Barcenas G
Barcenas G
Barcenas G
TESIS
Que para obtener el grado de
Maestro en Ciencias
Presenta
Dedicatoria
A mi madre, mi familia
Los pulpitos
iv
Agradecimientos
CIBNOR.
UNAM – UAS.
Comité Tutorial: Dr. Carlos Rosas Vázquez, Dr. José Manuel Mazón Suástegui, Dr. Ángel
Campa Córdova.
Contenido
1. INTRODUCCIÓN .................................................................................................................. 1
1.2 Cefalópodos................................................................................................................... 2
1.5 Temperatura................................................................................................................ 11
2. ANTECEDENTES ................................................................................................................ 18
2.2 Temperatura................................................................................................................ 19
3. JUSTIFICACIÓN.................................................................................................................. 22
4. HIPÓTESIS ......................................................................................................................... 22
5. OBJETIVOS ........................................................................................................................ 23
8. DISCUSIÓN ........................................................................................................................ 47
9. CONCLUSIONES ................................................................................................................ 54
Lista de Figuras
Lista de tablas
1. INTRODUCCIÓN
1.1 Acuicultura
La producción acuícola ha tenido un marcado crecimiento en las últimas décadas como una
respuesta a la continua demanda de alimentos y a los problemas de abastecimiento que
enfrenta el sector pesquero mundial. (FAO, 2016). Aunque, la acuicultura en gran medida
ha sido dulceacuícola, en las últimas décadas el estudio de los organismos marinos han
permitido el desarrollo de la maricultura para producir especies de interés comercial. Los
productos marinos pueden constituir hasta el 60 % de la dieta base de un adulto, pues son
una fuente natural de proteína y de ácidos grasos poliinsaturados (PUFAs), que son de
importancia para la salud. Es por esto que ha aumentado la demanda de productos marinos,
disparando el crecimiento del sector acuícola, de acuerdo a la FAO, en el 2016 la producción
mundial por acuicultura dejó una derrama económica de 137 732 millones de dólares. Este
sector también está en proceso de crecimiento en Latinoamérica de, pasando de producir
179,367 toneladas en 1990 a 2’565,107 toneladas en el 2012. Con un comportamiento de
crecimiento similar, en años recientes la acuacultura en México, dejó una derrama
económica de 15 mil 940 millones de pesos (SIAP, 2016).
México es de los 18 países que más contribuyen a la producción mundial pesquera, en cierta
medida por el aprovechamiento de especies con grandes volúmenes de captura, como la
sardina, atún, camarón, anchoveta, mojarra, ostión, calamar, jaiba, pulpo y tiburón
(CONAPESCA, 2016). El pulpo pese a que ocupa el doceavo lugar en volumen de captura, es
una de las especies con mayor valor comercial. Su pesquería, en el 2016, generó en el
mercado internacional 57 millones 169 mil dólares (SIAP ,2016). Yucatán ha sido el estado
con mayores volúmenes de captura de pulpo, generando un valor de 700 millones de pesos
anuales. Esta entidad también cuenta con 23 plantas certificadas para el procesamiento y
2
exportación de pulpo, que permiten el envío del 70% del producto a Europa y Japón
(CONAPESCA, 2015).
1.2 Cefalópodos
Los cefalópodos son organismos invertebrados que se distribuyen en todos los oceános,
desde aguas someras hasta aguas profundas. Existen siete órdenes aceptados (GBIF, 2016):
Teuthida (Naef, 1916), Nautilida (Agassiz, 1847), Octopoda (Leach, 1818), Sepiida (Zittel,
1895), Sepiolida (Fioroni, 1981), Spirulida (Stolley, 1919) y Vampyromorphida (Pickford,
1939). Los cefalópodos pueden dividirse en tres grupos principales, los que poseen concha
externa (Nautilus) o una concha interna (sepias y calamares) y los que no tienen concha
(pulpos). Las sepias, los calamares y los pulpos comparten diversas características, como el
hábitat y comportamiento (Tabla I).
3
Tabla I. Aspectos generales del comportamiento de los grupos más grandes de cefalópodos
Comportamiento Sepias Calamar Pulpo
(Béntico, Semi-béntico) Pelágico Béntico
Sentido más desarrollado Visual y químico Visual y mecánico Visual y químico
En el Orden octópoda se encuentran los pulpos, cefalópodos de ocho brazos que carecen
de concha interna. Su cuerpo en sentido proximal a distal, se divide en manto, cabeza y
cuerpo (Fig. 1). El manto además de controlar la característica propulsión a chorro, es un
saco que envuelve los órganos internos del sistema respiratorio, circulatorio, digestivo y
reproductor. En la parte lateral de la cabeza están localizados los ojos, y en el interior está
el sistema nervioso central, el cual está muy desarrollado (Guerra-Sierra, 1992; Rocha,
2003).
4
b
c a
Estos cefalópodos además de ser gonóricos, presentan dimorfismo sexual. Los machos
poseen un brazo hectocotilizado, estructura por la que se traslada el espermatóforo hacia
el interior de la hembra durante el apareamiento. La maduración sexual en las hembras se
alcanza cuándo el saco ovárico y el oviducto contienen ovocitos, y en los machos cuando el
testículo se ha desarrollado y el saco de Needham contiene espermatóforos (Ávila-Poveda
et al., 2009; Rocha, 2003).
1990, Correia et al., 2005) Octopus mimus (Uriarte et al.,2012), el Octopus vulgaris
(Domingues et al., 2010; Miliou et al., 2005), Octopus maya (Martines et al., 2014; Noyola
et al., 2013; Rosas et al., 2014; Walker et al., 1970) y Octopus bimaculoides (Hanlon, 1988;
Solorzano et al., 2009).
Reino Animalia
Subreino Bilateria
Infrareino Protostomia
Superfilo Lophozoa
Filo Mollusca
Clase Cephalopoda (Cuvier, 1797)
Subclase Coleoidea (Bather, 1888)
Superorden Octobrachia (Fioroni, 1981)
Orden Octopoda (Leach, 1818)
Suborden Incirrina (Gimpe, 1916)
Familia Octopidadae (Ferussac y D’orbygni 1834 – 1848)
Subfamilia Octopodinae (Grimpe, 1921)
Género Octopus (Cuvier, 1797)
Especie Octopus bimaculoides (Pickford y McConnaughey,
1949)
A B
El desarrollo embrionario de los cefalópodos se divide en veinte estadios (Naef, 1928). Los
estadios han sido divididos por eventos fisiológicos destacados, como el crecimiento de
ciertas características morfológicas y la organogénesis (Castro- Fuentes et al., 2002; Naef,
1928; Watanabe et al., 1996).
Una vez terminado el desove, los huevos fertilizados pueden ser reconocidos por la
aparición del espacio perivitelino (sp; Fig. 4). Posteriormente se inicia la meiosis y la
segmentación (estadio I). Durante las primeras horas post desove se puede observar la
aparición de los cuerpos polares. El primer surco de división celular se puede observar entre
las 9-24 h post desove. La división celular continúa hasta formar el blastodermo (Fig. 5).
A sp B
sp
Figura 4. Huevos de cefalópodo fertilizados. (A) Aparición del espacio perivitelino (sp).
Modificado de Watanabe et al. (1996). (B). Espacio perivitelino. Modificado de Lenz et al.
(2015).
8
A B C
Figura 5. Proceso de división celular, mostrado desde una vista apical del huevo. (A) y (B)
Primeras divisiones celulares, Modificado de Naef (1928) y Watanabe et al. (1996). (C)
Formación del blastodermo. Modificado de Naef (1928).
Durante la gastrulación y primera reversión del embrión (estadios del II- VIII) se inicia la
formación de las capas germinales. Del estadio III al V, el disco germinal (blastodermo) se
expande. En el estadio VI, se pueden apreciar distintas concentraciones de células del
mesodermo en la porción de vitelo recubierto. Para el estadio VII las células del
blastodermo (bd) ya cubren cerca de tres cuartos del vitelo (v) (Fig. 6A), para continuar
expandiéndose hasta recubrir todo el vitelo. En el estadio VIII, comienza la primera
reversión del embrión, el polo animal (pa) va del ápice del huevo al pedúnculo (Fig. 6B),
también se inicia la diferenciación de las que serán las estructuras funcionales.
9
A B pa
pa
Figura 6. Formación de capas germinales. (A) Células del blastodermo (db) cubriendo el
vitelo (v). (B) Inversión del embrión, el polo animal (pa) migra hacia el pedúnculo del
huevo. Modificado de Castro-Fuentes et al. (2002).
A B
Figura 7. Crecimiento del embrión. (A)Embrión con la retina pigmentada y los brazos bien
definidos. Fotografía por Bárcenas-Ibarra (2016). (B)Embrión entre estadios XVI y XVIII.
Modificado de Lenz et al. (2015).
A B
1.5 Temperatura
La temperatura, por los efectos que tiene sobre las funciones biológicas en los organismos,
es un factor que participa en la distribución de cada especie. En los animales ectotermos la
temperatura ambiental tiene efectos sobre la temperatura corporal y como consecuencia
sobre sus reacciones bioquímicas (Randall et al., 2002).
Al ser una medida de calor, la temperatura afecta la energía cinética en las moléculas,
provocando en los organismos dos efectos principales: el aumento en la energía cinética de
moléculas reactivas (enzimas principalmente) y la desnaturalización de macromoléculas
(Randall et al., 2002).
En una temperatura óptima, las biomoléculas (i.e. las enzimas) muestran una actividad
máxima, permitiendo que las funciones biológicas sean eficientes. Como las enzimas son
proteínas, están expuestas a la desnaturalización en temperaturas fuera del intervalo
óptimo, lo que puede generar el malfuncionamiento de los sistemas en los organismos. En
condiciones extremas el daño causado a nivel de membranas y proteínas se vuelve
irreversible. La medición de estos fenómenos fisiológicos, permite establecer la llamada
ventana térmica, cuya amplitud y características dependen de cada especie (Fig. 9).
12
Los radicales libres se tornan en átomos o moléculas inestables al donar electrones durante
la cadena respiratoria y quedar con uno o más electrones desapareados (Manduzio et al.,
2005). El anión superóxido se forma por diferentes reacciones de auto-oxidación, por la
reducción de un electrón del oxígeno molecular (O2) o durante la cadena de transporte de
electrones (Fig. 10A). Este anión aunque tiene baja reactividad, posee la capacidad de
liberar el Fe2 de proteínas férricas o grupos sulfuro, haciéndolo precursor para la formación
del radical hidroxilo. El peróxido de hidrógeno, resulta de la reducción directa del oxígeno
vía dos electrones (Fig. 10B) o bien por la reducción del radical superóxido (Fig. 10C). Su
liposolubilidad le permite la difusión entre las membranas, y es un intermediario para la
producción de otras especies reactivas de oxígeno (Manduzio et al., 2005).
14
El radical hidroxilo es generado por la reducción de tres electrones (Fig. 10D), vía reacción
de Fenton (Regoli y Giuliani, 2014), por la reducción del peróxido de hidrógeno o por la
descomposición del peroxinitrito (ONOO-). Los radicales peroxilos (ROO-) se producen en
las cadenas de los ácidos grasos en la presencia de oxígeno, sea por la adición de un radical
a un doble enlace o por la pérdida de un hidrógeno. El radical hidroxilo, el oxígeno singlete
y el peroxinitrito, son las especies reactivas más perjudiciales para los tejidos (Hermes-Lima
y Zenteno-Savin., 2002).
Figura 10. Reducción completa del oxígeno molecular a agua, vía cuatro electrones. [A] La
reducción con un electrón produce el anión superóxido. [B] El peróxido de hidrógeno se
genera por la reducción directa de dos electrones o bien en cascada [C], después de la
reducción de un electrón. [D] El radical hidroxilo se produce con la reducción vía un electrón
del peróxido de hidrógeno. [E] la reducción vía un electrón del radical hidroxilo produce
agua. Modificado de Winston y DiGiulio (1991).
propensas a causar daño a las biomoléculas, como el DNA, lípidos y proteínas, o bien de la
muerte celular (Manduzio et al., 2005; Marnett, 2000; Meng et al., 2014).
Las células utilizan dos mecanismos para contrarrestar los efectos de grandes
concentraciones de especies reactivas: la vía enzimática y la no enzimática (Tabla II)
(Buttermer et al., 2010; Di Giulio et al., 1989). En conjunto estas dos, forman el sistema
antioxidante (AOX). Esta respuesta compensatoria ayuda a mantener la homeostasis
celular, y es estimulada cuando hay alteraciones en el estado redox de la misma (Buttke y
Sandstrom, 1994; Rodrigues–Fuentes et al., 2017). Sin embargo, cuando el sistema
antioxidante de la célula se ve rebasado por la producción de especies reactivas de oxígeno,
este balance se pierde y la célula entra en un estado de estrés oxidativo (Abele y Puntarulo,
2004).
Sistema antioxidante
et al., 2006). El Glutatión reducido (GSH), que está presente en altas concentraciones en el
citoplasma celular, actúa directamente sobre las especies reactivas y como cofactor de la
glutatión peroxidasa (GPx) y la glutatión S-transferasa (GST). Cuando el GSH actúa con estas
dos últimas, pasa a su forma oxidada: GSSG, que posee dos moléculas GSH unidas que
forman un puente disulfuro. La glutatión reductasa (GR) reconvierte la forma oxidada a GSH
usando NADPH como agente reductor. El equilibrio entre GSH y GSSG, mantiene un estado
reducido de la célula, que ayuda a prevenir el daño oxidativo. El GSH representa cerca del
95% del glutatión celular (Lobo et al., 2010), por lo que un aumento en la concentración de
GSSG se puede interpretar como un indicador de estrés oxidante en la célula (Manduzio et
al., 2005; Regoli et al., 2011).
A B
Figura 11. Reacciones enzimáticas del sistema antioxidante. (A) Principales reacciones
enzimáticas para el metabolismo de especies reactivas de oxígeno. (B) Cuando la
producción de superóxido sobrepasa el sistema antioxidante (AOX) la célula entra a un
estado de estrés oxidativo, generando especies reactivas de oxígeno y radicales libres
altamente reactivos como el hidroxilo (OH-). Modificado de Casteilla et al. (2001).
El estrés oxidativo puede estar causado por procesos internos como la edad, enfermedades
y el peso corporal, o bien por condiciones ambientales como la presencia de contaminantes,
cambios en la concentración de oxígeno disuelto, la salinidad o la temperatura (Hermes-
Lima y Zenteno-Savin, 2002; Li et al., 2016; Zielinski y Pörtner, 2000). El estrés oxidativo
17
puede ser medido indirectamente con algunos biomarcadores tales como la peroxidación
de lípidos (Li et al., 2016), la actividad de enzimas como la colinesterasa y carboxilesterasas
(Barata et al., 2007; Slotkin, 2004) y la actividad del sistema antioxidante (AOX) (Lushchak
et al., 2011; Manduzio et al., 2005;). La peroxidación de lípidos se genera en los ácidos
grasos (AG), principalmente en los ácidos grasos polinsaturados (PUFA), porque los
hidrógenos alílicos (H-C-H) adyacentes a uno con doble enlance (H=C=H), son fácilmente
sustituidos/ removidos por los radicales libres (Buttermer et al., 2010; Halliwell y
Gutteridge, 2007). Cuando este proceso ocurre, el carbón se queda con un electrón libre e
interactúa fácilmente con un oxígeno formando el reactivo radical peroxilo, que ataca la
membrana fosfolipídica y proteica, desencadenando una cascada de reacciones en la
cadena de los ácidos grasos poliinsaturados (PUFAs). La susceptibilidad a la peroxidación
lipídica es directamente proporcional a la cantidad de insaturaciones presentes en los
ácidos grasos (Marnett et al., 2000; Repolho et al., 2014).
al., 2008) al hidrolizar esteres tanto endógenos como exógenos, este mecanismo protege
al organismo de algunos xenobióticos y disminuye el riesgo de inhibición de la AchE. (Barata
et al., 2004). Tanto la AchE y las CbEs son utilizados en múltiples estudios como indicadores
de neurotoxicidad.
2. ANTECEDENTES
Las primeras etapas dentro del ciclo de vida, se consideran críticas para el éxito de una
especie en estado silvestre. Esto ha impulsado el estudio del curso natural de la
embriogénesis y cómo esta fase puede ser modulada y alterada por cambios en las
condiciones ambientales (Parra et al., 2000; Villanueva et al., 2011). Naef (1928) hizo una
detallada descripción del desarrollo embrionario de Octopus vulgaris, y lo clasificó en veinte
estadios embrionarios (XX), su trabajo sentó precedentes para diversos estudios con
embriones de cefalópodos. Otros estudios descriptivos del desarrollo embrionario se han
hecho en Octopus aegina (Ignatius y Srinivason, 2006), Todarodes pacificus (Watanabe et
al., 1996) y en Octopus mimus (Castro- Fuentes et al., 2002) y Loligo peleali (Arnold, 1965).
Mangold et al. (1971), con el fin de aportar más información sobre la reproducción de
Eledonde cirrosa, realizó una detallada descripción morfológica de las veinte etapas en las
que se divide el desarrollo embrionario de estos octópodos (basado en Naef, 1928). Ortiz
et al. (2006), en su estudio descriptivo de los huevos y crías de Enteroctopus megalocyathus,
utilizaron características morfológicas específicas, tales como la longitud y anchura del
huevo, longitud del vitelo, longitud del manto, de brazos, sifón y diámetro del ojo.
Asimismo, Carrasco et al. (2014), para poder diferenciar entre los huevos y las paralarvas
de Octopus huttoni y Pinnoctopus Cordiformi hicieron un trabajo descriptivo de las
19
características morfológicas particulares. Lenz et al. (2015) describieron por primera vez,
bajo condiciones de laboratorio, gran parte del ciclo reproductivo de Octopus insularis: los
desoves, los huevos, el porcentaje de fecundidad y las paralarvas. Los estudios relacionados
a las etapas tempranas de desarrollo en los cefalópodos, han sido realizados con diversos
enfoques y aplicaciones.
2.2 Temperatura
Con Octopus maya, Juárez et al. (2015), evaluaron los efectos de la temperatura en distintas
etapas de desarrollo fisiológico, y encontraron que a una temperatura de 31° C solo un 13%
de las hembras desovó, a diferencia del100 % de hembras que desovaron cuando fueron
mantenidas a 24 °C. De igual manera, las crías provenientes de hembras expuestas a altas
temperaturas tuvieron un menor porcentaje de supervivencia que las obtenidas de
hembras provenientes del grupo control (24°C).
Villanueva (2000) encontró otro efecto de la temperatura en el calamar Loligo vulgaris, pues
las variaciones de este parámetro afectaron el crecimiento de las paralarvas: a bajas
temperaturas los organismos resultaron ser más robustos que los expuestos a temperaturas
mayores. Caamal-Monsreal et al. (2016) con Octopus maya, obtuvieron resultados
similares, los embriones incubados dentro de un rango de temperatura óptima se
desarrollaron con mejores características físicas que aquellos incubados en temperaturas
subóptimas, es decir que la temperatura de incubación repercute en la capacidad de los
juveniles para sobrevivir después de la eclosión. El efecto de la temperatura sobre las
primeras etapas de desarrollo también se han estudiado en Octopus mimus (Zuñiga et al.,
2013) y Octopus megalocyathus (Uriarte et al., 2015). Este tipo de estudios, además de que
permiten entender los efectos ambientales sobre la reproducción y durante las etapas
tempranas, son necesarios para implementar el manejo zootécnico de algunas especies,
que como los pulpos, tienen potencial de cultivo.
21
3. JUSTIFICACIÓN
Las primeras etapas de vida son consideradas clave para la supervivencia de la especie y
altamente susceptibles a los cambios ambientales. Desde este punto de vista, el estudio de
los efectos de la temperatura durante las fases de desarrollo embrionario de los
cefalópodos, ha sido útil para conocer la forma en que los cambios ambientales modulan a
las poblaciones naturales y a los organismos cultivados (Juarez et al., 2015; Sánchez-García
et al., 2017; Uriarte et al., 2015). En el presente trabajo las temperaturas experimentales
fueron establecidas utilizando la información disponible sobre la especie, que junto con las
proyecciones de calentamiento global según el IPCC, permitirán establecer los efectos de la
temperatura en el desarrollo embrionario de O. bimaculoides. Esta clase de información
puede ser aplicada con distintos fines, sea para la conservación de las poblaciones, para un
manejo pesquero adecuado o bien para establecer parámetros productivos eficientes para
el manejo zootécnico de la especie. Así, el presente estudio ha sido planteado para
responder a la siguiente pregunta de investigación:
4. HIPÓTESIS
Si Octopus bimaculoides tiene la capacidad para tolerar las variaciones térmicas naturales
de su hábitat, se puede suponer que temperaturas mayores a las de la época reproductiva
en el medio natural (16 - 18 °C) no sean deletéreas para los embriones, ya que estos también
deberían poseer los mecanismos fisiológicos que les permitan controlar el aumento de las
especies reactivas de oxígeno, y evitar efectos adversos sobre el desarrollo y crecimiento
embrionario.
23
5. OBJETIVOS
5.2.1 Conocer el efecto de cuatro temperaturas experimentales (16, 18, 20 y 22 °C) sobre
los cambios morfológicos durante el desarrollo y crecimiento embrionario, así como la
sobrevivencia en ayuno de juveniles recién eclosionados, de O. bimaculoides.
5.2.2 Determinar el efecto de cuatro temperaturas experimentales (16, 18, 20 y 22 °C)
sobre la respuesta antioxidante en los embriones de O. bimaculoides.
6. MATERIAL Y MÉTODOS
Los huevos con los que se realizó el presente estudio fueron obtenidos en la bahía de
Guerrero Negro, Baja California (Figs. 12 y 13). Con el apoyo de pescadores locales, se
identificaron refugios de hembras silvestres y se seleccionaron las puestas de huevos
(N=15). Los huevos en estadio inicial de desarrollo, fueron colocados en bolsas de plástico
con agua de mar y oxígeno. Cada bolsa fue colocada dentro de una hielera a una
temperatura de 16 °C ± 1 (Fig. 14), para el transporte al Centro de Investigaciones Biológicas
del Noroeste S.C. en La Paz, B.C.S.
24
Figura 12. Sitio de recolección: Bahía de Guerrero Negro, frontera entre Baja California
Sur y Baja California.
Figura 13. Refugios utilizados por las hembras silvestres de O. bimaculoides para desovar.
25
En una sala experimental con aire acondicionado, se preparó una incubadora con 16 tinas
de fibra de vidrio de 30 L, con el objetivo de colocar los huevos recolectados (Fig. 15A). Se
utilizaron ocho tinas con un sistema de circulación abierto con recambio de 300 % d-1 y
aireación constante. El flujo de agua provenía de un sistema con filtro de malla (20 μm),
filtro de carbono, luz UV y un equipo de enfriamiento (chiller), este último se utilizó para
mantener la temperatura de entrada al sistema a 16 °C (temperatura control). Se
acondicionaron tres reservorios de 150 L, cada uno con un calentador sumergible de 200
watts, para mantener las otras temperaturas experimentales en la incubadora (18, 20 y 22
°C; Fig. 15B). La incubación se hizo por duplicado en cada temperatura.
26
A
d B
Figura 15. Sistema de incubación. A) Incubadora para O. bimaculoides. a=18 °C; b=16 °C,
c=20 °C; d=22 °C. B) Reservorios utilizados para estabilizar las temperaturas experimentales
A
B
A B
Para iniciar el bioensayo, los huevos colectados fueron distribuidos al azar en las tinas (Figs.
16A, 16B).Una vez colocados, se procedió a aumentar paulatinamente la temperatura de
cada sistema a razón de 1 °C por hora aproximadamente, hasta alcanzar los 18, 20 y 22 °C.
27
Cada huevo fue pesado en una balanza analítica. Posteriormente, se tomó la fotografía in
vivo en un medio húmedo, utilizando un estereoscopio Nikon SMZ25 cámara DS-Fi3 Nikon,
cuyo aumento se ajustó al tamaño de los embriones (1x, 2x o 0.63x). Los huevos y
embriones (en mm) fueron medidos con el programa Nikonj2000. Con las fotografías se
clasificaron los estadios embrionarios. Las medidas realizadas fueron (Fig. 17):
1. Longitud total del huevo (LT)
2. Anchura total (A)
3. Longitud del vitelo (LV)
4. Longitud del manto (LM)
5. Longitud de la cabeza (LC)
6. Diámetro del ojo
7. Longitud de brazo
28
LM
LC
LT
LV LB
V
DO
A
Figura 17. Parámetros de crecimiento registrados en embriones de O. bimaculoides
incubados a diferentes temperaturas experimentales. LT= longitud Total; A= anchura del
huevo; LV= longitud de vitelo; LM=longitud de manto, LC= longitud de cabeza; LB= longitud
de brazo, DO= diámetro del ojo.
Para la medición de la actividad enzimática, los embriones fueron separados del vitelo en
frío. Los embriones de cada muestreo fueron agrupados en tres grupos, cada uno con cinco
29
embriones. Las muestras fueron mantenidas en ultra congelación a -80 °C, hasta el proceso
de liofilización.
Para el análisis enzimático, las muestras liofilizadas se re-suspendieron en Buffer Tris 7.4 y
fueron homogeneizadas. Se hicieron tres alícuotas, de las que se cuantificaron la proteína
total, el Glutatión total (GSH) y la lipoperoxidación (LPO). Posteriormente, para precipitar la
proteína, las muestras se centrifugaron en frío 1000 x g a 4 °C. Del sobrenadante, se
prepararon cuatro alícuotas para analizar la superóxido dismutasa (SOD), la catalasa (CAT),
la glutatión S tranferasa (GST), la acetilcolinesterasa (AchE) y la carboxilesterasa (CbE) (Fig.
18).
Figura 18. Preparación de las muestras para cuantificar la actividad del sistema
antioxidante.
30
Para cuantificar la actividad de la enzima superóxido dismutasa, se utilizó el KIT Sigma 19160
con un método indirecto, donde una reducción de WST-1(2-(4-lodofenil)-3-(4-nitrofenil)-
5(2,4-disulfofenil)-2H- tratrazolium, (sal monosódica) con un anión superóxido provoca una
tinción; la tasa de esta reacción con el oxígeno, se relaciona a la actividad de la xantin
oxidasa, la cual es inhibida por la SOD. La actividad de SOD de mide a través de esta
inhibición (IC50%) con colorimetría a una absorbancia de 440 nm, que se expresa como
como μmol / min / mg de proteína-1
La determinación de la enzima Glutation S transferasa, se hizo por triplicado con el Kit Sigma
CS04, la reacción se inicia cuando la enzima cataliza la unión de GSH (glutatión) + CNDB 100
31
La cuantificación del glutatión total, se hizo por duplicado basado en Kit de Sigma CA0260.
El método se basa en dos reacciones, 1. El glutatión es oxidado por el DTNB (2-ácido
nitrobenzoico) produciendo TNB (5-thio-2-ácido nitrobenzoico) y GSSG (glutatión en forma
oxidada). 2. El GSSG es reducido por la glutatión reductasa (GSSr) y NADPH para
recomponerse a GSH y NADP. La tasa de formación de TNB se lee en el espectrofotómetro
con módulo de cinética a una longitud de onda de 405 nm. La cantidad de GSH se determina
utilizando una curva estándar de GSSH (0.5, 0.25, 0125, 0.0625, 0.0312 nmol de GSH/ 10
μLde muestra). La actividad específica de GSH se expresa μmol / min / mg de proteína-1
Para determinar la actividad de las colinesterasas (método de Ellman et al., 1961) en las
muestras, por triplicado, se utilizó una solución DNTB/ Tris 7.4 (5,5-ditiobis-2-ácido
nitrobenzoico) como indicador de la liberación de la tiocolina durante la reacción de la
acetilcolina con el sustrato, el producto de esta reacción, el tionitrobenzoato, se cuantificó
con un módulo de cinética a 24° C y una absorbancia de 405 nm. Para la cuantificación de
CbE el sustrato utilizado fue pNPA (1 mM) aplicando un método modificado de Hosokawa
y Soth (2002). La actividad de AcHe y CbE se expresó en U mg de proteína-1.
32
Para determinar la peroxidación de lípidos, se usó como base la reacción de oxidación que
causan los peróxidos de Fe2+ a Fe3+en un pH ácido. Una solución de trabajo a base de sulfato
ferroso (1 mM), ácido sulfúrico (0.25 M) y naranja de xylenol (1 mM) se agregó a la muestra
y se dejó incubar a temperatura ambiente por 60 minutos. El producto generado en la
reacción se leyó en un espectrofotómetro a una longitud de onda de 595 nm. La
peroxidación se calculó en base a una curva estándar tipo TBOOH. El resultado se expresa
en nmol de peróxido por mg de tejido-1.
Para identificar cuales características morfológicas fueron las más afectadas por la
temperatura, se aplicó un análisis de componentes principales. Este análisis permite la
estructuración de un conjunto de datos multivariados obtenidos de una población, cuya
distribución de probabilidades no necesita ser conocida (Pla, 1986). El propósito fue:
33
Para llevar a cabo este análisis se consideraron las proyecciones de las variaciones
morfométricas para los componentes 1 y 2, que fueron expresados como los cosenos
cuadrados representados en ambos ejes. Los valores de los cosenos cuadrados mayores a
0.8 fueron considerados como aquellos que tuvieron mayor influencia en el análisis.
y = axb (1)
Donde Y es la longitud de brazo, manto o diámetro del ojo y X es la edad de los embriones,
a y b son constantes.
34
Donde β= Arc tan (Si + 1 Sinα/ Si - Si + 1 cosα), α es 2π/n radianes, y Si es el valor obtenido de
cada biomarcador. Con la suma de las áreas Ai (4), se obtiene el valor de IBR, donde n es el
número de biomarcadores (Sánchez-García et al., 2017).
7. RESULTADOS
En este trabajo fueron identificados veinte (XX) estadios embrionarios para Octopus
bimaculoides. La clasificación se hizo utilizando muestras de las cuatro temperaturas
experimentales y estuvo basada en los trabajos de Naef (1928), Castro-Fuentes et al., (2002)
y Watanabe et al. (1996). En los huevos fecundados (Fig. 19A) el vitelo y el corion se
separaron por la expansión del espacio perivitelino. Posteriormente se inició la división
celular y la formación del blastodisco o disco embrionario en la parte distal del huevo (lado
contrario al pedúnculo) (Fig. 19B). El blastodermo recubrió gradualmente el vitelo (en
sentido posteroanterior) durante los estadios II - VII (Fig. 19C). En el estadio VIII (Fig. 19D)
se observó la migración del embrión hacia la parte proximal del huevo (el pedúnculo),
posteriormente se inició la organogénesis. Durante los estadios IX al XIII el crecimiento de
los brazos fue evidente, aparecieron las primeras ventosas y la retina comenzó a tener
cambios de coloración (Fig. 19E). La formación del saco vitelino interno, localizado en la
parte caudal del manto, los primeros cromatóforos en las zonas del manto, cabeza y brazos,
y el iris totalmente pigmentado se observaron a partir de los estadios XIV a XV. En los
estadios embrionarios siguientes, (XVI a XVIII) además del crecimiento del saco vitelino
interno, la organogénesis se completó, dejando funcionales sistemas como el respiratorio y
circulatorio (Figs. 19G, 19H). La segunda inversión del embrión ahora hacia el polo posterior
del huevo se presentó en el estadio XIX, también se observó un saco vitelino interno
abundante y crecimiento de la glándula digestiva, en esta etapa los embriones estuvieron
fisiológicamente listos para la eclosión. (Figs. 19I, 19J).
36
A B
C D P
V
BL
hh
E F
Sv
R
Cr
B
Ve
Figura 19. Embriones en estadio VII al XV. C) Estadio VII: Blastodermo (BL) cubriendo cerca
del 90 % de vitelo (V). D) Estadio VIII Primera inversión del embrión, migra hacia el
pedúnculo (Pd). E) Estadio XIII: (X – XIII) inicio de la organogénesis, desarrollo de brazos (B),
pigmentación de la retina (R), aparición de ventosas (Ve). F) Estadio XV: formación de saco
vitelino interno (Sv), aparición de los primero cromatóforos (Cr).
38
G H
Sv
Gd
I J
Figura 19. Embriones en estadios del XVI al XIX. G) Estadio XVI: crecimiento del saco vitelino
interno, formación de la glándula digestiva. H) Estadio XVII – XVIII: órganos totalmente
desarrollados. I) Estadio XIX: segunda inversión del embrión. J) Embrión preparado para la
eclosión.
39
Los resultados muestran que la temperatura experimental afectó la tasa de cambio de los
estadios con respecto al tiempo. (Fig. 20). En los embriones incubados a 20 y 22 °C, la
pendiente de la relación entre estadio y tiempo (días) resultó ser significativamente más
elevada que en los embriones cultivados a 16 y 18 °C (P< 0.0001). Los embriones
mantenidos a la temperatura más alta (22 °C) alcanzaron el estadio diecinueve (XIX) 50 días
antes que los embriones mantenidos a 16 °C, y 20 días antes que los embriones expuestos
a 18 °C. Los embriones mantenidos a 20 °C alcanzaron el último estadio de desarrollo 30 y
10 días antes que los organismos expuestos a 16 y 18 °C respectivamente (Fig. 20).
Tabla III. Valores de la correlación múltiple derivada del análisis de componentes principales
(PCA) en relación al efecto la temperatura sobre los cambios morfométricos de los
embriones de O. bimaculoides incubados a 16, 18, 20 y 22 °C.
Con esta información se procedió a establecer la forma en que la temperatura moduló las
características morfológicas medidas. La relación entre las variables morfológicas y el
estadio de desarrollo de los embriones expuestos a las distintas temperaturas fue
representada por la ecuación exponencial Y= aebx. El crecimiento del ojo y los brazos
mostraron alta correlación con la temperatura. El manto se desarrolló a una velocidad
similar en los cuatro tratamientos (p > 0.05, Tabla IV). La relación del consumo del vitelo y
la temperatura fue representada con la ecuación Y= ae-bx. La velocidad con la que los
embriones consumieron sus reservas energéticas estuvo afectada por las distintas
temperaturas (P< 0.01, Tabla V).
Comparación
Longitud, mm a b R P entre Pendientes
Manto
16 0.082 0.2 0.86 0.0001
p= 0.04981;
18 0.067 0.21 0.94 0.0001
F= 2.64
20 0.05 0.23 0.91 0.0001 gl= 3
22 0.082 0.2 0.9 0.0001
Brazos
16b 0.074 0.2b 0.92 0.0001
p= 0.00007
18a 0.041 0.24a 0.93 0.0001
F= 5.82;
20a 0.037 0.24a 0.92 0.0001 gl= 3
22c 0.067 0.21c 0.92 0.0001
Diámetro Ojo
16b 0.082 0.1b 0.84 0.0001
p = 0.0076;
18 a 0.061 0.12a 0.93 0.0001
F = 4.05;
20 a 0.055 0.12a 0.88 0.0001 gl= 3
22c 0.067 0.11c 0.89 0.0001
a.b.c Letras diferentes indican las pendientes que resultaron ser significativamente diferentes entre tratamientos.
(p < 0.01)
43
En cuanto a los juveniles mantenidos en ayuno por diez días posteriores a la eclosión, la
sobrevivencia fue del 100 % independientemente de la temperatura experimental. A 20 °C,
solo se registró un 90 % de sobrevivencia, porque dos crías murieron atrapadas en la malla
de su encierro, evento que es independiente a la temperatura experimental (Fig. 22).
100
Porcentaje de sobrevivencia %
80
60
40
20
0
16 18 20 22
Temperatura, °C
se mantuvieron desde el estadio XV al XIX, aun con la intensa actividad de SOD, GST y GSH
(Fig. 23C). Este mismo efecto fue observado en los embriones expuestos a 22 °C, que a partir
del estadio XV mostraron evidencias de acumulación de radicales libres, los elevados niveles
de LPO y potencial REDOX indican un daño desde el estadio XV al XIX. Sin embargo, la
actividad de CbE y la AcHE se mantuvo constante hasta el estadio XIX. (Fig. 23D).
Los valores del IBR (resultado de la suma de las áreas cubiertas por el AOX, de los embriones
en cada tratamiento, en las gráficas de estrella) mostraron que la actividad antioxidante en
embriones expuestos a 16 °C tuvieron valores elevados (mayor área dentro de la gráfica) en
los estadios XI-XIV y XIX (Fig. 24). En contraste, a 18 °C se registraron valores altos de
actividad en los estadios XV a XVIII y XIX y niveles bajos en el estadio XVIII (Fig. 24). Los
embriones cultivados a 20 y 22 °C, mostraron valores constantes durante todo el desarrollo
embrionario, con un incremento en la actividad antioxidante hacia el término de la vida
embrionaria (estadio XIX; Fig. 24).
46
10.00
enzimática
6.00
4.00
2.00
0.00
11 -14 15 -17 18 19
Estadios
16 18 20 22
Figura 24. Respuesta integrada de biomarcadores utilizada para determinar los efectos de
la temperatura sobre la capacidad del sistema antioxidante para controlar la peroxidación
de lípidos y potencial redox en embriones de O. bimaculoides incubados artificialmente a
16, 18, 20 y 22 °C.
8. DISCUSIÓN
Resultados similares han sido observados en otras especies de pulpo. En un estudio con
embriones de Octopus vulgaris se observó que un aumento de 3 °C respecto a la
temperatura óptima, si bien aceleró el desarrollo embrionario, provocó anormalidades
morfológicas en las paralarvas. En este mismo estudio la formación de embriones y
paralarvas de tallas menores, se asoció a temperaturas de incubación por arriba de los 18
°C, que es su temperatura óptima (Repolho et al., 2014).
En Loligo vulgaris (Villanueva et al., 2000), Octopus maya (Caamal-Monsreal et al., 2016,
Sánchez-García et al., 2017) y Octopus mimus (Uriarte et al., 2012), también se ha
observado que los embriones incubados a altas temperaturas son de menor talla, lo que
sugiere que estos efectos podrían ser una respuesta común para los cefalópodos. El hecho
de que las temperaturas entre 16 y 22 °C hayan causado únicamente diferencias en el
crecimiento, sin efectos adversos marcados durante el desarrollo de los embriones, puede
deberse a que las condiciones de incubación utilizadas están dentro del intervalo térmico
del hábitat natural de O. bimaculoides (Uriarte et al., 2015). Este intervalo es similar al que
reportó Hanlon et al. (1988) para embriones de esta misma especie con origen en el norte
de Baja California y California.
Las condiciones óptimas para el desarrollo embrionario, están ligadas a que los procesos de
obtención de energía, proveniente del vitelo, permitan el funcionamiento óptimo de todos
los mecanismos fisiológicos (Katsenevakis et al., 2005; Clarke et al., 2004). En el presente
trabajo, se observó que la velocidad con la que los embriones de O. bimaculoides
consumieron el vitelo durante el tiempo de incubación, también estuvo modulada por la
temperatura. Los embriones incubados a 22 °C consumieron el vitelo en menor tiempo que
los embriones en los demás tratamientos, provocando un desbalance entre el uso de la
energía y el desarrollo de los organismos (Pimentel et al., 2012). Este desbalance se hace
más evidente por la alta demanda lipídica que conlleva un crecimiento somático acelerado,
lo que se expresa en organismos de menor tamaño, y posiblemente con un menor
contenido de lípidos que los embriones que se desarrollaron a temperaturas más bajas
(Bouchaud y Daguzan, 1990). La termodependencia en el consumo de vitelo, ha sido
51
Para establecer los efectos que pudiera tener la temperatura en la formación de las reservas
vitelinas durante el desarrollo embrionario, y consecuentemente en el desempeño de los
juveniles, se diseñó una prueba de resistencia al ayuno que fue realizada durante los
primeros 10 días de vida como juveniles (Caamal Monsreal et al., 2016; Mogel et al., 2010;
Sánchez-García et al., 2017). Los resultados de la prueba, demostraron que los juveniles de
O. bimaculoides tuvieron una alta sobrevivencia, lo que indica que las reservas energéticas
contenidas en el vitelo interno (acumuladas durante la embriogénesis) fueron suficientes
para mantener vivos a los organismos durante ese periodo de ayuno. (Boletzky, 1975; Vidal
et al., 2002). La sobrevivencia de los juveniles tempranos se ha asociado a la cantidad de
vitelo interno, pues este brinda la energía necesaria para la maduración de la glándula
digestiva y probablemente para el alargamiento de los brazos, como se ha observado en O.
maya (Caamal-Monsreal et al., 2016; Juárez et al., 2015) y O. mimus (Zuñiga et al., 2013).
Los resultados también mostraron que el sistema antioxidante controló los niveles de las
especies reactivas de oxígeno generadas por los embriones de O. bimaculoides (mantenidos
en las condiciones experimentales) a través de las enzimas CAT, GST, GSH y SOD, ya que
como se ha reportado, son un grupo de enzimas clave para los mecanismos de defensa
celular (Rudneva et al., 1999; Borkovic et al., 2005). Si bien las enzimas CAT y SOD, se
consideran como la primera línea de defensa del sistema antioxidante (Dandapat et al.,
2003), la baja actividad de la SOD durante los primeros estadios embrionarios de O.
bimaculoides, pudo haber ocurrido porque el oxígeno dismutado no fue la principal fuente
de producción de H2O2, sino que se generó directamente a partir de la reducción de dos
electrones utilizando algún agente reductor presente en la célula (Peters y Livingstone.,
1996). Al contrario, es interesante notar que la actividad de esta enzima (SOD) fue más
evidente durante los últimos estadios embrionarios, lo que de acuerdo a Abele et al.
(1988b) indica que los embriones expuestos a las temperaturas experimentales (16 a 22 °C),
poseen la capacidad celular para sobrellevar la producción de las especies reactivas de
oxígeno. No obstante, la respuesta del sistema antioxidante sugiere que los embriones de
O. bimaculoides con mejor estado fisiológico fueron aquellos incubados a 18 y 20 °C, esto
53
A su vez, los resultados también mostraron que en los embriones expuestos a las
temperaturas extremas (16 y 22 °C) la actividad del sistema antioxidante fue elevada y
continua, como respuesta una elevada peroxidación lipídica. Este mecanismo de defensa
posiblemente generó mayores costos energéticos y comprometió el proceso de crecimiento
de los embriones de O. bimaculoides. Lo que sugiere que, si bien el sistema antioxidante no
tuvo un desempeño óptimo, si fue lo suficientemente funcional a estas dos temperaturas,
para que los embriones no tuvieran consecuencias mayores después de la eclosión (Lesser
et al., 2006; Meng et al., 2014). En los embriones de otras especies, como O. vulgaris y O.
maya, se ha reportado que a temperaturas no óptimas, la ineficiencia del sistema
antioxidante para eliminar los radicales libres producidos, puede generar procesos
teratogénicos (Repolho et al., 2014) o bien un colapso de las enzimas del sistema
antioxidante con la consecuente muerte del embrión (Sánchez-García et al., 2017).
9. CONCLUSIONES
Los resultados del presente estudio confirman que la temperatura modula el desarrollo
embrionario de Octopus bimaculoides.
Para fines productivos, un intervalo adecuado para la incubación artificial de los embriones
de O. bimaculoides está entre los 18-20 °C, ya que entre 16-22 °C se obtendrán juveniles de
menor talla.
Estos resultados sientan las bases para posteriores estudios de conservación de la especie,
ya que aportan un indicio de su capacidad de resiliencia, ante la proyección de posibles
cambios en la temperatura del océano.
Recomendaciones
Así mismo, se sugiere evaluar el efecto de las condiciones de incubación sobre procesos
fisiológicos posteriores, como crecimiento y sobrevivencia de los juveniles, asimilación de
alimento, conversión alimenticia y producción de biomasa.
56
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