Tesis Final Miguel A. Rivera Olarte

UNIVERSIDAD VERACRUZANA
FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS

DE ORIZABA
QUÍMICA INDUSTRIAL
TRABAJO RECEPCIONAL
“Evaluación de la actividad antifúngica de bacterias asociadas a

la corteza de árboles del bosque mesófilo de montaña contra el
hongo fitopatógeno Fusarium solani”
PRESENTA
Miguel Antonio Rivera Olarte
DIRECTOR INTERNO
Dra. Marina Guevara Valencia
DIRECTOR EXTERNO
Dra. Frédérique Reverchon
Orizaba, Ver. Enero, 2019

II
El presente trabajo de tesis se realizó en el laboratorio de Microbiología Ambiental,
perteneciente a la Red de Estudios Moleculares Avanzados (REMAV) del Clúster Científico y
Tecnológico BioMimic®, ubicado en el campus III, edificio B, del Instituto de
Ecología A.C. (INECOL) en la ciudad de Xalapa-Enríquez, del estado de Veracruz. La
dirección quedó a cargo de la Dra. Frédérique Reverchon.
Este trabajo de tesis se enmarca en el proyecto financiado por el Fondo Sectorial para la
Investigación, el Desarrollo y la Innovación Tecnológica Forestal CONAFOR (2015-C01-
265677), titulado “Diagnóstico y potencial mitigación del impacto negativo para los bosques y
la industria del aguacate en México por la invasión de los escarabajos ambrosiales Xyleborus
glabratus y Euwallacea sp. y los hongos altamente patogénicos que estos insectos transmiten”,
cuyo responsable técnico es el Dr. Andrés Lira Noriega de la Red de Estudios Moleculares
Avanzados del Instituto de Ecología A.C.
III
RECONOCIMIENTOS
A la Universidad Veracruzana que me abrió sus puertas y brindo las herramientas, conocimiento
y experiencias necesarias que me ayudaron a forjar de mi un profesionista.
A la Facultad de Ciencias Químicas que me brindo todas las enseñanzas necesarias para mi
carrera y mi vida profesional.
Al Instituto de Ecología A.C. por brindarme sus instalaciones y el material necesario, que me
permitió realizar el trabajo, así como permitirme adquirir nuevos conocimientos.
A la Dra. Frédérique Reverchon por la oportunidad que me brindo, para ser parte de su equipo
de trabajo y por proporcionarme todas las herramientas para realizar el trabajo, así mismo
agradezco todo el conocimiento que me brindo, su disponibilidad de tiempo y su paciencia
invertida que contribuyeron en mi formación y en la culminación del trabajo.
A la Dra. Marina Guevara Valencia por ser mi directora interna dentro de la Facultad de Ciencias
Químicas de la UV y así mismo por el acercamiento y la ayuda que me brindo, para poder
realizar el trabajo, en INECOL, A.C. y poder hacer la conexión con la Dra. Frédérique
Rverchon.
A la Dra. Ofelia Ferrera Rodríguez por su apoyo técnico y asesorías en el uso del equipo del
Laboratorio de Microbiología Ambiental, así mismo por las enseñanzas y consejos en diferentes
técnicas de laboratorio que me ayudaron a poder terminar y obtener mejores resultados en el
trabajo.
A la Dra. Mónica Ramírez Vázquez por brindarme su apoyo técnico, ayuda y el equipo
necesario, que me permitió procesar mis muestras para poder evaluar el daño en las hifas del
hongo, en el Laboratorio de Microscopia Óptica Avanzada.
Al M.C. José Martin Camas López por su apoyo técnico y su ayuda ofrecida, que me permitieron
tomar las Micrografías y evaluar el daño observado en las hifas del hongo, en el Microscopio
Electrónico de Barrido (SEM).
Al M.C. José Benjamín Rodríguez Haas por su ayuda, conocimiento y asesoría en los
experimentos moleculares.
IV
A la M.C. Nailea Báez Vallejo por la ayuda y los consejos que me brindo en el Laboratorio de
Microbiología Ambiental, que me permitieron realizar el trabajo.
V
AGRADECIMIENTOS
A mi familia, en especial a mis padres el Sr. Miguel Ángel Rivera Hernández y la Sra. Angélica
Olarte Hernández y a mis hermanos David y Saraí Guadalupe, que me brindaron todo su apoyo,
amor y todo su esfuerzo realizado, a lo largo de la carrera y en el trabajo, para que esta etapa de
mi vida se viera culminada, porque sin ustedes esto no hubiera sido posible muchas gracias
A mi compañera y amiga, Karla Ruth Bravo Castillo, por la ayuda y confianza que me brindo a
lo largo del trabajo y me permitieron culminar con el trabajo de laboratorio.
A Jonathan Samuel, Jhonatan Osmany, Alfonso, Karla, Verónica y Leidy, mis amigos y
compañeros que estuvieron conmigo apoyándome y aconsejándome, en el trascurso de la carrera
y del trabajo.
A mis compañeros del Laboratorio de Microbiología Ambiental, Itzel, Narda, Alicia, Iveth,
Monserrat, Mayra, Daniel, Gerardo, Oscar y Yonatan, por su ayuda, consejos y su amistad que
me ofrecieron a lo largo del trabajo.
A mi novia Odemaris que estuvo presente en la culminación de mi carrera y mi trabajo, así como
en la ayuda y el tiempo que estuvo conmigo a lo largo de carrera.
VI
ÍNDICE GENERAL
Página
ÍNDICE DE FIGURAS ............................................................................................................ IX
ÍNDICE DE TABLAS ................................................................................................................ X
ABREVIATURAS Y SÍMBOLOS .......................................................................................... XI
RESUMEN ............................................................................................................................. XIII
1. INTRODUCCIÓN ................................................................................................................... 1
2. MARCO TEÓRICO ................................................................................................................ 2
2.1 Bosque mesófilo de montaña (BMM) ............................................................................... 2
2.2 Complejo ambrosial Euwallacea sp. / F. euwallaceae...................................................... 3
2.3 Los microorganismos y el control biológico ..................................................................... 5
2.4 Comunidades bacterianas de corteza ................................................................................. 6
3. JUSTIFICACIÓN .................................................................................................................... 9
4. HIPÓTESIS Y OBJETIVOS ................................................................................................. 10
4.1 Hipótesis .......................................................................................................................... 10
4.2 Objetivo General.............................................................................................................. 10
4.3 Objetivos Específicos ...................................................................................................... 10
5. METODOLOGÍA.................................................................................................................. 11
5.1 Área de estudio y colecta de muestras de corteza ........................................................... 11
5.2 Reactivación de las cepas bacterianas ............................................................................. 12
5.3 Caracterización morfológica los aislados bacterianos ..................................................... 13
5.4 Evaluación in vitro de la actividad antifúngica ............................................................... 15
5.4.1 Evaluación in vitro de la actividad antifúngica mediante ensayos de antagonismo
directo ................................................................................................................................ 15
indirecto ............................................................................................................................. 16
5.5 Análisis estadísticos......................................................................................................... 17
5.6 Identificación molecular de los aislados bacterianos con actividad antifúngica
significativa ........................................................................................................................... 18
5.6.1 Extracción y amplificación de ADN de las cepas bacterianas con actividad
antifúngica ......................................................................................................................... 18
5.6.2 Análisis filogenéticos ................................................................................................ 20
5.7 Evaluación del daño causado en hifas mediante microscopía electrónica de barrido
(SEM) .................................................................................................................................... 20
VII
6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN ........................................................................................... 22
6.1 Caracterización morfológica de los aislados bacterianos ................................................ 22
6.2 Evaluación in vitro de la actividad antifúngica de los aislados bacterianos .................... 22
directo ................................................................................................................................ 22
indirecto ............................................................................................................................. 28
significativa ........................................................................................................................... 31
7. CONCLUSIONES ................................................................................................................. 45
8. BIBLIOGRAFÍA ................................................................................................................... 46
9. ANEXOS ............................................................................................................................... 53
VIII
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura Página
1 Localización del Santuario Bosque de Niebla en el municipio de Xalapa, 11
Veracruz.
2 Características morfológicas de las colonias bacterianas. 13
3 Diferentes formas y agrupamientos que presentan las bacterias. 14
4 Esquema para la evaluación in vitro de la actividad antifúngica de aislados 16
bacterianos mediante compuestos difusibles.
5 Evaluación in vitro de la actividad antifúngica de los aislados bacterianos 17
mediante compuestos volátiles, con el método de cajas invertidas selladas.
6 Aislados bacterianos (*) que presentaron un porcentaje de inhibición del 26
crecimiento micelial de F. solani arriba del 30% y presentaron una actividad
antifúngica significativa.
7 Porcentajes de inhibición del crecimiento micelial de F. solani por los 42 27
aislados bacterianos que presentaron un porcentaje de inhibición arriba del
10%.
8 Porcentajes de inhibición del crecimiento micelial de F. solani por los 16 30
aislados bacterianos que produjeron un efecto inhibitorio significativo.
9 Aislados bacterianos que presentaron una actividad antifúngica 31
significativa en contra del hongo F. solani en los ensayos de antagonismo
directo e indirecto.
10 Árbol filogenético construido a partir de las secuencias obtenidas para el 36
género Pseudomonas.
género Stenotrophomonas.
género Erwinia.
13 Árbol filogenético construido a partir de las secuencias obtenidas para los 39
géneros Yersinia y Rahnella.
14 Daños ocasionados en las hifas del hongo F. solani por el aislado bacteriano 42
CH4-3A.
15 Daños ocasionados en las hifas del hongo F. solani por el aislado bacteriano 42
CH4-3D.
16 Micrografía de las hifas de F. solani con tratamiento y sin tratamiento. 43
IX
ÍNDICE DE TABLAS
Tabla Página
1 Solución stock para la elaboración del medio M9. 12
2 Concentraciones y volúmenes de los reactivos de la reacción de PCR. 19
3 Número de aislados bacterianos obtenidos por cada especie de árboles 22
muestreados.
4 Crecimiento micelial de F. solani en contacto con los aislados bacterianos 23
obtenidos a partir de la corteza de cuatro especies de árboles del BMM.
5 Crecimiento micelial de F. solani en ensayos de antagonismo directo con los 28
aislados bacterianos obtenidos a partir de la corteza de cuatro especies de
árboles del BMM.
6 Identificación molecular de los aislados bacterianos con actividad 32
antagónica significativa contra el hongo F. solani y su secuencia más
cercana en la base de datos GenBank del NCBI "16S ribosomal RNA
(Bacteria and Archaea)”.
X
ABREVIATURAS Y SÍMBOLOS
Abreviaturas y símbolos Significado
BMM Bosque mesófilo de montaña

CONABIO Comisión Nacional para el Conocimiento y Uso de la
Biodiversidad
CONAFOR Comisión Nacional Forestal
FAO Organización de las Naciones Unidas para la Alimentación y
la Agricultura
FD Muerte regresiva por Fusarium (Fusarium Dieback)
INECOL Instituto de ecología
KSHB Escarabajo barrenador Kuroshio (Kuroshium Shot Hole
Borer)
LB Medio Luria-Bertani
M9 Medio de minerales M9
PDA Agar de papa y dextrosa
PSHB Escarabajo barrenador y polífago (Polyphagous Shot Hole
Borer)
SEM Microscopio electrónico de barrido
SENASICA Servicio Nacional de Sanidad, Inocuidad y Calidad
Agroalimentaria
UFC Unidad formadora de colonias
°C Grado Celsius
cm Centímetro
Da Dalton
g Gramos
h Horas
L Litro
mm Milímetro
min Minutos
XI
mL Mililitro
µL Microlitro
nm Nanómetro
ng Nanógramo
r.p.m Revoluciones por minuto
s Segundo
V Volts
XII
RESUMEN
El bosque mesófilo de montaña es un ecosistema con gran biodiversidad que brinda importantes
servicios ecosistémicos. Debe ser protegido de amenazas, como por ejemplo las plagas
forestales, uno de ellos son los complejos ambrosiales responsables de la muerte regresiva por
Fusarium, causada por los hongos Fusarium euwallaceae y F. kuroshium transportados por los
escarabajos barrenadores Euwallacea spp. nr. fornicatus. Por tal motivo, se ha buscado medidas
que permitan biocontrolar estos hongos fitopatógenos, mediante la utilización de
microorganismos antagónicos, para reducir el uso de pesticidas sintéticos. Aunque la corteza
constituye el punto de entrada de los hongos responsables de la muerte regresiva por Fusarium,
pocos estudios se han enfocado en la búsqueda de agentes de biocontrol asociados a la corteza
de árboles para mitigar enfermedades vegetales. En este trabajo, se aislaron bacterias asociadas
a la corteza de cuatro especies representativas del bosque mesófilo de montaña (Platanus
mexicana, Liquidambar styraciflua, Persea schiedeana y Nectandra salicifolia), en el Santuario
Bosque de Niebla de Xalapa, Veracruz, para evaluar su actividad antifúngica contra el hongo
Fusarium solani, el cual está filogenéticamente emparentado con los hongos causantes de la
muerte regresiva por Fusarium. Se obtuvieron 102 aislados bacterianos a partir de las muestras
colectadas. Evaluándose la actividad antifúngica de 75 de los aislados mediante ensayos de
antagonismo directo e indirecto in vitro. De los cuales, 42 aislados, pertenecientes a los géneros
Pseudomonas, Rahnella, Stenotrophomonas, Yersinia y Erwinia, inhibieron de manera
significativa el crecimiento de F. solani en ensayos de antagonismo directo y 16 aislados
inhibieron significativamente el crecimiento del hongo mediante la emisión de compuestos
volátiles. Pseudomonas, Rahnella y Stenotrophomonas ya se han reportado como agentes
potenciales de control biológico y como bacterias promotoras de crecimiento vegetal. El
potencial de nuestros aislados como agentes de biocontrol se confirmó mediante observación
con microscopía electrónica de barrido de las hifas de F. solani expuesto al aislado CH4-3A
(Pseudomonas sp.), donde registramos daños en las hifas del hongo y formación de
conglobaciones. Se espera a futuro caracterizar los compuestos producidos por el aislado
bacteriano y probar su actividad antifúngica contra los hongos responsables de la muerte
regresiva por Fusarium.
XIII
1. INTRODUCCIÓN
El bosque mesófilo de montaña (BMM) es un ecosistema de transición entre selvas húmedas y
bosques húmedos, que posee una gran diversidad vegetal y contribuye en proporcionar servicios
ambientales importantes. En México, se estima que menos del 1 % del territorio nacional está
cubierto por el BMM pero que este ecosistema contribuye con el 10% de endemismo de la
diversidad vegetal (García Franco et al., 2008). A pesar de su importante biodiversidad y de los
servicios ambientales que presta, este ecosistema se considera como un "hábitat en peligro de
extinción" (López-Pérez et al., 2011), debido a la fragmentación de su superficie y al cambio de
uso de suelo (Williams-Linera, 2002). Adicionalmente, algunas plagas y enfermedades también
pueden tener repercusiones negativas para el BMM (FAO, 2012). Un claro ejemplo son los
complejos ambrosiales Euwallacea spp. nr. fornicatus / Fusarium euwallaceae y F. kuroshium,
causantes de la enfermedad conocida como marchitez regresiva de Fusarium. Esta enfermedad
puede afectar un amplio rango de hospederos, entre ellos miembros de las familias Lauraceae,
Altingiaceae, Platanaceae, Sapindaceae, Fabaceae y Simaroubaceae (Eskalen et al., 2013),
varias de ellas representativas del BMM. Debido a la rápida propagación del escarabajo
barrenador polífago (PSHB por sus siglas en inglés) y del escarabajo barrenador Kuroshio
(KSHB por sus siglas en inglés), recientemente descubierto y detectado en Baja California,
México (García-Avila et al., 2016; Na et al., 2018), es preciso plantear estrategias que permitan
controlar o mitigar esta enfermedad, respetando el medio ambiente. Una alternativa es el control
biológico mediante la utilización de bacterias nativas antagónicas, que permitirían reducir los
riesgos inherentes al uso de algunos agroquímicos. Se ha documentado que las bacterias
producen sustancias solubles o volátiles con potencial actividad antifúngica, que podrían reducir
el crecimiento y el desarrollo de los hongos causantes de la marchitez por Fusarium. Aunque la
corteza constituye el punto de entrada de los hongos responsables de la muerte regresiva por
Fusarium, pocos estudios se han enfocado a la búsqueda de agentes de control biológico
asociados a la corteza de árboles, para mitigar enfermedades vegetales. El objetivo de este
trabajo fue buscar agentes potenciales de control biológico de F. euwallaceae y F. kuroshium,
utilizando Fusarium solani como organismo modelo por su cercanía filogenética, a partir de
aislados bacterianos obtenidos de la corteza de cuatro especies de árboles representativas del
BMM (Platanus mexicana Moric., Liquidambar styraciflua L., Persea schiedeana Nees y
Nectandra salicifolia (Kunth) Nees,).
1
2. MARCO TEÓRICO
2.1 Bosque mesófilo de montaña (BMM)
El BMM es un ecosistema compuesto por una vegetación compleja y heterogénea en términos
de estructura y composición, por ser un ecosistema de transición entre selvas húmedas y bosques
húmedos y ubicarse en diferentes zonas geográficas y ecológicas (García Franco et al., 2008).
El término BMM fue utilizado por primera vez por Faustino Miranda (1947) para referirse a un
tipo de bosque que se desarrolla en el mismo piso altitudinal que el encinar, pero ocupa las
barrancas, donde las condiciones de humedad son favorables. Posteriormente, el término fue
aceptado por Jerzy Rzedowski (1978), el cual lo acotó para un tipo de bosque con una
distribución limitada y fragmentada, debido a su presencia en zonas restringidas con un clima
húmedo de altura (Williams-Linera, 2015). Este ecosistema se caracteriza por presentar largos
periodos de neblina o nubosidad, característica por la cual se le ha llamado bosque de niebla o
“cloud forest” (Sánchez-Velásquez et al., 2008).
En México, el BMM está ligado a las condiciones particulares de altitud, humedad y

temperatura, por lo cual llega a ser el ecosistema más diverso del país por unidad de área. Si
bien no llega a cubrir más del 1% de todo el territorio, contribuye con el 10% de endemismo de
la diversidad vegetal (García Franco et al., 2008). Su distribución es discontinua en los sistemas
montañosos; se presenta en las laderas de la Sierra Madre Occidental, la Sierra Madre Oriental,
así como en ciertas zonas de Chiapas, Guerrero, Jalisco y Michoacán. Además de su gran
biodiversidad, contribuye en proporcionar servicios ambientales como la captura de carbono, la
disminución de la erosión, de deslaves y de inundaciones, y el mantenimiento de las corrientes
de agua (García Franco et al., 2008).
Las especies dominantes del BMM varían con las distintas áreas geográficas en las cuales se
encuentra, sin embargo, hay algunas especies que poseen una amplia distribución y
frecuentemente se encuentran en este tipo de bosques. Algunas familias que se encuentran
comúnmente en el BMM son las Araliaceae, Clusiaceae, Cyatheaceae, Juglandaceae, Lauraceae,
Melastomataceae, Polypodiaceae, Platanaceae, Altingiaceae, Fagaceae, Papaveraceae,
Myrsinaceae, entre otras (López-Pérez et al., 2011; Ortega & Castillo, 1996).
A pesar de su biodiversidad y de los servicios ambientales que presta, el BMM está sumamente
amenazado y presenta la tasa de deforestación más alta entre los bosques de tipo tropical. Se
2
estima que, en México, más del 50% de los bosques de niebla han desaparecido, por lo que
varios investigadores consideran a este ecosistema como un "hábitat en peligro de extinción"
(López-Pérez et al., 2011). Históricamente, Veracruz ha sido el cuarto estado del país con mayor
proporción de BMM, pero gran parte de la cobertura de este ecosistema ha sido convertida a
otros usos antropogénicos del suelo (sistemas agroforestales, pecuarios y urbanos) (Williams-
Linera, 2002). Dada la gran importancia de la diversidad vegetal y de los servicios ecosistémicos
prestados por el BMM, su conservación y restauración es de vital importancia (CONABIO,
2010).
2.2 Complejo ambrosial Euwallacea sp. / F. euwallaceae

En todo el mundo la invasión por patógenos extranjeros amenaza la diversidad biológica de
árboles y arbustos de bosques, generando una gran perturbación de los ecosistemas y un grave
impacto socioeconómico. Esta expansión se ve impulsada por gran medida por el comercio
internacional y el aumento sin precedentes de viajes. Muchas de estas invasiones involucran
organismos no nativos, que antes no se conocían o no eran un problema en su lugar de origen,
en consecuencia, no pudieron ser regulados, detectados y detenidos en los puntos de control
(Paap et al., 2018).
El escarabajo barrenador y polífago, conocido como PSHB por sus siglas en inglés (Euwallacea
sp.), es un escarabajo originario del sudeste de Asia, el cual forma interacciones simbióticas con
múltiples especies de hongos, entre ellos Fusarium euwallaceae, Graphium euwallaceae y
Paracremonium pembeum. Esta asociación provoca la enfermedad conocida como marchitez
regresiva por Fusarium o “Fusarium Dieback” (FD) en aguacate y otras plantas hospedantes en
California, EUA e Israel (Paap et al., 2018). Como es el caso de muchos escarabajos con hábitos
ambrosiales, las hembras de Euwallacea sp., llevan las esporas de su simbionte fúngico en un
par de micangios localizados en la parte posterior de la mandíbula, las cuales inoculan en la
madera de los árboles al construir galerías de ramificación en la xilema del hospedante (Coleman
et al., 2013). Tanto los adultos como las larvas se alimentan de este hongo, que se extiende desde
las galerías para atacar el tejido vascular del árbol, causando finalmente la muerte regresiva del
hospedante (Paap et al., 2018).
3
El primer registro de PSHB fue en Israel en 2009 (Mendel et al., 2012) seguido de California,
EUA, en 2012 (Eskalen et al., 2012 ), donde al inspeccionar nueve árboles de aguacate se
encontraron evidencias de síntomas alrededor del orificio de entrada/salida del escarabajo, una
decoloración húmeda de la corteza exterior, exudados en polvo blanco secos o en forma de
”volcanes de azúcar” y gomosis en el exterior de la corteza y/o excretas del insecto, seguida
por muerte regresiva por Fusarium (SENASICA, 2016 ). Euwallacea sp. y sus simbiontes
fúngicos se han relacionado con el barrenador de té (Euwallacea fornicatus) y su simbionte
Fusarium ambrosium, el cual causa graves daños en las ramas del té (Camelia sinensis) en Sri
Lanka e India (Eskalen et al., 2012; Freeman et al., 2012). Tanto F. ambrosium como F.
euwallaceae forman un linaje genealógico exclusivo dentro del Cód. 3 de Fusarium solani
(Freeman et al., 2013).
El PSHB, al ser una especie generalista, se denomina "polífaga", debido a la amplia gama de
especies de árboles que ataca, teniendo un impacto negativo en los árboles de paisajes urbanos,
bosques y de producción de fruta (Paap et al., 2018). Euwallacea sp. puede atacar a más de 300
especies de árboles, de las cuales por lo menos 110 son susceptibles a la muerte regresiva por
Fusarium (Kabashima y Dimson, 2014). En un estudio realizado en dos jardines botánicos
infestados, en California (EUA), se observaron 207 especies con signos de ataque por el PSHB,
pertenecientes a 58 familias, siendo las familias más susceptibles a la muerte regresiva por
Fusarium: Lauraceae, Altingiaceae, Platanaceae, Sapindaceae, Fabaceae y Simaroubaceae
(Eskalen et al., 2013). Dentro de las especies susceptibles se encuentran el aguacate y una amplia
variedad de árboles de paisajes urbanos y de áreas naturales (SENASICA, 2016). Debido a que
México es el mayor productor y exportador a nivel mundial de aguacate (Persea americana
Mill.) con aproximadamente el 65% de la producción (Guevara-Avendaño et al., 2018), y a que
posee una gran diversidad de especies de árboles reportadas como hospedantes reproductivos y
susceptibles, la rápida propagación del PSHB representa una nueva amenaza que podría llegar
a afectar económicamente a los sectores agrícolas y forestales de México. Recientemente, se ha
detectado en Baja California, México, una especie emparentada del PSHB, denominada
Kuroshium Shot Hole Borer (KSHB por sus siglas en inglés), también vector de un hongo
causante de la muerte regresiva por Fusarium (García-Ávila et al., 2016; Na et al., 2018). Por
tal motivo se debe llevar a cabo actividades de Vigilancia Epidemiológica Fitosanitaria para la
detección oportuna de los complejos ambrosiales Euwallacea spp. nr. fornicatus / F.
4
euwallaceae y F. kuroshium, como acciones de exploración, rutas de trampeo y rutas de
vigilancia, así como plantear estrategias que sean eficaces y respetuosas con el medio ambiente,
como el control biológico. Dichas estrategias podrían ser mediante la utilización de bacterias
naturales como biocontrol, que nos permitan reducir los riesgos que representan el uso de
algunos agroquímicos.
2.3 Los microorganismos y el control biológico

Las plantas sostienen un complejo micro-ecosistema, que alberga una gran variedad de bacterias
capaces de colonizar diferentes órganos y tejidos vegetales (Martins et al., 2013). La
colonización de las plantas por bacterias puede tener repercusiones sobre su salud, cuando las
plantas están colonizadas por microorganismos fitopatógenos o al contrario cuando están
colonizadas por bacterias que las protegen del ataque de dichos fitopatógenos. En los últimos
años, las bacterias que pueden fungir como agentes potenciales de control biológico han atraído
considerable atención académica por sus posibles aplicaciones biotecnológicas. Una de estas
posibles aplicaciones es el control biológico, que se ha definido como la supresión o la
mitigación de una población de organismo plaga utilizando otros organismos antagónicos (Syed
Ab Rahman et al., 2018).
Debido a la gran cantidad de patógenos de plantas a nivel mundial, que varían desde el viroide
más pequeño hasta patógenos más complejos como bacterias, hongos, omicetos y nematodos, y
a las pérdidas económicas que pueden ocasionar estos agentes patógenos, se ha buscado
desarrollar nuevas prácticas de manejo agrícola o forestal que incluyan alternativas a los
productos químicos usados para el control de plagas y enfermedades y minimicen efectos
adversos sobre la salud humana, el medio ambiente y los organismos vivos (Syed Ab Rahman
et al., 2018). Una de estas alternativas es el uso posible de microbios como una alternativa de
control biológico para el manejo de plagas y patógenos de plantas, a través de la selección de
microbios que pueden competir y/o antagonizar a los patógenos de las plantas.
Un ejemplo es el caso del estudio de bacterias asociadas con vides, las cuales se han estudiado
para determinar si podían controlar el patógeno responsable de la enfermedad de Pierce, causada
por la bacteria fitopatógena Xylella fastidiosa subsp. fastidiosa. Asimismo, el estudio de la
diversidad de las bacterias endófitas de la vid ha demostrado que los géneros bacterianos
5
Pseudomonas y Bacillus pueden actuar como agentes biológicos de supresión de la enfermedad,
estimulando el crecimiento y la salud de las plantas (Martins et al., 2013).
Estudios microbiológicos basados en técnicas de cultivo han revelado que incluso una sola cepa
bacteriana puede producir una amplia gama de metabolitos secundarios. Los metabolitos
secundarios no están directamente involucrados en el crecimiento, desarrollo o reproducción de
las bacterias productoras, sin embargo, pueden desempeñar funciones ecológicas importantes
en las interacciones con otros organismos (Tyc et al., 2017). Las bacterias producen una gran
cantidad de metabolitos secundarios que tienen muchas propiedades fisicoquímicas y biológicas
diferentes, distinguiéndose compuestos orgánicos volátiles y metabolitos solubles. Por un lado,
los compuestos orgánicos volátiles son moléculas pequeñas (<300 Da) que pertenecen a
diferentes clases químicas, que pueden evaporarse y difundirse fácilmente, y que juegan un
papel fundamental en la cooperación y la competencia entre microorganismos que no viven
directamente adyacentes entre sí. Por otro lado, los metabolitos secundarios solubles actúan en
distancias más cortas, pero generalmente exhiben actividades biológicas más fuertes como en el
caso de las toxinas o de los antibióticos (Tyc et al., 2017). Por lo tanto, las bacterias que
producen sustancias solubles o volátiles con actividad antifúngica son ideales para ser incluidas
en estrategias de control biológico de hongos fitopatógenos.
2.4 Comunidades bacterianas de corteza

Los microorganismos, en particular las bacterias, pueden colonizar microambientes específicos
de las plantas, como lo son la filósfera (región de las hojas y los tallos, colonizada por
microrganismos, a menudo llamados epífitos), la rizósfera (zona del suelo que se encuentra
adyacente a las raíces en la cual la microbiota se ve afectada por la presencia de raíces de plantas)
u otras partes como la endósfera. Las bacterias endófitas se caracterizan por vivir dentro de los
tejidos de las plantas sin causar enfermedades a sus hospedantes. Las bacterias asociadas a las
plantas tienen muchas funciones importantes en el metabolismo y la fisiología de sus
hospedantes ya que pueden: estimular el crecimiento de las plantas mediante la síntesis de
hormonas de crecimiento vegetal o enzimas, promover la resistencia de las plantas induciendo
mecanismos de defensa del hospedante, controlar enfermedades mediante la supresión de
patógenos, solubilizar fosfatos y producir sideróforos (Rezgui et al., 2016).
6
La composición de las comunidades bacterianas de la filósfera, donde se encuentra ubicada la
corteza, se ve afectada por factores como disponibilidad de inóculo, fenología y estado
nutricional de las plantas hospedantes, y condiciones fisicoquímicas del ambiente (Martins et
al., 2013). Un estudio reciente sobre bacterias que habitan en diferentes partes de la planta de la
vid ha revelado diferencias en la abundancia y la diversidad bacteriana entre muestras, donde el
suelo y la corteza albergan una mayor diversidad y riqueza de especies de bacterias que los
frutos (uvas) y las hojas (Martins et al., 2013). Sin embargo, los estudios enfocados a
caracterizar los microorganismos asociados a cortezas de árboles son escasos. Por lo tanto,
generar esta información es muy relevante.
A diferencia de los microambientes asociados con las hojas que se consideran generalmente
limitados por nutrimentos, la corteza, al contener almidón, azúcares y otros nutrimentos de la
exudación de savia a partir de la xilema, constituye un ambiente favorable para el
establecimiento de un mayor número y una mayor diversidad de bacterias. La abundancia de
algunos géneros bacterianos a nivel de la corteza, como Xylanimonas, Xanthobacter,
Xanthomonas y Cellulomonas, se ha asociado a ambientes con contenidos altos en celulosa y
xilano, como la madera podrida y la corteza (Martins et al., 2013). Algunos informes también
indican que, en muchos árboles, las bacterias que habitan en la madera están asociadas con su
descomposición (Bruez et al., 2015).
En un estudio posterior, con el fin de investigar la microbiota endófita asociada con tejidos de
madera no necróticos y necróticos de vides tunecinas maduras que mostraban síntomas foliares
de enfermedades conocidas como GTD (por sus siglas en inglés, Grapevine Trunk Diseases), se
identificaron varios aislados bacterianos asociados a ambos tipos de tejidos. Las bacterias más
abundantes fueron identificadas como Bacillus (12 cepas), Pantoea (4 cepas), Pseudomonas (2
cepas) y Curtobacterium (1 cepa), y fueron posteriormente examinadas por su potencial para
actuar como agentes de control biológico (Rezgui et al., 2016) contra Lasidiodiplodia
pseudotheobromae, Neofusicoccum parvum y Schizophyllum commune, patógenos involucrados
en los GTD. En particular, un aislado identificado como B. subtilis B6 demostró poder controlar
la necrosis causada por N. parvum in vivo.
Estos estudios han demostrado que diversas bacterias colonizan los tejidos de madera, y que
algunas pueden jugar un papel crucial en el control de enfermedades. Sin embargo, a pesar de
7
su importancia, existe poca información disponible sobre las comunidades bacterianas asociadas
a la corteza; por tal motivo, se deben llevar a cabo más investigaciones sobre la diversidad y la
posible actividad biológica de las bacterias epífitas de corteza.
8
3. JUSTIFICACIÓN
Las reservas forestales constituyen recursos naturales que generalmente se caracterizan por su
gran biodiversidad, pero que pueden ser amenazadas por distintas plagas y enfermedades. Un
ejemplo de enfermedad amenazando las áreas forestales en México son los complejos
ambrosiales responsables de la muerte regresiva por Fusarium (Eskalen et al., 2013). Esta
enfermedad ha sido tratada tradicionalmente mediante el uso de productos químicos, los cuales
pueden poseer efectos adversos en la salud humana, el medio ambiente y los organismos vivos.
Entre las alternativas de control o mitigación de enfermedades vegetales que sean más amigables
con el medio ambiente, el control biológico parece ser una opción. Entre los agentes promisorios
de control biológico se encuentran los microorganismos asociados a las plantas. Cada vez se
han encontrado más pruebas que demuestran el potencial de los microbiomas asociados a las
hojas y las raíces de éstas para aumentar la eficiencia y el rendimiento de las plantas en los
sistemas de cultivo (Syed Ab Rahman et al., 2018). Sin embargo, aun así, hay un gran campo
por explorar, como es el caso de microbiomas asociados a árboles silvestres, ya que existe poca
información disponible. En particular, se desconocen los microorganismos asociados a la
corteza de estos árboles. Ya que la corteza constituye una barrera de protección contra la entrada
de escarabajos barrenadores, y por lo tanto contra los hongos fitopatógenos que transportan, es
importante generar información acerca de la diversidad de microorganismos que habitan en ella
y que podrían tener actividad antifúngica. Por tal motivo, se deben llevar a cabo más
investigaciones sobre la potencial actividad biológica de las bacterias epífitas de corteza para
poder identificar posibles candidatos en la búsqueda de agentes de biocontrol de la muerte
regresiva por Fusarium. En este proyecto, se enfocará en la búsqueda de posibles agentes de
biocontrol a partir de bacterias aisladas de la corteza de árboles de las siguientes especies:
Platanus mexicana Moric., Liquidambar styraciflua L., Persea schiedeana Nees y Nectandra
salicifolia (Kunth) Nees, presentes en el Santuario Bosque de Niebla de Xalapa, Veracruz.
9
4. HIPÓTESIS Y OBJETIVOS
4.1 Hipótesis
Algunas bacterias obtenidas de la corteza de las especies P. mexicana, L. styraciflua, P.
schiedeana y N. salicifolia pueden poseer actividad antifúngica contra el hongo
Fusarium solani.
4.2 Objetivo General

Evaluar la actividad antifúngica de aislados bacterianos obtenidos a partir de la corteza
de cuatro especies vegetales del bosque mesófilo de montaña contra el hongo F. solani.
4.3 Objetivos Específicos

• Obtener una colección de aislados bacterianos a partir de la corteza de P. mexicana, L.
styraciflua, P. schiedeana y N. salicifolia
• Evaluar la actividad antifúngica de los aislados bacterianos obtenidos en contra del
hongo fitopatógeno F. solani a través de ensayos de antagonismo directo e indirecto.
• Identificar molecularmente los aislados bacterianos que presenten actividad antifúngica
significativa.
• Documentar mediante técnicas de microscopía el daño causado por las bacterias de
corteza en las hifas del hongo fitopatógeno F. solani.
10
5. METODOLOGÍA
5.1 Área de estudio y colecta de muestras de corteza
Las bacterias caracterizadas en este estudio se aislaron a partir de muestras de corteza de árboles
pertenecientes a cuatro especies representativas del BMM, ubicados en el Santuario Bosque de
Niebla, el cual forma parte del Área Natural Protegida Estatal del Parque Francisco Javier
Clavijero del Instituto de Ecología A.C. (INECOL) (Figura 1).
a)
b)
Figura 1. Localización del Santuario Bosque de Niebla en el municipio de Xalapa, Veracruz.

a) Ubicación del Estado de Veracruz, México. b) Delimitación del Santuario del Bosque
de Niebla. Lira-Noriega, en Morteo-Zavaleta (2017).
Se seleccionaron 4 especies de estudio: L. styraciflua (Liquidámbar), P. mexicana (Haya), P.
schiedeana (Chinini) y N. salicifolia (Nectandra). El liquidámbar pertenece a la familia
Altingiaceae, el haya a la familia Platanaceae y el chinini y nectandra pertenecen a la familia
Lauraceae. Para la toma de muestras de corteza, se seleccionaron tres árboles por cada una de
las especies de estudio. Por cada árbol seleccionado, se colectaron al menos 3 pedazos de corteza
de aproximadamente 4 cm2 de diferentes puntos del tronco. Las muestras se colectaron con un
cuchillo previamente desinfectado con etanol al 70%. Todas las muestras se colocaron en bolsas
Ziploc® y se mantuvieron en condiciones frías (4°C) hasta ser procesadas en el laboratorio.
El aislamiento de las bacterias de corteza se realizó a partir de 1 g de muestra compuesta por

fragmentos de la corteza provenientes de diferentes puntos de muestreo en cada individuo. El
gramo de muestra se colocó en una proporción 1:10 de buffer de fosfatos (0.9%) estéril y se
11
prepararon diluciones seriales; se sembraron diluciones de 1×10-3 a 1×10-6 en cajas Petri con
medio LB (Luria-Bertani). Se determinó el número de Unidades Formadoras de Colonias (UFC)
mediante la técnica de conteo en placa, para estimar la abundancia de bacterias cultivables en
las muestras.
Posteriormente se tomaron muestras de colonias con características macroscópicas diferentes y

se aislaron las bacterias por agotamiento por estría, después se resembraron los aislados
bacterianos seleccionados para generar biomasa, para proceder a su conservación en medio LB
líquido con 30% de glicerol, en tubos Eppendorf ® de 1.5 mL.
5.2 Reactivación de las cepas bacterianas

Los aislados bacterianos crio-preservados en medio LB con 30% de glicerol fueron reactivados
colocando 10 µL de las muestras en cajas Petri con medio LB sólido. Las cajas inoculadas fueron
incubadas durante 24 a 48 h a 28°C. Después de este periodo, los aislados que presentaron
crecimiento fueron resembrados con un asa bacteriológica en medio de cultivo LB sólido,
utilizando el método de agotamiento por estría e incubándolos durante 24 a 48 h a una
temperatura de 28°C, con el fin de comprobar su pureza. Después de 24 h, se verificó si los
aislados no presentaban señales de posible contaminación mediante tinción de Gram. En el caso
de los aislados bacterianos que no fueran puros, se prosiguió con un nuevo paso de purificación
mediante resiembras continuas en cajas de Petri con medio LB, con el método de agotamiento
por estría, hasta obtener aislados puros. En caso de no obtener una separación de los aislados
bacterianos, se recurrió a utilizar otro medio de cultivo, el medio M9 con 10% de LB (Tabla 1),
para lograr separar y purificar los aislados bacterianos.
Tabla 1. Solución stock para la elaboración del medio M9.
Solución salina M9 (10X)

Na2HPO4-2H2O 72.2 g/L
KH2PO4 30 g/L
NaCl 5 g/L
NH4Cl 5 g/L
12
5.3 Caracterización morfológica los aislados bacterianos
Se describieron morfológicamente los aislados bacterianos purificados, con ayuda de un
microscopio estereoscópico (Leica EZ4), tomando en cuenta los siguientes criterios: forma de
la colonia; borde de la colonia; elevación de la colonia; superficie de la colonia; consistencia
(cremosa, membranosa, chiclosa, mucosa); color de la colonia; textura bajo luz transmitida y
luz reflejada (opaca, brillante, traslucida), conforme a lo descrito en la Figura 2.
Figura 2. Características morfológicas de las colonias bacterianas (Stanchi et al., 2007).
Posteriormente, se resembró nuevamente una colonia aislada de cada aislado en una nueva caja
de Petri con medio LB, para generar biomasa y proceder a la descripción de la morfología celular
de las bacterias, realizando una tinción de Gram. Esta tinción tiene como principio fundamental
poder diferenciar las bacterias Gram positivas de las Gram negativas, de acuerdo con el color
que logren fijar las células. Además, la tinción de Gram permite apreciar la forma de las células
bacterianas.
Para realizar la tinción de Gram, se colocó la muestra bacteriana tomada con un palillo de dientes
estéril sobre un portaobjeto y posteriormente se agregó una gota de solución salina estéril al 5%,
para luego fijar mediante calor la muestra. Para llevar a cabo la tinción de Gram se colocaron
los reactivos en el siguiente orden: cristal violeta por 1 min, seguido por lugol por 1 min, alcohol
acetona por 30 s y por último fuscina por 1 min; entre cada reactivo, se realizó un lavado con
agua destilada. Una vez seca la preparación, se observó en un microscopio óptico (Leica
DM750) para comprobar la pureza del aislado bacteriano y describir las características
13
morfológicas celulares de la bacteria, tomando en cuenta la clasificación presentada en la Figura
3.
Figura 3. Diferentes formas y agrupamientos que presentan las bacterias (Imagen obtenida de
Wikimedia Commons).
Una vez comprobada la pureza del aislado bacteriano, se realizó una resiembra para la obtención
de biomasa, para proceder a la conservación del aislado bacteriano en medio LB líquido con
30% de glicerol, en tubos Eppendorf® de 1.5 mL. Los tubos inoculados con los aislados
bacterianos puros se incubaron en un ThermoMixer® (Eppendorf) a 28°C durante 30 min,
agitando a una velocidad de 600 r.p.m. Posteriormente, se incubaron a temperatura ambiente
durante 30 min, se refrigeraron durante 24 h a 4°C y se conservaron a -20°C.
14
5.4 Evaluación in vitro de la actividad antifúngica
directo
Antes de llevar a cabo los ensayos de antagonismo in vitro, se sembró la cepa de Fusarium
solani la cual fue proporcionada por el Dr. Mauricio Luna-Rodríguez (Universidad
Veracruzana). Esta cepa fue aislada de Capsicum annum L., una especie afectada por la
marchitez por Fusarium (Sundaramoorthy et al., 2012). El hongo F. solani fue seleccionado
para este estudio, de acuerdo con los reportes que muestran su relación filogenéticamente
estrecha con F. euwallaceae (O´Donnell et al., 2015). Para la siembra de F. solani, se tomó
cajas de Petri con medio de cultivo Papa Dextrosa Agar (PDA). Las cajas Petri con el hongo se
incubaron durante siete días a una temperatura de 28°C para permitir el crecimiento adecuado
del hongo. A la par, los aislados bacterianos a evaluar fueron resembrados en cajas de Petri con
medio de cultivo LB sólido e incubados 48 h antes de montar el ensayo, a una temperatura de
28°C.
Para montar los ensayos de antagonismo directo, se tomó un disco de micelio de 5 mm de

diámetro desde el borde del crecimiento micelial del hongo con un sacabocado estéril y se
colocó en el centro de una caja Petri con medio PDA. Se tomaron los aislados bacterianos de
una sola colonia con un palillo de dientes estéril y se inocularon a una distancia de 2 cm del
disco micelial, como se observa en la Figura 4. Se analizaron tres aislados bacterianos diferentes
por caja. Además, se utilizó la inoculación simulada con un palillo de dientes estéril como
control en cada placa experimental. Los ensayos de antagonismo se llevaron a cabo por
triplicado. Las cajas inoculadas se incubaron a 28ºC y, después de 7 días, se midió el crecimiento
radial del micelio hacia los tratamientos bacterianos y el control. El porcentaje de inhibición del
crecimiento micelial se calculó usando la fórmula informada por Idris et al., (2007).
(𝑹 − 𝒓)
% 𝒅𝒆 𝒊𝒏𝒉𝒊𝒃𝒊𝒄𝒊ó𝒏 = 𝒙 𝟏𝟎𝟎
𝑹
Donde R es el radio de crecimiento fúngico desde el centro de la placa hacia el control, y r es el

radio de crecimiento fúngico hacia el tratamiento bacteriano.
15
Figura 4. Esquema para la evaluación in
vitro de la actividad antifúngica de
aislados bacterianos mediante
compuestos difusibles (Guevara-
Avendaño et al., 2018).

indirecto
Antes de llevar a cabo los ensayos de antagonismo indirecto in vitro, el hongo F. solani se
sembró en cajas de Petri con medio de cultivo PDA. Las cajas Petri con el hongo se incubaron
durante siete días a una temperatura de 28°C para permitir el crecimiento adecuado del hongo.
A la par, los aislados bacterianos que presentaron una actividad antifúngica significativa en los
ensayos de antagonismo directo fueron resembrados en cajas de Petri con medio de cultivo LB
sólido e incubados a 48 h antes de montar el ensayo a una temperatura de 28°C.
Para montar los ensayos de antagonismo indirecto, se sembró el hongo en una tapa de una caja
Petri con medio de cultivo PDA, tomando un disco de micelio de 5 mm de diámetro en el borde
del crecimiento micelial del hongo con sacabocado estéril; el disco de micelio se colocó en el
centro de una caja Petri con medio PDA. En otra tapa de caja de Petri con medio LB, se
inocularon los aislados bacterianos que presentaron una actividad antifúngica significativa,
mediante estriado por asa bacteriológica (un aislado por caja). Posteriormente, se colocaron las
dos tapas una frente a la otra y se sellaron con Parafilm® (Cruz-Martín et al., 2012). Para el
control, se ocupó una caja de Petri con PDA inoculada con el hongo y se colocó frente una caja
de Petri con medio LB sin inóculo bacteriano. Los ensayos de antagonismo se llevaron a cabo
por triplicado. Las placas se incubaron a 28°C durante 7 días (Figura 5). Posteriormente se
16
obtuvo el porcentaje de inhibición del crecimiento micelial usando la fórmula informada por
Idris et al., (2007) la cual fue modificada.
(𝑫 − 𝒅)
% 𝒅𝒆 𝒊𝒏𝒉𝒊𝒃𝒊𝒄𝒊ó𝒏 = 𝒙 𝟏𝟎𝟎
𝑫
Donde D es el diámetro de crecimiento fúngico sin el aislado bacteriano (Control), y d es el

diámetro de crecimiento fúngico en presencia del aislado bacteriano.
Figura 5. Evaluación in vitro de la

actividad antifúngica de los
aislados bacterianos mediante
compuestos volátiles, con el
método de cajas invertidas
selladas.
5.5 Análisis estadísticos

Para analizar los datos obtenidos en los ensayos de antagonismo tanto directo como indirecto,
se compararon las mediciones de crecimiento micelial de F. solani en presencia de los aislados
bacterianos con sus respectivos controles. Se realizó una prueba de Kolmogorov-Smirnov para
verificar la normalidad de los datos obtenidos para cada uno de los tratamientos con su
respectivo control, en el programa IBM SPSS Statistics 25. Se llevó a cabo una prueba de
Levene para verificar la igualdad de varianzas y posteriormente, de acuerdo con el resultado
arrojado en la prueba de Levene, se realizó una prueba de t de Student. Todas las pruebas se
consideraron significativas con valores de P≤0.05.
17
significativa
5.6.1 Extracción y amplificación de ADN de las cepas bacterianas con actividad antifúngica
Se realizó la extracción de ADN genómico de los aislados bacterianos que presentaron una
actividad antifúngica significativa, basado en los resultados obtenidos durante las pruebas in
vitro de los ensayos de antagonismo directo. Para la extracción de ADN bacteriano, se utilizó el
kit de extracción DNeasy® Blood and Tissue de Qiagen, siguiendo cada uno de los pasos
descritos en el protocolo del kit. Una vez terminado el proceso de extracción de ADN, se
comprobó el éxito de la extracción por medio de electroforesis, corriendo las muestras en un gel
de agarosa al 1%, a 85 V durante 35 min, posteriormente, se midió la concentración y calidad
de ADN con ayuda de un espectrofotómetro (NanoDrop 2000c).
Posteriormente, se prosiguió con la amplificación de la región 16S ADN ribosomal, a partir del
ADN extraído de las aislados bacteriano que presentaron una actividad antifúngica significativa,
mediante la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) en una reacción total de 50 μL,
colocando un volumen de 1 μL de ADN a una concentración de 25 ng/μLy 49 μL de la mezcla
de reacción en tubos Eppendorf® de 0.2 mL (Tabla 2). A la par de las reacciones se elaboró un
control negativo, utilizando 1 μL de agua ultra-pura estéril en lugar de la muestra de ADN. La
reacción de PCR se realizó utilizando los primers universales 27F (forward)
(AGAGTTTGATCMTGGCTCAG) y 1492R (reverse) (CGGTTACCTTGTTACGACTT),
siguiendo el protocolo reportado en Pajares et al., (2012).
18
Tabla 2. Concentraciones y volúmenes de los reactivos de la reacción de PCR.
Reactivos Concentración Volumen (µL)

H2O ultra pura (MiliQ) - 38.15
Buffer taq 10X 5
MgCl2 50 mM 2.5
Primer 27F 0.4 µM 1
Primer 1492R 0.4 µM 1
Dntp 10 mM 1
Taq polimerasa 2.5 unidades 0.35
ADN extraído 25 ng/µL 1
Total - 50
Las muestras de ADN se amplificaron en un termociclador (Mastercycler, Nexus gradient) con

los siguientes parámetros: una desnaturalización inicial a 94°C durante 2 min, seguido de 35
ciclos que consisten en una desnaturalización a 94°C por 1 min, hibridación a 53°C por 1 min y
una extensión a 72°C durante 2 min, y una extensión final a 72°C durante 3 min. El éxito de la
amplificación se verificó mediante electroforesis en gel de agarosa, corriendo un gel a una
concentración de 1% durante 45 min a 85 V.
Las muestras de ADN amplificadas fueron purificadas con el kit Wizard® SV Gel and PCR
Clean-Up System de Promega, siguiendo las instrucciones del protocolo. Posteriormente se
verificó el éxito de la purificación con un gel de agarosa al 1%, a 85 V durante 35 min y se
corroboró que las concentraciones de ADN obtenidas eran mayores 30 ng/μL. Para aquellas que
no llegaron a dar la concentración requerida, se realizó una concentración de la muestra de ADN
obtenida en un equipo concentrador. Las lecturas de concentración de ADN se realizaron con el
equipo NanoDrop 2000c a 280 nm. Las muestras de ADN purificado fueron secuenciadas por
la empresa Macrogen Inc.
19
5.6.2 Análisis filogenéticos
Las secuencias obtenidas a partir de las bacterias que presentaron actividad antifúngica
significativa se editaron de forma manual en el programa BioEdit, basándose en el
cromatograma. Una vez editadas las secuencias, se compararon con las secuencias disponibles
en la base de datos del GenBank del NCBI con el algoritmo BLAST
(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi), para realizar la búsqueda de las secuencias más
parecidas reportadas. Se descargaron las tres secuencias que obtuvieron un mayor porcentaje de
similitud con cada una de las secuencias obtenidas en este trabajo.
Para la construcción del árbol filogenético, se prosiguió a alinear las secuencias en el programa
MUSCLE de MEGA (Molecular Evolutionary Genetics Analysis) versión 7. Una vez alineadas
las secuencias, se construyó el árbol filogenético con el algoritmo Neighbor-Joining (NJ),
utilizando los modelos Jukes-Cantor, Kimura 2-parameter, Tamura-Nei y Tamura 3-parameter,
dependiendo del género bacteriano analizado, y un análisis Bootstrap con 1000 réplicas.
(SEM)
Para evaluar el daño causado en las hifas del hongo F. solani, se seleccionaron 3 aislados
bacterianos que presentaran una actividad antifúngica significativa, en los ensayos de
antagonismo mediante contacto directo como indirecto; se seleccionaron aislados que
presentaran un porcentaje de inhibición del crecimiento micelial alto. Los aislados
seleccionados fueron montados separadamente en una prueba de antagonismo mediante
contacto directo y se incubaron durante 7 días. Transcurridos los 7 días, se tomó una muestra de
alrededor de 1 cm × 1 cm del borde del crecimiento micelial de hongo, cercano al aislado
bacteriano seleccionado. Para el control, se tomó una muestra de 1 cm × 1 cm del borde del
crecimiento micelial del hongo F. solani sin el aislado bacteriano.
Las muestras tomadas tanto del hongo F. solani frente a los aislados bacterianos como del
control, fueron fijadas en Karnovsky. Una vez fijadas, las muestras se lavaron de 2 a 3 veces
durante 5 min en el mismo buffer para retirar el fijador. Las muestras lavadas y sin resto de
fijador pasaron por un proceso de deshidratación en un gradiente de etanol (30-100%) durante
30 min para cada concentración, hasta alcanzar el 100% de etanol. El material fue secado a
20
punto crítico con CO2 en un Quorum K850, posteriormente las muestras fueron colocadas con
pinzas ultrafinas en los portamuestras cilíndricos de aluminio para el montaje y cinta de carbón
(doble cara). Una vez realizado el montaje, las muestras fueron cubiertas con oro paladio en la
recubridora Quorum Q150, para poder realizar la adquisición de micrografías en un Microscopio
Electrónico de Barrido (SEM por sus siglas en inglés) marca JEOL -IT3000LV con software
IT300.
21
6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
6.1 Caracterización morfológica de los aislados bacterianos

Se lograron caracterizar un total de 102 aislados bacterianos a partir de las muestras obtenidas
de corteza de P. mexicana, L. styraciflua, P. schiedeana y N. salicifolia.
Tabla 3. Número de aislados bacterianos obtenidos por cada especie de árboles muestreados.
Especie de árbol Clave Hábitat Número de aislados

bacterianos obtenidos
Platanus mexicana H (Haya) Corteza 30
Liquidambar styraciflua C-LQA (Liquidámbar) Corteza 23
Persea schiedeana CH (Chinini) Corteza 32
Nectandra salicifolia N (Nectandra) Corteza 17
De estos aislados bacterianos, se obtuvo un total de 22 bacterias Gram positivas y 80 bacterias

Gram negativas. Con base en los criterios morfológicos macroscópicos y microscópicos
mencionados para llevar a cabo la descripción de los aislados bacterianos obtenidos, se
agruparon los aislados en 75 morfotipos. Un representante de cada uno de los 75 morfotipos,
seleccionado al azar, fue procesado para evaluar su actividad antifúngica (Anexo A).
6.2 Evaluación in vitro de la actividad antifúngica de los aislados bacterianos

directo
Se realizaron pruebas de antagonismo directo entre los 75 aislados bacterianos seleccionados y
el hongo fitopatógeno Fusarium solani. Los resultados de las mediciones del crecimiento
micelial del hongo fitopatógeno, después de siete días, se presentan en la Tabla 4 a continuación.
22
Tabla 4. Crecimiento micelial de F. solani en contacto con los aislados bacterianos obtenidos a
partir de la corteza de cuatro especies de árboles del BMM.
Aislado bacteriano Radio de Radio de Porcentaje de

crecimiento micelial crecimiento micelial inhibición del
en presencia de la sin bacteria - Control crecimiento micelial
bacteria (cm) (%)
(cm)
CH2-3A1 ME 2.93 ± 0.33 3.47 ± 0.09 15.68 ± 7.97
●CH2-3B1 2.93 ± 0.07 3.47 ± 0.12 15.28 ± 2.07
●CH2-3B1 ME 3.43 ± 0.07 3.97 ± 0.03 13.46 ± 0.96
CH3-1A 3.27 ± 0.15 3.47 ± 0.12 5.81 ± 1.79
●CH3-1A ME 3.57 ± 0.07 3.97 ± 0.03 10.04 ± 2.46
●CH3-6A1 2.53 ± 0.03 3.97 ± 0.03 36.11 ± 1.39
●CH3-6A1 ME 2.33 ± 0.09 3.63 ± 0.07 35.75 ± 2.45
●CH4-1A1 3.37 ± 0.03 3.63 ± 0.07 7.26 ± 2.33
CH4-1A1 ME 3.23 ± 0.03 3.47 ± 0.09 6.62 ± 2.38
CH4-1B1 3.32 ± 0.00 3.63 ± 0.07 6.36 ± 1.75
CH4-1C1 3.27 ± 0.03 3.47 ± 0.09 5.63 ± 2.82
●CH4-1C1 MEA 3.17 ± 0.03 3.70 ± 0.10 14.26 ± 2.94
●CH4-1C1 MEB 3.17 ± 0.03 3.83 ± 0.03 17.39 ± 0.81
○CH4-2A1 2.80 ± 0.00 3.33 ± 0.03 17.65 ± 0.00
○CH4-2A2 2.97 ± 0.03 3.57 ± 0.03 16.80 ± 1.49
CH4-2C 2.87 ± 0.22 3.40 ± 0.20 15.85 ± 1.62
●CH4-2F2 2.80 ± 0.06 3.30 ± 0.10 15.09 ± 1.37
●CH4-3A 1.70 ± 0.06 3.57 ± 0.03 52.30 ± 2.03
●CH4-3D 1.87 ± 0.13 3.40 ± 0.20 44.96 ± 3.80
CH4-6 2.97 ± 0.33 3.40 ± 0.20 13.21 ± 4.81
CH4-7 A 3.10 ± 0.00 3.60 ± 0.00 13.89 ± 0.00
●CH4-7 C 3.63 ± 0.03 3.97 ± 0.03 8.40 ± 0.80
N3-2A1A 2.60 ± 0.35 3.57 ± 0.09 27.4 ± 8.30
N3-2A1B 3.43 ± 0.07 3.70 ± 0.10 7.02 ± 3.82
●N3-2A1 ME 3.07 ± 0.07 3.60 ± 0.06 14.75 ± 3.11
●N3-2B1A 2.97 ± 0.03 3.60 ± 0.06 17.53 ± 2.16
○N3-2B1B 3.50 ± 0.00 3.83 ± 0.03 8.68 ± 0.79
○N3-2B1 MEA 3.43 ± 0.03 3.83 ± 0.03 10.41 ± 1.42
●N3-2B1 MEB 3.20 ± 0.06 3.70 ± 0.10 13.46 ± 1.27
●N3-2C1A 2.30 ± 0.06 3.73 ± 0.03 38.41 ± 1.11
●N3-2C1B 3.27 ± 0.03 3.60 ± 0.03 9.24 ± 0.79
○N3-2C1C 3.43 ± 0.03 3.63 ± 0.03 5.51 ± 0.05
●N3-2C1D 3.27 ± 0.03 3.63 ± 0.03 10.08 ± 0.88
○N3-2C1 ME 3.20 ± 0.00 3.90 ± 0.00 17.95 ± 0.00
N3-7 A 3.37 ± 0.12 3.47 ± 0.12 2.89 ± 0.10
●N3-8A1 3.37 ± 0.09 3.83 ± 0.03 12.19 ± 1.80
○N3-8A1 ME 3.27 ± 0.03 3.90 ± 0.00 16.24 ± 0.86
23
Continuación de la Tabla 4.
Aislado bacteriano Radio de Radio de Porcentaje de
bacteria (cm) (%)
(cm)
○N3-8B1 3.13 ± 0.03 3.83 ± 0.03 18.26 ± 0.16
○N3-8B1 ME 3.17 ± 0.03 3.90 ± 0.00 18.8 ± 0.85
●H2-1 2.80 ± 0.06 3.67 ± 0.03 23.62 ± 1.71
H2-2 3.60 ± 0.00 3.60 ± 0.00 0.00 ± 0.00
○H2-3 3.07 ± 0.03 3.67 ± 0.03 16.37 ± 0.15
H2-4A 3.97 ± 0.03 3.97 ± 0.03 0.00 ± 0.00
○H2-4B 3.20 ± 0.06 3.70 ± 0.00 13.51 ± 1.56
H2-6 2.77 ± 0.19 3.30 ± 0.10 13.54 ± 5.80
H2-7 3.50 ± 0.00 3.57 ± 0.03 1.85 ± 0.93
○H2-8A 3.20 ± 0.12 3.70 ± 0.00 13.51 ± 3.12
○H2-8B 2.83 ± 0.03 3.33 ± 0.03 16.67 ± 0.98
○H3-2A 2.80 ± 0.00 3.33 ± 0.03 17.65 ± 0.00
○H3-2C 3.17 ± 0.03 3.70 ± 0.00 14.41 ± 0.90
○H3-4A 2.80 ± 0.00 4.10 ± 0.00 31.71 ± 0.00
H3-5A 4.03 ± 0.03 4.10 ± 0.00 1.63 ± 0.81
○H3-5C 3.87 ± 0.03 4.10 ± 0.00 5.69 ± 0.81
○H3-6A 3.73 ± 0.03 4.10 ± 0.00 8.95 ± 0.81
H3-6B 4.00 ± 0.00 4.10 ± 0.00 2.44 ± 0.00
●H3-6C 2.77 ± 0.12 3.30 ± 0.10 13.54 ± 3.76
H3-7 3.97 ± 0.03 4.10 ± 0.00 3.25 ± 0.81
●C-LQA 1-5 A 3.37 ± 0.07 3.73 ± 0.03 9.84 ± 0.97
● C-LQA 1-5 B 3.07 ± 0.07 3.57 ± 0.03 14.02 ± 1.61
○C-LQA 1-6 A1 3.10 ± 0.00 3.63 ± 0.07 14.62 ± 2.77
○C-LQA 1-6 A2 3.23 ± 0.12 3.60 ± 0.00 10.18 ± 3.21
○C-LQA 1-6 B 3.10 ± 0.00 3.67 ± 0.03 15.44 ± 0.78
○C-LQA-1-9 A1 3.20 ± 0.00 3.63 ± 0.03 11.91 ± 0.80
●C-LQA-1-9 A2 3.07 ± 0.03 3.60 ± 0.03 14.77 ± 2.25
●C-LQA-1-9 A3 3.17 ± 0.03 3.60 ± 0.03 11.97 ± 0.79
●C-LQA 1-9 B 3.23 ± 0.03 3.57 ± 0.09 9.27 ± 1.70
○C-LQA 2-7 A 3.57 ± 0.03 3.97 ± 0.03 10.06 ± 1.39
C-LQA 2-9 3.47 ± 0.03 3.57 ± 0.03 2.78 ± 1.61
○C-LQA 3-1 3.10 ± 0.00 3.63 ± 0.07 14.62 ± 2.77
●C-LQA 3-2 A 3.20 ± 0.06 3.63 ± 0.07 11.92 ± 1.41
C-LQA 3-7 3.33 ± 0.03 3.57 ± 0.09 6.46 ± 1.76
C-LQA 3-8 3.43 ± 0.03 3.60 ± 0.06 4.61 ± 0.88
●C-LQA 3-12 3.67 ± 0.03 3.83 ± 0.03 4.34 ± 0.86
C-LQA 3-13A 3.60 ± 0.00 3.73 ± 0.03 3.55 ± 0.85
○C-LQA 3-14 3.27 ± 0.03 3.57 ± 0.03 8.38 ± 1.56
Los datos presentados son el promedio de tres réplicas ± error estándar. Los valores en negritas
indican actividad antifúngica significativa.
24
● Diferencia estadísticamente significativa entre el tratamiento y su respectivo control; los datos
cumplen el supuesto de igualdad de varianzas (prueba de Levene y t-Student, P<0.05)
○ Diferencia estadísticamente significativa entre el tratamiento y su respectivo control; los datos
no cumplen con el supuesto de igualdad de varianzas (prueba de Levene y t-Student, P<0.05)
De los 75 aislados bacterianos que se probaron en los ensayos de antagonismo, 53 presentaron

una actividad antifúngica significativa contra el hongo F. solani, en los ensayos de antagonismo
directo. Sin embargo, algunos de los porcentajes de inhibición del crecimiento micelial
producidos por los aislados bacterianos que presentaron una actividad antifúngica significativa
fueron muy bajos, por lo cual se seleccionaron los aislados bacterianos que presentaron un
porcentaje de inhibición del crecimiento micelial mayor al 10%. Por lo tanto, 42 aislados
bacterianos fueron seleccionados, de los cuales 12 aislados se obtuvieron a partir de la corteza
de P. schiedeana (CH), 11 de la de N. salicifolia (N), 9 de P. mexicana (H) y 10 de L. styraciflua
(C-LQA). De los 42 aislados bacterianos seleccionados, sólo 6 aislados bacterianos presentaron
un porcentaje de inhibición del crecimiento micelial de F. solani arriba del 30% (Figuras 6 y 7).
Cuatro de estos aislados bacterianos provinieron de P. schiedeana (CH), 1 de N. salicifolia (N)
y 1 de P. mexicana (H).
25
Figura 6. Aislados bacterianos (*) que presentaron un porcentaje de inhibición del crecimiento
micelial de F. solani arriba del 30% y presentaron una actividad antifúngica
significativa: a) CH3-6A1, b) CH3-6A1 ME, c) CH4-3A, d) CH4-3D, e) N3-2C1A y
f) H3-4A.
26
P. schiedeana N. salicifolia P. mexicana L. styraciflua
Figura 7. Porcentajes de inhibición del crecimiento micelial de F. solani por los 42 aislados bacterianos que presentaron un porcentaje
de inhibición arriba del 10%. Se destacan los 6 aislados que presentaron un porcentaje de inhibición arriba del 30 % (línea roja).
Todos los aislados bacterianos mencionados en el eje de las “x” mostraron una actividad antifúngica significativa.
27
indirecto
Se realizaron pruebas de antagonismo indirecto para evaluar la actividad antifúngica de los
compuestos orgánicos volátiles producidos por los 42 aislados bacterianos seleccionados, con
actividad antifúngica significativa y porcentajes de inhibición del crecimiento micelial de F.
solani mayores al 10% en los ensayos de antagonismo directo. El crecimiento micelial del hongo
creciendo en presencia de los aislados bacterianos, en ensayos de antagonismo indirecto y
después de 7 días, se presenta en la Tabla 5 a continuación.
Tabla 5. Crecimiento micelial de F. solani en ensayos de antagonismo directo con los aislados
bacterianos obtenidos a partir de la corteza de cuatro especies de árboles del BMM.
Diámetro de Diámetro de Porcentaje de

Aislado bacteriano
bacteria (cm) (cm) (%)
CH2-3B1 6.47 ± 0.03 6.50 ± 0.00 0.51 ± 0.51

CH2-3B1 ME 6.43 ± 0.07 6.50 ± 0.00 1.03 ± 1.03
CH3-1A ME 6.40 ± 0.00 6.50 ± 0.00 1.54 ± 0.00
○CH3-6A1 6.03 ± 0.03 7.00 ± 0.00 13.81 ± 0.48
○CH3-6A1 ME 6.03 ± 0.03 7.00 ± 0.00 13.82 ± 0.48
CH4-1C1 MEA 5.77 ± 0.03 6.03 ± 0.03 5.77 ± 1.08
CH4-1C1 MEB 7.00 ± 0.00 7.00 ± 0.00 0.00 ± 0.00
CH4-2A1 7.30 ± 0.10 7.40 ± 0.12 1.34 ± 0.78
CH4-2A2 7.00 ± 0.25 7.00 ± 0.12 0.05 ± 2.15
CH4-2F2 6.73 ± 0.39 7.30 ± 0.12 7.84 ± 4.36
●CH4-3A 5.27 ± 0.20 7.00 ± 0.00 24.76 ± 2.90
●CH4-3D 5.53 ± 0.06 6.07 ± 0.03 8.79 ± 0.53
●N3-2A1 ME 6.10 ± 0.06 6.63 ± 0.03 8.04 ± 0.52
N3-2B1A 6.00 ± 0.00 6.03 ± 0.03 0.55 ± 0.55
N3-2B1 MEA 5.90 ± 0.06 6.03 ± 0.03 5.90 ± 1.10
N3-2B1 MEB 6.50 ± 0.18 6.63 ± 0.03 2.00 ± 1.32
●N3-2C1A 6.13 ± 0.06 6.63 ± 0.03 7.53 ± 0.84
N3-2C1D 6.30 ± 0.12 6.37 ± 0.07 1.06 ± 1.06
N3-2C1 ME 6.80 ± 0.83 7.40 ± 0.12 8.16 ± 10.89
○N3-8A1 6.17 ± 0.03 6.50 ± 0.00 5.13 ± 0.51
28
Diámetro de Diámetro de Porcentaje de
Aislado bacteriano
bacteria (cm) (cm) (%)
N3-8A1 ME 6.77 ± 0.37 7.00 ± 0.12 3.26 ± 5.70
N3-8B1 6-17 ± 0.17 6.37 ± 0.07 3.17 ± 1.59
N3-8B1 ME 6.17 ± 0.12 6.50 ± 0.00 5.13 ± 1.85
H2-1 6.40 ± 0.00 6.50 ± 0.00 1.54 ± 0.00
●H2-3 6.37 ± 0.03 7.00 ± 0.12 9.01 ± 1.11
H2-4B 7.30 ± 0.12 7.30 ± 0.12 0.00 ± 0.00
●H2-8A 6.20 ± 0.15 7.00 ± 0.12 11.88 ± 0.80
H2-8B 7.03 ± 0.03 7.40 ± 0.12 4.92 ± 1.12
H3-2A 6.67 ± 0.42 7.30 ± 0.12 8.78 ± 4.52
●H3-2C 6.17 ± 0.07 7.00 ± 0.12 11.39 ± 2.36
H3-4A 5.97 ± 0.03 6.07 ± 0.03 1.65 ± 0.01
●H3-6C 6.33 ± 0.07 7.30 ± 0.12 13.17 ± 2.20
C-LQA 1-5 B 6.50 ± 0.00 6.50 ± 0.00 0.00 ± 0.00
C-LQA 1-6 A1 6.60 ± 0.10 7.00 ± 0.12 5.62 ± 2.91
●C-LQA 1-6 A2 6.57 ± 0.12 7.30 ± 0.12 10.00 ± 1.67
●C-LQA 1-6 B 6.33 ± 0.07 7.30 ± 0.12 13.16 ± 2.58
C-LQA 1-9 A1 7.00 ± 0.00 7.00 ± 0.00 0.00 ± 0.00
C-LQA 1-9 A2 6.80 ± 0.00 7.00 ± 0.00 2.86 ± 0.00
C-LQA 1-9 A3 6.77 ± 0.03 7.00 ± 0.12 3.25 ± 2.02
●C-LQA 2-7 B 6.37 ± 0.07 7.40 ± 0.12 13.92 ± 1.60
●C-LQA 3-1 6.63 ± 0.07 7.30 ± 0.12 9.07 ± 1.72
●C-LQA 3-2 A 6.77 ± 0.07 7.40 ± 0.12 8.51 ± 1.66
Los datos presentados son el promedio de 3 réplicas ± error estándar. Los valores en negritas
indican actividad antifúngica significativa.
● Diferencia estadísticamente significativa entre el tratamiento y su respectivo control; los datos
cumplen el supuesto de igualdad de varianzas (prueba de Levene y t-Student, P<0.05)
○ Diferencia estadísticamente significativa entre el tratamiento y su respectivo control; los datos
no cumplen con el supuesto de igualdad de varianzas (prueba de Levene y t-Student, P<0.05)
De los 42 aislados bacterianos que fueron evaluados para determinar la actividad antifúngica de
sus volátiles, 16 aislados bacterianos produjeron una inhibición del crecimiento micelial
significativa (P<0.05), como se muestra en la Figura 8. De estos 16 aislados, 4 aislados
bacterianos provenían de la corteza de P. schiedeana (CH), 3 de N.salicifolia (N), 4 de P.
mexicana (H) y 5 de L. styraciflua (C-LQA).
29
P. schiedeana N. salicifolia P. mexicana L. styraciflua
Figura 8. Porcentajes de inhibición del crecimiento micelial de F. solani por los 16 aislados
bacterianos que produjeron un efecto inhibitorio significativo. Se destaca el aislado
CH4-3A que presentó un porcentaje de inhibición arriba del 15% con respecto a los
demás aislados.
De los seis aislados bacterianos que presentaron porcentajes de inhibición del crecimiento
micelial mayor al 30% en los ensayos de antagonismo directo, cinco también presentaron una
actividad antifúngica significativa en las pruebas de antagonismo indirecto, como se muestra en
la Figura 9.
30
a b c
d e
Figura 9. Aislados bacterianos que presentaron una actividad antifúngica significativa en contra
del hongo F. solani en los ensayos de antagonismo directo e indirecto. a) CH3-6A1, b)
CH3-6A1 ME, c) CH4-3A, d) CH4-3D y e) N3-2C1A.
Cabe destacar que el aislado CH4-3A, aislado a partir de corteza de P. schiedeana, fue el que
presentó el mayor porcentaje de inhibición tanto en las pruebas de antagonismo directo
(52.30 %) como en las de antagonismo por emisión de volátiles (24.76 %).

significativa
Los 42 aislados bacterianos que presentaron porcentajes de inhibición mayores a 10% en los
ensayos de antagonismo directo fueron procesados para ser identificados molecularmente. Cabe
destacar que 3 aislados no se lograron amplificar durante la PCR, por lo que solamente 39
aislados fueron secuenciados. Los resultados de la comparación de las secuencias obtenidas a
partir de dichos aislados bacterianos con la base de datos GenBank de NCBI se muestra en la
Tabla 6.
31
Tabla 6. Identificación molecular de los aislados bacterianos con actividad antagónica significativa contra el hongo F. solani y su
secuencia más cercana en la base de datos GenBank del NCBI "16S ribosomal RNA (Bacteria and Archaea)”.
Aislado bacteriano No. de pares Número de Secuencia con mayor similitud en el GenBank y su Porcentaje
de bases (pb) acceso de número de acceso de similitud
GenBank (%)
CH2-3B1 858 MK215728 Pseudomonas tolaasii (NR_114481.1) 99
CH2-3B1 ME 852 MK215729 Pseudomonas orientalis (NR_024909.1) 99
CH3-1A ME 806 MK215730 Stenotrophomonas rhizophila (NR_121739.1) 96
CH3-6A1 855 MK215731 Pseudomonas koreensis (NR_025228.1) 99
CH3-6A1 ME 837 MK215732 Pseudomonas vancouverensis (NR_041953.1) 99
CH4-1C1 ME-A 839 MK215733 Pseudomonas tolaasii (NR_114481.1) 99
CH4-1C1 ME-B 807 MK215734 Pseudomonas orientalis (NR_024909.1) 99
CH4-2A1 815 MK215735 Rahnella woolbedingensis (NR_146848.1) 99
CH4-2A2 821 MK215736 Rahnella woolbedingensis (NR_146848.1) 99
CH4-2F2 832 MK215737 Rahnella woolbedingensis (NR_146848.1) 99
CH4-3A 822 MK215738 Pseudomonas koreensis (NR_025228.1) 99
N3-2A1 ME 836 MK215756 Pseudomonas extremorientalis (NR_025174.1) 99
N3-2B1A 803 MK215759 Pseudomonas marginalis (NR_117821.1) 99
N3-2B1 ME-A 835 MK215757 Pseudomonas antarctica (NR_025586.1) 99
N3-2B1 ME-B 801 MK215758 Pseudomonas extremorientalis (NR_025174.1) 99
N3-2C1A 808 MK215761 Pseudomonas simiae (NR_042392.1) 99
32
GenBank (%)
N3-2C1-D 848 MK215722 Pseudomonas canadensis (NR_156852.1) 98
N3-2C1 ME 839 MK215760 Pseudomonas extremorientalis (NR_025174.1) 99
N3-8A1 841 MK215764 Pseudomonas canadensis (NR_156852.1) 98
N3-8A1 ME 856 MK215763 Pseudomonas canadensis (NR_156852.1) 99
N3-8B1 831 MK215766 Pseudomonas fluorescens (NR_115715.1) 99
N3-8B1 ME 830 MK215765 Pseudomonas fluorescens (NR_114476.1) 99
H2-1 822 MK215747 Stenotrophomonas rhizophila (NR_121739.1) 99
H2-3 827 MK215748 Pseudomonas paralactis (NR_156987.1) 99
H2-4B 837 MK215749 Erwinia rhapontici (NR_118858.1) 98
H2-8A 839 MK215750 Pseudomonas koreensis (NR_025228.1) 99
H2-8B 827 MK215751 Pseudomonas koreensis (NR_025228.1) 99
H3-2A 839 MK215752 Pseudomonas helmanticensis (NR_126220.1) 99
H3-2C 815 MK215753 Pseudomonas baetica (NR_116899.1) 99
H3-4 A 793 MK215754 Pseudomonas trivialis (NR_028987.1) 99
H3-6C 854 MK215755 Pseudomonas canadensis (NR_156852.1) 99
C-LQA 1-5B 857 MK215739 Erwinia billingiae (NR_104932.1) 99
C-LQA 1-6 A1 812 MK215740 99
33
GenBank (%)
C-LQA 1-6 A2 836 MK215741 Rahnella victoriana (NR_146847.1) 100
C-LQA 1-6 B 840 MK215742 Rahnella bruchi (NR_146845.1) 98
C-LQA-1-9-A1 817 MK215743 Erwinia billingiae (NR_119255.1) 98
C-LQA-1-9-A3 830 MK215744 Erwinia billingiae (NR_104932.1) 99
C-LQA 2-7 A 825 MK215745 Erwinia billingiae (NR_118431.1) 99
C-LQA 3-1 833 MK215746 Rahnella woolbedingensis (NR_146848.1) 98
En negritas se resaltan los aislados que presentaron porcentajes de inhibición del crecimiento micelial mayores al 30% en ensayos de
antagonismo directo y actividad antifúngica significativa en los ensayos de antagonismo indirecto.
Como se observa en la Tabla 6, los 39 aislados bacterianos con actividad antifúngica pertenecieron a 5 géneros bacterianos diferentes:
Pseudomonas (25 secuencias), Stenotrophomonas (2 secuencias), Erwinia (5 secuencias), Rahnella (6 secuencias) y Yersinia (1
secuencia). Esta asignación taxonómica fue corroborada mediante árboles filogenéticos, como se muestra en las figuras 10-13. Cabe
destacar que el género Pseudomonas fue el más abundante dentro de los aislados con actividad antifúngica contra F. solani. Este género
ya se ha reportado en corteza de vides tunecinas (Rezgui et al., 2016) y en la filósfera de L. styraciflua y P. mexicana (Escudero, 2018),
lo que corrobora que la corteza comparte parcialmente sus comunidades bacterianas con las hojas (Arrigoni et al., 2018).
Como se ilustra en la Tabla 6, cuatro aislados bacterianos presentaron una actividad antifúngica significativa tanto en los ensayos de
antagonismo directo (mediante compuestos difusibles) como indirecto (mediante compuestos volátiles). Al identificarse molecularmente,
encontramos que estos aislados pertenecían al género Pseudomonas (Figura 10), el cual ha sido reportado por producir compuestos
34
antimicrobianos, por promover el crecimiento de plantas e inducir resistencia sistemática en
plantas contra patógenos. Un ejemplo son las bacterias aisladas por Bahroun et al., (2018), las
cuales fueron aisladas de nódulos de leguminosas, que fueron capaces de producir sideróforos,
los cuales pueden estimular el crecimiento de las plantas e inhibir el crecimiento de hongos
fitopatógenos a través de competencia por hierro.
35
Figura 10. Árbol filogenético construido a partir de las secuencias obtenidas para el género
Pseudomonas. Los aislados marcados con un círculo rojo corresponden a los que se
obtuvieron en este trabajo y que presentaron actividad antifúngica significativa.
En la literatura, se ha reportado que el género Pseudomonas es capaz de producir compuestos

como cianuro de hidrógeno, piroluteorina, fenolinas, pirrolnitrina, sideróforos, lipopéptidos
cíclicos y 2,4-diacetilfloroglucinol (DAPG), así como enzimas hidrolíticas como proteasas,
celulasas, quitinasas y β-glucanasas (Hernández-León et al., 2015). Dichos compuestos y
enzimas han presentado actividad antifúngica contra los hongos y oomicetos fitopatógenos F.
36
solani, Sclerotium rolfsii, F. oxysporum, Rhizoctonia solani, Pythium ultimum y Phytophthora
capsici (Bahroun et al., 2018; Cho et al., 2007; Le et al., 2018). La actividad antifúngica
mediante compuestos difusibles presentada por los aislados bacterianos CH3-6A1, CH3-6A1
ME, CH4-3A y N3-2C1A contra F. solani, con porcentajes altos de inhibición micelial (hasta
52.30 % para el aislado CH4-3A), podría ser atribuida a la amplia gama de compuestos
antimicrobianos que producen las bacterias del género Pseudomonas.
El género Pseudomonas, como otras bacterias, también produce compuestos orgánicos volátiles
(COV), como 2-tridecanol, dodecanona, 1-metil-naftaleno, benzaldehído, etanona-(2-furanilo)-
benzotiazol, m-xileno, tolueno, etilbenceno, dimetil disulfuro (DMDS), 1-undecanol,
ciclohexanol, decanol, 2-etil-1-hexanol, nonanal, 2-dodecanona, entre otros (Hernández-León
et al., 2015; Raza et al., 2016; Rojas-Solís et al., 2018; Sheoran et al., 2015). Algunos de estos
COV, como el DMSD y el 2-dodecanona, han sido reportados por presentar actividad
antifúngica contra los hongos fitopatógenos Botrytis cinerea y F. solani (Guevara-Avendaño et
al., 2019; Rojas-Solís et al., 2018).
37
Stenotrophomonas. Los aislados marcados con un círculo rojo corresponden a los que se
obtuvieron en este trabajo y que presentaron actividad antifúngica significativa.
Erwinia. Los aislados marcados con un círculo rojo corresponden a los que se obtuvieron
en este trabajo y que presentaron actividad antifúngica significativa.
38
Figura 13. Árbol filogenético construido a partir de las secuencias obtenidas para los géneros
Yersinia y Rahnella. Los aislados marcados con un círculo rojo corresponden a los que
se obtuvieron en este trabajo y que presentaron actividad antifúngica significativa.
Los otros géneros bacterianos obtenidos en este trabajo han sido escasamente estudiados. El
género Rahnella se ha encontrado en nódulos de leguminosas, ya que éstos albergan una gran
cantidad de bacterias simbióticas y endófitas. En ese estudio, Bahroun et al. (2018) reportaron
una inhibición del crecimiento micelial de F. solani por Rahnella aquatilis, así como su
capacidad para producir sideróforos y antibióticos como la pirrolnitrina o el cianuro de
hidrógeno (Bahroun et al., 2018). En otro estudio, la bacteria R. aquatilis, aislada de frutas y
hojas de manzanas, logró inhibir completamente la germinación de las esporas de Botrytis
cinerea y Penicillium expansum (Calvo et al., 2007). De igual manera, se reportó que R.
aquatilis era capaz de producir sideróforos si se cultivaba en el medio adecuado y que estos
compuestos tenían actividades antimicrobianas significativas in vitro y podían ayudar a regular
la microflora de las plantas (Calvo et al., 2007). En nuestro estudio, Rahnella spp. se aislaron
de la corteza de L. styraciflua y P. schiedeana y lograron inhibir el crecimiento de F. solani
hasta un 17% in vitro. Las bacterias del género Rahnella obtenidas en este trabajo fueron
filogenéticamente cercanas a R. victoriana, R. bruchi y R. woolbedingensis, como se observa en
39
la Figura 13, cuya actividad antifúngica no había sido reportada aún. Por lo tanto, hacen falta
más estudios para corroborar su actividad antagónica contra otros hongos fitopatógenos y
evaluar su potencial como agente bacteriano de control biológico en pruebas in vivo.
El género Stenotrophomonas, encontrado en este estudio asociado a la corteza de P. mexicana

y P. schiedeana, también ha sido escasamente estudiado. Rojas-Solís et al. (2018) aislaron
Stenotrophomonas maltophilia de plantas de tomatillo (Physalis ixocarpa), y encontraron que
dicha bacteria era capaz de inhibir el crecimiento del micelio de B. cinerea a través de la
producción de compuestos difusibles y volátiles. Así mismo, se pudo identificar que los
compuestos volátiles producidos por S. maltophilia fueron aldehídos, alcoholes, compuestos
aromáticos, ésteres, éteres y compuestos de azufre, entre los que destacan S-metiltiobutirato,
isobutil isotiocianato, 2-metiltioetanol y DMDS (Rojas-Solís et al., 2018). El DMDS ha sido
reportado recientemente como inhibidor del crecimiento micelial de F. solani como compuesto
orgánico volátil y como difusible (Guevara-Avendaño et al., 2019; Rojas-Solís et al., 2018).
Igualmente, Jankiewicz et al. (2012) aislaron S. maltophilia de rizósfera de trigo e identificaron
la producción de quitinasas por parte de esta bacteria, las cuales inhibieron el crecimiento de los
hongos fitopatógenos Alternaria alternata, R. solani, F. solani y F. oxysporum. Las quitanasas
juntos con las proteasas y la β-1,3-glucanasa, están involucradas en la degradación de la pared
celular durante el antagonismo (Aydi Ben Abdallah et al., 2016). Finalmente, Rojas-Solís et al.
(2018) observaron que S. maltophilia tuvo un efecto promotor sobre la longitud de la raíz y el
peso fresco total de la planta. Las bacterias obtenidas de género Stenotrophomonas fueron
filogenéticamente cercanas a Stenotrophomonas rhizophila, como se observa el Figura 11, cuya
promoción del crecimiento de las plantas ha sido reportada, en condiciones de estrés salino por
ejemplo (Schmidt et al., 2012; Egamberdieva et al, 2015). Por lo tanto, se espera evaluar a futuro
que los aislados obtenidos poseen la misma actividad de promoción de crecimiento vegetal, así
como evaluar su potencial como agente bacteriano de control biológico en pruebas in vivo.
Finalmente, los arboles filogenéticos de las Figuras 12 y 13, de los géneros Erwinia y Yersinia,
aislados en el presente trabajo a partir de la corteza de L. styraciflua y P. mexicana, no habían
sido reportados como agentes potenciales de control biológico. Sin embargo, ya se habían
aislado a partir de la rizósfera de distintas plantas y reportado como bacterias patógenas
humanas, oportunistas o facultativas (Berg et al., 2005). Aunque muchos géneros, incluyendo
40
Burkholderia, Enterobacter, Herbaspirillum, Ochrobactrum, Pseudomonas, Ralstonia,
Staphylococcus y Stenotrophomonas, tienen la capacidad de entrar en interacciones bivalentes
con plantas y hospederos humanos, también poseen propiedades promotoras del crecimiento de
las plantas, así como excelentes propiedades antagónicas contra agentes fitopatógenos. Sin
embargo, estos géneros también colonizan con éxito los órganos y tejidos humanos y, por lo
tanto, pueden llegar a causar enfermedades (Berg et al., 2005).
(SEM)
Con el fin de documentar el daño causado en las hifas de F. solani por tres aislados bacterianos
con alta actividad antifúngica, se procedió a la toma de micrografías a partir del micelio en
contacto directo con los aislados bacterianos, con un microscopio electrónico de barrido. Los
tres aislados que se seleccionaron fueron los que presentaron un porcentaje de inhibición del
crecimiento micelial alto (>30%) en los ensayos de antagonismo directo, y que inhibieron el
crecimiento de F. solani mediante la producción de volátiles. Por lo tanto, se seleccionaron los
aislados bacterianos CH4-3A (Pseudomonas sp.), CH4-3D (en proceso de secuenciación) y N3-
2C1A (Pseudomonas sp.), obtenidos de la corteza de P. mexicana y N. salicifolia.
En la Figura 14 se muestra la actividad antifúngica del aislado bacteriano CH4-3A,

perteneciente al género Pseudomonas, el cual generó daño en forma de conglobaciones en las
hifas del hongo F. solani (Figura 14b), en comparación con el control donde no se observó
ningún daño en las hifas (hongo sin contacto con aislado bacteriano, Figura 14a). La inducción
de daños en las hifas se podría deber a las enzimas producidas por el aislado bacteriano, ya que
en un estudio realizado por Akocak et al. (2015), se demostró que un tratamiento con quitinasas
podía ser eficaz para detener el crecimiento del hongo Aspergillus flavus así como producir
cambios morfológicos notables en las hifas de éste. En un estudio con bacterias del género
Bacillus contra el hongo ascomicete Sclerotinia sclerotiorum, se documentó que en presencia
de lipopéptidos (compuestos reportados también en el género de Pseudomonas (Hernández-
León et al., 2015)), se observaban cambios de morfología en las hifas como inflamaciones y una
extensa vacuolización (Alvarez et al., 2011). Cabe destacar que el aislado bacteriano CH4-3A
41
presentó porcentajes altos de inhibición en los ensayos de antagonismo mediante contacto
directo e indirecto.
Figura 14. Daños ocasionados en las hifas del hongo F. solani por el aislado bacteriano CH4-
3A. a) Hifas del hongo sin el tratamiento bacteriano (Observación a 10,000 X) y b)
Deformación en la hifa del hongo inducida por el aislado CH4-3A (Observación a 8,000
X).
En la micrografía representando el daño provocado en hifas de F. solani por del aislado
bacteriano CH4-3D (en proceso de identificación), también se pudo observar la formación de
conglobaciones, en comparación con control no expuesto al aislado bacteriano (Figura 15).
Figura 15. Daños ocasionados en las hifas del hongo F. solani por el aislado bacteriano CH4-
3D. a) Hifas del hongo sin el tratamiento bacteriano (Observación a 10,000 X) y b)
42
Deformación en la hifa del hongo inducida por el aislado CH4-3D (Observación a
8,000 X).
Finalmente, en el caso del aislado bacteriano N3-2C1A, perteneciente al género bacteriano
Pseudomonas, no se logró observar ningún daño aparente en las hifas del hongo F. solani
expuesto al aislado bacteriano, como se observa en la Figura 16. En este caso, la inhibición del
crecimiento micelial observada en los ensayos de antagonismo directo podría deberse a una
actividad fungistática y no fungicida, quizás a través de la competencia por nutrimentos.
Figura 16. Micrografía de las hifas de F. solani con tratamiento y sin tratamiento: a) Hifas del
hongo F. solani sin el tratamiento bacteriano (Observación a 3,000 X) y b) Hifas del
hongo en contacto con el aislado N3-2C1A (Observación a 2,000 X). No se observaron
deformaciones en las hifas del hongo inducidas por el aislado N3-2C1A.
Se puede especular que los aislados bacterianos obtenidos en el presente trabajo, particularmente
los pertenecientes al género Pseudomonas y aislados a partir de la corteza de P. mexicana, P.
schiedeana y N. salicifolia, podrían ser potenciales candidatos para el control biológico de F.
solani. Además, la actividad promotora del crecimiento vegetal de algunas especies de
Pseudomonas (Fincheira and Quiroz, 2018; Santoyo et al., 2016) podría proveer beneficios
adicionales a las plantas para ayudarles a combatir la infección provocada por hongos
fitopatógenos. Los daños causados en las hifas del hongo por el aislado CH4-3A confirman que
este aislado produce compuestos antibióticos, los cuales serán caracterizados en estudios
posteriores.
43
En este trabajo, se demostró que 42 aislados bacterianos, la mayoría identificados como
Pseudomonas spp., tuvieron buenos resultados como inhibidores del crecimiento del hongo F.
solani. Reportes previos sobre el género Pseudomonas muestran que está conformado por varios
agentes potenciales de biocontrol contra patógenos de plantas. Aunque los aislados bacterianos
obtenidos pueden ser agentes promisorios para el control biológico de hongos fitopatógenos,
también se tiene que tomar en cuenta los riesgos que podrían presentar, para así garantizar que
no supongan una amenaza inadvertida para la salud humana. Finalmente, este trabajo abre un
nuevo panorama sobre las bacterias asociadas a especies silvestres. Se espera, en un futuro,
poder aislar y caracterizar los compuestos producidos por estos aislados y poder llegar a
probarlos contra los hongos F. euwallaceae y F. kuroshium, causantes de la muerte regresiva
por Fusarium, los cuales pueden llegar a afectar los bosques y en particular el BMM.
44
7. CONCLUSIONES
En el presente trabajo, las bacterias aisladas de la corteza de cuatro especies de árboles comunes
del BMM (P. mexicana, P. schiedeana, L. styraciflua y N. salicifolia) fueron evaluadas in vitro
contra el hongo fitopatógeno F. solani mediante ensayos de antagonismo directo e indirecto.
Se encontró que 53 aislados bacterianos presentaron una actividad antifúngica significativa

contra el hongo F. solani, en los ensayos de antagonismo mediante contacto directo. Sin
embargo, no todos los aislados bacterianos presentaban porcentajes altos de inhibición del
crecimiento micelial, por lo cual se seleccionaron los aislados bacterianos que presentaron un
porcentaje de inhibición del crecimiento micelial mayor al 10%, seleccionando así 42 aislados
bacterianos.
Al identificarse molecularmente se determinó que estos aislados pertenecen a los géneros

Pseudomonas, Stenotrophomonas, Erwinia, Rahnella y Yersinia.
En los ensayos de antagonismo indirecto, 16 aislados mostraron actividad antifúngica

significativa mediante la emisión de compuestos orgánicos volátiles. Cabe destacar que el
aislado bacteriano CH4-3A, del género Pseudomonas, presentó una actividad antifúngica
significativa tanto en los ensayos de antagonismo directo como indirecto, con porcentajes de
inhibición del crecimiento micelial altos.
Al evaluar el daño causado por este aislado en hifas del hongo F. solani, mediante microscopía
electrónica de barrido (SEM), se observó que el aislado bacteriano CH4-3A inducía la
formación de conglobaciones, y constituye un agente promisorio de control biológico de hongos
del género Fusarium.
Este estudio amplió un campo de conocimiento poco estudiado y demostró el potencial de

bacterias asociadas a corteza de especies forestales, para ser utilizadas en estrategias
sustentables de control biológico contra patógenos de plantas.
45
8. BIBLIOGRAFÍA
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9. ANEXOS
Anexo A
Morfología Tinción
Aislados
Morfotipo Forma de la Colonia
Borde Elevación Superficie Consistencia Color Luz Transmitida
Luz ReflejadaPositivo/Negativo
Forma de la Bacteria
1 N3-2A1A Circular Entero Convexa Lisa Cremosa Blanco cremosa
Traslucida Opaca Gram (-) Bacilos
2 N3-2A1B Irregular Entero Convexa Lisa Cremosa Blanco cremosa
3 N3-2A1 ME Circular Ondulado Convexa Rugosa Cremosa Blanco cremosa
Traslucida Opaca Gram (+) Bacilos
4 N3-2B1A Circular Ondulado Plana Rugosa Cremosa Blanco cremosa
5 N3-2B1B Circular Entero Convexa Rugosa Cremosa Blanco cremosa
6 N3-2B1 MEA Circular Ondulado Convexa Rugosa Cremosa Blanco cremosa
7 N3-2B1 MEB Circular Entero Convexa Rugosa Cremosa Blanco cremosa
8 N3-2C1A Circular Ondulado Convexa Rugosa Cremosa Blanco cremosa
Traslucida Brillante Gram (-) Bacilos
9 N3-2C1B Circular Ondulado Convexa Lisa Cremosa Blanco cremosa
10 N3-2C1C Circular Entero Convexa Rugosa Cremosa Blanco cremosa
11 N3-2C1D Circular Ondulado Convexa Lisa Cremosa Blanco cremosa
Opaca Opaca Gram (-) Bacilos
12 N3-2C1 ME Circular Ondulado Convexa Rugosa Cremosa Blanco cremosa
13 N3-7A Circular Entero Convexa Lisa Chiclosa Amarillo cremoso
14 N3-8A1 Circular Ondulado Convexa Lisa Mucosa Blanco cremosa
15 N3-8A1 ME Circular Entero Convexa Lisa Mucosa Blanco cremosa
16 N3-8B1 Circular Entero Convexa Lisa Mucosa Blanco cremosa
17 N3-8B1 ME Circular Entero Convexa Lisa Mucosa Blanco cremosa
18 CH2-3A1 ME Puntiforme Entero Convexa Lisa Cremosa Amarillo cremoso
Opaca Brillante Gram (-) Diplobacilos
19 CH2-3B1 Irregular Ondulado Plana Rugosa Cremosa Blanco cremosa
Traslucidad Brillante Gram (-) Diplobacilos
20 CH2-3B1 ME Irregular Ondulado Plana Rugosa Cremosa Blanco cremosa
Traslucidad Brillante Gram (-) Diplobacilos
21 CH3-1A Puntiforme Entero Convexa Lisa Cremosa Amarillo Traslucidad Opaca Gram (+) Bacilos
22 CH3-1A ME Circular Entero Convexa Rugosa Cremosa Amarillo cremoso
Traslucidad Opaca Gram (-) Bacilos
23 CH3-6A1 Circular Entero Convexa Lisa MembranosaBlanco cremosa Traslucidad Brillante Gram (+) Bacilos
24 CH3-6A1 ME Circular Entero Convexa Lisa MembranosaBlanco cremosa Traslucida Brillante Gram (-) Bacilos
25 CH4-1A1 Circular Entero Convexa Rugosa Cremosa Blanco cremosa
Traslucida Opaca Gram (+) Diplobacilos
53
Continuación del Anexo A
Aislados
26 CH4-1A1 ME Circular Ondulado Convexa Lisa Cremosa Blanco cremosa
Traslucida Opaca Gram (+) Diplobacilos
27 CH4-1B1 Puntiforme Entero Convexa Lisa Cremosa Blanco cremosa
28 CH4-1C1 Circular Entero Convexa Lisa Cremosa Blanco cremosa
29 CH4-1C1 MEACircular Entero Convexa Lisa Cremosa Blanco cremosa
30 CH4-1C1 MEBCircular Ondulado Convexa Lisa Cremosa Blanco cremosa
31 CH4-2A1 Circular Ondulado Convexa Rugosa Cremosa Blanco cremosa
Opaca Opaca Gram (-) Diplobacilos
32 CH4-2A2 Circular Ondulado Convexa Lisa Cremosa Blanco cremosa
Traslucida Opaca Gram (-) Diplobacilos
CH4-2B Circular Entero Convexa Lisa Cremosa Blanco cremosa
Opaca Opaca Gram (-) Cocobacilos
33 CH4-2C Circular Entero Convexa Lisa Cremosa Blanco cremosa
CH4-2D Circular Entero Convexa Lisa Cremosa Blanco cremosa
CH4-2E1 Irregular Ondulado Convexa Lisa Cremosa Blanco cremosa
CH4-2E2 Irregular Ondulado Convexa Lisa Cremosa Blanco cremosa
34
CH4-2F1 Irregular Ondulado Convexa Lisa Cremosa Blanco cremosa
CH4-2F2 Irregular Ondulado Convexa Lisa Cremosa Blanco cremosa
CH4-3A Circular Entero Convexa Lisa MembranosaBeige Trasluicda Brillante Gram (-) Bacilos
35
CH4-3B Circular Entero Convexa Lisa MembranosaBeige Trasluicda Brillante Gram (-) Bacilos
CH4-3C Circular Ondulado Convexa Lisa MembranosaBeige Traslucida Brillante Gram (-) Bacilos
36
CH4-3D Circular Ondulado Convexa Lisa MembranosaBeige Traslucida Brillante Gram (-) Bacilos
37 CH4-6 Puntiforme Entero Convexa Lisa Cremosa Beige Opaca Brillante Gram (-) Bacilos
CH4-7A Circular Ondulado Convexa Lisa Chiclosa Amarillo cremoso
38
CH4-7B Circular Ondulado Convexa Lisa Chiclosa Amarillo cremoso
CH4-7C Circular Entero Convexa Lisa Chiclosa Amarillo cremoso
39 CH4-7D Circular Entero Convexa Lisa Chiclosa Amarillo cremoso
CH4-7E Circular Entero Convexa Lisa Chiclosa Amarillo cremoso
54
Aislados
40 H2-1 Puntiforme Entero Convexa Lisa Cremosa Amarilla Opaca Opaca Gram (-) Diplobacilos
41 H2-2 Puntiforme Entero Convexa Lisa Cremosa Traslucida Opaca
Amarillo cremoso Gram (-) Diplobacilos
42 H2-3 Circular Entero Convexa Lisa Cremosa Trslucida
Amarillo cremoso Opaca Gram (-) Bacilos
43 H2-4A Circular Ondulado Convexa Lisa Cremosa Rosa cremosoTrasluicda Brillante Gram (-) Bacilos
44 H2-4B Circular Entero Convexa Lisa Cremosa Rosa cremosoTrasluida Brillante Gram (+) Bacilos
45 H2-6 Irregular Ondulado Convexa Lisa Cremosa Opaca
46 H2-7 Circular Entero Convexa Lisa Cremosa Opaca
47 H2-8A Circular Ondulado Convexa Lisa Mucosa Traslucida Opaca
Blanco cremosa Gram (+) Bacilos
48 H2-8B Circular Entero Convexa Lisa Mucosa Traslucida Opaca
H3-2A Circular Ondulado Convexa Lisa Mucosa Beige Traslucida Opaca Gram (-) Diplobacilos
49
H3-2B Circular Ondulado Convexa Lisa Mucosa Beige Traslucida Opaca Gram (-) Diplobacilos
H3-2C Circular Entero Convexa Lisa Mucosa Beige Traslucida Opaca Gram (-) Diplobacilos
50
H3-2D Circular Entero Convexa Lisa Mucosa Beige Traslucida Opaca Gram (-) Diplobacilos
H3-4A Circular Ondulado Convexa Rugosa MembranosaBeige Traslucida Brillante Gram (-) Bacilos
H3-4B Circular Ondulado Convexa Rugosa MembranosaBeige Traslucida Brillante Gram (-) Bacilos
51 H3-4C Circular Ondulado Convexa Rugosa MembranosaBeige Traslucida Brillante Gram (-) Bacilos
H3-4D Circular Ondulado Convexa Rugosa MembranosaBeige Traslucida Brillante Gram (-) Bacilos
H3-4F Circular Ondulado Convexa Rugosa MembranosaBeige Traslucida Brillante Gram (-) Bacilos
H3-5A Circular Entero Convexa Lisa MembranosaBeige Traslucida Brillante Gram (-) Diplobacilos
52
H3-5B Circular Entero Convexa Lisa MembranosaBeige Traslucida Brillante Gram (-) Diplobacilos
53 H3-5C Circular Ondulado Convexa Lisa MembranosaBeige Traslucida Opaca Gram (-) Bacilos
54 H3-6A Circular Ondulado Convexa Lisa MembranosaBeige Traslucida Brillante Gram (-) Diplobacilos
55 H3-6B Circular Entero Convexa Lisa MembranosaBeige Traslucida Brillante Gram (-) Diplobacilos
H3-6C Circular Entero Convexa Lisa MembranosaBeige Traslucida Brillante Gram (-) Bacilos
H3-6D Circular Entero Convexa Lisa MembranosaBeige Traslucida Brillante Gram (-) Bacilos
56
H3-6E Circular Entero Convexa Lisa MembranosaBeige Traslucida Brillante Gram (-) Bacilos
H3-6F Circular Entero Convexa Lisa MembranosaBeige Traslucida Brillante Gram (-) Bacilos
55
Aislados
H3-7 Circular Entero Elevada Lisa Cremosa Tralucida Opaca
Blanco cremosa Gram (-) Bacilos
57 H3-8A Circular Entero Elevada Lisa Cremosa Traslucida Opaca
H3-8B Circular Entero Elevada Lisa Cremosa Traslucida Opaca
58 C-LQA 1-5A Circular Entero Convexa Lisa Cremosa Opaca
Blanco cremosa Brillante Gram (+) Diplobacilos
59 C-LQA 1-5B Circular Entero Convexa Lisa Cremosa Opaca
Blanco cremosa Brillante Gram (+) Cocobacilos
C-LQA 1-6 Circular Ondulado Convexa Lisa Cremosa Traslucida Brillante
Blanco cremosa Gram (-) Cocobacilos
60
C-LQA 1-6A1 Circular Ondulado Convexa Lisa Cremosa Traslucida Brillante
61 C-LQA 1-6A2 Circular Ondulado Convexa Rugosa Cremosa Traslucida Opaca
62 C-LQA 1-6B Irregular Ondulado Convexa Rugosa Cremosa Traslucida Opaca
63 C-LQA 1-9A1 Circular Entero Convexa Lisa Cremosa Traslucida Opaca
64 C-LQA 1-9A2 Circular Entero Convexa Lisa Cremosa Traslucida Opaca
Blanco cremosa Gram (-) Diplobacilos
65 C-LQA 1-9A3 Circular Ondulado Convexa Lisa Cremosa Traslucida Opaca
66 C-LQA 1-9B Circular Entero Plana Plegada Cremosa Opaca
Blanco cremosa Opaca Gram (+) Bacilos
C-LQA 2-7A Circular Entero Convexa Lisa Cremosa Traslucida Opaca
Amarillo cremoso Gram (-) Bacilos
67 C-LQA 2-7B Circular Entero Convexa Lisa Cremosa Traslucida Opaca
C-LQA 2-7C Circular Entero Convexa Lisa Cremosa Traslucida Opaca
68 C-LQA 2-9 Irregular Ondulado Plana Rugosa Rugosa Traslucidad Brillante
69 C-LQA 3-1 Circular Entero Convexa Lisa Cremosa Trasluica
Blanco cremosa Opaca Gram (-) Cocobacilos
C-LQA 3-2A Circular Entero Convexa Lisa Cremosa Amarillo Traslucida Opaca Gram (-) Cocobacilos
70 C-LQA 3-2B Circular Entero Convexa Lisa Cremosa Amarillo Traslucida Opaca Gram (-) Cocobacilos
C-LQA 3-2C Circular Entero Convexa Lisa Cremosa Amarillo Traslucida Opaca Gram (-) Cocobacilos
71 C-LQA 3-7 Circular Entero Convexa Lisa Cremosa Opaca
Amarillo cremoso Brillante Gram (+) Cocobacilos
72 C-LQA 3-8 Puntiforme Entero Convexa Lisa Cremosa Opaca
Blanco cremosa Brillante Gram (+) Diplobacilos
73 C-LQA 3-12 Rizoide Rizoide Plana Rugosa Cremosa Opaca
74 C-LQA 3-13A Irregular Ondulado Plana Rugosa Cremosa Opaca
75 C-LQA 3-14 Circular Entero Plana Lisa Rugosa Traslucidad Opaca
Blanco cremosa Gram (+) Cocos
56

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UNIVERSIDAD VERACRUZANA

FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS

“Evaluación de la actividad antifúngica de bacterias asociadas a

Orizaba, Ver. Enero, 2019

Abreviaturas y símbolos Significado

BMM Bosque mesófilo de montaña

En México, el BMM está ligado a las condiciones particulares de altitud, humedad y

2.2 Complejo ambrosial Euwallacea sp. / F. euwallaceae

2.3 Los microorganismos y el control biológico

2.4 Comunidades bacterianas de corteza

4.2 Objetivo General

4.3 Objetivos Específicos

Figura 1. Localización del Santuario Bosque de Niebla en el municipio de Xalapa, Veracruz.

El aislamiento de las bacterias de corteza se realizó a partir de 1 g de muestra compuesta por

Posteriormente se tomaron muestras de colonias con características macroscópicas diferentes y

5.2 Reactivación de las cepas bacterianas

Tabla 1. Solución stock para la elaboración del medio M9.

Solución salina M9 (10X)

Figura 2. Características morfológicas de las colonias bacterianas (Stanchi et al., 2007).

Para montar los ensayos de antagonismo directo, se tomó un disco de micelio de 5 mm de

Donde R es el radio de crecimiento fúngico desde el centro de la placa hacia el control, y r es el

5.4.2 Evaluación in vitro de la actividad antifúngica mediante ensayos de antagonismo

Donde D es el diámetro de crecimiento fúngico sin el aislado bacteriano (Control), y d es el

Figura 5. Evaluación in vitro de la

5.5 Análisis estadísticos

Reactivos Concentración Volumen (µL)

Las muestras de ADN se amplificaron en un termociclador (Mastercycler, Nexus gradient) con

6.1 Caracterización morfológica de los aislados bacterianos

Especie de árbol Clave Hábitat Número de aislados

De estos aislados bacterianos, se obtuvo un total de 22 bacterias Gram positivas y 80 bacterias

6.2 Evaluación in vitro de la actividad antifúngica de los aislados bacterianos

Aislado bacteriano Radio de Radio de Porcentaje de

De los 75 aislados bacterianos que se probaron en los ensayos de antagonismo, 53 presentaron

Diámetro de Diámetro de Porcentaje de

CH2-3B1 6.47 ± 0.03 6.50 ± 0.00 0.51 ± 0.51

6.3 Identificación molecular de los aislados bacterianos con actividad antifúngica

En la literatura, se ha reportado que el género Pseudomonas es capaz de producir compuestos

El género Stenotrophomonas, encontrado en este estudio asociado a la corteza de P. mexicana

En la Figura 14 se muestra la actividad antifúngica del aislado bacteriano CH4-3A,

Se encontró que 53 aislados bacterianos presentaron una actividad antifúngica significativa

Al identificarse molecularmente se determinó que estos aislados pertenecen a los géneros

En los ensayos de antagonismo indirecto, 16 aislados mostraron actividad antifúngica

Este estudio amplió un campo de conocimiento poco estudiado y demostró el potencial de

CONABIO. (2010). El Bosque Mesófilo de Montaña en México: Amenazas y Oportunidades

Egamberdieva, D., Jabborova, D. y Berg, G. (2015). Synergistic interactions between

Escudero-Osorio, Yonatan S. (2018). Evaluación de la actividad antifúngica de aislados

Fincheira, P. y Quiroz, A. (2018). Microbial volatiles as plant growth inducers. Microbiological

García-Quiroz, W. (2017). Evaluación de la actividad antifúngica de bacterias asociadas a la

Guevara-Avendaño E, Carrillo JD, Ndinga-Muniania C, Moreno K, Méndez-Bravo A,

Hernández-León, R., Rojas-Solís, D., Contreras-Pérez, M., Orozco-Mosqueda, M., Macías-

Jankiewicz, U., Brzezinska, M. y Saks, E. (2012). Identification and characterization of a

Morteo-Zavaeta, J. (2017). Cracterización e identificación de bacterias asociadas a rizósfera y

Organización de las Naciones Unidas para la Agricultura y la Alimentación (FAO). (2012).

Rojas-Solís, D., Zetter-Salmón, E., Contreras-Pérez, M., Rocha-Granados, M., Macías-

Sánchez-Velásquez, L., Galindo-González, J. y Díaz-Fleischer, F. (2008). Ecología, manejo y

Santoyo, G., Moreno-Hagelsieb, G., del Carmen Orozco-Mosqueda, M. y Glick, B. (2016).

SENASICA. (2016). Escarabajo Barrenador Polífago (Euwallacea sp.). Servicio Nacional de

Sundaramoorthy, S., Raguchander, T., Ragupathi, N. y Samiyappan, R. (2012). Combinatorial

Williams-Linera, G. 2015. El bosque mesófilo de montaña, veinte años de investigación