Uso de RNAi sobre el mRNA del

receptor a interleucina 7, como

alternativa de tratamiento para
leucemia linfoblástica aguda T

Edgardo Becerra Becerra

Universidad Autónoma de Querétaro
Facultad de química

Introducción

La leucemia linfoblástica aguda T (LLA-T) 2004). El caso contrario ocurre cuando

es un de cáncer hematológico agresivo, hay una activación constitutiva de las vías
derivado a partir de células T precursoras JAK y STAT mediante una mutación en el
en el timo. Representa del 10-15 % de los IL7R, lo cual ha sido implicado con el
casos en niños y 20-25 % en adultos. Los desarrollo de LLA (Zhang et al., 2012). La
buenos resultados en el tratamiento activación constitutiva de las vías JAK y
quimioterapéutico han incrementado STAT ocurre por las mutaciones de
dramáticamente a través de los años, sin ganancia de función en el IL7R. Dichas
embargo, esto se ha logrado mediante el mutaciones son somáticas y se presentan
uso intensivo de quimioterapéuticos que, alrededor del 10% de los casos de LLA-T
a su vez, dan lugar a severos efectos pediátrica (Shochat et al, 2011; Zenatti et
adversos de largo plazo (Pui y Jeha, al, 2011; Zhang et al, 2012).
2007). Por otro lado, se ha reportado que
hay recaídas en el 50% de casos en La mutación p.L242_L243ins-LSRC en
adultos y más del 30% en niños. Esto es IL7R es una inserción en el exón 6, lo cual
una premisa para el desarrollo de da lugar a la introducción de 4 residuos
tratamientos más eficientes, selectivos y de aminoácidos, siendo cisteína uno de
seguros para LLA-T. ellos, extracelulares en la región
transmembranal del IL7R. La presencia
El desarrollo de un tratamiento selectivo de estos los residuos de cisteína favorece
debe enfocarse en una vía en particular la formación de un puente disulfuro y la
y, a su vez, en una proteína. Las vías JAK activación, independiente de ligando, del
y STAT son importantes para el desarrollo IL-7R; lo cual induce la dimerización IL7R-
linfoide normal (Higuchi et al., 1997). Se IL7R y posterior activación de JAK1 con la
ha reportado que la inactivación de esta fosforilación de STAT5 (Shochat et al,
vía, por la mutación en componentes 2011; Zenatti et al, 2011; Zhang et al,
principales, como el receptor de 2012). La activación constitutiva de las
interleucina 7 (IL7R) da lugar a vías JAK y STAT dan lugar a la
inmunodeficiencia severa (Kalman et al, transformación celular linfoide y
tumorgénesis (Zennati et al, 2011). A
nivel molecular, la activación mutacional del IL7R, con el objetivo de disminuir su
de IL7R promueve la progresión del ciclo expresión e inhibir la activación
celular y la viabilidad mediante la constitutiva de las vías JAK y STAT y
activación de vías como PI3K/Akt y mTOR favorecer la sensibilidad a
(Barata et al, 2004). Además, ocurre un glucocorticoides de las células de LLA-T.
bloqueo en la apoptosis mediada por
fármacos glucocorticoides (Li et al, 2016).

En resumen, IL7R ha sido sugerido como

un potencial blanco molecular para el
tratamiento de LLA-T con mutaciones en
el IL7R. Una alternativa de tratamiento,
además del uso de anticuerpos anti IL7R,
es el uso de N-acetilcisteína (NAC). NAC
es un antioxidante con la capacidad de
reducir el puente disulfuro que favorece
la dimerización de IL7R. Además, NAC se
ha usado extensamente en la clínica y ha
demostrado tener un alto margen de
seguridad. Sin embargo, la eficacia del
tratamiento con NAC depende del grado
de estrés oxidadito en la célula. A mayor Figura 1. Dimerización del IL7R mediante
nivel de estrés oxidativo, menor será la residuos de cisteína introducidos
eficacia de NAC (Chen et al, 2011). Por mediante mutación y activación de las
otro lado, la NAC puede favorecer la vías JAK y STAT (Mansour et al, 2014).
reacción de glutationilación, en la que el
glutamato se une a residuos de cisteína Materiales y métodos
de distintas proteínas, modificando su
función (Nnenna y Melissa, 2012). Línea celular. Se utilizaron células DND-
41 (ATCC-ACC 525) de LLA-T las cuales
En el campo de la biología molecular, el tienen una mutación por inserción de 12
uso de RNAi ha emergido como una pb en el exón 6, dando lugar a la
interesante e importante estrategia de introducción de 4 aminoácidos
tratamiento mediante el uso dirigido de (p.L242_L243ins-LSRC). Se cultivarán en
siRNA que disminuye los niveles de una medio RPMI-1640 con 10% de suero fetal
proteína en específico, de la cual se bovino (SFB), estreptomicina y penicilina
requiere disminuir su actividad o su y se mantuvieron a 37 ºC y 5% de CO2.
expresión. La terapia génica mediante
siRNA se podrá utilizar en la clínica para Diseño de shRNA e infección. Se utilizó
tratar enfermedades que se consideran un vector levtiviral pGFP-C-shLenti
incurables, como el cáncer (Endoh et al, (OriGene, Rockville, MD, 20850 USA)
2009). En el presente trabajo, se para el silenciamiento del IL7R. Las
pretende utilizar siRNA dirigido al mRNA secuencias shRNa fueron:
IL7R: 5′-GCACTCATTAAATCACAAGAA-3′ espectrofotométricamente a 260nm. Se
Control: 5′-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3′ utilizaron 2g de RNA total y sesintetizó
el cDNA con el kit M-MLV de
Previamente, el exón 6 del IL7R se transcriptasa reversa (Thermofisher, Cat.
secuenció mediante el método de 203741). 20ng de cDNA se mezclaron con
SANGER. Las secuencias de shRNA-Il7R SYBR Green Master Mix y se llevó a cabo
se diseñaron en base a la secuencia de
la PCR. Se utilizó -actina como
inserción de 16pb en el exón 6 (+ 3pb
housekeeping y los primers para IL7R
extra) que representa la mutación
fueron:
responsable de la dimerización de 1L7R.
Las secuencias de shRNA-IL7R y control “forward”: 5′-AAGAAGGGAAGAGAGCATTGG-3′
se clonaron en e vector pGFP-C-shLenti. “reverse” 5′-GAAAAAACTCAAAATGCTGATGG-3′
El vector lentiviral recombinante se El volumen final de reacción fueron 50L
empacó en células HEK-293T. Las células y las condiciones fueron las siguientes:
DND-41 se sembraron en placas de desnaturalización a 90 ºC por 2 minutos,
cultivo p6 y se dejaron incubar durante seguido de 30 ciclos posteriores de
24h. Posteriormente, la transfección se desnaturalización a 94ºC por 30
llevó a cabo cuando las células segundos, el alineamiento a 61ºC por 30
alcanzaron el 70% de confluencia. El segundos y la extención a 72ºC por 30
medio de cultivo se reemplazó con medio segundos. Los niveles de expresión del
RMPI-1640 (ATCC, Cat. 30-2001) sin SFB. mRNA se reportaron como expresión
Las células fueron inoculadas con 4L de relativa normalizados a la expresión de -
una solución viral (1.5x109 Tu/mL) para la actina. Los productos de PCR fueron
infección en precencia de polibreno, para evaluados mediante electroforésis en gel
favorecer la introducción de los vectores de agarosa al 1.2% y los resultados
recombinantes lentivirales . Las células se fueron evaluados y analizados en un
incubaron 12 h con la solución viral para sistema de documentación del gel.
permitir la infección. Posteriormente, se
reemplazó el medio de cultivo por RPMI-
1640 con 10% de SFB y las células Western blot. Se llevó a cabo utilizando
siguieron cultivándose durante 2 los siguientes anticuerpos (obtenidos en
semanas previo a su uso. Los niveles de Sigma Aldrich): anti-IL7R, anti-pY-STAT5
expresión de GFP se analizaron con un (para evaluar la activación de la vía STAT
microscopio de flourescencia. La (Y694) ), ambos diluidos 1 en 1000. Como
eficiencia del shRNA se determinó control se usó el anticuerpo anti--actina
mediante RT-PCR y western blot. diluido 1 en 5000 y un anticuerpo
secundario anti conejo acoplado a la
enzima peroxidasa de rábano diluido 1
en 10,000.
Extracción de RNA y RT-PCR. El RNA se
extrajo de las células de cada grupo de
tratamiento mediante el kit de extracción
Evaluación de la sensibilizació de células
RNAiso™ plus (Takara, Japón. Cat 276-g).
DND-41 a dexametasona. Las células
La concentración de RNA se determinó
DND-41 (infectadas con shRNA-IL7R y
shRNA-control) se trataron con f) Determinar si el uso de shRNA
diferentes concentraciones de inhibe la activación constitutiva
dexametasona: 1x10-2 M, 1x10-3M y 1x10- de la vía STAT y compararlo con el
4
M por 8h y 24h. Después de cada lapso efecto producido por NAC.
de tratamiento, se lavaron las células con
PBS y se marcaron con el anticuerpo Resultados y discusión
annexina V acoplada al fluoróforo
isotiocianato de fluoreceína, detectando Secuenciación del exón 6 del IL7R. Se
las células apoptóticas mediante realizó la secuenciación del exón 6 del
citometría de flujo. IL7R, para confirmar la mutación en la
línea celular. El diseño del shRNA se
realizó conteniendo y flanqueando la
Tabla 1. Grupos de tratamiento para la inserción de 12pb del mRNA-IL7R.
evaluación de apoptosis.

Con este diseño de tratamientos se

pretende comprobar varios puntos:

a) Si el vector lentiviral shRNA- Figura 2. Dominios del IL7R. En el exón 6,

control tiene algún efecto sobre la correspondiente al dominio
viabilidad de las células DND-41. transmembranal, se ubica la mutación
b) Si las células DND-41 con la del tipo inserción p.L242_L243ins-LSRC,
mutación del IL7R son resistentes responsable de la aparición de 3
a dexametasona y compararlas aminoácidos extra.
con el efecto apoptótico
producido por NAC. Se realizó la secuenciación del exón 6 del
c) Si el uso de vectores lentivirales IL7R, donde se observa la insersión de
shRNA-control no modifica el 12pb correspondientes a los 4
efecto de NAC y de aminoácidos extra, 2 de los cuales son
dexametasona. cisteínas. Éstas, responsables del ennlace
d) Si el uso de shRNA sobre IL7R disulfuro responsable de la dimerización
tiene un efecto apoptótico per se IL7R-IL7R y posterior activación
y si sensibiliza a las células DND- constituviva de la vía JAK y STAT.
41 a dexametasona.
e) Determinar el efecto de NAC
sobre la inhibición de la
dimerización del IL7R y
compararlo con el uso de shRNA.
Figura 3. Secuenciación del gen IL7R. A)
Secuenciación SANGER de la mutación Figura 5. Expresión relativa de IL7R
tipo inserción p.L242_L243ins-LSRC del mRNA en células DND-41.
exón 6 en las células DND-41. B)
Secuenciacón del WT del exón 6. Se utilizó shRNA sobre el IL7R, tomando
como base la secuencia mutada del exón
6, de manera que sólo el mRNA del IL7R
mutado sea degradado por el shRNA.
Para determinar la eficacia del shRNA, se
realizó western blot y northern blot, para
determinar los niveles de proteína y
mRNA, respectivamente. En ambos casos
se observa una disminución significativa
de la expresión del IL7R, cuando se
infecta a las células con shRNA. Por otro
lado, se realizó western blot para
determinar los niveles de IL7R en su
Figura 4. Determinación de la eficacia de forma de monómero y de dímero, así
shRNA. A) Northern blot en gel de como los niveles de STAT fosforilado
agarosa, para determinación de la (para evaluar su activación constitutiva).
expresión del mRNA-IL7R. B) western En la figura 6 se puede apreciar que al
blot para la determinación de los niveles infectar a las células con shRNA-IL7R,
de proteína IL7R. disminuyen los niveles de IL7R, lo cual
inhibe la dimerización y, por lo tanto, los
niveles de STAT fosforilado. Estos
resultados son consistentes y
complementarios a los resultados de
western blot, northern blot y PCR, donde
se observa una disminución significativa
de los niveles de mRNA y proteína IL7R.
Cuando se trata a las células con NAC,
para romper el puente disulfuro Cys-Cys
(Mansour et al., 2014), se observa
también una disminución de los niveles
de IL7R dimerizado y de STAT fosforilado.
Sin embargo, se ve un mayor efecto al respuesta de dexametasona con 24h de
utilizar shRNA-IL7R, ya que el tratamiento.
tratamiento con NAC únicamente inhibe
la dimerización IL7R-IL7R y no su
expresión.
Las células con mutaciones en el IL7R, las
cuales favorecen su diemerización y
posterior activación de las vías JAK y
STAT, presentan resistencia a
dexametasona (Zenatti et al., 2011), lo
cual hace necesario que se utilicen dosis
elevadas de dexametasona para lograr
Figura 6. Western blot para evaluar los inducir apoptosis en este tipo de células.
niveles de IL7R y la STAT. Al disminuir la expresión de IL7R, con el
uso de shRNA-IL7R, podemos apreciar un
aumento significativo en la apoptosis
inducida por dexametasona, en las
diferentes concentraciones utilizadas, en
comparación con las células infectadas
con shRNA-control (figuras 7 y 8). Se
determinó una IC50 de 0.07M de
dexametasona en células infectadas con
shRNA (-) y una IC50 de 0.01M de
dexametasona en células infectadas con
shRNA-IL7R. Al disminuir la expresión de
IL7R y, su posterior dimerización,
disminuye la activación de vías de
Figura 7. Evaluación de apoptosis en una supervicencia y proliferación (Sochat et
curva concentración-respuesta de al., 2011), sensibilizando a las células a
dexametasona con 8h de tratamiento. dexametasona.

Figura 8. Figura 6. Evaluación de

apoptosis en una curva concentración-
 infectadas con shRNA-control,
remarcando la eficacia de silenciar el
mRNA de IL7R. Por otro lado, cuando se
utiliza únicamente shRNA-IL7R, se
obtiene un efecto apoptótico similar al
obtenido con los grupos de shRNA-IL7R +
NAC o dexametasona, indicando que no
es necesario el uso esos fármacos para
obtener un efecto apoptótico
significativo. El uso de shRNA-IL7R
favorece la disminución de los nieveles
de IL7R y su posterior dimerización y
activación de la vía STAT, lo cual induce
apoptosis en células DND-41 leucémicas.
Figura 9. Evaluación de apoptosis en
células DND-41, en distintas condiciones
de tratamiento farmacológico y con
shRNA.

Con el objetivo de determinar la mayor

eficacia de shRNA comparada NAC, se
realizaron los tratamientos indicados en
la tabla 1. En la figura 9 podemos
Conclusión
obervar que la viabilidad no se ve
comprometida en células sin ningún La infección con shRNA-IL7R a células
tratamiento y células tratadas con DND-41 con mutación en el gen del IL7R
shRNA-control. Por lo tanto, el shRNA favorece una disminución de la
control no tiene efecto significativo en la dimerización del receptor y de la
inducción de apoptosis y no compromete activación constitutiva de la vía STAT. Lo
la viabilidad celular. Los tratamientos con anterior da como resultado la inducción
NAC y con dexametasona en células de apoptosis, significativamente mayor al
infectadas y no infectadas con shRNA (-) control, sin tratatamiento farmacológico.
tuvieron el mismo efecto apoptótico, Por otro lado, el uso de shRNA-IL7R
pero significativamente mayor que los sensibiliza a las células DND-41 al efecto
controles. El tratamiento con NAC y de dexametasona, requiriéndose una
dexametason en células infectadas con menor concentración para inducir
shRNA-IL7R tuvieron un efecto apoptosis de manera significativamente
apoptótico significativamente mayor que superior al control y al tratamiento con
los controles y los tratamientos con NAC dexametasona en células no infectadas.
y dexametasona anteriores. El uso de Como perspectiva, se propone un estudio
shRNA-IL7R + NAC o dexametasona in vivo en ratones inoculados con células
favoreció un incremento de la inducción DND-41 y su posterior infección con
apoptosis de casi el doble comparado shRNA-IL7R para determinar su efecto a
con los tratamientos en células
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