INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL

CENTRO DE INTERDISCIPLINARIO INVESTIGACIÓN PARA EL

DESARROLLO INTEGRAL REGIONAL UNIDAD MICHOACÁN
CIIDIR IPN UNIDAD MICHOACÁN

BIOCONTROL DE Rhizopus stolonifer EN FRUTOS DE

ZARZAMORA (Rubus fruticosus) EMPLEANDO MICROBIOTA NATIVA,
ASOCIADA A LA PLANTA

T E S I S

QUE PARA OBTENER EL GRADO DE MAESTRO EN CIENCIAS

EN PRODUCCIÓN AGRÍCOLA SUSTENTABLE

P R E S E N T A:

IIA ISMAEL FERNANDO CHÁVEZ DÍAZ

DIRECTORES DE TESIS:

DRA. MARÍA VALENTINA ANGOA PÉREZ

DR. SIGIFREDO LÓPEZ DÍAZ

JIQUILPAN MICHOACÁN, 2011

 INSTITUTO POLITECNICO HACIOHAL
SECRETA DE INVESTIGACI N Y POSGRADO

CAR TA CESION DE DERECHOS

En la Ciudad de JIQUILPAN, MICHOACAN e1 dIa 14 del mes de NOVIEMBRE del año

2011, e1 que suscribe C.LLA. ISMAEL FERNANDO CHAVEZ D1AZ alumno de1
programa de MAESTRIA EN CIENCIAS EN PRODUCCION AGRICOLA
SUSTENTABLE con nñmero de registro B091348, adscrito a CENTRO
INTERDICIPLINARIO DE INVESTIGACION PARA EL DESARROLLO REGIONAL
INTEGRAL (C1IDIR-IPN UNIDAD MICHOACAN), manifiesta que es autor (a)
intelectual del presente trabajo de Tesis bajo la direccion de la DRA. MARIA
VALENTINA ANGOA PEREZ y el DR. SIGIFREDO LOPEZ DiAZ y cede los derechos
del trabajo intitulado ‘BIOCONTROL DE Rhizopus stolonifer EN FRUTOS DE
ZARZAMORA [Rubus fruticosus ) EMPLEANDO MICROBIOTA NATIVA,
ASOCIADA
A LA PLANTA, al Instituto Politécnico Nacional para su difusion, con fines académicos y
de investigacifin.

Los usuarios de la informacifin no deben reproducir el contenido textual, graficas o datos

del trabajo sin e1 permiso expreso del autor y/o director del trabajo. Este puede ser
obtenido escribiendo a la siguiente direccion: JUSTO SIERRA No. 28 JIQUILPAN,
MICHOACAN, MEXICO. C.P. 59510, TELEFONO : 01 (353) 53-30218. Si eI permiso se
otorga, e1 usuario debera dar el agradecimiento correspondiente y citar la fuente del mismo.

I.I.A. Ismael Fernando Chavez Diaz.

 Tesis de Maestría

Reconocimiento

Al INSTITUTO POLITECNICO NACIONAL por haber brindado el apoyo

económico para la realización del presente trabajo de investigación otorgando
una beca de Maestría. Así como también a la Secretaría de Investigación y
Posgrado (SIP), por haber otorgado el apoyo económico para la asistencia
como participante a congresos por el Programa Institucional para la
Formación de Investigadores (PIFI). De igual manera a la Coordinación de
Cooperación Académica del IPN por haber otorgado la beca de movilidad
misma que cubrió la estancia de investigación desprendida por las
actividades del presente trabajo de investigación científica.

Con gratitud a los Honorables Miembros del Comité

Revisor: Dra. María Valentina Angoa Pérez.
Dr. Sigifredo López Díaz.
Dra. Ana Niurka Hernández Lauzardo.
Dra. Hortencia Gabriela Mena Violante.
Dr. Luis Fernando Ceja Torres.

i
 Tesis de Maestría

Agradecimientos

El logro del presente trabajo es producto de la colaboración de un gran

equipo de trabajo entre los que agradezco de manera personal a:

Admirables directores de Tesis:

Dra. María Valentina Angoa Pérez y Dr. Sigifredo López Díaz, gracias por
su apoyo, dirección y enseñanzas.

Mi tutor externo al centro:

Dra. Ana Niurka Hernández Lauzardo, le estoy profundamente agradecido
por las diversas enseñanzas, su hospitalidad y apoyo incondicional, de
igual manera agradezco a su esposo el Dr. Miguel Gerardo Velázquez del
Valle.

A los encargados de laboratorio:

M.C. Guadalupe Oyoque Salcedo en CIIDIR-IPN Unidad Michoacán y a
M.C. Monica Hernández López en CEPROBI-IPN, quienes me apoyaron y
aportaron un poco de su tiempo.

A los técnicos de laboratorio:

Tec. Erendira Jazmin Novoa Medellin y Tec. José Antonio Cortez Pérez.

A los docentes que me formaron como Maestro en Ciencias:

Dr. José Venegas, Dra. Martha Velázquez, Dr. José Luis Montañez, Dr.
Francisco Covarrubias, Dr. Hipólito Cortez, Dra. Hortencia Mena, Dr. Luis
Ceja Torres, Dr. Carlos Muñoz, Dra. Dioselina Álvarez, gracias a todos por
su experiencia y conocimiento.

i
 Tesis de Maestría

Agradecimientos

Agradezco también a cada uno de mis compañeros por haberme brindado

su amistad, haberme acompañado en cada una de las etapas que viví a su
lado y hacerme una estancia agradable durante los estudios de maestría
realizados, de cada uno de ustedes me llevo el recuerdo con alegría, y los
considero como colegas con basto potencial para lograr sus metas:

Claudia, Rosy, Lupita, Alejandro, Oswaldo, Blanquita, Estrella, Maggy,

Jesús, Rafa, Fabián, Melisa, Daniela, Verónica, Verito, Charly, Carlos,
Osvaldo, Erika, Rosalba, Jure, Beto, Medina, Hugo, Charls, Violeta, Dora,
Benjamín, Cesar, Ludwig, Stephanie, Gustavo, Teo, Cyali, Luis, Dynora,
Elizabeth, Luz, Manuel, Jonás, Víctor, Omar, Manuel, Alex, Martha, Tania,
Oaxaco, Isrrael, Alex Pimienta, Selva-sankar, Sarry, Carlos Castillo y
Henri Piña.

Con especial cariño a Alejandra Gonzales Urias, Deneb Maldonado,

Liliana Córdova, Olga Cruz, Miguel Olvera y Myrna Cervantes, a mis
primas Cinthia y Estefania Benites, a mis abuelos Socorro Rodríguez e
Ismael Chávez gracias por estar siempre que los necesité.

Agradezco también con especial cariño a Lupita Arceo, Becky, Licha, Ely,
Fabián, Toño y Cony, personal del CIIDIR que siempre me apoyó y gracias
a ellos pude llevar a cabo cada trámite.

A todos ustedes GRACIAS.

i
 Tesis de Maestría

Dedicatoria.

El presente trabajo de investigación lo dedico a quien me enseñó a amar

la naturaleza, a quien ha sido mi luz y mi guía en la vida, a quien me dio
todo sin esperar nada a cambio, a ti que me enseñaste a razonar, a ti que
me enseñaste el valor del trabajo y la dedicación, no tengo manera de
agradecerte mis éxitos, gracias por estar presente en cada uno de ellos.
Dedico el presente trabajo a mi MADRE, Ma. Luisa Díaz Ventura.

A mi hermano por enseñarme a ser fuerte, a no caer y a levantarme

cuando lo he hecho, eres un ejemplo a seguir
A mi hermano Alvaro Chávez Díaz

A quien fue como mi padre, y recuerdo constantemente, se que te llenaría

de orgullo estar conmigo al presentar este trabajo, Dios te tenga en su
gloria.
A mi abuelo, Jorge Díaz Jiménez

i
 Tesis de Maestría

“Hay siempre un libro abierto para todos los ojos: La Naturaleza”…

Jean Jacques Rousseau

“Lo que conocemos es una gota de agua; lo que desconocemos es el océano”…

Isaack Newton

“Nunca desistas de un sueño. Solo trata de ver las señales que te llevan a
él”…
Paulo Coelho

v
 Tesis de

Índice
Índice de Tablas........................................................................................1

Índice de Figuras......................................................................................2

RESUMEN:......................................................................................................4

ABSTRACT................................................................................................5

Capítulo I. Introducción

1.1 Zarzamora (Rubus fruticosus).............................................................6

1.1.1 Historia, Morfología, Taxonomía y Clasificación de los

cultivares. 6 1.1.2

Composición química del fruto

1.1.3 Actividad nutracéutica y compuestos fitoquímicos....................9

1.1.4 Producción de zarzamora en el mundo....................................11

1.1.5 Perfil productivo y comercial de la zarzamora mexicana.........13

1.1.6 Manejo del Cultivo en México..................................................14

1.1.7 Cosecha y Manejo Postcosecha................................................15

1.1.8 Zona productora en Michoacán................................................16

1.2 Género Rhizopus......................................................................................17

1.2.1 Rhizopus stolonifer, agente causal de podredumbre blanda.......18

1.3 Estrategias de Control de Rhizopus stolonifer.........................................19

1.3.1 Fungicidas.................................................................................19

1.3.2 Control Químico........................................................................20

1.3.3 Control cultural pre y postcosecha...........................................21

1.3.4 Control por atmosferas y radiaciones.......................................21

I
 Tesis de

1.3.5 Control con productos naturales..............................................22

1.3.6 Control por medio de microorganismos...................................23

1.4 Interacciones planta-microorganismo, microorganismo-microorganismo

...................................................................................................... 24

1.5 Control biológico postcosecha.............................................................25

1.5.1 Competencia por nutrientes y espacio.....................................27

1.5.2 Formación de biosurfactantes y biopelículas...........................27

1.5.3 Antibiosis..................................................................................28

1.5.4 Producción de enzimas y parasitismo.......................................28

1.5.5 Inducción de resistencia...........................................................29

1.5.6 Sideróforos.....................................................................................29

1.5.7 Liberación de compuestos volátiles..........................................31

1.6 Género Bacillus...............................................................................................31

1.7 Leifsonia aquatica (anteriormente Corynebacterium acuaticum).........32

1.8 Justificación....................................................................................33

1.9 Hipotesis.........................................................................................34

1.10 Objetivos......................................................................................34

Capítulo II. Materiales y Métodos

2. Materiales y Métodos........................................................................35

2.1 Toma de muestras..........................................................................35

2.2 Obtención de la microbiota nativa asociada a la planta.................36

2.3 Obtención de aislados fúngicos del género Rhizopus....................36

2.4 Identificación microscópica de cepas fúngicas del género Rhizopus .

38 2.5

Identificación de los antagonistas..................................................38

2.6 Purificación de las cepas fúngicas de Rhizopus....................................39

I
 Tesis de

2.7 Reproducción de los postulados de Koch y patogenicidad de las cepas

...................................................................................................... 40

2.8 Diseño de técnica de inoculación y cantidad mínima de inóculo...42

2.9 Bioensayos preliminares.................................................................43

2.10 Bioensayo de antagonismo in vitro........................................................44

2.11 Detección de sideróforos.............................................................45

2.12 Antagonismo en presencia de iones Fe (III) para reducir

producción de sideróforos.......................................................................45

2.13 Bioensayo de antagonismo in situ..........................................................46

2.14 Análisis estadístico......................................................................47

Capítulo III. Resultados

3.1 Caracterización morfológica e identificación de aislamientos de

Rhizopus spp................................................................................................48

3.2 Pruebas de patogenicidad y grado de severidad............................50

3.3 Morfología de la infección de Rhizopus stolonifer en fruto de

zarzamora.
...................................................................................................... 53

3.3.1 Características de Fruto Maduro de Zarzamora......................53

3.3.2 Germinación y formación de estructuras.................................55

3.1.1 Infección y dispersión...............................................................55

3.1.2 Lisis y desintegración del fruto................................................57

3.1.1 Descripción de estructuras características encontradas durante

la infección................................................................................59

3.2 Identificación de agentes con poder antagónico............................61

3.3 Actividad antifúngica in vitro.....................................................................62

3.4 Producción de Sideróforos.............................................................64

3.5 Actividad antifúngica en presencia de Hierro................................66

3.6 Antagonismo in situ y grado de severidad.......................................68

I
 Tesis de

Capítulo IV. Discusión y Conclusiones.......................................................72

4.1 Discusión...........................................................................................72

4.2 Conclusiones.....................................................................................82

Capítulo V. Perspectivas............................................................................84

Literatura citada.....................................................................................85

I
 Tesis de

Índice de Tablas

Tabla 1.1. Clasificación taxonómica de la zarzamora variedad ‟Brazos‟. 7

Tabla 1.2. Composición química del fruto de zarzamora por cada 100g 10

Tabla 1.3. Actividad antioxidante y compuestos fitoquímicos en el fruto de 11

zarzamora

Tabla 1.4. Clasificación taxonómica de Rhizopus stolonifer 18

Tabla 1.5. Productos comerciales para biocontrol de enfermedades postcosecha 26

Tabla 2.1. Escala de severidad diseñada para la evaluación de la 42

patogenicidad de los aislados del género Rhizopus.

Tabla 3.1. Identificación y clasificación de aislados del género Rhizopus por 49

medio de las estructuras características

Tabla 3.2. Descripción de síntomas y signos mostrados por los frutos 53

sometidos a la inoculación por los aislados de Rhizopus.

Tabla 3.3 Identificación de antagonistas por medio del kit BBL CRYSTAL™ para 61
Gram positivas.

Tabla 3.4. Efecto inhibitorio in vitro de los agentes antagónicos asociados al 63

cultivo de zarzamora versus los aislados de R. stolonifer nativos del
agroecosistema

Tabla 3.5. Valoración de la producción de sideróforos en un rango de 72 h, en 65

medio casaminoácido con CAS como solución indicadora (MCAS).

Tabla 3.6. Evaluación del antagonismo entre aislados bacterianos asociados al 67

cultivo de zarzamora versus los aislados de R. stolonifer nativos del
agroecosistema, en un medio enriquecido con FeCl3.

Tabla 3.7. Evaluación del antagonismo entre los agentes antagónicos 70

asociados al cultivo de zarzamora vs. los aislados de R. stolonifer nativos del
agroecosistema, en fruto de zarzamora.

1
 Tesis de

Índice de Figuras

Figura 1.1. Morfología del cultivar de zarzamora variedad „Brazos‟. 8

Figura 1.2. Principales países productores de zarzamora en el mundo. 13

Figura 2.1. Metodología de obtención de microbiota nativa asociada a la 37

planta de zarzamora.

Figura 2.2. Cámaras húmedas para desarrollo de R. stolonifer. 38

Figura 2.3. Procedimiento para la reproducción de los postulados de Koch. 41

Figura 3.1. Aislados de género Rhizopus nativos del cultivo de zarzamora. 48

Figura 3.2. Frutos inoculados con diferentes aislados del género Rhizopus 51
después de 72 h.

Figura 3.3 Gráfica de evolución cronológica del daño causado por los aislados 52
del género Rhizopus en fruto de zarzamora.

Figura 3.4. Fruto de zarzamora con calidad de exportación visto al 54

microscopio estereoscópico.

Figura 3.5. Infección por R. stolonifer a las 24 h. 56

Figura 3.6. Fruto infectado por R. stolonifer a las 48 h. 57

Figura 3.7. Infección por R. stolonifer a las 72 h. 58

Figura 3.8. Estructuras características encontradas en fruto de zarzamora al ser 60

infectado por R. stolonifer.

Figura 3.9. Morfología de las colonias formadas por los agentes antagonistas en 62
medio PDA.

Figura 3.10. Antagonismo de B. licheniformis y B. subtilis aislado de suelo versus 63

el aislado A de R. stolonifer.

Figura 3.11. Antagonismo de B. licheniformis y L. aquatica versus aislado C de 64

R. stolonifer.

2
 Tesis de

Figura 3.12 Producción de sideróforos por aislados bacterianas en MCAS. 65

Figura 3.13. Producción de sideróforos por R. stolonifer aislado C en MCAS como 66

solución indicadora.

Figura 3.14. Actividad antifúngica de L. aquatica y B. licheniformis hacia R. stolonifer 67

aislado A, en presencia de hierro.

Figura 3.15. Actividad antifúngica de B. licheniformis (derecha) y L. aquatica 68

(izquierda) hacia R. stolonifer aislado C.

Figura 3.15. Bioensayos de antagonismo in situ hacia R. stolonifer aislado A. 70

Figura 3.16. Bioensayos de antagonismo in situ hacia R. stolonifer aislado C. 71

3
 Tesis de

RESUMEN:
Recientemente se han detectado y demostrado varios de los efectos
secundarios que ocasiona el uso de fungicidas sintéticos sobre la biosfera,
medio ambiente, salud humana y la generación de resistencia en diversos
fitopatógenos. Por lo que, el uso de microorganismos antagonistas en el
control de enfermedades postcosecha ofrece una opción viable con
resultados alentadores. El objetivo de la presente investigación fue
obtener la microbiota nativa asociada al cultivo de la zarzamora para
discernir entre ésta los efectos antagónicos potenciales hacia Rhizopus
stolonifer, considerado a nivel mundial como un fitopatógeno destructivo
para productos agrícolas.
Se aisló la microbiota nativa de un cultivo comercial de zarzamora variedad
„Brazos‟ de muestras de plantas provenientes de la localidad exportadora
de Atapan, Michoacán. Se evaluó la patogenicidad de 5 aislados del
género Rhizopus, y posteriormente el potencial antagónico de 113
microorganismos al confrontarse in vitro sobre medio PDA, evaluándose el
índice antifúngico de los más efectivos. Por medio de confrontaciones in
situ con los aislados de R. stolonifer obtenidos, se determinó el grado de
severidad, el porcentaje de inhibición así como el porcentaje de incidencia
de la enfermedad.
Cuatro aislados bacterianos mostraron actividad antagónica en contra de
los 2 aislados de R. stolonifer, 3 pertenecen al género Bacillus y uno al
género Leifsonia, del cual no existen reportes anteriores sobre actividad
antagónica hacia fitopatógenos. Se obtuvo un índice antifúngico con una
media de hasta 42.78% in vitro y una incidencia de la enfermedad de 15%
(Tukey p˂.005). Se obtuvo también una descripción detallada del proceso
infectivo del hongo en el fruto.
Es elemental profundizar en la investigación de las interacciones entre
fruto- antagonista-fitopatógeno con la finalidad de esclarecer los procesos
biológicos emergentes que dan paso a los mecanismos de acción
implicados en el control biológico para comprender su funcionamiento y
así desarrollar estrategias tecnológicas de manejo integrado de
4
 Tesis de

enfermedades postcosecha y por consecuencia lograr sistemas agrícolas

productivos de forma sustentable.

5
 Tesis de

ABSTRACT:
The use of synthetic fungicides render severe side effects affecting the
biosphere, environment, and human health, they even induce resistance
on plant pathogens. The usage of antagonist microorganisms against
postharvest pathogens offers a viable option with hopeful results. In this
study the main purpose is to obtain the native microorganisms associated
to blackberry fruit crop in order to determine the potential antagonist
effects over the soft rot caused by Rhizopus stolonifer. This fungus disease
is considered a devastating threat fungus for fruits and vegetables
worldwide.
Native microbiota was isolated from plant „Brazos‟ variety samples of a
commercial blackberry fruit exporter zone located in Atapan Michoacán,
Mexico. The pathogenicity of 5 isolates from Rhizopus genus was
determined. The antagonistic potential in vitro of 113 microorganisms was
evaluated on PDA medium, such as antifungal index of the most effective
antagonists. Confrontations against R. stolonifer in situ were also evaluated,
determining severity grade, inhibition percentage and incidence of
disease percentage.
Four bacterial isolates showed efficient antagonistic activity against two
R. stolonifer isolates. Three of them belong to Bacillus genus and the last
one to Leifsonia genus, which had no antagonistic properties on previous
reports.
The main antifungal index had a mean up to 42.78% in vitro, while the
disease incidences were signifincantly reduced to a 15% (Tukey p˂0.005).
Also a detailed description of infection process for blackberry fruit in
particular was obtained.
A deeper understanding on the interactions among fruit, antagonist and
postharvest‟s pathogens is needed in order to elucidate the biological
process previous to mechanisms of action involved in biological control.
This information could help to develop technological strategies applied to
integrated postharvest disease management and consequently achive
productive and sustainable agricultural systems.
6
 Tesis de

Capítulo I. Introducción

1.1 Zarzamora (Rubus fruticosus)

1.1.1 Historia, Morfología, Taxonomía y Clasificación de los

cultivares

Procedente mayormente de América, oeste de Europa, algunas zonas de

Asia y del Ártico, la zarzamora (género Rubus spp.) figuró en el pasado
como una especie invasiva, pero también como una fuente de alimento
interesante para diversas especies animales. Posteriormente los frutos
fueron considerados como un recurso alimentario de temporada y las
plantas fueron usadas por sus propiedades medicinales. Hasta finales del
siglo XIX, la demanda por los frutos permitió que se considerara como un
cultivar (Strik et al., 2007).

Taxonómicamente, la zarzamora pertenece a la familia de las rosáceas

(Tabla 1.1) por lo que crece de forma arbustiva, presentando tallos
leñosos dotados de espinas. Las hojas tienden a distribuirse de forma
imparipinnada, constando de tres a cinco foliolos los cuales son ovados
con bordes aserrados, el haz presenta coloración verde intenso brillante,
mientras que el envés es blanquecino con pilosidad. Presenta flores de
hasta tres centímetros de diámetro, las cuales crecen en racimos al final
de las ramas, constan de 5 pétalos variando de blanco a rosado, y 5
cépalos. La infrutescencia forma una polidrupa, la cual consta de diversas
drupas individuales arracimadas a un eje central (Berg, 2008) (Figura
1.1).

7
 Tesis de

Tabla 1.1. Clasificación taxonómica de la zarzamora variedad ‟Brazos‟

(USDA, 2011).

Dominio Eukaryota
Reyno Plantae
Subreyno Tracheobionta
Superdivisión Spermatophyta
División Magnoliophyta
Clase Magnoliopsida
Subclase Rosidae
Orden Rosales
Familia Rosoideae
Genero Rubus
Especie fruticosus
Variedad 'Brazos'
Nombre binominal: Rubus fruticosus

Son diversos los cultivares y las especies mejoradas que han tomado lugar
en el mundo comercial de este cultivo, los mayormente usados alrededor
del mundo se clasifican en tres tipos, según las estructuras de sus cañas:
1) Los cultivares rastreros necesitan de tutores o soportes para llevar a
cabo su producción, comprenden las variedades „Marion‟, „Silvan‟, „Black
Dimond‟ y
„Thornless Evergreen‟; sus frutos son redondeados y suaves, por lo que
son mayormente comercializadas como mermeladas o bases frutales para
alimentos. 2) Cultivares como „Chestern Thornless‟, „Thornfree‟, „Loch Ness‟,
„Dirksen Thornless‟, „Hull Thornless‟, „Smoothstem‟, „Gazda‟ y „Čačanska
Bestrna‟ presentan cañas semierectas, sus frutos son ligeramente
redondeados y consistentes, con posibilidad de comercializarse en fresco
o congelados, por otra parte los frutos de los híbridos de zarzamora-
frambuesa de las variedades „Boysen‟ y „Logan‟, se comercializan
procesados. 3) Y las variedades de cañas erectas como la „Brazos‟,
„Tupy‟, „Kiowa‟, „Ouachita‟,
„Apache‟, „Chickasaw‟ y „Cherokee‟, además de las variedades sin espinas
„Navaho‟ y „Arapaho‟, resultan ser mejores para comercialización de fruto en

8
 Tesis de

fresco ya que éste es más firme y grande en comparación con las demás
variedades, en esta clasificación se incluyen los cultivares desarrollados

9
 Tesis de

recientemente en la Universidad de Arkansas llamados „Prime-Jan‟ y

„Prime- Jim‟ los cuales son erectos con espinas y tienen la capacidad de
fructificar en las cañas principales. Los cultivares erectos y semierectos
cultivados de forma comercial, también necesitan tutores para controlar
el crecimiento de las cañas ya que estas al ser muy largas tienden a
doblarse hacia el suelo 4) También en México se encuentran cultivares
silvestres del tipo R. americanus, R. laciniatus y R. ulmifolius, aunque en
menor medida por ser carentes de uso comercial (Strik et al., 2007).

Figura 1.1. Morfología del cultivar de zarzamora variedad „Brazos‟. Morfología de A) Flores;
B) Fruto; C) Hojas y Ramas; D) Cultivar comercial de tipo erecto, variedad „Brazos‟
con tutores (Berg, 2008).

1
 Tesis de

1.1.2 Composición química del fruto

Alrededor del mundo los frutos conocidos como berries son valorados,
reconocidos y cotizados por su sabor dulce, aroma afrutado y actualmente
por sus propiedades nutracéuticas. La composición química de los frutos
de zarzamora puede ser variable dependiendo del cultivar, el lugar de
establecimiento del cultivo y el estado de madurez al ser cosechado, ya
que estos son frutos no climatéricos con respecto a su producción y
respuesta al etileno (Perkins-Veazie et. al., 2000; Talcott, 2007). En
general, las zarzamoras se componen por carbohidratos, vitaminas,
minerales, fibra dietética, ácido málico (siendo el ácido orgánico
predominante), ácido ascórbico, acido fólico, carotenoides y polifenoles
concentrados que les otorgan el color, sabor y propiedades nutracéuticas
que los caracteriza, además de contener también trazas minerales
(Talcott, 2007). En particular, la sacarosa es el carbohidrato mayoritario
de los frutos verdes, sin embargo, en el proceso de madurez éste es
rápidamente hidrolizado a fructosa y glucosa quedando menos del 1% del
contenido de este disacárido en los frutos maduros, por lo cual puede ser
consumido por diabéticos (Tabla 1.2) (Reyes-Carmona et. al., 2005; Kafkas
et. al., 2006).

1.1.3 Actividad nutracéutica y compuestos

fitoquímicos

Investigaciones actuales corroboran el hecho de que enfermedades de

orden cardiovascular como la arterioesclerosis, y crónicas degenerativas
como el cáncer y la diabetes se encuentran íntimamente ligadas a los
hábitos alimenticios a los cuales se ha acostumbrado el ser humano o
bien, a los cuales está sometido por los ritmos de la vida cotidiana actual,
resultando en el incremento de la incidencia de las mismas (Yildiz y Peral-
Eyduran, 2009;
1
 Tesis de

Hai-Liu, 2007). Tales hábitos alimenticios excluyen las porciones diarias

recomendadas de frutas y vegetales, los cuales son proveedores, en gran
escala, de compuestos funcionales, como la fibra dietética, vitaminas, y
clorofila, los cuales promueven el buen funcionamiento del organismo, y
nutracéuticos como los polifenoles, flavonoides, isoflavonas, y tocoferoles,
que por su parte confieren un efecto protector debido a sus capacidades
antioxidantes, las cuales evitan que la célula sufra posibles daños de tipo
oxidativo causados por radicales libres, además de reducir los niveles de
grasa en sangre (Wada y Ou, 2002; Yildiz y Peral-Eyduran, 2009). Así los
frutales conocidos como berries, se distinguen por contener compuestos
nutracéuticos (Tabla 1.3), siendo reportados como uno de los 50
productos mayormente consumidos y como uno de los mayores
suministros de compuestos antioxidantes en la dieta de norteamericanos y
europeos, aportando hasta 5.75 μmol/porción consumida (144 g, 1 taza).
Como resultado al conocimiento de tales hechos, en los últimos años, se
ha despertado un gran interés en los consumidores del mundo hacia la
adquisición de frutos frescos de zarzamora (Halvorsen et al., 2006; Talcott,
2007; Yildiz y Peral-Eyduran, 2009).

Tabla 1.2. Composición química del fruto de zarzamora por cada 100 g
(Talcott, 2007).

Contenido Químico del Fruto de Zarzamora

Compuesto Unidad Cantidad Vitaminas Unidad Cantidad Minerales Unidad Cantidad
Sacarosa % 0.12-0.26 Acido Ascorbico mg 21 Calcio (Ca) mg 29
Total
Fructosa % 2.11-3.38 Tiamina mg 0.02 Hierro (Fe) mg 0.62
Glucosa % 1.58-2.61 Rivoflavina mg 0.03 Magnesio (Mg) mg 20
Solidos Solubles °Brix 10.8-11.4 Niacina mg 0.65 Fosforo (P) mg 22
Solidos Totales % 8.20-13.6 Acido Pantotenico mg 0.28 Potasio (K) mg 162
Acido Málico % 0.06-1.10 Vitamina B6 mg 0.03 Sodio (Na) mg 1
pH pH 2.55-4.28 Folato Total µg 25 Zinc (Zn) mg 0.53
Acidez Titulable % 0.16-4.22 Vitamina A IU 214 Cobre (Cu) mg 0.17
α-Tocoferol mg 1.17 Manganeso (Mn) mg 0.65
β-Tocoferol mg 0.04 Selenio (Se) mg 0.4
γ-Tocoferol mg 1.34
Δ-Tocoferol mg 0.9
Vitamina K µg 19.8

1
 Tesis de

Tabla 1.3. Actividad antioxidante y compuestos fitoquímicos en el fruto de

zarzamora (Wada y Ou, 2002).

Compuestos Fitoquímicos Nutraceuticos en

Fruto de Zarzamora

ORACa 175 μmol de TE/g*

Compuestos Fenólicos 30.94 mg/g*
de los cuales:
Ácido Gálico 0.13 mg/g*
Rutina 1.50 mg/g*
Quercitina 2.5 mg/g*
Isoquercitrina 0.38 mg/g*
Ácido Elágico 1.50 mg/g*
Catequina 1.40 mg/g*
Epicatequina 11.20 mg/g*
Ácido Hidroxibenzoico
3 mg/g*
(salicílico)
Ácido Hidroxicinámico 8.8 mg/g*
Antocianinas 5.69 mg/g*
de las cuales:
cianidina 3-glucósido 80.43%
cianidina 3-arabinósido 10.19%
cianidina 3-(6'-
6.06%
malonil)glucósido
Otras 3.40%

a (Oxygen Radical Absorbance Capacity) expresado en Equivalentes Trolox (análogo de

vitamina E). * Expresado por gramos de materia seca.

1.1.4 Producción de zarzamora en el mundo

El interés por el cultivo de las especies de zarzamora (Rubus sp.) ha

crecido substancialmente en los últimos años, específicamente por las
especies comercializables para su consumo en fresco, autores como Clark
(2006), lo atribuyen a factores como: a) El desarrollo de especies con
mayor vida de

1
 Tesis de

anaquel, calidad, adaptación y libres de espinas. b) El incremento en la

mercadotecnia enfocada a la promoción de beneficios a la salud
relacionados con el consumo de este producto frutícola. c) El Incremento
en el desarrollo de tecnologías para su cultivo. d) El desarrollo de técnicas
de manejo postcosecha.

Es abundante la producción de zarzamoras en el mundo, cultivándose

gran diversidad de variedades. En Europa se reportaron alrededor de
7,692 ha cultivadas en el 2005, siendo Serbia y Hungría los mayores
productores en este continente, cerca del 90% de la producción es
procesada, se cultivan mayormente variedades semierectas y rastreras.
Asia cultivó en el mismo año alrededor de 1,550 ha de las variedades
„Chester Thornless‟ y „Hull Thornless‟ (semierectos) y con menor producción
de „Boyse‟, „Marion‟ y „Siskiyou‟. Tanto en Oceanía como en África la
producción es escasa contando 259 ha y 100 ha, siendo los mayores
productores Nueva Zelanda („Boysen‟) y África del Sur („‟Hull Thornless‟,
„Loch Ness‟, „Choctaw‟ y „Arapaho‟). El mayor productor de zarzamoras en
la actualidad es el continente Americano siendo Estados Unidos de
América el principal productor en el mundo. Para el 2005, se reportaron
4,818 ha cultivadas mayormente en los estados de Oregon, California,
Texas, y Georgia, cultivando las variedades „Marion‟, „Boysen‟,
„Thornless Evergreen‟ y „Silvan‟, comercializando el 95% de la
producción como productos procesados. Por su parte México aumentó
drásticamente la producción de zarzamora de 1995 al 2004 aportando
32% de la zarzamora producida en Norte América, así el país mexicano se
coloca como el segundo productor más importante de zarzamora en el
mundo, sin embargo, sigue siendo el principal de frutos para
comercialización en fresco (Strik et al., 2007) (Figura 1.2).

1
 Tesis de

Figura 1.2. Principales países productores de zarzamora en el mundo (2005) (Strik et al.,
2007).

1.1.5 Perfil productivo y comercial de la zarzamora

mexicana

Con una historia bastante alentadora, México ha sobresalido en la

exportación de berries en el mundo. Desde la diversificación de productos
de exportación en los países Latinoamericanos, México incursionó
tomando importancia a nivel internacional en el mercado frutícola,
postulándose como uno de los principales productores de zarzamora en el
mundo y aportando el 7% de la producción mundial de este fruto en 1995
(Muñoz y Juárez, 1995). Para el 2004, entre los países de América Latina y
el Caribe, México ocupó el tercer lugar como país productor
contribuyendo con el 13% de las exportaciones de frutales, entre los
cuales la zarzamora figuraba como uno de los productos principales
(Benavides y Segura, 2006). En el periodo de

1
 Tesis de

1995-2005, debido al desarrollo de técnicas especializadas en su

producción, se distingue un incremento explosivo en la obtención de este
frutal llegando a cotizar la tonelada en $20,139. 00 pesos en los mercados
internacionales, considerándose actualmente como una de las mayores
fuentes de ingresos económicos para el país (SEDRU, 2010). Finalizando
la década de 1995-2005 México contaba con un total de 2,300 ha
cultivadas que produjeron un total de 28,985 Mg de fruto. Cerca de la
totalidad de la producción de zarzamora en México se destina a su
comercialización en fresco en países de Europa, Norte América y Asia, por
lo que se cultivan variedades de tipo erecto con fruto grande, firme, de
color llamativo y aroma afrutado. En su mayoría los cultivares son de la
variedad „Brazos‟ y „Tupy‟ aunque también se cultivan las variedades
„Cherokee‟, „Apache‟, „Shawnee‟, „Comanche‟, „Choctaw‟ y
„Arapaho‟, así como la variedad „Sleeping Beauty‟ de uso exclusivo de la
compañía Driscoll‟s (Calderón-Zavala, 2006; Clark, 2006; Strik et al.,
2007).

1.1.6 Manejo del Cultivo en México

A partir de 1995, la producción de zarzamora crece de forma acelerada,

debiéndose al desarrollo de sistemas y técnicas de cultivo desarrolladas a
partir de la investigación en campo, con el objetivo de extender la
temporada de fructificación de las variedades „Brazos‟ y „Tupy‟. México
cuenta con un sistema extensivo de producción de zarzamora único en el
mundo, lo cual le permite obtener alto rendimiento en los cultivares y ser
el segundo productor más importante a nivel mundial (Calderón-Zavala,
2006; Clark, 2006; Strik et al., 2007).

Dicho sistema de producción forzada, consta de la aplicación de un

defoliante en el cual se mezcla urea ó sulfato de amonio (20%), con sulfato
de cobre (3%) y aceite agrícola (2%), esta solución se aplica de dos a tres

1
 Tesis de

veces después de que emerge la caña principal. Posteriormente se

cortan las

1
 Tesis de

puntas de las cañas y los laterales se reducen 30 cm para después

aplicarse promotores de crecimiento como giberelinas o fenil ureas,
siendo ampliamente usado el Thidiazurón (TDZ); estas son sustancias con
actividad citocininica, que se asperjan aproximadamente tres semanas
después de la defoliación promoviendo el brote de nuevas cañas y la
floración, para después de 90 a 100 días cosechar los frutos. Antes de
defoliar nuevamente, se aplica una mezcla de sulfato de zinc, cobre y boro
para detener el crecimiento tan acelerado y “sazonar” la planta. Esta
práctica se lleva a cabo varias veces durante la temporada para obtener
varias cosechas en el temporal de Octubre a Mayo para el mercado
internacional y la última cosecha de Mayo a Junio para el mercado local,
después de esto, las cañas se cortan a nivel del suelo y se dejan crecer
para el temporal siguiente. El sistema de producción usado por los
productores mexicanos es único en el mundo, permitiéndoles obtener
frutos de alta calidad durante la mayor parte del año para abastecer el
mercado Norte Americano, Europeo y Asiático (Calderón-Zavala, 2006;
Strik et al., 2007).

1.1.7 Cosecha y Manejo Postcosecha

Por lo general la cosecha se lleva a cabo en las primeras horas de la

mañana, después de que no haya rocío en los frutos, procurando
temperaturas frescas. La cosecha de la zarzamora debe ser retrasada
hasta obtener una madurez óptima ya que no son frutos climatéricos, por
otra parte, no se debe dejar sobre madurar ya que esto acortaría
notablemente la vida de anaquel. El objetivo de cosechar en plena
madurez implica que el fruto haya acumulado los azucares suficientes
para tener un buen balance entre su acidez, dulzor y astringencia. En
México, la cosecha se hace de forma manual, desprendiendo directamente
el fruto de la planta para colocarlo en un contenedor tipo „Clamshell‟ sin
procesos intermediarios de lavado o desinfección. Los frutos se toman
1
 Tesis de

cuidadosamente para evitar pinchaduras o

1
 Tesis de

daños mecánicos ya que son delicados y una herida implicaría la entrada

de fitopatógenos. Los frutos defectuosos, con drupelas de coloración
diferente, muy pequeñas, con pocas drupelas o dañadas, son colectados
en contenedores aparte, ya que son procesados como jugos, concentrados,
bases, o mermeladas. Ya colectados los frutos son llevados por el colector
a un proceso de control de calidad en donde son examinados visualmente,
los envases son sellados, empacados en cajas y estivados sobre soportes
de madera para evitar el contacto con el piso, después se les retira el
calor de campo por medio de aire forzado bajando la temperatura hasta
1°C durante dos horas. Finalmente los frutos se embarcan a su destino en
camiones con cámaras a bajas temperaturas. Generalmente se exhiben en
los supermercados a temperaturas entre los 14°C y 16°C, temperatura
óptima para mantener la calidad del fruto, pero no la suficiente para
detener a algunos fitopatógenos postcosecha (Calderón-Zavala, 2006;
Strik et al., 2007; Talcott, 2007; Llamas, 2010).

1.1.8 Zona productora en Michoacán

En su mayoría la producción de zarzamora en México es llevada a cabo en

el Estado de Michoacán, específicamente en las ciudades de Los Reyes,
Atapan, Zamora, Uruapan, Peribán, Tangancicuaro, Ario de Rosales,
Tacámbaro y Ziracuaretiro, aunque el cultivo está ampliamente extendido
en todo el Estado. Michoacán ofrece las condiciones idóneas para el
desarrollo del cultivo, contando con vegetación propia de ecosistemas
boscosos (pino- encino) la cual favorece un clima templado y una alta
humedad relativa, sin embargo, las condiciones óptimas para el desarrollo
del cultivo, propician de igual manera el buen desarrollo de una amplia
gama de hongos, entre los cuales algunos resultan ser fitopatógenos que
han afectado la economía de los productores por los problemas
fitosanitarios en estadios postcosecha que

2
 Tesis de

han surgido en los últimos años (Cajuste et al., 2000; Calderón-Zavala,

2006).

1.2 Género Rhizopus

El agroecosistema en el cual se desarrolla el cultivo de la zarzamora,

cuenta con características que favorecen la proliferación de una gran
variedad de hongos, incluyendo a varias especies del género Rhizopus, este
es considerado un género cosmopolita ya que sus especies son capaces de
subsistir en diversos ecosistemas y condiciones cumpliendo varias
funciones biológicas, al mismo tiempo que son de interés científico en los
ámbitos gastronómico-biotecnológico, ya que especies como Rhizopus
oryzae y Rhizopus oligosporus son objeto de investigación en procesos de
fermentación por medio de los cuales se obtienen productos típicos como
el sake (bebida alcohólica asiática) y el tempe (alimento a base de soja
parecido a la carne) (Egounlety y Aworh, 2003; Zhang-Fengying, 2007);
industrialmente se usan varias especies para la obtención de saborizantes
artificiales (citronelilo) ó aditivos alimentarios como el ácido láctico
(Soccol et al., 1994; Melo et al., 2005); en biotecnología para la obtención
de enzimas amilasas termoresistentes con la especie Rhizopus microsporus
(Piexoto et al., 2003), y en el campo agrícola, en donde la especie Rhizopus
stolonifer en particular es de amplio interés, ya que la enfermedad que
genera, conocida comúnmente como „pudrición blanda‟, es considerada
como uno de los principales y más destructivos factores biológicos que
atacan a los frutos en estadios postcosecha alrededor del mundo (Quing et
al., 2002).

2
 Tesis de

1.2.1 Rhizopus stolonifer, agente causal de

podredumbre blanda

La especie fúngica Rhizopus stolonifer (Tabla 1.4), es un hongo versátil

capaz de sobrevivir a temperaturas de hasta 4°C como mínima y 38°C
como máxima, al igual que puede desarrollarse a una amplia gama de
humedades relativas. Se caracteriza por ser buen colonizador de los
restos de plantas y por ser infeccioso para los frutos maduros después de
haber sido cosechados, usando heridas o hendiduras naturales como
entradas. Su velocidad de crecimiento es rápida en comparación a otros
hongos y sus esporas se dispersan fácilmente por el suelo y el aire, lo que
le permite colonizar rápidamente a los productos hortofrutícolas en
almacenamiento destruyéndolos en pocos días. Es fácilmente reconocido
debido a que es un hongo filamentoso con características distinguibles,
forma micelio cenocítico el cual es aéreo y filamentoso de color blanco
característico de la especie, con esporangios visibles que dan un aspecto
de punteado negro a simple vista. En microscopio pueden distinguirse
fácilmente las estructuras que lo caracterizan como los rizoides amplios y
complejos, esporangióforos erectos, esporangios redondeados y
esporangiosporas, ambos en color negro (Shipper, 1984; Hernández-
Lauzardo et al., 2006; Mitcham et al., 2007; Bautista- Baños et al., 2008;
Hernández-Lauzardo et al., 2008; Velázquez-del Valle et al., 2008;
Hernández-Lauzardo et al., 2009;).
Dominio: Eukaryota
Reino: Fungi
Filo: Zygomycota
Tabla 1.4. Clasificación Subfilo: Mucoromycotina
taxonómica de Rhizopus Clase: Zygomicetes
stolonifer (Shipper, 1984; Orden: Mucorales
Familia: Mucoraceae
Agrios, 2002). Genero: Rhizopus
Especie: stolonif er

Nombre binominal: Rhizopus stolonifer

2
 Tesis de

R. stolonifer ataca macerando los tejidos de los frutos por medio de la

hidrólisis que genera al excretar enzimas pectinolíticas, las cuales
disuelven y degradan la pectina de la lámina media de las células
vegetales, generando zonas hidróticas con olor desagradable y en algunos
casos con fermentación. Se le ha reportado y reconocido como uno de los
fitopatógenos postcosecha más destructivos y severos alrededor del
mundo, siendo causal de la enfermedad conocida como pudrición blanda
en diversos frutos y vegetales, y apareciendo más comúnmente en las
drupas con hueso como los duraznos y ciruelas, así como en berries,
papayas, jitomates y tomates, además de todo tipo de cucurbitáceas, ajos,
tubérculos como papas, camotes, betabel, zanahorias y yuca, y otros
productos hortofrutícolas como cacahuates, frijol, chícharo, cebolla,
chiles, tulipanes, cormos de gladiolos, brócoli, col y coliflor, por lo cual se
ha recurrido a diversos métodos de control para reducir las mermas
económicas que este agente biológico causa en el mercado (Herrera y
Ulloa, 1998; Agrios 2002; Quing et al., 2002; Korsten y Wehner, 2003;
Hernández-Lauzardo et al., 2009). Debido a las pérdidas monetarias que
representa la aparición de ésta enfermedad, y a que es un
microorganismo que se encuentra presente naturalmente en la cutícula de
los frutos se ha optado por diferentes métodos de control para detenerlo
(Bautista-Baños et al., 2008; Velázquez-del Valle et al., 2008).

1.3 Estrategias de Control de Rhizopus stolonifer

1.3.1 Fungicidas

Diversas sustancias de acción fungicida han sido usadas para controlar

este agente biológico, los mejores resultados se han obtenido usando
Dicloran en frutos de jitomate (Solanum lycopersicum) y duraznos (Purunus
persica Batsch). El Iprodine ha sido de mayor aceptación controlando la
enfermedad
2
 Tesis de

en frutos de jitomate en almacén, sin embargo, su producción fue

cancelada de manera voluntaria en 1996 debido a que representaba un
factor de riesgo social y ambiental. Posteriormente se formularon
fungicidas de menor impacto ambiental como el fludixonil y el
tebuconazole, los cuales son efectivos en duraznos, nectarinas (Purunus
persica L. Var. Nectarina) y ciruelas (Spondias purpurea), otros fueron el
benomil y miclobutanil. Si bien se ha corroborado la efectividad de dichas
sustancias, debe reconsiderarse su uso para el control de dicho agente
fitopatógeno por diversas razones: 1)
R. stolonifer ha desarrollado resistencia al dicloran, benomil y miclobutanil,
resultando en una incidencia mayor; 2) Los fungicidas son derivados del
petróleo por lo que contribuyen a la emisión de gases invernadero y sus
costos aumentan continuamente afectando la economía de los
productores;
3) En campo tienen efecto nocivo hacia organismos benéficos para los
cultivos; 4) Representan un riesgo social y ambiental (Mari y Gouzzardi,
1998; Adaskaveg et al., 2002; Müller, 2002; Northover y Zhou, 2002;
Tiripathi y Dubey, 2004; Jasso-de Rodríguez et al., 2005; Fröster et al.,
2007; Velázquez-del Valle et al., 2008).

1.3.2 Control Químico

Algunos productos químicos ofrecen actividad fungicida o fungistática

controlando la pudrición como el peróxido de cloro (ClO2), reduciendo la
germinación de esporas en pruebas in vitro; óxido nitroso (N2O),
retrasando la infección en fresa (Fragaria x ananasa); ozono (O3), probado
en uvas (Vitis vinífera) controlando la pudrición por completo; molibdato de
amonio ((NH4)2MoO4), reduciendo el diámetro de las lesiones hidróticas
en manzanas (Malus sylvestris), etanol en soluciones, reduciendo la
germinación de esporas, ácido peracético en solución, con eficiencia total

2
 Tesis de

al tratar nectarinas. La aplicación de estos productos implica el

incremento del precio de los productos hortofrutícolas ya que los costos
de producción aumentan,

2
 Tesis de

aunque algunos son relativamente de bajo costo (Sarig et al., 1996; Qadir y
Hashinaga, 2001; Nuñez et al., 2001; Gabler et al., 2004; Mari et al., 2004;
Zoffoli et al., 2005; Velázquez-del Valle et al., 2008).

1.3.3 Control cultural pre y postcosecha

Las buenas prácticas agrícolas son una medida que ayuda a reducir la
aparición de la enfermedad en los productos hortofrutícolas, sin embargo,
debe aplicarse en conjunto con otras técnicas para lograr buenos
resultados:
a) El control pre cosecha consiste en la buena selección del material
genético del cultivo y el lugar donde se establecerá, las condiciones de
aireación, humedad relativa y temperatura idóneas, las fechas propicias
para establecer el cultivo y la adecuada desinfección de la herramienta de
trabajo. b) Por su parte el control cultural postcosecha incluye un buen
planeamiento de las fechas y horas de cosecha, la madurez con la que se
recolecta el fruto, manipulación adecuada, selección del material de
empaque y condiciones de traslado y almacenamiento. El control cultural
ayuda a la reducción de la enfermedad, sin embargo, no es efectivo en su
totalidad ya que las esporas de R. stolonifer pueden llegar al fruto de
diversas maneras, por lo tanto debe conjuntarse con otras medidas para
asegurar su éxito (Bautista-Baños et al., 2008; Velázquez-del Valle et al.,
2008).

1.3.4 Control por atmósferas y radiaciones

Las atmósferas modificadas ofrecen una opción viable y variable en costo

dependiendo del gas utilizado para controlar la infección por R. stolonifer,
pueden tener buenos resultados ya que actúan sinérgicamente con otros
tratamientos al aplicarse simultáneamente (Romanazzi, 2001; Romanazzi,
2003). Igualmente efectivas pero de costo elevado, las radiaciones ultra
2
 Tesis de

violeta (UV) aplicadas a los productos cosechados tienen la capacidad de

“activar” cierto grado de resistencia interna en los frutos, haciéndolos
menos susceptibles al decaimiento debido a la inhibición de las enzimas
poligalacturonasa, y al ataque de fitopatógenos. Por otra parte, las
radiaciones gamma han tenido éxito al inhibir totalmente el desarrollo de
R. stolonifer de manera independiente y combinándose con otros
tratamientos. Aunque resulta efectivo el control con atmósferas
controladas y con radiaciones, los costes de los productos se elevan
considerablemente, por lo que su aplicación se ve limitada a nivel
comercial (Barkai-Golan et al., 1993; Stevens et al., 1997; Bazza-Zeinab et
al., 2001; Stevens et al., 2004; Velázquez-del Valle et al., 2008).

1.3.5 Control con productos naturales

Otras sustancias y técnicas más económicas y amigables con el medio

ambiente han surgido junto con el desarrollo sustentable. La quitina
desacetilada obtenida de los crustáceos, mejor conocida como quitosano,
el cual es un polímero de glucosamina (2-amino-2-desoxi-D-glucosa) unida
por enlaces β(1-4), se ha usado extensamente en la investigación para su
aplicación comercial, debido a sus características fungicidas, no tóxicas,
como inductor de resistencia y por ser biodegradable, las cuales hacen al
quitosano un polímero con gran potencial de aplicación en el campo
agrícola. (Stanford, 1989; El Ghaouth et al., 1992; Tiripati y Dubey, 2004;
García- Rincon, 2008; Guerra-Sánchez et al., 2008; Hernández-Lauzardo et
al., 2007, 2008). Por otra parte una gran gama de extractos vegetales han
sido probados para corroborar su potencial como agentes antifúngicos.
Los extractos de semillas de paraíso blanco (Moringa oleifera), los aceites
esenciales de tomillo (Thymus compactum) y orégano (Origanum compactum),
los vapores de mentol obtenidos de la menta (Mentha x piperita) y de lanilol
obtenidos de la albahaca (Ocinum basilicum), así como los polvos de raíces
de

2
 Tesis de

kava (Piper minthysticum), han demostrado su actividad antifúngica

inhibiendo la formación de micelio y esporulación del hongo. Aunque los
extractos vegetales muestran una solución eficaz, la forma de obtener
algunos resulta costosa y las investigaciones quedan en la fase in vitro
(Edris y Farrag, 2003; Plotto et al., 2003; Xuan et al., 2003; Velázquez-
Gurrola et al., 2005).

1.3.6 Control por medio de microorganismos

Existen microorganismos que de manera natural se asocian formando

relaciones simbióticas de comensalismo o de mutualismo con las plantas y
que al colonizar y llevar a cabo su ciclo de vida presentan actividad
antagonista hacia agentes fitopatógenos. Smilanick et al. (1993)
observaron que en la superficie de los frutos habitaban levaduras
soportando el ataque de los fungicidas comerciales y colonizando las
superficies sin dejar espacio o alimento disponible para los patógenos. Se
ha comprobado la eficiencia de cepas como Pantoea agglomerans al evitar la
pudrición por R. stolonifer en nectarina, manzana, fresa, pera (Pyrus
communis L.) y naranja (Citrus sinensis L.). Microorganismos como
Trichosporon pullulans, Cryptococcus laurentii y Pichia membranefaciens han
controlado efectivamente la pudrición blanda en cerezas dulces (Prunus
avium L.), C. laurentii incluso actuando a temperaturas de almacenamiento
y con atmósferas modificadas. El uso de microorganismos nativos
asociados a las plantas resulta ser una alternativa viable, de bajo costo y
fácil de obtener, por lo que las investigaciones actuales apuntan a la
búsqueda de agentes biológicos en cultivos con actividad antagónica
hacia los agentes causales de las enfermedades en los cultivos abriendo
paso a la aplicación del control biológico a nivel comercial (Abdel- Mallek
et al., 1995; Lagunas-Lagunas et al., 2001; Nuñez et al., 2001; Quin et al.,
2004; Rancés et al., 2006; Velázquez-del Valle et al., 2008).

2
 Tesis de

1.4 Interacciones planta-microorganismo, microorganismo-

microorganismo

En la historia de la biotecnología vegetal, se ha dilucidado un amplio

número de interacciones entre plantas y microorganismos. Por su parte,
las plantas ofrecen un gran número de hábitats ricos en nutrientes que
promueven el crecimiento microbiano. Las superficies de semillas, raíces,
hojas y frutos, pueden llegar a albergar una gran diversidad de
comunidades microbianas, en tanto que las flores y tejidos vasculares se
encuentran libres o alojan colonias específicas. Los microorganismos
asociados a las plantas pueden desempeñar diferentes papeles por un
lado deletéreos (parásitos) o bien, neutrales (comensalistas) o benéficos
(mutualistas, sinérgicos), tendiendo a colonizar y mantener saludables a
las plantas (Quing et al., 2002; Beattie, 2006; Raaijmakers et al., 2009;
Diallo et al., 2011). Los microorganismos asociados a las plantas también
interactúan entre sí, estas interacciones se dan entre los miembros de la
misma colonia e incluso entre las diferentes colonias de la comunidad. En
los casos de algunos géneros, las interacciones entre los individuos de una
misma colonia afectan directamente a colonias de géneros diferentes. Es
decir, al alcanzar o pasar un umbral de concentración celular, los
individuos responden a señalizaciones moleculares como las acil-
homoserina-lactonas en Gram negativas o pequeños oligopéptidos en
Gram positivas, activando la expresión de genes específicos que desatan
comportamientos colectivos como la secreción de ciertos metabolitos
secundarios que afectan a otras colonias, reduciendo su número
poblacional o incluso erradicándolas. Basado en este fenómeno llamado
quórum sensing, surge el Control Biológico, en donde se incrementan las
poblaciones de algún o algunos géneros microbianos con actividad
antagónica hacia organismos específicos con la finalidad de controlar
naturalmente las poblaciones de los fitopatógenos. El primer reporte
biotecnológico del uso de un microorganismo como antagonista biológico,
fue el de Trichoderma spp. controlando la
2
 Tesis de

pudrición causada por Botrytis sp. en plantas de fresa, sin embargo, el

primer trabajo clásico de Control Biológico fue llevado a cabo bajo
condiciones postcosecha, controlando la pudrición café en drupas por
medio de un aislado de Bacillus subtilis (Tronsmo y Denis, 1977; Pusey y
Wilson, 1984; Beattie, 2006).

1.5 Control biológico postcosecha

En la mayoría de los casos, los fitopatógenos llegan a los productos

hortofrutícolas desde el campo, manteniéndose como infecciones latentes que
posteriormente se desarrollan durante los estadios de transporte o
almacenamiento, aun más cuando el producto ha sufrido daños a causa de
la manipulación. Alrededor del 20% al 25% de los productos agrícolas se
pierden por causa de fitopatógenos de origen fúngico en el mundo, aun en
los países desarrollados. El control biológico postcosecha ha resultado
una alternativa viable para el manejo de enfermedades en frutos y
vegetales en almacenamiento, ya que conjunta las características de ser
efectivo, económico y seguro tanto para la salud humana como para la del
ambiente. En la literatura, se muestran técnicas en las cuales el inóculo
del antagonista puede incluirse en el producto de forma pre y
postcosecha, siendo más utilizada por su eficacia la inoculación
postcosecha por medio de inmersión o aspersión de las células, de los
metabolitos o una fracción de éstos. Hasta hoy en día, bajo este principio
se han diseñado algunos productos de uso comercial (Tabla 1.5), los
cuales han demostrado eficientemente la reducción de las poblaciones de
fitopatógenos, asegurando la calidad con la que los productos se
comercializan en el mercado y evitando pérdidas económicas por mermas
(Dorby et al., 2009; Sharma et al., 2009; Quin et al., 2004; Quing et al.,
2002).

3
 Tesis de

Tabla 1.5. Productos comerciales para biocontrol de enfermedades

postcosecha (Pusey y Wilson, 1984; McLaughlin et al., 1990; Dorby, 1993;
Mercier y Wilson, 1994; Wisniewski, 1995; Janisiewicz y Jeffers, 1997;
Korsten et al., 1997; Janisiewicz y Korsten, 2002; Dorby, 2006).

Producto Agente Antagonista Frutas/Vegetales Patogenos Blanco Distribuidor

Citricos,
Aspire Pichia guillermondii + Diversos Ecogen-Israel Paternship
manzanas
Thiobendazole patogenos. Ltd.
y peras.
Colletotrichum Cropcheck Ltd. Nueva
Avogreen Bacillus subtilis Aguacate spp.,
Zelanda
Cercospora
Manzanas, spp.
EcoScience Corp.
peras,
Penicillum spp., Orlando, EUA.
BioSave Pseudomonas syringae citricos, cerezas
Botritis spp.
y
papas.
Pseudomonas Manzanas,
Blight Ban fluorescence Erwinia spp. Nu Farm, Inc. EUA.
peras, fresas y
papas.

Contans WG, Fusarium spp.,

Coniothyrium minitans Cebolla Prohyta Biologischer,
Intercept WG Botritis spp.,
Alemania.
Aspergillus spp.,

Papas y otros Rhyzoctonia spp., KFZB Biotechnick,

Rhio-plus. Bacillus Erisyphe spp.,
subtilis vegetales. Alemania.
Liveillula spp.
Podosphaera spp.,
Sclerotium spp.,
Manzanas,
Phytophtora spp., Agro Quess Inc., EUA.
Serenade Bacillus peras, uvas y
Puccinia spp.,
subtilis vegetales.
Alternaria spp.

Candida oleophila
YieldPlus
+ Penicillum spp., YieldPlus Agricultural
Thiobendazole Citricos Geotrichum spp. Products Africa del Sur.

Los microorganismos usados para el control biológico, cuentan con

diversos mecanismos biológicos para controlar la acción de los
fitopatógenos, entre los que se mencionan en la literatura la competencia
por nutrientes y espacio, antibiosis, producción de enzimas y parasitismo
directo entre otros (Dorby et al., 2009; Sharma et al., 2009; Köhl et al.,
2011).

3
 Tesis de

1.5.1 Competencia por nutrientes y espacio

Es mencionado que la competencia por nutrientes y/o espacio es

considerado como uno de los principales mecanismos de acción por medio
de los cuales los microorganismos antagónicos controlan a los
fitopatógenos postcosecha. La toma de nutrientes de una manera
eficiente, genera que un microorganismo tenga la capacidad de excluir
naturalmente a otros de espacios naturales como las superficies de los
frutos y vegetales, de igual manera con un crecimiento acelerado y/o una
dispersión eficiente, se limita la posibilidad de colonización por
microorganismos ajenos al medio, una mejor adaptación a diversas
condiciones ambientales y nutricionales, asegura que los agentes
antagónicos tengan éxito en el control de enfermedades postcosecha.
Aunque es mencionado como el principal mecanismo de acción, también
se argumenta que otros mecanismos pueden entrar en juego a la par
(Compant et al., 2005; Dorby et al., 2009; Sharma et al., 2009; Babalola,
2010).

1.5.2 Formación de biosurfactantes y biopelículas

Para permanecer en sus sitios de acción, los microorganismos despliegan

dos estrategias, a saber: 1) la excreción de biosurfactantes como la
iturina, fenacina, lychehisina y surfactina (Bacillus spp) que les facilitan
adherirse o mantenerse en un sitio específico, o bien, 2) la generación de
matrices de exopolisacáridos que forman biopelículas que cubren áreas de
interés. Estos dos mecanismos permiten a los antagonistas fijarse a las
superficies sobre las cuales actúan, pudiendo ser las heridas o cutículas
de los productos frutales o vegetales, permitiéndoles competir más
eficientemente por nutrientes, o bien cubrir las superficie de las
estructuras de los patógenos, previniendo la germinación de esporas o
permitiéndoles parasitar las hifas de éstos, también se ha propuesto que

3
 Tesis de

tanto los biosurfactantes como las

3
 Tesis de

biopelículas facilitan la circulación de sustancias de acción antibiótica

(Dorby et al., 2009).

1.5.3 Antibiosis

La antibiosis consiste en la segregación al medio de sustancias con la

capacidad de atrofiar, inhibir o destruir las células de los organismos
fitopatógenos, por medio de productos del metabolismo secundario de los
antagonistas, los cuales poseen cualidades antibióticas. Algunas
sustancias reconocidas en trabajos clásicos de control biológico incluyen a
la iturina (Bacillus subtilis), bacitracina (Bacillus licheniformis y B. subtilis),
fenacina-1- ácido carboxílico (Bacillus spp., Pseudomonas spp.)
siringomicina, pyrrolnitrina, (Pseudomonas spp.), 2,4-diacetyphloroglucinol
(DAPG) (Pseudomonas fluorescens) y los alcaloides quinolizidínicos
(Burkholderia cepacia), sin embargo, la secreción de dichos compuestos se
encuentra estrechamente ligada a una señalización determinada por el
fenómeno conocido como quórum sensing, por lo que es importante
alcanzar una población mínima para que el control biológico se lleve a
cabo bajo este principio. El control de enfermedades por medio de
antagonistas que producen compuestos antibióticos es considerado como
el segundo mecanismo de acción más importante (Hernández-Rodríguez,
et al., 2006; Sharma, et al. 2009; Babalola, 2010).

1.5.4 Producción de enzimas y parasitismo

La producción de enzimas líticas es otro mecanismo de acción identificado

en algunos antagonistas. Debido a que la pared celular de los hongos está
compuesta de quitina y β1-3 glucano, o bien de celulosa y β1-3 glucano (en
el caso de algunos oomycetos fitopatógenos como Phytophtora), las
enzimas

3
 Tesis de

como las quitinasas, β1-3 glucanasas, celulasas, lipasas y proteasas,

producidas por algunos antagonistas, degradan las paredes celulares de
los hongos fitopatógenos lisando sus células. Por otra parte, algunos
agentes de biocontrol como Pichia guillermondii y Trichoderma spp. son
parásitos directos de algunos hongos fitopatógenos, fijándose a la pared
celular o apresando las hifas de estos y posteriormente usando este tipo
de enzimas para llevar a cabo el parasitismo directo al entrar a las células
del fitopatógeno y alimentarse de estas (Quing et al., 2002; Macagnan, et
al., 2005; Sharma, et al., 2009).

1.5.5 Inducción de resistencia

Aunque la inducción de resistencia en frutos es un campo poco dilucidado

de la biotecnología y cuenta con pocos avances, se ha considerado como
otro mecanismo de acción de los microorganismos antagonistas,
propuesto en 1996 por Arras. Sin embargo, se tienen datos de que
algunos oligosacáridos de la pared celular o sideróforos producidos por
los antagonistas, funcionan como moléculas elicitoras promoviendo e
incrementando la actividad de enzimas como β1-3 glucanasas,
peroxidasas, quitinasas, acumulación de fitoalexinas y la sobre producción
de mucílago extracelular en las heridas de los frutos, las cuales
promueven el proceso de sanación de la herida, por lo que se considera
que inducen a un mecanismo de defensa propio del fruto (Hernández-
Rodríguez, et al., 2006; Sharma, 2009).

1.5.6 Sideróforos

El hierro (Fe+3) es un elemento biológicamente importante, especialmente

para los microorganismos que viven en condiciones aerobias, debido a
que es esencial para diferentes funciones como la reducción de
precursores de DNA
3
 Tesis de

y RNA, así como para la síntesis de ATP por cadena transportadora de

electrones, de igual manera, es constituyente de diversos tipos de
biomoléculas como los citocromos, clorofila, hemoproteínas, e incluso
funciona como cofactor para un gran número de enzimas (Rachid y
Ahmed, 2005; Macagnan et. al., 2008; Logeshwaran et. al. 2009).

Los sideróforos son compuestos específicos quelantes de hierro los cuales

son secretados por los microorganismos bajo condiciones de estrés
causadas por una baja concentración de hierro en el medio, siendo su
producción inversamente proporcional a la concentración de este
elemento, dichas biomoléculas participan en la solubilización y el
transporte de iones hierro hacia el interior de las células microbianas
(Meyer y Abdallah, 1978; Rachid y Ahmed, 2005; Teixeira-Lacava et. al.,
2008). Dependiendo de la naturaleza de las moléculas para generar
enlaces con el hierro, estos se pueden clasificar en sideróforos de
hidroximato, carboxilato, catecolato y fenolato. Se ha reportado que los
hongos son capaces de producir sideróforos del tipo hidroximato y
carboxilato únicamente, por otra parte las bacterias son productoras de
los cuatro tipos (Das et. al., 2007; Pérez-Miranda et. al., 2007). La
producción de sideróforos por parte de los agentes antagónicos en
cantidades suficientes puede generar biocontrol debido a que limitan la
biodisponibilidad del hierro para algunos patógenos, incluso, estos
pueden funcionar como, promotores de crecimiento vegetal o inductores
de resistencia en plantas. Por otra parte, los sideróforos también se
relacionan con la patogénesis, en especial los de tipo hidroximato,
producidos por diferentes hongos fitopatógenos, incluyendo a los del
género Rhizopus (Machuca y Milagres, 2003; Pérez-Miranda et al., 2007;
Macagnan et. al., 2008; Nenwani et. al., 2009;).

3
 Tesis de

1.5.7 Liberación de compuestos volátiles

Se han reportado algunos otros compuestos volátiles de bajo peso

molecular con poder biocida importante, tales como el ácido cianhídrico o
cianuro de hidrógeno (HCN), el cual es liberado a la par con compuestos
volátiles orgánicos como el 2,3-butaneidol y la acetoína, mismos que
promueven el crecimiento vegetal. La pioluteorina es otro compuesto
volátil reconocido en el campo de control de fitopatógenos por tener un
amplio espectro antifúngico. Otras sustancias con esta naturaleza que han
sido reportadas son las furanonas y el auxofuran (Ezziyyani et al., 2004;
Hernández- Rodríguez et al., 2006; Babalola, 2010).

1.6 Género Bacillus

El género Bacillus, descrito por primera vez en 1872 por Cohn pertenece a
la división de los „Firmicutes‟, siendo bacterias en forma de bastón,
ampliamente distribuidas en la naturaleza, creyéndose que
aproximadamente el 95% de las bacterias baciliares encontradas en los
suelos pertenecen a éste género. Las especies de Bacillus se encuentran
dispersas por el suelo, aguas dulces y saladas, e incluso en el aire,
muchas de estas forman asociaciones simbióticas con las plantas, por lo
que se les encuentra en las hojas, raíces (al interior y exterior) y en la
rizosfera. Su capacidad de formar endosporas les permite sobrevivir a
condiciones adversas y poseen una gran adaptabilidad fisiológica y
genética, lo que hace a muchas especies óptimas para su uso como
agentes de control biológico. Algunas especies tienen propiedades
promotoras de crecimiento vegetal (PGPB) por su capacidad de solubilizar
nitrógeno (diazotroficas), solubilizar fosfato y producir diferentes tipos de
hormonas vegetales. En control biológico, varias especies resultan de
interés debido a que son una fuente importante de genes que codifican
para diversos tipos de enzimas que actúan

3
 Tesis de

en contra de fitopatógenos, enzimas que detoxifican factores de virulencia

o bien moléculas de interés con actividad antibiótica como la bacitracina,
polymixina, tyrocidina, garamicidina y circulina, o la surfactina,
lychehisina, iturina y fenacina que además de tener propiedades
antibióticas también actúan como surfactantes. Otros genes encontrados
en el género Bacillus codifican para moléculas con la capacidad de elicitar
la activación de genes en plantas asociados a las rutas del ácido salicílico
y del etileno/ácido jasmónico, teniendo así la capacidad de generar
Resistencia Sistémica Inducida (ISR) al colonizar las plantas o los frutos.
Estas características, hacen idóneas a algunas especies del género Bacillus
como agentes de control biológico (Azevedo et al., 1993; De la Rosa et al.,
2002; Moroginski et al., 2004; Anderson et al., 2006; Beattie, 2006; Ahmad,
2008; Barriuso et al.,
2008; Egamberdiyeva e Islam, 2008; Sharma, 2008; De-Vleesschauwer y
Höfte, 2009;).

1.7 Leifsonia aquatica (anteriormente Corynebacterium

acuaticum)

Corinebacterium acuaticum fue descrita por primera vez por Leifson en 1962
(Evtushenko, et al., 2000), sin embargo, hoy en día se ha reclasificado
dentro de un nuevo género nombrándose como Leifsonia aquatica. Se
caracteriza por ser una bacteria Gram positiva con forma de bacilo que no
forma esporas. Naturalmente se ha encontrado en ecosistemas boscosos,
asociada a aguas limpias, líquenes, rocas y a suelo rizosférico del árbol de
la teca (Tectona grandis). Es capaz de formar agregados fácilmente,
generando biopelículas para adherirse a las superficies. Tiene afinidad
por los minerales por lo que es buena solubilizadora de los mismos, sin
embargo, no se ha indagado sobre su relación con los agroecosistemas
(Evtushenko, et al., 2000; Rickard, et al., 2003; An, et al., 2009; Madhaiyan
et al., 2010).

3
 Tesis de

1.8 Justificación

El interés por la investigación biotecnológica enfocada en el desarrollo y

aplicación del control biológico, radica en reducir y reemplazar el uso de
agroquímicos sintéticos en los productos hortofrutícolas, ya que al ser la
mayoría de estos de consumo inmediato y en fresco, las sustancias usadas
actualmente para su protección, tienen un impacto directo tanto en la
salud del consumidor (especialmente en niños y ancianos), como en el
bienestar ambiental. A pesar de esto, es una realidad tangible que
alrededor del 20% al 25% de las frutas y vegetales cosechados en el
mundo se pierden debido a la acción de fitopatógenos fúngicos en las
etapas de traslado y almacenamiento aun en los países desarrollados. El
uso de microorganismos asociados a los cultivos para el control de
enfermedades postcosecha, surge como una alternativa económica,
responsable social y ambientalmente, por lo que se considera como una
herramienta potencial y substancial para el desarrollo de una producción
agrícola sustentable, sin embargo, su uso no ha alcanzado la aceptación
total por los productores agrícolas a pesar de los reportes científicos
referentes al éxito en la aplicación de dicha biotecnología. Al analizar
algunos casos en los que el control biológico no surte el efecto
pronosticado, se han detectado dos principales causas: 1) las prácticas
agrícolas en las cuales se implementan y aplican los microorganismos, y
en mayor medida 2) a la diversidad biótica y abiótica de los
agroecosistemas en los que se introducen y al cual son ajenos, de tal
manera que la probabilidad de supervivencia es menor, aun más cuando
dichos productos biológicos son conjugados con tratamientos
convencionales (Compant, et al., 2005; Dorby et al., 2009; Sharma, et al.,
2009; Latour, et al., 2009; Babalola, 2010; Diallo, 2011). Así en el presente
trabajo de investigación, se pretende a nivel laboratorio obtener la
microbiota nativa asociada al cultivo comercial de la zarzamora, con la
finalidad de identificar agentes con poder antagónico, los cuales estén

3
 Tesis de

sujetos a las mismas condiciones del cultivo e incluso sean

4
 Tesis de

capaces de controlar naturalmente la pudrición blanda de los frutos

causada por Rhizopus stolonifer.

1.9 Hipótesis

El cultivo de la zarzamora cuenta con microorganismos asociados a la

planta capaces de reducir la infección postcosecha por Rhizopus stolonifer
en frutos.

1.10 Objetivos

Objetivo General

Evaluar la actividad biocontroladora de la microbiota bacteriana asociada

al cultivo de la zarzamora (Rubus fruticosus) contra el hongo fitopatógeno
Rhizopus stolonifer.

Objetivos específicos

1) Aislar, identificar y evaluar la patogenicidad de cepas

pertenecientes al género Rhizopus asociados a plantas y frutos de
zarzamora.
2) Aislar, identificar y determinar la actividad antagónica in vitro de
cepas bacterianas asociadas al cultivo de zarzamora versus los
aislados patogénicos del género Rhizopus.
3) Evaluar la eficacia de los antagonistas bacterianos para reducir la
incidencia de la enfermedad en los frutos de zarzamora en
condiciones postcosecha.

4
 Tesis de

Capítulo II. Materiales y Métodos

2. Materiales y Métodos

El trabajo experimental fue desarrollado en dos dependencias del

Instituto Politécnico Nacional (IPN), CIIDIR-IPN Unidad Michoacán en el
laboratorio de fitopatología, y en CeProBi-IPN Morelos en el laboratorio de
fitopatología. Se contó con la colaboración del C. Emanuel Santillán,
productor de zarzamora de exportación quién aportó las muestras de
material biológico.

2.1 Toma de muestras

Las plantas de zarzamora de las cuales se obtuvo la microbiota nativa

asociada se recolectaron en rancho „Los Molinos‟, en la localidad de
Atapan ubicada geográficamente a 1580 msnm a una longitud de
102°25‟26‟‟ y una latitud de 19°39‟06‟‟, perteneciente al municipio de
Los Reyes en el estado de Michoacán (INEGI, 2005). La parcela se
encontraba dividida por sectores de forma rectangular a los cuales se les
numeró del 1 al 6, las muestras de las plantas fueron tomadas de los
sectores 3 y 5 seleccionando una planta de cada uno de los vértices del
sector y una más del centro, debido a que el sector 6 era el único que
presentaba fruto; fue de este de donde se tomaron las muestras de dicho
material. Las plantas seleccionadas fueron tomadas desde la raíz,
introduciendo en una bolsa de polietileno la raíz completa con una
muestra del suelo que la rodeaba, en otra bolsa se colocaron las hojas.
Posteriormente, se identificaron e introdujeron en una hielera para
conservarlas, lo mismo se hizo para los frutos recolectados. Los frutos con
calidad de exportación fueron tomadas directamente de la cosecha del

4
 Tesis de

día.

4
 Tesis de

2.2 Obtención de la microbiota nativa asociada a la planta

En el laboratorio de suelos y fitopatología del CIIDIR-IPN Unidad

Michoacán, se hicieron improntas de las muestras de hojas en medio
papa-dextrosa-agar DIFCO (PDA). Los frutos se tomaron y rotaron sobre
el mismo medio. Se separó el suelo pegado a las raíces y se llevó a cajas
Petri con PDA por medio de improntas con la ayuda de una esponja
estéril. Por otra parte, las raíces fueron lavadas con agua corriente y
jabón, se sumergieron en solución de hipoclorito de sodio al 3% durante 5
min, se lavaron repetidas veces con agua destilada estéril (ADE) y se
secaron. Con ayuda de un bisturí se separó la corteza y el centro fue
cortado en hojuelas, de las cuales una parte fue colocada sobre medio
PDA y las otras fueron trituradas con agua peptonada al 2%. Se tomaron 5
hojuelas colocándolas sobre medio PDA. Del líquido resultante de la
trituración de hojuelas se tomaron 5 asadas las cuales fueron distribuidas
sobre PDA. Se incubaron a temperatura ambiente hasta obtener la
aparición de colonias (Figura 2.1).

Transcurrido el tiempo de incubación, se seleccionaron las colonias que

presentaban mayor producción de biomasa y las que presentaron mayores
halos de separación de otras colonias; estas se transfirieron a cajas Petri
con PDA, por caja se incluyeron hasta 9 colonias. Posteriormente, las
colonias que presentaron morfología típica bacteriana se aislaron y
purificaron en medio PDA mediante resiembras sucesivas y extensión por
agotamiento.

2.3 Obtención de aislados fúngicos del género Rhizopus

Para obtener aislados del género Rhizopus se establecieron cámaras

húmedas de la siguiente forma: en el interior de bolsas plásticas se colocó
papel absorbente humedecido con ADE, sobre los cuales se colocaron seis

4
 Tesis de

frutos y se cerraron de tal manera de que quedara aire dentro de éstas.

Se

4
 Tesis de

almacenaron a temperatura ambiente hasta observar la aparición de

micelio característico al género (Figura 2.2).

A B C

D E F G
Figura 2.1. Metodología de obtención de microbiota nativa asociada a la planta de
zarzamora. A) Improntas con hojas; B) Frutos rotados sobre medio PDA; C) Improntas de
suelo; D) Corte de raíces para obtener hojuelas; E) Hojuelas sobre PDA; F) Hojuelas
trituradas con agua peptonada; G) Asada esparcida sobre PDA.

Figura 2.2. Cámaras húmedas para desarrollo de Rhizopus stolonifer.

4
 Tesis de

Posteriormente, del micelio característico desarrollado sobre los frutos, se

tomó una muestra y se colocó sobre medio PDA. Por otro lado, también se
tomo micelio con morfología característica al género de las cajas Petri con
improntas de hojas, frutos, suelo, con hojuelas de raíz y extracto de raíz y
se pasó al medio de cultivo nuevo para cultivar al microorganismo.

2.4 Identificación microscópica de cepas fúngicas del género

Rhizopus

Para la observación al microscopio de las cepas para su identificación, el

hongo fitopatógeno se cultivó en cámaras húmedas sobre cubos de medio
PDA. Para ello, se gelificó una placa de PDA de un centímetro de grosor,
el cual fue cortado en cubos de 1cm de largo por 1 cm de ancho, los cubos
se colocaron por pares sobre una caja Petri con una capa de PDA de 3
mm, posteriormente se tocó con una punta estéril el micelio esporulado
de las cepas fúngicas supuestas a pertenecer al género Rhizopus y se
pinchó el cubo en la parte superior y en los cuatro laterales. Se colocó un
cubre objetos estéril sobre el cubo y se dejó incubar a temperatura
ambiente hasta obtener cuerpos fructíferos esporulados. El cubre objetos
se tomó con una pinza estéril y se colocó sobre un porta objetos con una
gota de azul de tripano para ser observado al microscopio. La observación
tuvo como objetivo identificar las cepas por medio de las estructuras
características del género y determinar la especie a la que pertenecían
cada una según las claves descritas por Shipper en 1984.

2.5 Identificación de los antagonistas

La identificación de los aislados bacterianos fue realizada con ayuda de la

Doctora Graciela Castro del Departamento de Microbiología en la Escuela
Nacional de Ciencias Biológicas del Instituto Politécnico Nacional (ENCB-IPN)

4
 Tesis de

en el laboratorio de Bacteriología, en donde los cultivos bacterianos

fueron sometieron a pruebas bioquímicas con el sistema de identificación
BBL CRYSTAL™ Identification System Rapid Gram-Positive ID Kit,
distribuido por BD (Becton, Dickinson y Compañía).

2.6 Purificación de las cepas fúngicas de Rhizopus

Al obtener los aislados fúngicos en placas Petri con PDA, se aplicaron dos
métodos de purificación para asegurar el obtener colonias puras.
Primeramente se hizo un cultivo de punta de hifa; en donde se tocó el
micelio esporulado de los hongos y se inoculó una caja Petri con medio
agar-agua (AA), posterior a esto, bajo el estereoscopio se eligió la punta
de una hifa la cual se cortó con un bisturí para colocarse sobre medio PDA
en donde se incubó a temperatura ambiente hasta obtener cuerpos
fructíferos con esporas. En segunda instancia, se tomaron las cepas
cultivadas bajo la técnica de punta de hifa y se vertieron 10 mL de ADE
sobre el micelio removiendo con una varilla de dispersión para colectar
las esporas, esta solución se filtró haciéndose pasar a través de una gasa
estéril para retener el micelio, posteriormente se hicieron diluciones
logarítmicas (Hernández- Lauzardo et al., 2006) pasando 2 µL de la
dilución quinta, sexta y séptima a una caja Petri con medio AA
esparciendo con una varilla de dispersión, se incubaron a temperatura
ambiente hasta obtener esporas individuales germinadas las cuales se
cultivaron individualmente en PDA para obtener cultivos monospóricos.

4
 Tesis de

2.7 Reproducción de los postulados de Koch y patogenicidad de las cepas

Se reprodujeron los postulados de Koch con la finalidad de comprobar la

patogenicidad de las cepas del género Rhizopus aisladas del cultivo de
zarzamora, para lo cual se tomó una caja Petri con micelio esporulado de
cada una de las cepas fúngicas, a las cuales se añadieron 10 mL de ADE y
se removieron las esporas con una varilla de dispersión, esta solución fue
filtrada por medio de una gasa estéril, se calculó el número aproximado
de esporas en la solución por medio de un hematocitómetro y aplicando la
siguiente fórmula:

NAE = Σ(C1, C2, C3, C4, C5) * 2000

En dónde:

NAE: Número aproximado de esporas en la solución.

Cn: El número de esporas presente en cierto campo del hematocitómetro.

Para determinar la patogenicidad de los aislados de Rhizopus, se

acondicionaron cámaras húmedas individuales para los frutos, las cuales
constaban de un envase plástico aséptico (sumergido en solución de
hipoclorito de sodio al 1% durante 5 min, enjuagando repetidas veces con
ADE) el cual contenía dentro papel secante estéril humedecido con ADE.
Los frutos fueron sumergidos en hipoclorito de sodio al 1% durante 5 min
y enjuagados repetidas veces con ADE. Posteriormente se secaron con
papel secante estéril, y se colocaron individualmente dentro de un
contenedor. Posteriormente, se inocularon con 10 6 esporas/mL
(Hernández-Lauzardo et al., 2009), los contenedores se posicionaron sobre
una charola de cartón con papel absorbente humedecido con ADE, la cual
se introdujo en una bolsa

4
 Tesis de

plástica simulando una cámara húmeda y se dejaron en incubación a

temperatura ambiente (Figura 2.3).

Figura 2.3. Procedimiento para la reproducción de los postulados de Koch.

La evaluación de la patogenicidad y severidad de daño causada por las

cepas se llevó a cabo mediante el uso y diseño de una escala de severidad
(Tabla 2.1) que permite cuantificar por medio de un porcentaje el daño
causado por las cepas al fruto de zarzamora. Los frutos fueron evaluados
cada 24 h, posteriores a la inoculación durante tres días. Para la
evaluación se asignó un grado del 1 al 5 que corresponde a un porcentaje
de daño generado por la cepa. La unidad experimental constó de 10
frutos, generándose dos réplicas. Los grados de daño en porcentaje
fueron promediados y graficados para observar la evolución del desarrollo
del hongo sobre el fruto, considerándose los grados del 2 al 3 como
grados en donde el fruto solo sufre daño a la calidad visual, mientras que
los grados 4 y 5 corresponden al desarrollo de la enfermedad conocida
como podredumbre blanda provocada por R. stolonifer.
5
 Tesis de

Al final del bioensayo el agente causal fue aislado nuevamente en PDA y

observado al microscopio para completar los postulados de Koch.

Tabla 2.1. Escala de severidad diseñada para la evaluación de la

patogenicidad de los aislados del género Rhizopus.

2.8 Diseño de técnica de inoculación y cantidad mínima de inóculo

Basándose en diversos reportes, la forma usual de inoculación de

patógenos fúngicos es por medio de discos de micelio o soluciones de
esporas colocados sobre heridas ocasionadas intencionalmente en los
frutos (Govender et al., 2005; Kefialew y Ayalew, 2008; Hernández-
Lauzardo et al., 2009; Arrevola et

5
 Tesis de

al., 2010). Hernandez-Lauzardo et al., (2009) obtienen infecciones viables

a partir de discos de micelio de 5mm y de soluciones de esporas de 1x10 6
esporas/mL en frutos de durazno, papaya y jitomate, por lo que se parte
de estos datos para generar una técnica viable para inocular los frutos de
zarzamora. Se usaron frutos maduros asépticos y heridos
intencionalmente por medio de un bisturí estéril haciendo una incisión de
5 mm en la zona de abscisión, mismos a los que se les incorporó un disco
de micelio de 5 mm sobre la herida o bien solución de esporas a
diferentes concentraciones usándose 106, 105 y 104 esporas/mL. Los frutos
se incubaron en cámaras húmedas, las cuales constaban de recipientes
plásticos acondicionados con algodón humedecido con ADE y cubierto por
un papel absorbente estéril sobre el cual se posicionaron los frutos
infectados, se hicieron evaluaciones cada 24 h según la escala de
severidad, al cabo de 72 h se determinó el índice de severidad. La unidad
experimental constó de 10 frutos y se hicieron 2 réplicas.

2.9 Bioensayos preliminares

Las cepas identificadas bajo los criterios de las claves de Shipper (1984)
como Rhizopus stolonifer e identificadas como fitopatógenos post cosecha
por medio de la reproducción de los postulados de Koch, fueron sometidas
a pruebas preliminares de antagonismo confrontándose contra los
microorganismos nativos asociados al cultivo de la zarzamora. Dichas
pruebas consistieron en colocar una asada de cada uno de los
microorganismos en cada uno de los extremos de la caja Petri y colocando
un disco de 5 mm de PDA con micelio de R. Stolonifer al centro de la caja
para ser confrontado. Las placas se dejaron incubar durante 72 h y se
midió el halo de inhibición de crecimiento del patógeno.

5
 Tesis de

2.10 Bioensayo de antagonismo in vitro

En cuatro puntos equidistantes de una caja Petri, se inocularon las cepas

bacterianas por medio de una asada, esparciéndolas en un área de 1 cm
de ancho del borde hacia el centro y 2 cm de largo en cada uno de los
puntos. El patógeno fue inoculado por medio de discos de 5 mm de
diámetro de PDA con micelio esporulado de R. stolonifer, los controles
positivos constaron únicamente de un disco de micelio de cada una de las
cepas, mientras que a los controles negativos contaban con un disco de
PDA estéril. Las placas se dejaron incubar a temperatura ambiente y se
evaluó el crecimiento del micelio cada 24 h tomando tres mediciones del
diámetro con la ayuda de un vernier y promediando durante tres días. Con
los datos obtenidos se calculó el índice antifúngico usando la formula
descrita por Gou et al., (2006):

Índice Antífungico = 1 – (Da/Db) * 100

En donde:

Da: Diámetro de la zona de crecimiento micelial del bioensayo.

Db: Diámetro de la zona de crecimiento micelial del control.

El bioensayo se llevó a cabo bajo un diseño completamente aleatorio

contando con tres repeticiones por unidad experimental, para asegurar la
reproducibilidad del mismo fue repetido tres veces. Todos los bioensayos
in vitro fueron realizados usando cajas Petri con diámetro de 860 mm,
aunque para el acomodo de las fotografías mostradas difieran de tamaño.

5
 Tesis de

2.11 Detección de sideróforos

Para determinar la presencia de sideróforos producidos por las bacterias

antagónicas, se utilizó la solución indicadora de Cromo Azurol-S (CAS)
descrita por Schwyn y Neilands en 1987 disuelta en medio casaminoácido
(MCA). Para la solución indicadora se preparó primeramente una solución
de FeCl3, la cual constó de 27 mg de FeCl3*6H20 disueltos en 100 mL-1 de
agua destilada, posteriormente en 40 mL-1 de agua destilada se
disolvieron 72.9 mg de Bromuro Hexadeciltrimetilamino (HDTMA),
manteniéndose en agitación se incluyeron 10 mL-1 de la solución de FeCl3
y 60.5 mg de Cromo Azurol-S, se añadieron 50 mL-1 de agua destilada
lentamente para completar 100 mL-1. Para un litro de medio se usaron 5
gr de ácido casaminico, 1 gr de K2HPO4, 1.55 g MgSO4*7H2O y 15 g de
agar bacteriológico disueltos en 1 L de agua destilada. Tanto el medio
como la solución indicadora se esterilizaron a 121 °C a 15 lb de presión
durante 15 min. Ambos se dejaron enfriar hasta 50 °C, sin perder
esterilidad, se retiraron 100 mL-1 del MCA y se añadieron los 100 mL-1 del
CAS, el medió fue agitado hasta obtener un color oscuro uniforme y
fueron vertidos 20 mL-1 de medio en cajas Petri de 860 mm, dejándose
solidificar hasta obtener una coloración azul brillante. Las cepas
bacterianas fueron inoculadas por medio de una asada haciendo un
círculo en el centro y se dejaron incubar durante 72 h a temperatura
ambiente. Los halos de cambió de color fueron medidos cada 24 h.

2.12 Antagonismo en presencia de iones Fe (III) para reducir

producción de sideróforos

Las pruebas de antagonismo fueron llevadas a cabo bajo las mismas

condiciones que las descritas en el punto 2.10, sin embargo, se hizo una
modificación en el medio de cultivo, añadiéndose 100 mg de FeCl3 (Rachid
y Ahmed, 2005) por litro de PDA, generando así condiciones con alta

5
 Tesis de

disponibilidad de hierro. El bioensayo se evaluó durante 72 h, al final de

las cuales se hicieron tres mediciones de los diámetros de micelio por caja
Petri los cuales fueron promediados, posteriormente se aplicó la fórmula
de índice antifúngico descrita en el punto 2.10. La unidad experimental
constó de 3 repeticiones con tres replicas cada una.

2.13 Bioensayo de antagonismo in situ

El antagonismo in situ se llevó a cabo tanto con células viables como con
extracto libre de células. En ambos casos, las bacterias fueron cultivadas
en 100 mL de medio líquido infusión papa-dextrosa (PDI), el cual se
inoculó con
3 asadas de bacterias, dejando incubar 24 h, a temperatura ambiente. El
extracto libre de células se obtuvo por centrifugación a 10 mil rpm
durante 2 min de una suspensión bacteriana para retirar las células,
colocando el sobrenadante en vasos de precipitados estériles. La
suspensión bacteriana también se colocó en recipientes estériles para su
aplicación. Los frutos fueron aseptizados en hipoclorito de sodio al 1%
durante 5 min y enjuagados repetidas veces con ADE, se hizo una incisión
de 5 mm de ancho en la zona de abscisión con un bisturí estéril, un
tratamiento consistió en sumergir los frutos en el extracto libre de células
y otro el cultivo bacteriano. Ya tratadas, las zarzamoras se colocaron en
cámaras húmedas diseñadas con envases plásticos tipo clamshell
acondicionados con algodón y papel secante estéril, ambos humedecidos
por medio de aspersiones de ADE. Se colocaron 10 frutos por cámara
húmeda y se inocularon con 50 µL de solución de esporas de R. stolonifer a
una concentración de 1x105 esporas/mL sobre la herida intencional. Los
controles fueron sumergidos en ADE. En tanto que a los controles
negativos se les añadieron 50 µL de ADE, a los controles positivos se les
inoculó con la solución de esporas. Todos los tratamientos fueron
incubados a temperatura ambiente durante 72 h, evaluándose cada 24 h

5
 Tesis de

según la escala de severidad, al final del bioensayo se aplicó la fórmula

para calcular el índice de severidad, la cual fue descrita por Pérez et al. en
1995:

Índice de Severidad = Xi (1) + Xi (2) + Xi (3) + Xi (4) + Xi (5)

N

En donde:

Xi: Es el número de frutos observados por cada grado de daño.

Números del 1 al 5: Grado de daño según la escala de severidad diseñada en

el punto 2.7

N: Número de frutos por unidad experimental.

2.14 Análisis estadístico

Todos los experimentos tuvieron un diseño experimental completamente
al azar. Los bioensayos de antagonismo in vitro se realizaron considerando
tres placas Petri como unidad experimental, mientras que en los
experimentos in situ se consideraron 10 frutos por clamshell. Ambos
experimentos se realizaron tres veces para comprobar la reproducibilidad
de la investigación. Los datos se analizaron por medio de un análisis de
varianza (ANOVA). Las diferencias obtenidas fueron analizadas por medio
de la prueba de comparación de medias de Tukey con una p˂0.05. Los
análisis se llevaron a cabo con el programa SAS System for Windows
versión 9.0.

5
 Tesis de

Capítulo III. Resultados

3.1 Caracterización morfológica e identificación de
aislamientos de Rhizopus spp

Se obtuvieron cinco aislados con micelio característico del género fúngico

Rhizopus, al purificarse se obtuvieron cultivos monospóricos los cuales
presentaron micelio aéreo bien definido, algodonoso, en color blanco, a
simple vista, con punteado que varió entre negro, gris y café atenuados,
según los distintos aislados. Los diferentes aislados se etiquetaron con las
primeras cinco letras del alfabeto. Al observarse bajo el microscopio
estereoscópico mostraron similitud en la morfología micelial, sin embargo,
el tamaño y color de los esporangios varía según el aislado (figura 3.1).

A B C
A B C

D E D E

Figura 3.1. Aislados del género Rhizopus nativos del cultivo de zarzamora. Vistos en
microscopio estereoscópico y a simple vista.

5
 Tesis de

Partiendo de los grupos de especies y las características morfológicas

descritas por Shipper (1984), se determinó la especie de cada uno de los
aislados (tabla 3.1).

Tabla 3.1. Identificación y clasificación de aislados del género Rhizopus por

medio de las estructuras características según Shipper (1984).

Aislado

Aislado A: Aislada de hojas viejas de zarzamora. Mostró rizoides amplios

con pequeñas ramificaciones secundarias, los esporangióforos emergen
directo de los rizoides, en color café y son erectos con ligeras curvaturas
en algunos casos, esporangios globosos, redondeados color negro con
abundantes esporangiosporas, las cuales son pequeñas en color negro de
forma redondeada irregular, aislamiento clasificado como Rhizopus
stolonifer.

Aislado B: Aislada de suelo rizosférico, muestra rizoides amplios y sencillos,

en algunos casos con escasas ramificaciones, esporangióforos largos
erectos sin curvaturas, los cuales emergen en un segmento un tanto más
arriba de donde se juntan los rizoides. Los esporangios son esféricos color

5
 Tesis de

negro con

5
 Tesis de

abundantes esporangiosporas color negro, redondas de forma irregular, estas

características corresponden a la especie Rhizopus oryzae.

Aislado C: Obtenida de frutos maduros con calidad de exportación,

presenta los rizoides más complejos de todas los aislados, son amplios con
abundantes ramificaciones, los esporangióforos fueron color café, erectos
y ligeramente curvados en algunos casos, estos emergieron directamente
de los rizoides, por otra parte los esporangios presentaron formas
globosas, con
esporangiosporas abundantes color negro, redondas de forma irregular,
por lo tanto este aislado fue clasificado como Rhizopus stolonifer.

Aislado D: Nativa de fruto verde, con rizoides cortos sin ramificaciones, los
esporangióforos emergen por un lado de los rizoides, son cortos con un
esporangio grande y redondeado con esporangiosporas negras esféricas.
Catalogado como Rhizopus microsporus.

Aislado E: Aislada de frutos maduros, con rizoides simples pero amplios,

esporangióforos erectos en algunos casos un poco encorvados, los rizoides
emergen un tramo más arriba de donde se juntan los rizoides, presentan
un
esporangióforo redondeado color negro con abundantes
esporangiosporas. Clasificada como Rhizopus oryzae.

3.2 Pruebas de patogenicidad y grado de severidad

Solo las especies identificadas como R. stolonifer resultaron ser agentes

causales de la enfermedad conocida como pudrición blanda, desarrollando
micelio a las 24 h. A las 48 h cubrieron el fruto y generaron exudados,
infectándolo y reblandeciéndolo, mientras que a las 72 h el fruto se
encontraba degradado y con indicios de fermentación, al abrir los frutos

6
 Tesis de

se encontraron completamente degradados por dentro. Las especies

6
 Tesis de

identificadas como R. oryzae y R. microsporus, solo generaron micelio sobre

el fruto sin generar la enfermedad ni degradar los frutos, sin embargo, la
generación de micelio afectó a la calidad visual de los mismos, por su
parte, los frutos control, no presentaron daños de pudrición (figura 3.2).

A B C

D E F

Figura 3.2. Frutos inoculados con diferentes aislados del género Rhizopus después de 72 h.
A) R. stolonifer aislado de hojas; B) R. oryzae aislado de suelo; C) R. stolonifer aislado de
fruto maduro con calidad de exportación; D) R. microsporus aislado de fruto verde; E) R.
oryzae aislado de fruto maduro; F) Fruto Control.

A las 24 h se observó que el aislado A de R. stolonifer mostró un

crecimiento micelial mayor a los demás aislados, mientras que el E y B (R.
oryzae) mostraron menor producción de micelio. En la segunda medición
hecha a las 48 h, el aislado C (R. stolonifer) alcanzó un rango de daño del
75%, siendo mayor que el ocasionado por el aislado A, ambos aislados
mostraron indicios de desarrollo de pudrición blanda, los otros tres
aislados presentaron micelio pobre y disperso sobre todo el fruto, aunque,
no generaron síntomas de enfermedad y los frutos permanecieron
turgentes. Al final del bioensayo, los

6
 Tesis de

aislados C y A de R. stolonifer causaron daños del 100% y el 90%

respectivamente mostrando micelio abundante y espeso, exudados con
olor fétido y fermentación. Los aislados B de R. oryzae y D de R.
microsporus, solo generaron micelio que cubrió hasta un 50% del fruto y el
espesor del micelio no fue muy consistente, en tanto que el aislado E de R.
oryzae solo cubrió un 45%, estos últimos tres aislados no generaron
enfermedad, solo afectaron la calidad del fruto, los frutos control no
desarrollaron micelio pero presentaron escasos exudados en comparación
a los aislados infectivos (figura 3.2). El daño ocasionado en cada una de
las etapas se midió según la escala de severidad, obteniéndose los
porcentajes de daño ocasionado, se graficó la tendencia de cada uno de
los aislados. Según la escala, a partir del 51% correspondiendo con la
descripción de los signos y síntomas, se consideró que solo dos de los
aislados desarrollaron la enfermedad, correspondiendo a los aislados A y
C. (figura 3.3).

120%

100% 100%
90%
stolonifer (A)
80%
oryzae (B)
stolonifer (C)
60% 51% 51% 51%
% de

50%50% microsporus (D)

oryzae (E)
40%
45%
Control
Pudrición
20%

0%

0%
24 h 48 h 72 h

Figura 3.3 Evolución cronológica del daño causado por los aislados del género Rhizopus en
fruto de zarzamora (n=15, p˂0.05).

6
 Tesis de

A las 72 h, se elaboró una descripción completa de los síntomas y signos

encontrados en los frutos inoculados, asignándoseles un grado de
infectividad (Tabla 3.2).

Tabla 3.2. Descripción de síntomas y signos mostrados por los frutos

sometidos a la inoculación por los aislados de Rhizopus, asignando un
grado de inefectividad.
Aislado Especie Infectividad* Descripción
Causal de podredumbre blanda, fruto cubierto en su
A Rhizopus totalidad con micelio característico, completamente
stolonifer +
degradado desintegrandose al tacto, líquidos drenados con
olor fétido, estructuras reproductivas bien formadas.
B Rhizopus No infectivo, micelio aereo característico cubriendo al
oryzae fruto afectando calidad visual, frutos íntegros
ligeramente
-
suaves al tacto, sin líquidos drenados, estructuras
reproductivas bien formadas.
C Rhizopus Causal de podredumbre blanda, fruto cubierto en
stolonifer
su totalidad con micelio característico,
completamente
degradado desintegrandose al tacto, indicio de
++ fermentación y producción de gases, líquidos drenados
D Rhizopus en
microsporus
abundancia con olor fuertemente fétido,
estructuras reproductivas bien formadas saliendo
E Rhizopus del envase.
oryzae No infectivo, micelio aereo característico cubriendo al
- fruto afectando calidad visual, frutos íntegros suaves
al tacto, sin líquidos drenados, estructuras
Control reproductivas
bien formadas.
No infectivo, micelio aereo escaso cubriendo al fruto
afectando calidad visual, frutos íntegros ligeramente
- suaves al tacto, sin líquidos drenados, estructuras
reproductivas en formación.
- Frutos íntegros, algunas drupelas
magulladas, ligeramente suaves, sabor
agradable.
*++ Muy infectivo, + Infectivo, - No infectivo.

3.3 Morfología de la infección de Rhizopus stolonifer en

fruto de zarzamora

3.3.1 Características de Fruto Maduro de Zarzamora

El fruto de zarzamora es una polidrupa formada por drupelas individuales
(figura 3.4A), por lo que al observar al microscopio estereoscópico, se
6
 Tesis de

reconocieron espacios entre las drupelas, los cuales no se encontraron

6
 Tesis de

sellados completamente (figura 3.4B). Se observó que dichos espacios

eran ocupados por pequeños carpelos que no fueron fecundados o bien,
no se desarrollaron correctamente, estando en contacto directo con el
centro de la fruta, el cual es suave y acuoso, estos espacios son propensos
a resguardar esporas y humedad (figura 3.4C). En cuanto a la zona de
abscisión, se observó delgada y con pequeñas vellosidades, propias del
fruto, las cuales son reminiscencias de estambres, que propician el
alojamiento de esporas (figura 3.4D). En un corte transversal se observó
el interior de una drupela, encontrando que la semilla conserva la
reminiscencia de lo que fuera un estilo, el cual atraviesa el interior de una
drupa individual saliendo al exterior, por lo que cada drupela presenta
hendiduras en el centro (figura 3.4E). Los frutos presentaron buen color,
sólido y oscuro, y textura firme antes de haber sido inoculados.

A B E

C D

Figura 3.4. Fruto de zarzamora con calidad de exportación visto al microscopio

estereoscópico (10X). A) Fruto completo; B) Espacio entre drupelas (flecha); C) Carpelos
no fecundados o atrofiados (flecha); D) Zona de abscisión (flecha); E) Reminiscencia de
estilo a través de una drupela (flecha).

6
 Tesis de

3.3.2 Germinación y formación de estructuras

La mayor parte de esporas germinadas se encontró en la zona de

abscisión y en los espacios entre las drupelas (figura 3.5 A y G). Las
esporas germinadas dieron paso a la conformación de micelio aéreo y de
los primeros cuerpos fructíferos que forman esporas capaces de seguir
colonizando el fruto (figura
3.5 B, C y E). Los rizoides no fueron visibles, sin embargo, se visualizaron
esporangióforos con pequeños esporangios en las puntas, los cuales se
encontraron en desarrollo, estos no contenían esporas, aunque en algunos
casos se tornaron oscuros (figura 3.5 F y H). En un corte transversal, el
interior del fruto se mostró ligeramente oscurecido, no se distinguió con
facilidad la integridad de las drupelas, además de ser acuoso (figura 3.5
D). En esta fase, no se desarrolló micelio abundante, sin embargo, las
enzimas pectinolíticas comenzaron a actuar, por lo que hubo exudado de
líquidos y algunas drupelas empezaron a perder turgencia y a cambiar de
color, no se percibieron olores fétidos.

3.1.1 Infección y dispersión

El micelio aéreo mostró un desarrollo considerable, cubriendo los frutos

de un 40 a un 75%, las drupelas aún fueron visibles a través de éste
(figura 3.6 A y B). Se observó el cambio de color en los esporangióforos de
blanco a café claro al estar maduros y con esporangios en las puntas en
color negro debido a las esporas maduras, los rizoides no fueron visibles
debido a que se encontraron debajo de la cutícula del fruto, mostrando su
amplitud como rugosidades en la misma (figura 3.6 C y D). Los
esporangios presentaron una consistencia polvosa, debido a la gran
cantidad de esporas maduras, las cuales comenzaron a diseminarse por la
superficie de todo el fruto (figura 3.6 E). Al examinar un corte transversal
se observó que el interior del fruto había perdido consistencia y tenía

6
 Tesis de

abundante liberación de líquidos, el micelio se

6
 Tesis de

encontró únicamente en la parte externa del fruto, sin embargo, la

infección fue notoria en el interior, en algunos frutos se observó
ahuecamiento del centro por la generación de gases (figura 3.6 F y G).
Por su parte el corte longitudinal mostró la maceración causada por el
hongo en el fruto, por lo que resultó difícil el reconocimiento de las
estructuras de las drupelas, el color del fruto fue más oscuro al igual que
en el corte longitudinal (figura 3.6 H). La zona de abscisión y los espacios
entre algunas drupelas mostró micelio en abundancia sin embargo no
mostraron estructuras reproductivas (figura
3.6 I).

A B H

C D

E F G

Figura 3.5. Infección por Rhizopus stolonifer a las 24 h (10X). A) Esporas en germinación
entre dos drupelas (flecha); B) Formación de micelio (flecha); C) Micelio entre drupelas
(flecha); D) Corte longitudinal en donde se muestra cambio de color en el fruto; E)
Formación
de estructuras reproductivas de forma ovalada (flechas); F) Estructuras reproductivas en
maduración (flecha); G) Zona de abscisión con micelio y estructuras reproductivas
6
 Tesis de

(flecha);
H) Estructuras reproductivas germinando en una drupela (flecha).

7
 Tesis de

A B C D

F G H I

Figura 3.6. Fruto infectado por R. stolonifer a las 48 h (10X). A) Esporangios maduros entre
dos drupelas (flecha); B) Micelio aéreo abundante cubriendo el fruto; C) Estructura
característica de R. stolonifer; D) Estructuras maduras con rizoides bajo la cutícula de la
drupela formando rugosidades (flecha); E) Esporangio diseminando esporangiosporas
(flecha); F) Micelio aéreo en la superficie del fruto (flecha), no se encontró micelio
dentro del fruto; G) Corte transversal con ahuecamiento en el centro debido a la posible
producción de gases (flecha); H) Corte longitudinal mostrando el cambio de coloración
en el centro del fruto (flecha); I) Zona de abscisión con carpelos atrofiados y micelio
vegetativo (flecha).

3.1.2 Lisis y desintegración del fruto

Los frutos se mostraron cubiertos por micelio abundante y espeso, en

algunos casos los exudados fueron moderados, mientras tanto en otros el
fruto perdió hasta el 50% del volumen inicial debido a la lisis generada
por las enzimas secretadas por el fitopatógeno. No fue posible ver los
frutos a simple vista debido a que se encontraron cubiertos por micelio al
100% o casi a la totalidad (figura 3.7 A). La mayor parte de los
esporangióforos y esporangios se encontraron maduros, estos últimos
diseminando esporas (figura 3.7 B). Los espacios entre drupelas y la zona

7
 Tesis de

de abscisión se

7
 Tesis de

encontraron llenos de micelio, mientras que en las partes exteriores se

observaron las estructuras reproductivas (figura 3.7 C). Los frutos
perdieron consistencia y al hacer cortes transversales, se observó que el
interior no contenía micelio, sin embargo, la maceración fue avanzada por
lo que los frutos se desintegraron fácilmente. No se reconocieron las
estructuras del centro y/o de las drupelas, el color fue uniforme y
presentaban un olor alcohólico y fétido. En los cortes longitudinales se
presentaron las mismas características, el fruto se encontró destruido por
completo debido a la digestión enzimática (figura 3.7 D y E). La
enfermedad conocida como podredumbre blanda, ocasionada por el
agente biológico Rhizopus stolonifer, fue completada en un ciclo de 72 h, en
las cuales se desarrollo, diseminó y maceró el fruto.

B C

D E

Figura 3.7. Infección por R. stolonifer a las 72 h (10X). A) Frutos degradados cubiertos con
micelio (flechas); B) Micelio con estructuras reproductivas maduras; C) Zona de
abscisión; D) Corte transversal de fruto con pudrición blanda (flecha); E) Corte
longitudinal de fruto con pudrición blanda.

7
 Tesis de

3.1.1 Descripción de estructuras características

encontradas durante la infección

Sobre todos los frutos se generó micelio aéreo característico, el cual fue
algodonoso, con los esporangios visualizándose como puntos negros a
simple vista, el espesor del micelio aumentó conforme avanzaron las
etapas de la infección, haciendo cada vez menos visible el fruto (figura 3.8
A). Los esporangióforos, casi en su totalidad fueron erectos, rectos, solo
en algunos casos presentaron leves curvaturas, a las 24 h presentaron
color blanco, tornándose a café conforme avanzó la infección (figura 3.8
B). En la punta de cada esporangióforo se encontró un esporangio, al
inicio de la infección estos esporangios fueron de forma ovalada y de color
claro, tornándose a color negro, de forma esférica y adquiriendo una
textura polvosa al madurar las esporas (figura 3.8 C). Las esporas fueron
visibles en el esporangio hasta las 48 h, en donde ya maduras, se
desprendieron del mismo colonizando otras drupelas, éstas se
visualizaron como un polvo fino de color negro (figura 3.8 D). Los rizoides
fueron difícilmente visibles, sin embargo, a las 48 h se mostraron
rugosidades debajo de la cutícula de los drupelas en donde incidía un
esporangióforo, algunos rizoides fueron observados fijos en la superficie
de papel absorbente en donde se colocaron los frutos, a las 72 h se
encontraron también en el micelio aéreo, en un corte transversal a las 48
h se visualizó un rizoide dentro de la pulpa en maceración de un drupela
(figura 3.8 E). A lo largo de la infección se observaron estructuras
completas en las cuales se hace la distinción fácilmente de que el aislado
utilizado para dicha experimentación (aislado C) pertenece a la especie
Rhizopus stolonifer, ya que mostraron esporangióforos erectos, rizoides
complejos con afinidad a fijarse al fruto, esporangios redondos, globosos y
esporas en color negro (figura 3.8 F).

7
 Tesis de

B
A

C D

E
F

Figura 3.8. Estructuras características encontradas en fruto de zarzamora al ser infectado

por R. stolonifer (10X). A) Micelio aéreo característico del hongo; B) Esporangióforos
erectos, algunos con ligeras curvaturas (flechas); C) Esporangios jóvenes, en maduración
y maduros
(flechas); D) Esporangiosporas (flecha); E) Rizoides complejos encontrados bajo la
cutícula del fruto, sobre el papel absorbente de la cámara húmeda, en el micelio aéreo y
dentro de una drupela (flechas); F) Estructura completa característica de Rhizopus
stolonifer, observando esporangióforos unidos directamente al rizoide complejo,
esporangios en las puntas de los esporangióforos y esporangiosporas cubriendo el

7
 Tesis de

esporangio.

7
 Tesis de

3.2 Identificación de agentes con poder antagónico

Se obtuvieron en total 113 aislados de microorganismos diferentes, de

hojas (maduras y brotes), frutos (verdes, rojos y maduros), raíces
(endofíticos) y de suelo (rizosféricos). Al confrontarse contra R. stolonifer,
se obtuvieron 19 aislados con poder antagónico marcado, de las cuales se
eligieron cuatro por mantener el antagonismo estable durante 5 días en
tres réplicas. Estos aislados presentaron morfología colonial similar
(figura 3.9) y fueron reconocidos como bacilos Gram positivos, se
obtuvieron tres aislados del género Bacillus y uno del género Leifsonia
(Tabla 3.3).

Tabla 3.3 Identificación de antagonistas por medio del kit BBL CRYSTAL™
para Gram positivas.
Identificación de Aislados Bacterianos
Sitio Prueba
M orfología Colonial Coloración Ryu Tincion Gram Catalasa BBL Crystal
Aislamiento (KOH)
Colonia mediana de forma
irregular, con superficie
Hojas umbilicada formando Blanco Bacilos Bacillus
(Maduras) rugosidades y una cremoso. + + pequeños. ++ licheniformis
protuberancia en el centro,
con bordes ondulados.
Colonia grande, de forma
Suelo irregular y superficie plana Blanco Bacilos Bacillus
Rizosferico presentando una pequeña + +++
cremoso. medianos. subtilis
protuberancia en el centro, +
con bordes ondulados.
Colonia pequeña de forma
irregular casi redondeada, de
Centro
amarillento,
Hojas superficie umbilicada formando con o, de bordes bordes blancos, opaca.
(Maduras) rugosidades en la mayor una lobulados.
parte de la colonia, protu
presentando bordes beran Blanco opaco.
espiculados. cia en
Hojas Colonia grande de forma el
(Brotes) irregular, de superficie plana centr

7
 Tesis de

Bacilos Leifsonia
+ + + aquatica
med
iano
s.

+++
B
a
+ + c
Ba il
cil l
os u
gr s
an s
de u
s. b
t
il
i
s

7
 Tesis de

A B

C D

Figura 3.9. Morfología de las colonias formadas por los agentes antagonistas en medio
PDA a las 72 h de crecimiento. A) Bacillus licheniformis aislado de hojas maduras, con
superficie umbilicada y bordes ondulados; B) Bacillus subtilis aislado de suelo rizosférico,
con
sufperficie plana y bordes ondulados; C) Leifsonia aquatica aislada de hojas maduras, de
superficie umbilicada y bordes espiculados; D) Bacillus subtilis aislado de brotes de hojas,
mostrando superficie plana y bordes lobulados.

3.3 Actividad antifúngica in vitro

En los bioensayos in vitro desarrollados sobre PDA (figuras 3.10 y 3.11),

Bacillus licheniformis y Bacillus subtilis de suelo fueron significativamente
mejores controladores para el aislado A, con un índice antifúngico de
41.42% y 40.04% de inhibición respectivamente, los dos aislados
mostraron estabilidad durante las 72 h del bioensayo (figura 3.10). En
tanto que para el aislado C, B. licheniformis, L. aquatica y B. subtilis de suelo,
presentaron un efecto controlador significativamente igual, pero mayor al
aislado restante,

7
 Tesis de

con un índice antifúngico de 42.78%, 41.87% y 41.46% respectivamente

(tabla 3.4).

Tabla 3.4. Efecto inhibitorio in vitro de los agentes antagónicos asociados al

cultivo de zarzamora versus los aislados de R. stolonifer nativos del
agroecosistema.

Indice Antifúngico %
Agente antagónico
R. stolonif er A R. stolonif er C
Bacillus licheniformis 41.42 B 42.78 B
Bacillus subtilis (S) 40.04 B 41.46 B
Leifsonia aquatica 36.64 C 41.87 B
Bacillus subtilis (H) 37.56 C 36.18 C
Control - 0.00 D 0.00 D
Control + 100 A 100 A
Las letras muestran las diferencias significativas con una p ˂ 0.05, según la
prueba de diferenciación de medias de Tukey, con una n=9 .

B C

Figura 3.10. Antagonismo de B. licheniformis y B. subtilis aislado de suelo versus el aislado A

de R. stolonifer, presentando un índice antifúngico de 41.42% y 40.04% respectivamente.
A) Control positivo aislado A; B) Control negativo B. licheniformis; C) Control negativo B.
subtilis aislado de suelo; D) Bioensayo de antagonismo B. licheniformis versus R. stolonifer A;
E) Bioensayo de antagonismo B. subtilis de suelo y R. stolonifer A.

8
 Tesis de

B C

Figura 3.11. Antagonismo de B. licheniformis y L. aquatica versus aislado C de R. stolonifer, con

inhibición de 42.78% y 41.87% respectivamente. A) Control positivo aislado C; B) Control
negativo B. licheniformis; C) Control negativo L. aquatica; D) Bioensayo de antagonismo B.
licheniformis versus R. stolonifer C; E) Bioensayo de antagonismo L. aquatica
y R. stolonifer C.

3.4 Producción de Sideróforos

De los aislados bacterianos, B. subtilis de suelo fue significativamente el

mejor productor de sideróforos, alcanzando un halo indicador de 21.6±1
mm en un periodo de 72 h, por su parte B. subtilis aislado de hojas (figura
3.12) y
B. licheniformis presentaron similitudes significativas con halos de 20.2±1
mm y 18.1±1 mm en el mismo periodo de tiempo. De los fitopatógenos
únicamente R. stolonifer C (figura 3.13) fue generador de sideróforos
presentando una media significativamente mayor a la de las bacterias
alcanzando un halo indicador de 37.0±1 mm (tabla 3.5).

8
 Tesis de

Tabla 3.5. Valoración de la producción de sideróforos en un rango de 72 h,

en medio Casaminoácido con CAS como solución indicadora (MCAS).

Microorganismo *Halo indicador mm

Bacillus licheniformis 18.1 B,C
Bacillus subtilis (S) 21.6 B
Leifsonia aquatica 17.8 C
Bacillus subtilis (H) 20.2 B,C
Rhizopus stolonif er A 0.0 D
Rhizopus stolonif er C 37.0 A
Control 0.0 D
Las letras muestran las diferencias significativas con
una p˂0.05 , según la prueba de diferenciación de
medias de Tukey, con una n=6. *Datos sujetos a un CV= ±1
mm

Figura 3.12 Producción de sideróforos por aislados bacterianas en MCAS. 1) B. subtilis

aislado de suelo (21.6±1 mm); 2) B. subtilis aislado de hojas (20.2±1 mm). En cada
imagen se muestra una caja control, tres réplicas y una muestra representativa del
bioensayo en
donde se puede apreciar el halo amarillo indicador de la producción de sideróforos
marcado con una flecha.

8
 Tesis de

Figura 3.13. Producción de sideróforos por R. stolonifer aislado C en MCAS como solución
indicadora. Se muestra una caja control, tres réplicas y una muestra representativa del
bioensayo en donde se puede apreciar el halo amarillo indicador de la producción de
sideróforos marcado con una flecha.

3.5 Actividad antifúngica en presencia de Hierro

Los resultados del bioensayo llevado a cabo sobre PDA adicionado con
FeCl3 (tabla 3.6) mostraron que L. aquatica presentó un control
significativamente mayor al confrontarse con R. stolonifer aislado A
ejerciendo un índice antifúngico de 48.64%, sin embargo fue
significativamente la menor productora de sideróforos con un halo
indicador de 17.8±1 mm, seguida por
B. licheniformis el cual efectuó un control de 46.11% en el medio
enriquecido siendo el segundo menor productor de sideróforos con un
halo indicador de 18.1±1 mm (figura 3.14). Por otra parte, para R.
stolonifer aislado C, B. licheniformis fue significativamente el mejor
controlador produciendo un antagonismo de 48.32%, seguido por L.
aquatica, la cual presentó un 47.03% de inhibición hacia dicho aislado del
fitopatógeno (figura 3.15).

8
 Tesis de

Tabla 3.6. Evaluación del antagonismo entre aislados bacterianos asociados

al cultivo de zarzamora versus los aislados de R. stolonifer nativos del
agroecosistema, en un medio enriquecido con FeCl3.

Indice Antifúngico %
Agente antagónico
R. stolonif er A R. stolonif er C
Bacillus licheniformis 46.11 C 48.32 B
Bacillus subtilis (S) 42.71 D 43.09 D
Leifsonia aquatica 48.64 B 47.03 C
Bacillus subtilis (H) 38.76 E 41.26 E
Control - 0.00 F 0.00 F
Control + 100 A 100 A
Las letras muestran las diferencias significativas con una p˂ 0.05, según
la prueba de diferenciación de medias de Tukey, con una n=9 .

A A G

Figura 3.14. Actividad antifúngica de L. aquatica y B. licheniformis hacia R. stolonifer aislado A,

en presencia de hierro, presentando un 48.64% y 46.11% de índicie antifúngico
respectivamente. A) Control positivo aislado A; B) Control negativo L. aquatica; C) Control
negativo B. Licheniformis; D) Control MCAS; E) Bioensayo de antagonismo entre R.
stolonifer
aislado A versus L. aquatica; F) Producción de sideróforos por L. aquatica; E) Bioensayo de
antagonismo entre R. stolonifer aislado A versus B. licheniformis; F) Producción de
sideróforos por B. licheniformis.

8
 Tesis de

A A G

Figura 3.15. Actividad antifúngica de B. licheniformis (derecha) y L. aquatica (izquierda) hacia

R. stolonifer aislado C, en presencia de hierro, con índices antifúngicos de 48.32% y
47.03% respectivamente. A) Control positivo aislado C; B) Control negativo B.
licheniformis;
C) Control negativo L. aquatica; D) Control MCAS; E) Bioensayo de antagonismo entre R.
stolonifer aislado C versus B. licheniformis; F) Producción de sideróforos por B. licheniformis;
E) Bioensayo de antagonismo entre R. stolonifer aislado C versus L. aquatica; F) Producción
de sideróforos por L. aquatica.

3.6 Antagonismo in situ y grado de severidad

En las confrontaciones antagónicas in situ, los aislados A y C de R. stolonifer

generaron daños con medias significativas de 4.25 y 4.90 grados de
severidad sobre los frutos tomados como control positivo, según la escala
de severidad descrita en la tabla 2.1, lo cual equivale para cada una a un
0% de inhibición. El control negativo, mantuvo los frutos en grado 1 ya
que no se generaron daños de ningún tipo, sin embargo, los frutos no
conservaron la turgencia original. Por su parte, los frutos tratados con
suspensión celular de
B. subtilis de suelo presentaron un índice de severidad con una media

8
 Tesis de

significativa de 2.30, inhibiendo al fitopatógeno en un 45.88%, los frutos

8
 Tesis de

mostraron una incidencia de la enfermedad de un 15%, observándose

frutos completamente sanos, sin desarrollar micelio y conservando la
turgencia original del fruto, por otra parte, los frutos tratados con
extracto libre de células de L. aquatica presentaron un índice de severidad
con una media significativa de 2.56 en donde solo el 25% de los frutos
desarrollaron enfermedad, evitando así un daño mayor causado por el
aislado A de R. stolonifer el cual se vio inhibido en un 39.76% (figura 3.16).
En cuanto al aislado C, se observó significativamente más inhibido por el
extracto libre de células de B. subtilis de suelo (47.76%), incidiendo en
enfermedad en un 22%, mostrando frutos sanos, turgentes y con un índice
de severidad significativo de 2.56, a su vez L. aquatica versus el aislado C,
mostró frutos con un índice de severidad de 2.85 y una inhibición de
41.84%, la enfermedad incidió en 32% en estos frutos (tabla 3.7). Algunos
de los frutos bajo los tratamientos reconocidos como significativamente
más eficaces desarrollaron indicios de la enfermedad, sin embargo, esta
no fue tan severa como en los controles, la mayoría de los frutos se vieron
afectados con micelio o con exudados aunque no se haya desarrollado la
enfermedad (figura 3.17). Se observó también en los bioensayo tanto con
aislado A como en el C de R. stolonifer, que en algunos frutos se produjo
micelio diferente al encontrado en los aislados in vitro o en las pruebas de
antagonismo, el cual presentó una estructura mayormente espesa al
micelio normal y con coloración amarilla, este fue aislado en PDA para
descartar la posibilidad de contaminación en los bioensayos. Este se
incubó durante 72 h a temperatura ambiente mostrando un crecimiento
normal correspondiente al del aislado inoculado previamente. En los
frutos tratados con B. subtilis se produjo un fruto por bioensayo con estas
características, mientras que los tratados con
L. aquatica produjeron dos frutos por bioensayos presentando este tipo de
micelio (figuras 3.16 y 3.17).

8
 Tesis de

Tabla 3.7. Evaluación del antagonismo entre los agentes antagónicos

asociados al cultivo de zarzamora vs. los aislados de R. stolonifer nativos
del agroecosistema, en fruto de zarzamora.
Aislados del Género Rhizopus
Agente
Trat. Indice de Severidad* a
% de Inhibición** a
% Incidencia de Enfermedad a
antagónico
A C ACAC 18.82 D25.51 E58.67 F,G73.67 F
B. licheniformis
3.45 D 3.65 E 20.00 D,C47.76 B32.67 C,D22.00 B
B. subtilis (S)
39.76 B41.84 B,C25.00 B,C32.00 B,C
Extrac

L. aquatica 3.40 D,C 2.56 B

libre

B. subtilis (H) 22.35 D,C29.59 D,E43.33 D,E60.00 D,E,F

2.56 B 2.85 B,C
to

B. licheniformis 28.24 C37.36 C,D65.00 G62.00 D,E,F

3.30 D,C 3.45 D,E
B. subtilis (S) 45.88 B30.61 D,E15.00 B45.00 C,D
3.05 C 3.05 C,D
L. aquatica 27.06 D,C33.67 C,D,E 45.00 D,E,F65.00 E,F
2.30 B 3.40 D,E
celular
Suspe
nci ón

B. subtilis (H) 22.35 D,C33.67 C,D,E 51.67 E,F,G48.67 C,D,E

3.10 D,C 3.25 C,D,E
Control - Control + 100.00 E100.00 F0.00 A0.00 A
3.30 D,C 3.25 C,D,E
0.00 A0.00 A100.00 H100.00 G
1.00 A 1.00 A
4.25 E 4.90 F

* Expresados en grados de severidad, se gún la escala presentada en la tabla 2.1. **Calculados en referencia a los grados de severidad expresados
en la tabla 2.1. Las letras muestran las diferencias significativas con una p˂0.05 , se gún la prueba de diferenciación de medias de Tuke y, con una
n=30 . a)
Las medias con mayor impacto significativo en el bioensayo fueron marcadas con la letra 'A', por lo que en orden alfabetico consecutivo el impacto
disminuye .

A B

C D

Figura 3.15. Bioensayos de antagonismo in situ hacia R. stolonifer aislado A. A) Control

negativo; B) Control positivo aislado A; C) Bioensayo antagónico con frutos tratados con
suspensión celular de B. subtilis aislado de suelo versus aislado A; D) Bioensayo con frutos
tratados con extracto libre de células de L. aquatica versus aislado A. Las flechas
muestran los frutos con producción de micelio diferente, las puntas de flecha muestran
frutos completamente sanos que conservaron turgencia original después de las 72 h del
bioensayo.

7
 Tesis de

A B

C D

Figura 3.16. Bioensayos de antagonismo in situ hacia R. stolonifer aislado C. A) Control

negativo; B) Control positivo aislado A; C) Bioensayo antagónico con frutos tratados con
extracto libre de células de B. subtilis aislado de suelo versus aislado C; D) Bioensayo con
frutos tratados con extracto libre de células de L. aquatica versus aislado C. Las
flechas muestran los frutos con producción de micelio diferente, las puntas de
flecha muestran frutos completamente sanos que conservaron turgencia original
después de las 72 h del bioensayo.

7
 Tesis de

Capítulo IV. Discusión y

Conclusiones
4.1 Discusión

La mayoría de los trabajos de control biológico en etapas postcosecha han

tomado como modelo experimental frutos de cutícula cerosa y gruesa, y
que cuentan con una anatomía natural que los hace compactos, tal es el
caso de los estudios realizados con mango (Manguifera indica), cítricos
como naranja (Citrus siensis) y mandarina (Citrus reticulata), jitomate
(Lycopersicon esculetum Mill.), papaya (Carica papaya L.) y durazno (Prunus
pérsica Batsch.), entre otros (Govender et al., 2005; Kefialew y Ayalew,
2008; Hernández-Lauzardo et al., 2009; Arrevola et al., 2010). Estos frutos
resultan de fácil manipulación debido a que su cutícula gruesa les
confiere cierto grado de protección hacia el medio exterior y turgencia al
tacto, permitiendo así, usar diferentes tipos de tratamientos como
aplicación de ceras con compuestos activos, inmersión en baños de agua
caliente o soluciones salinas (Obagwu y Korsten, 2003; Meng y Tiang,
2009). En el caso de la zarzamora, la aplicación de dichas estrategias
resulta de mayor complejidad ya que se trata de una polidrupa (Berg,
2008) cuya morfología hace que sea frágil y susceptible al daño (Chávez-
Franco et al., 2000; Strik et al., 2007). Debido a su anatomía natural, la
zarzamora tiende a tener espacios entre las drupelas que la conforman,
siendo propicios para almacenar humedad y esporas de microorganismos.
Lo anterior permite suponer que dichos espacios ofrecen un
microambiente óptimo para que Rhizopus stolonifer se desarrolle y sea
posible conseguir infecciones exitosas. Los autores anteriormente
mencionados como Govender et al. (2005), Kefialew y Ayalew (2008),
Hernández-Lauzardo et al. (2009) y Arrevola et al. (2010), reportan

7
 Tesis de

haber hecho incisiones en los frutos de entre 3 a 5 mm de profundidad y/o

longitud para generar infecciones exitosas en los bioensayos. Sin
embargo, en el bioensayo para determinar la patogenicidad de los
aislados del género Rhizopus, se corroboró que el fitopatógeno puede
colonizar e infectar los frutos exitosamente sin haber hecho heridas
previas, debiéndose posiblemente a la anatomía natural del fruto o bien a
que la maquinaria enzimática de éste resulte efectiva para degradar la
superficie de las drupelas, la cutícula de los espacios entre estas o de la
zona de abscisión.

En el presente trabajo se demuestra la efectividad de los aislados del

agroecosistema de la zarzamora como agentes antagonistas hacia R.
stolonifer, obteniendo datos similares a los de otros trabajos clásicos de
control biológico. En este sentido, Arrebola et al. (2010), reportaron la
eficiencia de aislados del género Bacillus para controlar a Penicillium
crustosum, con un 33% de inhibición in vitro del patógeno a las 72 h de
haber realizado el bioensayo. Cabe señalar que en este caso, el biocontrol
fue resultado de la liberación de hasta 21 compuestos volátiles diferentes
por parte de especies como Bacillus subtilis. Dicho porcentaje de inhibición
fue menor al presentado por las cepas de B. subtilis aisladas de suelo y
hojas en el presente trabajo, cuyos índices antifúngicos fueron de 41.46%
y 37.56% respectivamente, y un aislado de B. licheniformis con un índice
antifúngico de 41.78%. En contraste, Leelasuphakul et al. (2008),
reportaron porcentajes de inhibición del micelio de Penicillum digitatum que
fueron de 42% hasta 76% por producción de volátiles, y desde 84% hasta
99% al usar los extractos libres de células de B. subtilis después de 72 h de
incubación, esto de manera in vitro. Se propone que el uso de los extractos
permitió el control gracias a la producción de antibióticos. Cabe resaltar
que a diferencia de este último estudio, en este trabajo se usaron células
viables con madurez de 24 h para la confrontación in vitro, las cuales se
inocularon al mismo tiempo que el patógeno en la placa Petri con PDA, y

7
 Tesis de

no extractos de 72 h, los cuales tal

7
 Tesis de

vez pudieron favorecer la acumulación de metabolitos con potencial para

el control del crecimiento del patógeno.

Por otra parte, la incidencia de la enfermedad se vio reducida en los

bioensayos in vivo, obteniendo una reducción de 15% a 22% de incidencia
de la enfermedad en los frutos al usar un cultivo celular de B. subtilis de
suelo y el extracto crudo del mismo respectivamente. Diversos trabajos de
control biológico respaldan el hecho de que B. subtilis es un agente
antagónico asociado a las plantas, el cual ha podido ser aislado de raíces,
suelo, de forma endofítica, en tallos, hojas y superficies de los frutos. Se
ha reportado que dicha especie ha logrado reducir hasta un 25% de la
enfermedad producida por Penicillium crustosum en frutos de naranja al
usar los compuestos los volátiles producidos para modificar atmósferas en
empaques (Arrebola et al., 2010), también en cítricos como la mandarina,
se ha logrado reducir la incidencia de P. digitatum hasta 40% al aplicar
esporas de B. subtilis a los frutos y 25% al sumergirlos en extractos crudos
de la misma cepa, retrasando la enfermedad hasta los 7 y 9 días
respectivamente (Leelasuphakul et al., 2008).

Por su parte, en el bioensayo in situ, se observa que la aplicación de

extracto libre de células de B. licheniformis reduce hasta un 41% la
incidencia en la enfermedad. Al comparar estos resultados con los
obtenidos por Govender et al. (2005), quienes usaron B. licheniformis para
controlar infecciones por Coletotrichum gleosporoides y Botryospheria spp., y
muestran un control en la incidencia de dichas enfermedades de 40% y
30% respectivamente al aplicar el microorganismo con agua caliente, se
observa que los resultados obtenidos en el presente estudio son similares.
Sin embargo, los mismos autores encontraron una disminución mucho
mayor al aplicar el mismo microorganismo en conjunto con percholarz (N-
popil-N-[2-(2,4,6- triclorofenoxiacético) etil] imidazol-1-carboxamida) y
agua caliente (20% y 10% de incidencia respectivamente).

7
 Tesis de

No solo las especies del género Bacillus reportan actividad antagónica

hacia hongos fitopatógenos en los trabajos clásicos de control biológico
postcosecha, se han empleado también especies fúngicas de los géneros
Trichoderma y Trichosporon, bacterias promotoras de crecimiento vegetal
de los géneros Pseudomonas y Serratia, levaduras asociadas a las
superficies de hojas y frutos como los géneros Pichia y Candida, incluso se
han utilizado especies de géneros no asociados a los agroecosistemas
como Enterobacter cloacae usada para controlar infecciones por Rhizopus
stolonifer en duraznos (Wilson et al., 1987; Compant et al., 2005; Dorby et al.,
2009; Sharma et al., 2009; Babalola, 2010). En este sentido, cabe señalar
que en el presente trabajo se encontró entre los mejores antagonistas a
una bacteria no reportada como controlador biológico e identificada como
Leifsonia aquatica, la cual generó resultados comparables a los reportados
en los trabajos mencionados.

El control biológico postcosecha debe ser entendido como un proceso

(Dorby et al., 2009) en el cual se ven inmiscuidos diversos factores entre
los que figuran las condiciones del medio de almacenamiento como la
temperatura, humedad relativa, las condiciones de madurez e integridad
de los frutos, el tipo de empaque, sustancias usadas como ceras o gases
para modificar la atmósfera y los microorganismos presentes, estos
últimos pueden ser de diferente índole: 1) ya sean asociados, 2)
antagónicos agregados, 3) fitopatógenos u 4) otros infiltrados de alguna
manera al sistema. La sumatoria de dichos factores influenciará
directamente sobre el triángulo interactivo fruto-antagonista-patógeno el
cual llevará a cabo los procesos biológicos que favorecerán la
preservación o decaimiento de los frutos. De tal manera, dichos procesos
biológicos generan respuestas en cada uno de los vértices mencionados
en este triángulo interactivo, en donde la primicia del control biológico es
que la acción del antagonista en el fruto, aminore la acción deletérea del
fitopatógeno en el sistema. Algunos de los trabajos donde se ejemplifican

7
 Tesis de

algunos de los mecanismos usados por los microorganismos

7
 Tesis de

antagonistas se presentan a continuación: Zhang et al. (2010) reportaron

que el modo de acción de Aureobasidium pullulans contra Monillinia laxa,
Botrytis cinérea y Penicillium expansum en duraznos, manzanas (Malus x
domestica Borkh.) y ciruelas (Purunus domestica L.) se basa en el uso de
enzimas líticas como β1-3 glucanasas (GLC) y quitinasas (CHI), pero sin
fijación de las hifas de A. pullulans a las de ninguno de los fitopatógenos,
por lo que argumenta se trata de competencia directa por espacio y
nutrientes. Las enzimas GLC y CHI se encuentran estrechamente ligadas
en el proceso de microparasitismo llevado a cabo por varios hongos de
géneros como Trichoderma y Aspergillus (Quiroz-Sarmiento et al., 2008). De
igual manera, se ha reportado que algunas especies del género Bacillus
producen estas enzimas (Leelasphuakul et al., 2008). Por otra parte, se ha
comprobado que R. stolonifer es un patógeno exitoso que evita el
microparasitismo por parte de organismos conformados por células
individuales como las de las levaduras Pichia membranefaciens y hongos
como Cryptococcus albidus los cuales fueron efectivos controladores de los
patógenos como Monillinia frutícola y P. expansum respectivamente (Chan y
Tian, 2005).

El hecho de que R. stolonifer evita el microparasitismo descarta la

posibilidad de que el mecanismo de biocontrol usado por los aislados del
género Bacillus obtenidos en este trabajo hayan sido por esta vía, sin
embargo, es bien conocido que las especies del género Bacillus son
capaces de producir diferentes tipos de compuestos volátiles, entre los
cuales se incluyen cetonas, ácidos orgánicos, alcoholes, compuestos
nitrogenados, compuestos sulfurados, y ésteres (Arrebola et al., 2010),
como también lipopolipéptidos cíclicos anfifílicos (surfactantes) con
actividad antibiótica como la surfactina, iturina A y amicoumacina A
(Pinchuk et al., 2002; Govender et al., 2005; Leelasphakul et al., 2008). Por
lo anterior, es posible que el mecanismo de acción usado por estas cepas
pudiera ser la antibiosis, no obstante falta hacer bioensayos para

7
 Tesis de

verificarlo.

7
 Tesis de

Además de producir enzimas, surfactantes y antibióticos, los

microorganismos pueden inducir respuestas biológicas en los frutos,
reportando casos exitosos como el de Pseudomonas putida, en donde se
observó que el antagonista indujo resistencia en el fruto de papaya
inhibiendo la producción de etileno, por lo que retardó la maduración y
mantuvo la firmeza, incrementó la actividad de la fenilalanina amonio-
liasa (PAL) y polifenol oxidasa (PPO), siendo enzimas clave en la ruta de
los fenilpropanoides el cual da paso a la síntesis de fenoles, fitoalexinas y
ligninas asociados con la resistencia local, e incrementó la actividad de
enzimas detoxificadoras como súper oxido dismutasa (SOD), catalasa
(CAT) y peroxidasa (POD), las cuales actúan directamente sobre las
especies reactivas de oxigeno (ROS) evitando la oxidación del sistema (Shi
et al., 2011). La inducción de resistencia como mecanismo de acción ha
sido reportado como efectivo en el control de Rhizopus nigricans (sinónimo
de R. stolonifer (Shipper, 1984)) por medio del uso de antagonistas como
la levadura Pichia guilliermondii, la cual indujo resistencia en jitomate
cherry (Lycopersicos esculentum var. Cerasiforme) al incrementar la
actividad de enzimas como PPO, POD, CAT, SOD, PAL, CHI y GLC en el
fruto reduciendo significativamente la incidencia de la enfermedad hasta
24% (Zhao et al., 2008). La maquinaria enzimática reportada en dichos
trabajos es propia de los frutos, siendo activada por los microorganismos
antagonistas, estas enzimas intervienen directamente en la recuperación
de las heridas en los frutos, además de que algunas pueden lisar la pared
celular de patógenos fúngicos.

Por otra parte, se ha observado en éstos trabajos que los antagonistas

aplicados en heridas tienden a producir mayores cantidades de mucílago
extracelular alrededor de las paredes celulares, el cual contiene elicitores
químicos activos que sirven como cascadas de señalización teniendo como
respuesta la activación del mecanismo de defensa del fruto. Se ha
comprobado que otros elicitores pueden ser oligosacáridos que forman

8
 Tesis de

parte

8
 Tesis de

de la pared celular del antagonista, moléculas secretadas para la

captación de nutrientes como los sideróforos, o moléculas de otras índoles
como antibióticos, surfactantes, flagelina o bien, moléculas que
intervienen en el proceso conocido como quorum sensing, tales como las
acil-homserina- lactonas en gram negativas o pequeños oligopéptidos en
gram positivas (Lyon, 2007; Champigny and Cameron, 2009; Sharma et al.,
2009). De acuerdo a lo mencionado, se puede argumentar que las
bacterias usadas en el presente estudio fueron teñidas como Gram
positivas, por lo que utilizan oligopéptidos para llevar a cabo las
señalizaciones que les permiten iniciar procesos metabólicos secundarios
para la producción de sustancias antibióticas o quelantes para su
protección y nutrición, por lo que puede suponerse que estas tienen la
capacidad de inducir resistencia por medio de la señalización generada a
partir de que el fruto reconoce tales moléculas, sin embargo, falta hacer
uso de técnicas de proteómica y/o biología molecular para afirmarlo.

Varios autores mencionan que los sideróforos han sido responsables de

generar resistencia sistémica inducida en plantas (Hernández-Rodríguez
et al., 2006), argumentando que los antagonistas al liberar sideróforos
privan a las células de hierro, por lo que como respuesta se activa el ciclo
de la metionina, el cual da paso a la producción de este aminoácido que es
un productor de etileno y este a su vez se encuentra relacionado con la
inducción de resistencia (De Vleeschauwer y Höfte, 2009). Dicha hipótesis
no se encuentra bien corroborada, si bien, no se sabe si los sideróforos
son capaces de inducir resistencia en frutos, estos están relacionados con
la inefectividad de las cepas de patógenos fúngicos ya que son usados
para secuestrar el hierro al lisar las células. En el presente trabajo se
observó que el aislado de R. stolonifer C, el cual mostró mayor
patogenicidad de los 5 aislados obtenidos, fue el que produjo mayor
cantidad de sideróforos, incluso en comparación con los aislados
bacterianos. Tomando en cuenta lo antes mencionado, proponemos que

8
 Tesis de

aunque los aislados bacterianos con actividad

8
 Tesis de

antagónica usados en este trabajo no produjeron sideróforos en cantidad

suficiente para causar daño al fruto, estos pudieron ser reconocidos por el
mismo como moléculas señal que generaran una respuesta para la
inducción de resistencia.

Otra de las bacterias con efecto biocontrolador hacia Rhizopus stolonifer fue
perteneciente al género Leifsonia. Aunque esté género no ha sido muy
estudiado, se conoce que son bacterias que producen biopelículas para
adherirse a superficies, las cuales se argumenta, podrían ser usadas para
circular diferentes tipos de sustancias que ayudan a su supervivencia
cumpliendo fines de alimentación y protección, mientras que no se ha
investigado a cerca de su índole y sus propiedades (Rickard et al., 2003),
no obstante, se conoce que al asociarse a plantas, algunas especies son
capaces de producir fitohormonas y 1-aminociclopropano-1-carboxilato
(ACC) desaminasa (acdS), la cual es una enzima capaz de hidrolizar el
ACC, mismo que es un intermediario del etileno en las plantas, por lo que
disminuye sus efectos y promueve el crecimiento vegetal, de igual manera
se ha comprobado que son capaces de generar resistencia sistémica
inducida (ISR) (Mdhaiyan, et al., 2010; Gutiérrez-Galeano et al., 2010).

Recapitulando lo antes mencionado, en los bioensayos de antagonismo in

vitro sobre medio PDA, el control biológico por parte de los tres aislados
del género Bacillus pudiera deberse a la producción de sustancias con
actividad antibiótica, las cuales probablemente limitaron el crecimiento
del fitopatógeno. Otro de los posibles mecanismos de control exhibido por
las cepas antagonistas evaluadas en este trabajo pudiera ser la
producción de compuestos volátiles los cuales no permitieron generar
micelio aéreo sobre el espacio cercano a la bacteria. No puede asegurarse
que in vitro hayan intervenido las enzimas líticas (GLC y CHI) producidas
por las bacterias, ya que no hay contacto entre las células de las bacterias
y las hifas del hongo, aunado al hecho de que no se observó micelio

8
 Tesis de

degradado. En cuanto a la

8
 Tesis de

acción de los sideróforos, se puede argumentar que el medio PDA sobre el

cual se llevaron a cabo los bioensayos, es un medio que suministra una
fuente de carbono a los organismos pero pobre en minerales y otros
micronutrientes por lo que consideramos que los sideróforos formaron
parte de los mecanismos de acción en las confrontaciones hacia el aislado
de R. stolonifer A. No obstante se observó que el aislado C, fue buen
productor de sideróforos, lo cual supone que es una cepa con facilidad de
adaptarse a los medios restringidos en nutrimentos teniendo la capacidad
de obtenerlos y limitarlos para otros organismos, hecho que pudiera estar
relacionado con la patogenicidad del aislado y con el suceso de que B.
subtilis aislado de suelo muestre poca actividad antagónica in vitro, pero
que sea el mejor controlador in situ.

En cuanto a los bioensayos in vitro llevados a cabo sobre medio PDA

adicionado con FeCl3, se supuso que el efecto fue inhibir la producción de
sideróforos para observar el antagonismo sin la intervención de este
factor, lo que resultó en un incremento significativo en el antagonismo por
parte de de todos los aislados, observándose mayor aumento en los
aislados de B. licheniformis y L. aquatica. Autores como Sharma et al. (2009)
y Köhl et al. (2011), sustentan este comportamiento al comentar que
diversos antagonistas suelen presentar mayor capacidad antagónica al
encontrarse en presencia de minerales u otros nutrientes especiales, por
lo que debe evaluarse si es factible el uso de dichos organismos a nivel
comercial en una relación costo-beneficio. Al comparar los resultados de
los bioensayos en medio PDA y en PDA+FeCl3, podemos deducir que
posiblemente el antagonismo incremente debido a que al verse bloqueada
la ruta metabólica de producción de sideróforos, las bacterias hayan
canalizado dicha energía y precursores para la elaboración de otro tipo de
compuestos. Por otra parte, para el aislado de R. stolonifer C, se vio
bloqueada una de las estrategias por medio de las cuales restringía la
captación de nutrimentos por parte de las

8
 Tesis de

bacterias, por lo que se puede suponer que por esta razón se incrementó
el antagonismo en este medio para este aislado.

En los bioensayos in situ, se observó que B. subtilis aislado de suelo muestra

una mejor actividad que en los ensayos in vitro, lo anterior pudiera
explicarse como resultado de una mejor interacción de esta cepa con el
fruto, debido que según los reportes mencionados, ésta cuenta con
mayores mecanismos de acción al estar en contacto con el fruto, entre los
que figuran:
a) Surfactantes con actividad antibiótica para restringir la actividad
biológica del patógeno.
b) Enzimas líticas (GLC y CHI) que diseminadas en el fruto se ven en
contacto directo con el patógeno.
c) Compuestos volátiles que afectan al micelio aéreo (hasta 21 tipos
diferentes).
d) Inducción de resistencia por medio de oligopéptidos, surfactantes y
sideróforos en donde se incrementa la actividad de enzimas como
PAL, PPO, SOD, CAT, GLC y CHI.
e) Mayor producción de sideróforos en comparación a las otras
especies que limitan la disponibilidad de hierro e intervienen en la
inducción de resistencia.

En cuanto a Leifsonia aquatica, poco se sabe sobre la actividad metabólica

de dicho microorganismo, sin embargo, se ha demostrado en el presente
estudio su capacidad para ser un agente de control biológico. Por lo
anteriormente discutido sobre dicho agente, se puede deducir que in vitro,
la producción de sustancias implicadas en la formación de biopelículas
pueden estar relacionadas con su mecanismo de acción, podemos suponer
por una parte que está implicada la producción de compuestos volátiles ya
que no permite la formación de micelio aéreo sobre esta, así como
también la producción de compuestos con actividad antibiótica, en donde

8
 Tesis de

los segundos pueden ser difundidos en el medio al generar un margen

después del cual no se observó

8
 Tesis de

crecimiento de micelio del patógeno. En cuanto a los bioensayos in situ, se

descarta la competencia por espacio ya que los mejores resultados fueron
vistos en el ensayo con extractos de este aislado, por lo que es posible que
el control sea dado por metabolitos liberados tales como antibióticos o
algún otro vinculado con la inducción de resistencia en el fruto. De igual
manera no se descarta la participación de fitohormonas y la enzima acdS
que produce.

4.2 Conclusiones

El análisis de los datos obtenidos en el presente estudio y la discusión de

los mismos hace posible concluir lo siguiente:

1) Fue posible el aislamiento de diversas especies nativas del género

Rhizopus las cuales se encontraron asociadas a suelo, hojas y frutos
de la planta de zarzamora.

2) Solo los aislados identificados como pertenecientes a la especie

Rhizopus stolonifer fueron capaces de generar infecciones y provocar
podredumbre blanda en los frutos con o sin haberse herido
previamente.

3) Los aislados identificados como pertenecientes a las especies R.

oryzae y R. microsporus, no fueron capaces de provocar podredumbre
blanda, sin embargo, desarrollaron micelio sobre la superficie
dañando la calidad visual del fruto.

4) Fue posible el aislamiento de los agentes biológicos con actividad

antagónica asociados a las plantas del agroecosistema del cultivo
comercial de zarzamora en Atapan Michoacán, los cuales fueron
capaces de reducir el crecimiento del hongo in vitro y reducir la
incidencia de la enfermedad en fruto.

8
 Tesis de

5) El tratamiento con suspensión celular de B. subtilis fue mayormente

efectivo hacia el aislado de R. stolonifer A, en tanto que para el
aislado de R. stolonifer C, el tratamiento con extracto crudo fue el
más efectivo.

6) Leifsonia aquatica presenta potencial para ser usada como agente de

control biológico, sin embargo, se desconoce sobre su relación con
los agroecosistemas, su inocuidad hacia el ser humano y sus
mecanismos de acción.

7) Los frutos tratados con exudados de Leifsonia aquatica presentaron

una mayor reducción en la incidencia de enfermedad en los
bioensayos in situ en comparación con los tratados con suspensión
celular del mismo.

9
 Tesis de

Capítulo V. Perspectivas
Resulta de gran importancia continuar con la búsqueda de agentes
microbianos con potencial antagónico propios de los agroecosistemas, los
cuales puedan brindar la posibilidad de controlar efectivamente las
enfermedades de los cultivos tanto en etapas anteriores como en
postcosecha.
De igual manera, es necesario el estudio profundo de los mecanismos de
acción de dichos agentes antagónicos con la finalidad de identificar
metabolitos secundarios de interés que podrían ser utilizados como
fungicidas biodegradables naturales, así como la inocuidad de estos con
relación a la salud humana.
Es conveniente la utilización de técnicas de proteómica y biología
molecular para conocer las interacciones a nivel molecular entre fruto-
patógeno, fruto- antagonista y antagonista-patógeno, las cuales permitan
comprender mejor los procesos biológicos que surgen del sistema para así
detallar los puntos clave por medio de los cuales se ejerce el control
biológico hacia un patógeno o patógenos determinados, y poder
desarrollar tecnologías que aplicadas a nivel comercial permitan un mayor
acercamiento a la producción sustentable de productos hortofrutícolas al
reemplazar poco a poco los fungicidas sintéticos que son usados hoy en
día, reduciendo así los riesgos a la salud humana, al medio ambiente y
posiblemente a un menor costo.

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