Practica 5 Equipo 5

Introducción
La célula, en biología, es la unidad básica rodeada de membrana que contiene las

moléculas fundamentales de la vida y de la que están compuestos todos los seres
vivos. Una sola célula suele ser un organismo completo en sí mismo, como una
bacteria o una levadura. Otras células adquieren funciones especializadas a
medida que maduran. Estas células cooperan con otras células especializadas y
se convierten en los componentes básicos de grandes organismos multicelulares,
como los humanos y otros animales. (Cooper, JA 2023).
Como sucede dentro del cuerpo humano la célula contiene pequeños organelos
que llevan a cabo las diferentes funciones entre sí y que están relacionados
directamente con la membrana plasmática para el correcto funcionamiento de la
célula, si bien algunos de los organelos son visibles bajo el microscopio tales
como el núcleo, mitocondrias, los cloroplastos, existen técnicas para lograr
separar el resto de los organelos; El procedimiento ideal para separar dichas
estructuras subcelulares seria el que permitiera obtener los organelos deseados
sin alterar o modificar su morfología y/o función, pudiendo mencionarse como
ejemplo típico la "fracción sobrenadante" en algunos procedimientos de
centrifugación diferencial. (Guzman Garcia J. 1962).
La centrifugación es una técnica de separación por sedimentación, acelerada

gracias al uso de una fuerza centrífuga. Se trata de una operación habitual a nivel
industrial en distintas industrias como la industria alimentaria, farmacéutica y
biotecnológica, entre otras. En el contexto biotecnológico, la centrifugación se
aplica a la separación de células y micelios del medio de cultivo (recuperación
primaria), a la separación del líquido que contiene el compuesto de interés de los
sólidos generados por disrupción celular, o bien a la separación de mezclas de
partículas, células, orgánulos o moléculas. (Graham, 2001).
Objetivo General
 Distinguir núcleos, cloroplastos y mitocondrias mediante un método de

centrifugación diferencial para comprobar por microscopía la separación de
las fracciones puras de los diferentes orgánulos.
Objetivos específicos
 Desarrollar diferentes técnicas de homogenización de tejido fresco.
 Determinar las rpm para aislar núcleos, cloroplastos y mitocondrias de

diferentes tipos celulares.
 Identificar los organelos de las fracciones celulares por microscopía.

Análisis y Resultados
Fraccionamiento celular (muestras vegetales)
Homogenizado
1. Se pesaron aproximadamente 5 gramos de hoja de espinaca para
posteriormente macerarla en el mortero añadiendo 25 mL de Buffer Tris-HCl
0.02 M, 0.35 M NaCl a un pH de 7.5 hasta haber obtenido una suspensión
en un color verde intenso.
2. Se filtró el macerado usando una gasa y se repartió la solución en dos
tubos para centrifuga no sin antes haber sido balanceados ajustando el
peso de ambos.
3. Se centrifugaron ambos tubos durante 10 minutos a 2500 rpm.
4. Se conservó el sobrenadante, se tomo una pequeña muestra y se coloco
sobre un portaobjetos para posteriormente ser observada al microscopio
realizando antes un frotis y colorante azul de metileno.
Imagen 1: fotografía del procedimiento del Imagen 2: fotografía del procedimiento del
peso de la muestra (hojas de espinaca). balanceo de los tubos para centrifuga con las
muestras.
Imagen 3: fotografía de las muestras de los Imagen 4: fotografía de la muestra tomada

tubos contenidas con la mezcla preparada en del pellet vista en microscopio óptico con
el paso 1 luego de centrifugar y decantar el objetivo a 40X, donde podemos observar
sobrenadante. numerosos cloroplastos procedentes de la
hoja de espinaca.
1. Posteriormente después de preparar y haber observado la muestra teñida
con colorante se procedió a preparar dos microtubos con las siguientes
características: 200 uL de disolución de sacarosa al 60%, 150 uL de
sacarosa al 50%, 150% uL de sacarosa al 40%, 150 uL de sacarosa al
30%, 150 uL de sacarosa al 20% agregando todas las disoluciones con una
punta de micropipeta diferente para evitar mezclar y vertiendo la pared del
tubo y al final agregando una ultima capa de 200 uL del sobrenadante de la
centrifugación anterior.
2. Después, se llevó a centrifugar a 12000 rpm durante 20 min.
3. Tras haber transcurrido el tiempo necesario en la centrifuga se retiraron las
muestras, se hizo observación de la presencia de bandas y se extrajo una
muestra de cada capa para su posterior observación en microscopio.
Imagen 5: fotografía del procedimiento para Imagen 6: fotografía de la muestra

el balanceo del peso de los microtubos antes contenida en el microtubo 1 después de
de llevar a la centrifuga. centrifugar, podemos observar la división
por densidad en tres capas, el pellet verde
al fondo corresponde a los cloroplastos.
Imagen 7: fotografía de la muestra Imagen 8: fotografía tomada de la capa

contenida en el microtubo 2 después de superficial del microtubo 1 vista en
centrifugar, podemos observar la división microscopio óptico con objetivo a 40x.
por densidad en tres capas, el pellet verde al podemos observar posiblemente la
fondo corresponde a los cloroplastos. presencia mitocondrias y lisosomas.
Sesión 2
1.Se homogeneizaron 0.5g de hígado de pollo en un mortero previamente enfriado

con hielo hasta la obtención de una mezcla viscosa. A la mezcla se agregó 15 mL
de TEK (Tris D HCl 50 mM pH 7.5; EDTA 10 mM y KCl al 1.5%).
Imagen 9: fotografía de la muestra Imagen 10: fotografía de la muestra

contenida siendo pesada en la balanza homogeneizada en mortero a bajas
analítica. temperaturas.
2.Se filtró la suspensión con ayuda de varias capas de gasa previamente

humedecida con la solución a un tubo de centrífuga de 10 mL frío. Se centrifugó a
100 G (1000 rpm) para quitar residuos de tejido. Se separó el sobrenadante en un
tubo limpio.
Imagen 11: fotografía de la muestra filtrada

a través de gasas.
3. El sobrenadante volvió a centrifugarse a 700 G (2500 rpm) por 10 minutos. Se
pasó nuevamente el sobrenadante a un tubo limpio. Se conservó 1 mL del
sobrenadante para la centrifugación con el gradiente de sacarosa.
Imagen 12 : fotografía de la muestra siendo

llevada a peso equivalente para
posteriormente introducirla en la centrifuga.
4. Nuevamente se centrifugó a 1,500 G (3600 rpm) por 10 min. a 4ºC y se obtuvo

el precipitado, se observó lo siguiente; (oscuro D núcleos) y el sobrenadante (claro
D mitocondrias).
5. Se decantó el sobrenadante, guardó 1 mL y vertió en un tubo eppendorf
6. El pellet fue resuspendido con 1 mL de solución buffer y pasado a un microtubo.
Imagen 13: fotografía del pellet obtenido

tras la centrifugación.
7. Se centrifugaron ambos microtubos a 9300 rpm por 10 minutos más.
8. El precipitado se extrajo y se observaron (mitocondrias) y se diluyo con 1 mL

más de solución salina de NaCl 0.9%.
9. Se observó al microscopio tiñendo con azul de metileno y otra se tiñó con verde
Janus
Imagen 14: fotografía de la microcentrífuga

Imagen 15: fotografía del comparativo de
trabajando.
las muestras centrifugadas.
Conclusión
Es de suma importancia comprender como es que funcionan las diversas técnicas

de separación de los orgánulos celulares así como comprender las funciones que
cada uno lleva acabo
La técnica que se llevo acabo es la de centrifugación la cual nos

Bibliografía
Cooper, J. A. , Staehelin, . L. Andrew , Bernfield, . Merton R. , Slack, . Jonathan

M.W. , Alberts, . Bruce M. , Chow, . Christopher , Laskey, . Ronald A. , Lodish, .
Harvey F. , Cuffe, . Michael and Stein, . Wilfred D. (2023, September 26). cell.
Encyclopedia Britannica. https://www.britannica.com/science/cell-biology
Graham, D.J. (2001). Biological Centrifugation (1st ed.). Garland Science.

https://doi.org/10.1201/9781003076797
Gómez, V. M. V., Castillo, P. M. V., & Castillo, V. E. V. Membrana celular, organelos

y suborganelos. Introducción a la Biología celular humana, 78.
Morales-Gutiérrez, Ma. Emma, Gutiérrez-Espinosa, Ma. Alejandra, Santacruz-

Varela, Amalio, Ramírez-Ramírez, Iván, Pérez-Grajales, Mario, & González-
Hernández, Víctor A.. (2016). Microtécnica de enriquecimiento y extracción de
ADN de cloroplastos y mitocondrias. Agrociencia, 50(8), 977-988. Recuperado en
20 de Septiembre de 2023, de http://www.scielo.org.mx/scielo.php?
script=sci_arttext&pid=S1405-31952016000800977&lng=es&tlng=es.
SEPARACIÓN DE CÉLULAS. (s/f). Ehu.eus. Recuperado el 20 de septiembre de

2023, de https://www.ehu.eus/biofisica/juanma/mbb/pdf/separar_celulas.pdf

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La célula, en biología, es la unidad básica rodeada de membrana que contiene las

La centrifugación es una técnica de separación por sedimentación, acelerada

 Distinguir núcleos, cloroplastos y mitocondrias mediante un método de

 Desarrollar diferentes técnicas de homogenización de tejido fresco.

 Determinar las rpm para aislar núcleos, cloroplastos y mitocondrias de

 Identificar los organelos de las fracciones celulares por microscopía.

Imagen 3: fotografía de las muestras de los Imagen 4: fotografía de la muestra tomada

Imagen 5: fotografía del procedimiento para Imagen 6: fotografía de la muestra

Imagen 7: fotografía de la muestra Imagen 8: fotografía tomada de la capa

1.Se homogeneizaron 0.5g de hígado de pollo en un mortero previamente enfriado

Imagen 9: fotografía de la muestra Imagen 10: fotografía de la muestra

2.Se filtró la suspensión con ayuda de varias capas de gasa previamente

Imagen 11: fotografía de la muestra filtrada

Imagen 12 : fotografía de la muestra siendo

4. Nuevamente se centrifugó a 1,500 G (3600 rpm) por 10 min. a 4ºC y se obtuvo

Imagen 13: fotografía del pellet obtenido

8. El precipitado se extrajo y se observaron (mitocondrias) y se diluyo con 1 mL

Imagen 14: fotografía de la microcentrífuga

Es de suma importancia comprender como es que funcionan las diversas técnicas

La técnica que se llevo acabo es la de centrifugación la cual nos

Cooper, J. A. , Staehelin, . L. Andrew , Bernfield, . Merton R. , Slack, . Jonathan

Graham, D.J. (2001). Biological Centrifugation (1st ed.). Garland Science.

Gómez, V. M. V., Castillo, P. M. V., & Castillo, V. E. V. Membrana celular, organelos

Morales-Gutiérrez, Ma. Emma, Gutiérrez-Espinosa, Ma. Alejandra, Santacruz-

SEPARACIÓN DE CÉLULAS. (s/f). Ehu.eus. Recuperado el 20 de septiembre de

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