Fundamento de Extraccion de Adn 2023

T. P.
Nº 4 - Biología Celular - 2023
EXTRACCIÓN DE ADN
.
La extracción consiste en el aislamiento y purificación de moléculas de ADN. Se
basa en las características fisicoquímicas de la molécula. El ADN está constituido por dos
cadenas de nucleótidos unidas entre sí formando una doble hélice. La unión de los
nucleótidos ocurre entre el grupo fosfato y el azúcar, mediante enlaces fosfodiéster,
dando lugar al esqueleto de la molécula. Las bases de cadenas opuestas se unen
mediante puentes de hidrógeno y mantienen estable la estructura helicoidal. Los grupos
fosfato están cargados negativamente y son polares, lo que le confiere al ADN una carga
neta negativa y lo hace altamente polar, características que son aprovechadas para su
extracción.
La extracción de ADN se realiza a pH alcalino, lo que favorece la estabilidad de la
molécula, a diferencia de la extracción de ARN. Los grupos fosfato tienen una fuerte
tendencia a repelerse, debido a su carga negativa, lo que permite disolver al ADN en
soluciones acuosas y formar una capa hidratante alrededor de la molécula. Pero, en
presencia de isopropanol se rompe la capa hidratante y quedan expuestos los grupos
fosfato, permitiendo su precipitación.
Existen diversos métodos para la extracción de ADN. La elección del mismo depende del
tipo de muestra a procesar y está condicionada a la disponibilidad de equipamiento y
reactivos para su realización. Por ejemplo, existen métodos automatizados que procesan
un lote dado de muestras o métodos manuales.
Uno de los métodos es la extracción orgánica con fenol-cloroformo, una técnica

ampliamente usada para la extracción de ADN. Se fundamenta en la lisis total de las
células y sus estructuras subcelulares mediante el empleo de diferentes buffers y
detergentes, y la posterior eliminación de las proteínas y componentes lipídicos con
solventes orgánicos. Se utiliza la fuerte tendencia hidrofílica de los grupos fosfato del ADN
para separarlo en medios acuosos, mientras que las proteínas y los lípidos se separan en
solventes orgánicos. La fase acuosa y la orgánica se separan por centrifugación lo que
permite aislar al ADN. Los solventes que se usan frecuentemente son el fenol, el
cloroformo y el alcohol isoamílico. Estos reactivos contaminan fácilmente el ADN, por lo
que se debe evitar acarrearlos en el proceso de purificación, cuando la fase acuosa es
transferida a un nuevo tubo.
Otro método de extracción de ADN es el salting-out. Permite que a partir de un lisado

celular se puedan separar las moléculas de proteínas y otros contaminantes
del ADN mediante la adición de altas concentraciones de sal que producen una
disminución de la solubilidad de las moléculas orgánicas en la fase acuosa.
Pasos para la extracción del ADN
1) Colecta de la muestra
La colecta de la muestra y su manejo adecuados son indispensables para una
extracción del ADN exitosa. Una colecta y manejo apropiado de la muestra permite
obtener ADN íntegro y sin contaminantes, los cuales pueden afectar la acción de las
enzimas durante el análisis del ADN, por ejemplo, en la reacción de PCR. Cada tejido
tiene sus consideraciones propias y siempre será necesario conocerlas. Si trabaja con
sangre, es importante considerar que la hemólisis libera hemoglobina, un contaminante e
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inhibidor de las reacciones enzimáticas. Por otra parte, durante la coagulación el

fibrinógeno se convierte en fibrina insoluble la cual tiene atrapa entre sus fibras proteínas,
agua y células, impidiendo una lisis apropiada. Los buffers empleados para la obtención
de sangre contienen reactivos que evitan la coagulación, como el EDTA, la heparina y el
citrato de sodio.
2) Homogeneización del tejido y lisis celular

La homogeneización mecánica o química, consiste en romper las uniones entre las
células para facilitar la interacción con las soluciones de lisis que ayudan a liberar el
material genético. Existen diferentes buffers de lisis celular, que pueden contener los
reactivos necesarios para generar las condiciones óptimas de trabajo. Uno de ellos es el
buffer de lisis que contiene Tris-HCl 10mM pH 7,5 - MgCl2 5mM – SDS 1%. Durante el
proceso de lisis las interacciones entre las moléculas que conforman la membrana celular
y nuclear se modifican o destruyen permitiendo que los ácidos nucleicos se liberen. Se
utilizan soluciones básicas, detergentes o agentes caotrópicos que permiten disolver la
membrana celular, así como inhibidores para inactivar las enzimas que degradan el ADN.
Muchas soluciones de lisis contienen también EDTA, que forma un complejo con los iones
de Mg2+ e impide el funcionamiento de las DNasas. Los componentes celulares no
solubles como el material fibroso y proteínas que permanecen en solución, se separan del
ADN por centrifugación.
3) Separación de proteínas y lípidos (salting-out)

En esta etapa se separa el ADN de las proteínas y lípidos. Al emplear NaCl 6 M,
se logra precipitar estos componentes luego de una centrifugación intensa. El ADN
permanece en el sobrenadante, el cual debe transferirse cuidadosamente a otro tubo para
los pasos posteriores de extracción.
4) Precipitación del ADN

Para ello, se adiciona isopropanol que rompe la capa hidratante alrededor de la
molécula y expone los grupos fosfatos. El ADN se repliega sobre si mismo haciéndose
insoluble. Un paso de centrifugación es importante para mantener al ADN en el fondo del
tubo mientras que el isopropanol es desechado. Los restos de isopropanol se eliminan
con un lavado con etanol al 70% y el remanente se elimina por evaporación.
5) Redisolución del ADN

Una vez que se ha eliminado el etanol, el paso siguiente es hidratar el ADN para
mantenerlo en solución. En el caso de emplear agua, el pH debe ser de 7 para permitir la
redisolución completa del ADN y evitar una hidrólisis ácida. Cuando se está disolviendo el
ADN es importante evitar el pipeteo y la agitación agresiva pues se pueden fragmentar
moléculas de alto peso molecular. Una opción que evita la fragmentación consiste en
incubar a 55 °C el ADN, 1 a 2 horas con agitación suave.
6) Comprobación de la integridad del ADN por electroforesis

La calidad del ADN, se evalúa mediante electroforesis en gel de agarosa. Si el ADN
está íntegro, se debe observar una banda estrecha cercana al pocillo de siembra del ADN
en el gel. Si está fragmentado, se observará una banda de más de un cm de ancho o un
sendero luminoso en la calle de la muestra. El ADN fragmentado dificulta la amplificación
de productos de PCR de alto peso molecular y afecta la reproducibilidad de las técnicas.
2
1 2 3 4 5 6 7
Figura 1. Gel de agarosa para visualizar la integridad del ADN.

Calle 1 marcador de peso molecular
Calles 2 y 3 vacíos
Calles 4 y 7 muestras con poca degradación
Calle 5 muestra degradada
Calle 6 muestra íntegra.
7) Almacenamiento del ADN

Una vez que el ADN ha sido analizado mediante electroforesis, una parte de la
muestra se puede almacenar a 4 °C para los análisis inmediatos y el material restante a -
20 °C o -80 °C, para una preservación por varios meses. En este último caso es
conveniente que el ADN se conserve en soluciones con baja concentración de sales para
inhibir la acción de DNasas contaminantes.
En el laboratorio se realizará el siguiente protocolo:
Toma de muestras y extracción de ADN a partir de hisopados de mucosa yugal
En las pericias de genética forense, las muestras de referencia, a diferencia de las

evidencias, son aquellas que se toman de individuos precisamente identificados.
Comúnmente, en el laboratorio se emplean hisopados bucales o sangre periférica. Los
hisopados bucales se obtienen con hisopos que se frotan en la mucosa bucal y se
conservan envueltos en papel de filtro luego de secarlos. La sangre periférica se obtiene
por lo general, por punción dactilar y se deposita en papel de filtro. Una vez que se secan,
se guardan. Este tipo de muestras contienen, por lo general, una mayor cantidad de ADN
que una evidencia. El método de extracción de ADN depende de la muestra de referencia
empleada.
Durante el TP, los alumnos se dividirán en grupos y se tomaran entre ellos muestras de
hisopado de mucosa yugal, de las cuales extraerán el ADN. El protocolo es muy sencillo:
3
1- Con un hisopo estéril fortar enérgicamente 15 veces por cada una de las mejillas
internas. El mismo se colocará en un tubo tipo eppendorf de 1,5 ml correctamente
identificado.
2- Luego procederán a agregar a cada tubo procurando no tocar el mismo, 500 ul del
reactivo de extracción.
3- Cada tubo se incuba a 70° C durante 30 minutos. Se retira del bloque térmico y se
deja que tome T° ambiente.
4- Luego, procederán a realizar una electroforesis en gel de agarosa al 1.5 %, al igual
que en el TP2, para observar el ADN extraído.
El reactivo usado es un buffer de lisis celular comercial, por lo tanto, no es posible

conocer sus componentes y su concentración. Se trata de una técnica rápida, manual y
directa para la extracción de ADN empleada en el ámbito forense para muestras de
referencia de hisopados de mucosa yugal. Es una técnica manual porque no requiere de
equipamiento automatizado para su empleo, y es directa porque el extracto obtenido
puede emplearse directamente y así como se obtiene, para la amplificación mediante
PCR de los SRTs de diferentes kits comerciales, sin la necesidad de otros pasos de
purificación o concentración. El extracto obtenido puede conservarse en heladera a 4° C
durante 4 años, según instrucciones del fabricante.
La calidad del ADN de las muestras puede observarse mediante una electroforesis
en geles de agarosa.

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Uno de los métodos es la extracción orgánica con fenol-cloroformo, una técnica

Otro método de extracción de ADN es el salting-out. Permite que a partir de un lisado

Pasos para la extracción del ADN

inhibidor de las reacciones enzimáticas. Por otra parte, durante la coagulación el

2) Homogeneización del tejido y lisis celular

3) Separación de proteínas y lípidos (salting-out)

4) Precipitación del ADN

5) Redisolución del ADN

6) Comprobación de la integridad del ADN por electroforesis

Figura 1. Gel de agarosa para visualizar la integridad del ADN.

7) Almacenamiento del ADN

En el laboratorio se realizará el siguiente protocolo:

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