Informe de Diseño de Epitopes

En el aula se encuentra un archivo que presenta diferentes secuencias de aminoácidos. La idea es

que cada grupo seleccionen 2 se estas secuencias para realizar el informe. En el navegador están
las secuencias de las proteínas y los links a utilizar.

Lo primero es hacer un BLAST para identificar que secuencia aminoacídica y a que organismo
pertenece. Todas corresponden a proteínas relacionadas con la respuesta inmune.

La identidad se refiere al número de nucleótidos o aminoácidos (dependiendo de lo que se

compara) que son idénticos dentro de lo que está comparando. Lo que hace el BLAST es comparar
la secuencia problema con lo que existe en la base de datos (asociada al NCBI) y los compara.
Entonces lo compara con las proteínas que identifica que son parecidas y entrega un porcentaje de
identidad.

Cuando presenta un 100% de identidad indica que esa proteína efectivamente es la proteína
problema.

Cuando se quiere analizar y comparar funciones entre las proteínas, lo ideal es analizar la
secuencia de aminoácidos, ya que el código genético es degenerado y las proteínas son mas
conservadas. Así se pueden ver los dominios conservados y que tanto lo están entre las especies
cuando se haga alineamiento múltiple.

Este alineamiento se basa en comparar dos o más secuencias, se toman las dos secuencias
(alineamiento de pares) y se comienzan a ver donde hay regiones que sean idénticas o se parezcan
mucho entre sí. Se puede determinar si estas se parecen o no, esto se realiza una vez que se sabe
si estas secuencias tienen similitud o no.

Se hace un BLAST y se ven las especies y se seleccionan las mas parecidas y se hace un
alineamiento múltiple, para saber las regiones que son conservadas y son similares.

El valor E se relaciona con la homología y si esta fue o no al azar. El E debe ser lo más cercano a 0
y así nos indica que efectivamente lo que entrega es igual.
Las 2 secuencias que eligieron deben ser analizadas en BLAST para saber a qué proteína
corresponde y a que especie. A partir de esto hace un alineamiento múltiple en Clustal-Omega
para saber si esta proteína es conservada a nivel de especies. Esto es relevante para la producción
de anticuerpos, permite saber si el dominio conservado que presenta la proteína se conserva
también a lo largo de las diferentes especies.

1) BLAST  PROTEIN BLAST

Se seleccionan 8 secuencias de especies distintas, en donde 1 de ellas debe corresponder
a la proteína de interés.
Con el resumen grafico pueden ver como se realizó el alineamiento de la proteína con la
base de datos y que tan bueno fue. Los diferentes colores de las barras indican los
diferentes alineamientos que realizo. También indica si hay un dominio conservado que
le da la función biológica a la secuencia. Haciendo click ahí, envía a la base de datos de
dominios conservados del NCBI.
Nota: otra manera para saber a qué proteína corresponde es copiar el código GenBank y
pegarlo en la página del NCBI y en el menú desplegable seleccionar “protein” y de esta
manera se sabe qué tipo de proteína, la especie que corresponde, cuantos aminoácidos
tiene y sus características generales (debe estar en el informe).
2) CD-search  se sube la secuencia de interés
Otra manera de identificar si el dominio conservado es correcto, se puede ver en la página
CD search (que también es del NCBI), la cual me indica si es o no el mismo intervalo del
dominio conservado. Apretando el dominio sale la descripción del dominio y que función
cumple.
3) Clustal-Omega
Para realizar el alineamiento múltiple se seleccionan las secuencias que nos interesan.
Para eso en BLAST (protein Blast) demarcamos y seleccionamos 8 para hacer el
alineamiento (lo señalado en el paso 1). Si o si debe estar marcada la proteína de interés
que es la primera que sale y así poder alinearla y ver si esta conservada con las otras 7
especies distintas que se seleccionaron. Luego de seleccionarlas se descargan las
secuencias completas en formato FASTA. En el informe se debe indicar la secuencia
utilizaron para realizar el alineamiento múltiple, para ello deben indicar que secuencia
seleccionaron especificando código universal, el nombre de la proteína y la especie
Siguiente este ejemplo:
Para el alineamiento del componente de ATPasa duplicado YbhF de la bomba de eflujo tipo ABC se
seleccionaron las siguientes proteínas: WP_010946396.1 ABC transporter ATP-binding protein
[Legionella pneumophila]; WP_058479804.1 ABC transporter ATP-binding protein [Legionella
waltersii]; WP_035890689.1 ABC transporter ATP-binding protein [Legionella norrlandica];
WP_126339539.1 ABC transporter ATP-binding protein [Legionella spiritensis]; WP_039143566.1
ABC transporter ATP-binding protein [Gallibacterium anatis]; WP_066106663.1 ABC transporter
ATP-binding protein [Gallibacterium salpingitidis].
 Alineamiento en Clustal-Omega: El código que entrega es el código universal en donde ahí
pueden chequear a que proteína corresponde. Los “*” indican que hubo un 100% de
conservación, es decir, que todos los aminoácidos se conservaron bien. Cuando los
cambios son menores se representa con un “.”y cuando los aminoácidos tienen
características fisicoquímicas similares se representa con “ : ”
Cuando hay se señala “ ******************** ”me indican que puede ser un potencial
epitope porque se conserva muy bien entre las diferentes especies y se puede utilizar en la
producción de anticuerpo en diferentes especies de peces (que pueden utilizarse en la
acuicultura o con fines investigativos). IMPORTANTE INCLUIR ESTO COMO RESULTADO.
También pueden poner resultados de otros servidores (como los aprendidos en
bioinformática).
4) UniProtKB
Otra forma para saber que la proteína realmente corresponde a lo que me indica el BLAST
es con servidor UniprotKB.
Con los códigos de búsqueda que me entrega BLAST puedo realizar la búsqueda en
UniprotKB. Así se aseguran de que la proteína problema corresponde a la que dice BLAST.
UniprotKb también entrega información adicional sobre la función, la estructura,
ubicación, interacciones, etc. Se puede hacer una tabla con lo que muestran los diferentes
servidores, las funciones, los proceso en los que participa, localización, procesamiento, la
familia, los dominios, etc. Toda la información general que salga sobre la proteína. Esto se
pone en los resultados.
5) VaxinJen
Para analizar si la proteína problema tiene potencial antigénico o inmunogénico se realiza
en VaxinJen según un valor que entrega. Se utiliza la opción de bacterias, se necesita saber
si va a producir una respuesta inmune para la producción de anticuerpos específicos. Para
que la proteína tenga un potencial antigénico debe tener un valor mayor a 0,4. Si es mayor
quiere decir que tiene un potencial antigénico y se puede seguir trabajando con la
proteína, si no presenta un valor elevado no sirve para generar una respuesta inmune
estimulando la producción de anticuerpos.
6) Bcepred  Diseño de epítopes.
Una vez que se sabe que proteína es, la que función que cumple, cuantos aminoácidos y si
tiene o no capacidad antigénica. Se utilizan 2 servidores (Bcepred e Immnomedicine
Group) que permiten comparar entre ellos los epitopes. Para esto se utiliza el Bcepred, un
servidor que corresponde a un algoritmo que permite la producción de epitopes para
células B, según las características fisicoquímicas de la proteína o de las regiones que la
componen. En Bcepred se copia la secuencia de la proteína y se colocan las propiedades
fisicoquímicas a analizar (hidrofobicidad, flexibilidad, superficie expuesta y potencial
antigénico). Se muestran diferentes gráficos según las características fisicoquímicas que
tiene la proteína y la longitud que presenta en la secuencia. Al final de la página de
Bcepred, en azul se presentan los potenciales epitopes. Para seleccionar lo epitopes deben
estar en común con al menos 3 propiedades fisicoquímicas que se seleccionaron. Para
saber que el epitope que se seleccionó es antigénico se copia la región, se van a VaxinJen y
la copian, si da mayor a 0,4 es un potencial epitope.
7) Immnomedicine Group
 Permite ver las regiones posibles regiones epitopes asociados a MHC-1 y MHC-2. Para esto
se borra la secuencia modelo que aparece por defecto y se coloca la secuencia de la
proteína de interés y aparece una tabla con los epitopes seleccionado. Se puede colocar el
grafico que entrega los peaks en donde mayor peak mayor potencial antigénico. Posterior
a esto, se comparan los epitopes que encontró este servidor con los epitopes que
encontró el servidor Bcepred. Se hace una comparación entre dos servidores que utilizan
algoritmos diferentes para encontrar los mismos epitopes, esto certifica que el epitope
que se selecciona en ambos servidores es bueno. La comparación es manual y para esto,
seleccionan un epitope de la tabla de Inmunomedine Group y se dirigen a Bcepred y
utilizando el comando “Ctrl + F” y “Ctrl + V” pegan la secuencia seleccionada. El epitope
que se selecciona se debe repetir en las 3 propiedades fisicoquímicas y en el caso de no
encontrarlas, se puede acomodar la posición del epitope.
8) ToxinPred
Para saber si los epitopes son tóxicos o no, se utiliza el programa ToxinPred. Para esto, se
pega el epitope que seleccionaron se deja todo por defecto y arroja el resultado. Es
importante que el epitope no sea toxico para que se pueda utilizar en estudios posteriores
con animales.
9) ProtScale
El último programa para utilizar es el ProtScale, este servidor permite calcular y presentar
el perfil producido por los aminoácidos en una proteína seleccionada. Se pega la
secuencia de la proteína, se eligen 3 propiedades fisicoquímicas: hidrofobicidad,
accesibilidad de aminoácidos (% de residuos accesibles) y flexibilidad. Entrega peaks que
indica que tan flexible, hidrofóbica y accesible es la proteína. El grafico se utiliza como
resultado para determinar con exactitud los candidatos a epítopes de la secuencia de
interés.
 Donde haya mayor hidrofobicidad el peak será mayor e indica la ubicación en
donde están los aminoácidos con mayor hidrofobicidad. Como candidato a
epitopes se buscan secuencias que estén expuestas, por ende son polares. A
través de este peak indiquen los aminoácidos que son hidrofílicos, que son los de
interés porque están son los más expuestos.
 En % de residuos accesibles las regiones más expuestas son aquellas que
muestran un peak y estas son las de interés ya que pueden ser reconocidos
facilmente por anticuerpos. Se puede comparar la posición del epitope que se
seleccionó con las regiones menos hidrofóbicas y más accesibles para saber si es
un buen potencial epitope, y además, se pueden comparar los resultados con los
de Bcepred.
 La flexibilidad de las regiones, al igual que en los anteriores, son más que
presentan un peak más alto. Si el epitope es flexible va a existir menos
impedimento estérico y a su vez, está más expuesto en la estructura terciaria de la
proteína.
NOTA: Interesa que los epítopes sean flexibles, hidrofílicos y que sean accesibles para los
anticuerpos.
Resumen informe:

1) Seleccionar 2 secuencias
2) Identificar a que proteína corresponde y a que especie corresponde.
3) Hacer un alineamiento múltiple en Clustal-Omega para saber si tiene dominios conservados y
si es que se conservan en las diferentes especies. Permitiendo que la producción de epitopes
con este antígeno se pueda usar en diferentes especies.
4) Se debe ver si esta proteína tiene potencial antigénico para generar una respuesta inmune.
5) Se realiza un diseño de epitopes con Bcepred y Immnomedicine Group, seleccionar aquellos
epitopes similares entre estos dos programas. Ver si son antigénicos con VaxinJen y ver si son
tóxicos con Toxinpred y así seleccionar si estos epitopes son candidatos para la producción
de anticuerpos.
6) Con ProtScale permite saber si estos epitopes están expuestos, son hidrofílicos, son
flexibles, etc.

Introducción:

 Se basan en la inmunización
 Importancia de la prot’ en la producción de anticuerpos,
 describir las proteínas escogidas y su importancia
 En que está relacionada, etc.

Metodología: Describir los diferentes programas que utilizaron, con la bibliografía

correspondiente a estos servidores. Poner el código de las proteínas que utilizaron para el
alineamiento.

Resultados: Tablas, figuras obtenidas a través de los servidores. Seleccionar al menos 3 epitopes
que tengan mayor valor antigénico, etc.

Discusión: porque los candidatos a epitopes que se seleccionaron se pueden utilizar para la
producción de anticuerpos, se pueden utilizar?, porque son buenos con respecto a otros? Y si es
posible utilizarlos en diferentes especies animales. Porque es importante en peces? porque es
importante en chile?

Conclusiones más relevantes.

Entrega para el MARTES 5 DE OCTUBRE 23:59.