Peroducción de Kit Por Western Blot

EXPERIENCIAS PRACTICAS
EN LA PRODUCCION DEL
CISTIBLOT
Mblgo. Kelly Davelois Atac

Área de Investigación, Desarrollo
y Producción
ESCALABS e.i.r.l.
▪ Técnica Inmunológica : Western blot
▪ Aplicación práctica : CISTIBLOT
▪ Etapas del desarrollo del nuevo producto:
▪ 1. Investigación
▪ 2. Diseño y Desarrollo
▪ 3. Producción
INVESTIGACIÓN
. Antes de iniciar la producción de un reactivo
de diagnóstico se realiza todo un proceso
de Investigación.
. La Producción del Cistiblot se inicio con:
1. Una investigación epidemiológica
2. Investigación Científica
DIAGNOSTICO IMNUNOLOGICO DE LA
CISTICERCOSIS
PRUEBAS PARA LA DETECCION DE ANTICUERPOS
1. Reacción de Fijación del Complemento en LCR

(Weinsberg, 1909; Nieto, 1940). No sirve para suero y
da algunas reacciones cruzadas.
2. Hemaglutinación Indirecta.- Se usó hasta 1985.- Es

una técnica fácil de realizar, sin embargo, tiene baja
sensibilidad y da reacciones cruzadas.
3. Prueba de ELISA.- Desarrollada desde 1972, la cual

utiliza conjugados enzimáticos que amplifican la
reacción Ag-Ac, alcanzando mayor sensibilidad que
las técnicas tradicionales; sin embargo la E se
mantuvo baja por el uso de Ag. Totales que dan
reacciones cruzadas.
PROBLEMAS DE LA PRUEBA DE ELISA
▪ Mezcla de antígenos que produce

reacciones cruzadas.
▪ Solución es la Electroinmunotransferencia
(EITB) o Western Blot.
▪ Ante los resultados excelentes de la
Estandarización de la técnica de Western
blot para el diagnostico de la cisticercosis
humana, El Dr. Escalante tuvo la visión de
producir un kit de diagnóstico que pueda ser
utilizado por los diferentes laboratorios.
▪ Es así, como se inicia la elaboración del
DISEÑO Y DESARROLLO del producto
DISEÑO Y DESARROLLO DEL
CISTIBLOT
▪ Estudio de mercado
▪ Determinar el nombre del producto
▪ Definir las características del producto:
▪ Alta sensibilidad y especificidad
▪ Reproducibilidad
▪ Repetibilidad
▪ Rápida realización
▪ Estabilidad
▪ Bajo costo
Definición
▪ El CISTIBLOT se define como un reactivo
de diagnóstico que permite la detección de
anticuerpos específicos de tipo IgG en
suero o líquido cefalorraquídeo de pacientes
con Cisticercosis mediante la técnica de
Western blot.
PRUEBA PILOTO
▪ Se desarrollo un kit para la evaluación de 20
pruebas y fue enviado a las diferentes
empresas Certificadoras de Control de
Calidad:
▪ 1. Instituto Nacional de Salud
▪ 2. Universidad Cayetano Heredia
▪ 3. Instituto de Ciencias Neurológicas
“Oscar Trelles”
▪ 4. HYPATIA
EFICACIA DEL “CISTIBLOT” EN LA DETECCIÓN DE
ANTICUERPOS EN PACIENTES CON CISTICERCOSIS
(Kit para 20 pruebas)
1. EN EL LABORATORIO
* Sensibilidad : 91.4 %
* Especificidad : 100.00 %
* Reproducibilidad: : Buena (Igual patrón antigénico)
* Estabilidad reactivos : 6 meses en refrigeración.
2. EN CENTROS ACREDITADOS
2.1. En U. P. Cayetano Heredia
* Sensibilidad : 93 %
* Especificidad : 100 %
2.2. En el Instituto Nacional de Salud
* Especificidad : 100 %
2.3. En el Laboratorio Hypatia
* Especificidad : 100.00 %
* Reproducibilidad : Buena (Igual patrón antigénico)
* Estabilidad del kit : 8 meses en refrigeración
Estudio en campo
▪ Se trabajo en conjunto con Médicos
Neurólogos de la ciudad de Trujillo, para
evaluar la eficiencia del kit.
▪ Ante los excelentes resultados se inicio la
producción del CISTIBLOT
TRAMITES REGLAMENTARIOS
▪ La inscripción del producto en Indecopi, en

la Diremid y Digemid para el registro
sanitario correspondiente.
PRODUCCIÓN DEL CISTIBLOT
Infraestructura
▪ Escalabs cuenta con un laboratorio de
Producción, area de preparación de
reactivos y materia prima, un procesador de
agua ultra pura, zona de lavado y
esterilizacion
1. Selección de reactivos y
equipos
2. EXTRACCIÓN DE CISTICERCOS
Prueba de viabilidad: 1er. control
3. Obtención del Antígeno
. El antígeno utilizado es excreción-secreción
de Cysticercus cellulosae , es obtenido en
condiciones de esterilidad y almacenado a -
20 ºC.
▪ Para su uso practico y evitar su
contaminación es alicuotado en volumenes
de 500 uL y se le adiciona inhibidores de
proteasas.
4. Preparación antigénica
▪ Al antígeno obtenido se mide la concentración de
proteínas por el método calorimétrico de Bradford
▪ Se realiza mediante la técnica de SDS -PAGE en
condiciones de desnaturalización
5. Evaluación y Selección
antigénica
▪ Los diferentes
antígenos de C.
cellulosae, son
evaluados para
seleccionar el mejor
de acuerdo a las
características
determinadas por el
fabricante, utilizando
la técnica de
Western blot
▪ 2do CONTROL
6. Elaboración de las tiras
inmunorreactivas
▪ Proceso donde el antígeno seleccionado es procesado para
obtener las tiras inmunorreactivas, siguiendo los pasos :
▪ Electroforesis vertical:
Todos los reactivos son preparados en
esterilidad: 3er. Control
▪ Electroforesis transversal
▪ Durante el proceso se realiza un
monitoreo de los equipos : 4to Control
▪ Cortado de las membranas:
7. Revelado Enzimático
▪ Proceso que permite evaluar las tiras
elaboradas mediante la técnica de ELISA
▪ En esta etapa se clasifican los lotes de
acuerdo a las especificaciones
determinadas, pasando a cuarentena,
eliminación o almacenamiento.
▪ 5to Control
Principio de la Prueba
4.El complejo es visualizado por la
adicion del sustrato cromogenico, el
cual determina la aparicion de una
banda de color marron en la zona
donde se encuentra los antigenos.
3.Se incuba con un conjugado (IgG
antihumana con peroxidasa)para
formar un complejo constituido por
Ag-Ac.primario- Ac. Secundario
2.Las tiras con las 9 bandas se
incuban con el suero problema para
formar un complejo antigeno-
anticuerpo cuando el suero es
positivo.
1.Las glicoproteinas de la forma
larvaria de Taenia solium se
encuentran fijadas en las tiras de
nitrocelulosa.
8. Almacenamiento
▪ Todos las muestras

biológicas y algunos
insumos son
almacenados a -20
ºC
▪ Todos los reactivos
preparados, insumos
y los componente del
kit son almacenados
de 2 a 4 ºC
▪ Control
9. Preparación de sueros
controles
▪ Proceso que permite elaborar los diferentes
sueros controles.
▪ Los sueros son obtenidos en condiciones de
esterilidad, alicuotados y almacenados a -
20 ºC hasta su evaluación.
▪ La selección del suero control se realiza
después de su evaluación conjunta con los
otros componentes previamente evaluados.
6to Control
Control positivo
▪ El control positivo, es un suero
confirmado por observación
del quiste en el TAC, RMN
,con sintomatologia activa.
Reacciona con las 9 bandas
diagnosticas para Cisticercosis
▪ El suero humano se le ha
descartado Hepatitis y HIV.
▪ Se controla que durante su
almacenamiento no contenga
pelicula superficial, precipitado
Control negativo
▪ El suero control negativo
no reacciona con ninguna
de las bandas
diagnosticas.
▪ El suero humano se le ha
descartado Hepatitis y
HIV
▪ Estos sueros provienen
de recien nacidos
10. Esterilización
▪ Proceso que consiste en la esterilización de
los envases inmediatos del kit, de los
materiales requeridos para su evaluación y
empacado.
11. Pesado de los componentes
▪ Consiste en pesar los insumos en las
cantidades requeridas en el kit
12. Preparación de componentes
▪ Proceso que permite
preparar algunos de los
componentes del kit:
▪ 1. Solución de lavado: para
la prep. De reactivos y
lavados
▪ 2. Solución
detergente:permite bloquear
las zonas del papel que no
contiene antigenos y asi
evitar el bankground al
momento de incubar la tiras
con los anticuerpos.
▪ 3. Conjugado enzimático:
anticuerpo anti IgG humana
ligada a una enzima
peroxidasa,
13. Armado del kit
▪ Proceso que permite preparar el kit colocando
los diferentes componentes.
12. Evaluación final
▪ Luego de la preparación de los diferentes
componentes del kit, se realiza una
evaluación conjunta.
▪ 7mo. Control
13. Cuarentena
▪ Es el periodo de tiempo de almacenamiento
del producto terminado después del cual se
procede a un control microscópico y un
control de salida.
14. Selección de producto terminado
▪ Proceso que consiste en separar el
producto no conforme del conforme antes
de su despacho
conforme No conforme
15. Etiquetado y marcado
▪ Es este proceso se realiza el etiquetado de
las cajas ( envases mediatos) y de los
envases que contienen los componentes
▪ ( envases inmediatos )
16. Documentos del kit
▪ Se coloca la documentación necesaria del
kit, que consiste en:
▪ Inserto : Describe el procedimiento de
trabajo
▪ Hoja de resultados
▪ Informe de análisis
17. Inspección de salida
▪ El Jefe de Control de calidad hace una
inspección de salida del producto
terminado.
18. Despacho
▪ Etapa en el que se realiza el envío del
producto terminado al Distribuidor o destino
final.
CISTIBLOT

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1. Reacción de Fijación del Complemento en LCR

2. Hemaglutinación Indirecta.- Se usó hasta 1985.- Es

3. Prueba de ELISA.- Desarrollada desde 1972, la cual

▪ Mezcla de antígenos que produce

▪ La inscripción del producto en Indecopi, en

▪ Todos las muestras

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