofrecen (Brown, 1986). El comn denominador de estas tcnicas es que prescinden de sistemas biolgicos de transferencia (virus, bacterias, etc.) para introducir informacin gentica exgena a las clulas vegetales (Bravo, 1999). Agrobacterium tumefaciens Dentro de los mtodos de transformacin gentica utilizando vectores biolgicos, el principal es con Agrobacterium tumefaciens, bacteria capaz de transformar clulas vegetales debido a que posee un plsmido llamado Ti (de las siglas en ingls, tumor inductor), que es ADN circular extracromosmico, del cual se puede insertar un segmento del DNA que posee, hacia el genoma de la planta infectada (Zupan y Zambryski, 1995). Asimismo se pueden emplear virus como vectores de transformacin como los geminivirus (Vega y Rivera, 2001; Mor et al., 2002). El sistema de transformacin de plantas va Agrobacterium tumefaciens ha sido aplicado exitosamente en distintas plantas de dicotiledneas, como la papa, el tabaco, la soya, zanahoria, algodn y jitomate entre otros, lo que sugiere que dicho sistema es probablemente efectivo para cualquier especie vegetal (Potrykus, 1991).

Zarzamora Rubus fruticosus es una especie perteneciente a la familia de las rosceas. Es originaria de Europa, Asia y Norte de frica. Es una planta vivaz, leosa, invasiva, con largos tallos flexibles llenos de espinas. Las hojas son pinnadas y se dividen en foliolos ovales, dentados, pubescentes por la parte inferior; estn cubiertas de finas espinas, especialmente por la nervadura media. Las flores son de color blanco o rosado y se agrupan en racimos terminales. El fruto, denominado mora, es compuesto y globuloso. Los diversos colores que adopta determinan el grado de maduracin (verde, rojo y negro, respectivamente). La planta presenta al mismo tiempo la floracin y los diversos grados de maduracin del fruto, hecho inusual en otras plantas (CITA). Enfermedades en zarzamora Dentro de las plagas que atacan los cultivos de zarzamora se encuentran los fidos o pulgones Aphis sp, los cuales chupan gran cantidad de savia y transmiten virus, debilitan las plantas y propician la deformacin de los frutos. La araita roja Tetranychus sp, que ataca el follaje y se localizan en el envs de la hoja, Anatrepha sp., el barrenador del tallo Epialus sp. Dentro de las enfermedades fungosas se encuentra la pudricin del fruto causado por Botrytis cisnerea; la muerte descendente causada por Colletotrichum gloeosporioides y la marchitez por Verticilium sp. (Tamayo, 2001). Una de las ms importantes es la antracnosis, causado por el hongo Colletotrichum acutatum. Colletotrichum acutatum J.H. Simmonds La antracnosis es una de la enfermedades ms importantes en zarzamora y es causada por diversas especies de Colletotrichum, entre ellas C. acutatum (APS, 1998). C. acutatum es un hongo ascomiceto de la familia Phyllachoraceae (Sutton, 1992) y es el causal principal de esta enfermedad, que afecta hojas, tallos, flores y frutos especialmente cuando estos ltimos estn maduros. Las lesiones son hundidas de color oscuro, cuando ataca la corona del tallo, se presenta la muerte de las plantas. Bajo condiciones de humedad masas de micelio de color rosado, salmn o anaranjado cubren el centro de la lesin. JUSTIFICACIN Por la necesidad de encontrar nuevas alternativas para el mejoramiento de zarzamora, principalmente para la generacin de plantas que muestren resistencia a hongos, en el presente trabajo se propuso la obtencin de plantas transgnicas de zarzamora (Rubus fruticosus L. Cv. Tupi), mediante la insercin del gene de la protena E3 de aguacate, para evaluar su actividad antifngica. HIPTESIS Mediante la transformacin gentica en zarzamora (Rubus fruticosus L. Cv. Tupi) con el gene de la protena E3 de aguacate, se generarn plantas resistentes a hongos.

OBJETIVO GENERAL Establecer el sistema de transformacin gentica de zarzamora (Rubus fruticosus L. Cv. Tupi) con el gene de la protena E3 de aguacate para obtener plantas resistentes a hongos. Objetivos especificos 1. Establecer cultivos in vitro de pices de plntulas de zarzamora (Rubus fruticosus L. Cv. Tupi). Determinar las condiciones de cultivo para obtencin de callos y la regeneracin in vitro de zarzamora (organognesis o embriognesis somtica), variando dosis y tipos de reguladores de crecimiento. Establecer el mtodo de transformacin gentica de callos de zarzamora mediante la insercin del gene de la protena E3 con Agrobacterium tumefaciens. Caracterizar la transformacin gentica mediante pruebas moleculares y de resistencia al hongo Colletotrichum acutatum.

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MATERIALES Y MTODOS El presente trabajo se desarrollar en las instalaciones de los Lab. de Biotecnologa Vegetal y de Fisiologa Molecular de Frutos del Instituto de Investigaciones Qumico Biolgicas de la UMSNH, Ciudad Universitaria. Material biolgico Se utilizarn esquejes de tallos jvenes de zarzamora (Rubus fruticosus L. Cv. Tupi) de cultivos de la regin de Uruapan, Michoacn. Para la transformacin gentica se utilizar la cepa LBA4404 de Agrobacterium tumefaciens con el plsmido pCAMBIA que contiene el gen de seleccin nptII que da resistencia al antibitico kanamicina y el gen reportero uidA, que codifica para la expresin de la enzima -glucuronidasa, que da una coloracin azul al incubarse con el sustrato Poli X-Gluc (Ensayo GUS). La resiembra de esta bacteria se realizar en medio slido YM (Vincent, 1985) a 28C. A este plsmido se le clonar la construccin con el gen para la expresin de la protena E3 de aguacate. Establecimiento in vitro La asepsia de segmentos de tallos con yemas apicales o axilares se realizar siguiendo el mtodo convencional de esterilizacin superficial, que consiste en enjuague con detergente (15%, 15 min) y la incubacin en etanol (70%, 2 min) y en una solucin de hipoclorito de sodio comercial (1.2% de cloro activo, 20 min) conteniendo 1 g/L del fungicida Tecto 60 y Agrimicn 500 (0.5 g/L). Despus del tratamiento de asepsia, los segmentos de tallo (con yemas apicales o laterales) se sembrarn en medio MS (Murashige y Skoog, 1962) gelificado con phytagel

(3 g/L) con diferentes concentraciones de auxina/citocinina para la obtencin de tejidos desdiferenciados. Los tratamientos se basarn en reportes para la proliferacin de callos, brotes (organognesis) o embriones somticos (embriognesis somtica) (PONER CITAS DE ART. DE MICROP. DE ZARZAMORA) Transformacin con A. tumefaciens Co-Cultivo.-Segmentos de callos de brotes micropropagados (< 0.5 cm) de zarzamora se cultivarn en presencia de la bacteria en medio lquido YM, estableciendo las condiciones de la infeccin: cantidad de bacteria y tiempo del co-cultivo. Posteriormente los callos de zarzamora se incubarn en medio semislido (sin antibiticos) MS (sin reguladores de crecimiento) por 24 horas a 28C. Despus, stos se cultivarn en el medio MS inductor de brotes o de embriones somticos, conteniendo el antibitico eliminador de la bacteria (carbenicilina, 500 mg/L). Los cultivos se incubarn a 25C en condiciones de 2000 lux (16 h de fotoperodo) hasta conseguir la regeneracin. Seleccin de resistencia.- Para realizar la prueba de resistencia al antibitico de seleccin, los tejidos con reaccin hacia la formacin de brotes, se cultivarn en el medio de seleccin, con la cantidad de kanamicina (dosis inhibitoria) previamente determinada. Los brotes o embriones somticos que resistan esta dosis de antibitico se sometern a las pruebas de la verificacin de la transformacin gentica, realizando el ensayo de la glucuronidasa (Prueba de GUS). Caracterizacin molecular Ensayo de GUS.- Este anlisis revela la expresin del gen reportero uidA que codifica para esta enzima, que muestra su actividad hidrolizando el sustrato artificial X-Gluc (5bromo-4-cloro-3-indolil -D-glucurnido) generando un precipitado de color azul (ndigo) en los agregados celulares por los productos de reaccin (Vitha et al., 1995). En la solucin con X-Gluc se colocarn tejidos de hoja o brotes de explantes resistentes a kanamicina, sobre cajas de petri (1 mL aproximadamente para cada caja). Despus se colocarn a 37C por una hora, hasta que el tejido se tia de color azul. Pruebas de resistencia a hongos Por lo menos se seleccionarn 50 lneas transgnicas, las cuales sern micropropagadas para someter algunas de las plntulas a las pruebas de resistencia al hongo. Este ensayo consiste en desafiar a las plantas contra el hongo, bajo el sistema de cultivos de hojas in vitro, 10 L de esporas del hongo C. acutatum (1 x 103/ml) se colocarn en hojas heridas de las plntulas que despus se colocarn en cajas petri con Agar-Agua (6 g/L agar) en condiciones de asepsia. Se determinar el grado de infeccin sobre las hojas observando proliferacin de micelio, indicativo de la germinacin de esporas. Se utilizarn como control plantas no manipuladas y hojas no inoculadas. LITERATURA CITADA (FALTAN CITAS) Badii, M. H., Flores A. E., Foroughbakhlela R., Quiroz H. y Torres R. 1996. Ecologa del Manejo Integrado de Plagas (MIP) con Observaciones Sobre Control Microbiano de Insectos. Publicacin Universidad Autnoma de Nuevo Len Avances Recientes en la Biotecnologa de Bacillus thuringiensis. 21-49.

Broekaert Willem F., Terras Franky R. G., Cammue Bruno P. A., and Osborn Rupert W., 1995. Plant Defensins: Nove1 Antimicrobial Peptides as Components of the Host Defense System Plant Physiology, 108: 1353-1358. Broekaert, W. F., Cammue B. P. A., Debolle M. F. C., Thevissen K., Desamblanx G. W., Osborn R. W., 1997. Antimicrobial peptides from plants. Critical Reviews in Plant Sciences, 16:297323. Cortinas, N. C., Cristn F. A. y Loredo M. O. 1996. Los plaguicidas. Gaceta Ecolgica, 40: 62-70. Mxico INE-SEMARNAP. Franco O. L., Pelegrini P. B., 2005. Plant -thionins: Novel insights on the mechanism of action of a multi-functional class of defense proteins, The International Journal of Biochemistry & Cell Biology 37:22392253. Herrera, E. A. y Carsolio C. 1998. Contaminacin y Conservacin del Medio Ambiente. En Medio Ambiente, Control Biolgico y Hongos Parsitos. Avance y Perspectiva. CINVESTAV, 17: 195-204. Garca-Olmedo F., Rodrguez-Palenzuela P., Molina A., J. M. Alamillo, Lpez-Solanilla E., Berrocal-Lobo M., Poza-Carrin C., 2001. "Antibiotic activities of peptides, hydrogen peroxide and peroxynitrite in plant defence. FEBS Letters, 498:219-222. Mendoza-Zamora, C. 1991. Histopatologa y especies de Tranzschelia que atacan durazno y ciruelo en el estado de Mxico. Revista Mexicana de Fitopatologa, 10 (1): 3537. Murashige T. y Skoog F. 1962. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiol. Plantarum. 15:473-497. Vitha, S., Bene, K., Phillips, J.P., and Gartland, K.M.A. (1995). Histochemical GUS Analysis. In Agrobacterium Protocols, K.M.A. Gartland and M.R. Davey, eds (Totowa, NJ: Humana Press), pp. 185-193.

CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES

ACTIVIDAD Establecimiento de cultivos in vitro. Efecto de reguladores de crecimiento sobre la propagacin in vitro. Establecimiento del mtodo transformacin gentica. Caracterizacin transgnicas. de de

1er. SEM. X

2. SEM.

3er. SEM.

4. SEM.

plantas X X

Anlisis de resultados, escritura de tesis y examen final.