Bioquímica

Docente: Divanery Rodríguez Gómez.

Reporte de laboratorio
Medición de proteína por
Bradford
Integrantes:
Cortes Anguiano Diego Alberto
Díaz López Arely Alejandra
@PSICOPUNTES Vázquez Laguna Ana Daniela
Zavala García Natalia Ivonne

1
 Marco Teórico

Las proteínas son moléculas formadas por aminoácidos que están unidos por un tipo de enlaces
conocidos como enlaces peptídicos. Todas las proteínas están compuestas por:
o Carbono
o Hidrógeno
o Oxígeno
o Nitrógeno

Y la mayoría contiene además azufre y fósforo.

El ADN contiene toda la información necesaria para que una proteína pueda ser sintetizada, ya
que, mediante mecanismos de transcripción y traducción, un triplete de nucleótidos de ADN se
convierte en un aminoácido concreto. Los ribosomas son los orgánulos encargados de
ensamblar estos aminoácidos, dando lugar a cadenas con órdenes y longitud variable, o lo que
es lo mismo, lo que nosotros conocemos como proteínas. Estas biomoléculas son esenciales
para concebir la vida, pues suponen aproximadamente el 80% del protoplasma en seco en toda
célula y representan el 50% del peso en todos los tejidos vivos.
Las dos propiedades principales de las proteínas, que permiten su existencia y el correcto
desempeño de sus funciones son la estabilidad y la solubilidad.
o La primera hace referencia a que las proteínas deben ser estables en el medio en el que estén
almacenadas o en el que desarrollan su función, de manera que su vida media sea lo más
larga posible y no genere contratiempos en el organismo.
o En cuanto a la solubilidad, se refiere a que cada proteína tiene una temperatura y un pH que
se deben mantener para que los enlaces sean estables.
Clasificación de las proteínas según la función de su forma y solubilidad

 Proteínas fibrosas: las proteínas fibrosas tienen una estructura alargada, formada por
largos filamentos de proteínas, de forma cilíndrica. No son solubles en agua. Un ejemplo de
proteína fibrosa es el colágeno.
 Proteínas globulares: estas proteínas tienen una naturaleza más o menos esférica. Debido a
su distribución de aminoácidos (hidrófobo en su interior e hidrófilo en su exterior) que son
muy solubles en las soluciones acuosas. La mioglobina es un claro ejemplo de las proteínas
globulares.
 Proteínas de membrana: son proteínas que se encuentran en asociación con las
membranas lipídicas. Esas proteínas de membrana que están embebidas en la bicapa
lipídica, poseen grandes aminoácidos hidrófobos que interactúan con el entorno no polar de
la bicapa interior. Las proteínas de membrana no son solubles en soluciones acuosas. Un
ejemplo de proteína de membrana es la rodopsina.

Clasificación de las proteínas según su estructura secundaria

2
 Hélice alfa: Esta estructura se desarrolla en forma de espiral sobre sí misma debido a los
giros producidos alrededor del carbono beta de cada aminoácido. La mioglobina es un claro
ejemplo de proteína de hélice alfa.

 Hoja plegada beta: Cuando la cadena principal se estira al máximo, se adopta una
configuración conocida como cadena beta. La tenascina es un ejemplo de las proteínas hoja
plegada beta.

 Alfa/beta: Las proteínas que contienen una estructura secundaria que alterna la hélice alfa y
la hoja plegada beta. Un ejemplo de proteína alfa/beta es la triosa fosfato isomerasa. Esta
estructura es conocida como un barril TIM. La helicoidal alterna y los segmentos de hoja
plegada beta forman una estructura de barril cerrado.

 Alfa + Beta: En estas proteínas, la hélice alfa y la hoja plegada beta se producen en
regiones independientes de la molécula. La ribonucleasa A es un ejemplo de proteína alfa +
beta.

Método de Bradford

Los métodos para la cuantificación de proteínas se basan en:

 Propiedad intrínseca de las proteínas para absorber luz en el UV

 Para la formación de derivados químicos
 Capacidad de proteínas de unir ciertos colorantes
El método de Bradford se trata de un método espectrométrico, término que engloba a un
conjunto de procedimientos laboratoriales basados en la interacción de la radiación
electromagnética con un analito (el componente de interés que se quiere separar de la matriz).

La clave de este conglomerado terminológico se encuentra en el colorante “azul de Coomassie”,

ya que en el método de Bradford se cuantifican los cambios en su absorbancia según ciertos
parámetros. Este colorante se muestra azul en su forma aniónica, verde en la neutral y rojo en la

3
catiónica. En condiciones ácidas en la solución, el azul de Coomassie se torna de rojo a azul y,
en el proceso, se une a las proteínas que se quieren cuantificar. Si no hay proteínas en el medio
acuoso, la mezcla permanece de un color marrón, así que es muy fácil detectar la presencia de
estas macromoléculas en primera instancia con esta metodología.
Al unirse con la proteína, el azul de Coomassie en su forma catiónica y doble protonada (roja)
forma una unión no covalente muy fuerte con dicha macromolécula, mediante fuerzas de Van
Der Waals e interacciones electrostáticas. Durante la formación de este complejo químico, el
colorante le dona a las porciones ionizables de la proteína su electrón libre, lo que causa la
disrupción del estado proteico normal.

Objetivos

4
OBJETIVO GENERAL
Conocer los fundamentos, teoría, ventajas y desventajas del método de Lowry,
Bradford y la técnica de Biuret para la determinación del contenido de proteínas.
OBJETIVOS ESPECÍFICOS

 Conocer la metodología de cada uno de los métodos de determinación de proteínas.

 Identificar las ventajas, desventajas y usos de las técnicas.
 Conocer la importancia de la determinación proteínas y los distintos modos de
obtención.

Hipótesis
El método, descrito por primera vez por el Dr. Marion Bradford en 1976, se basa en una
reacción colorimétrica de proteínas con un tinte, Coomassie Azul Brillante G-250. Las proteínas
se unen al tinte en un ambiente ácido., induciendo un cambio espectral del color marrón
(absorbancia máxima a 465 Nuevo Méjico) al azul (absorbancia máxima a 610 Nuevo Méjico).
Las interacciones hidrófobas e iónicas con las proteínas de la muestra estabilizan la forma
aniónica del tinte., provocando un cambio de color visible.
El color azul que se desarrolla es, por tanto, proporcional al contenido de proteínas y se puede
medir espectrofotométricamente en 595 Nuevo México, una longitud de onda donde la
diferencia de absorbancia entre las dos formas coloreadas del tinte es mayor.
Construyendo una curva de calibración utilizando concentraciones conocidas de proteínas
utilizadas como estándar (vea abajo), Entonces es posible descubrir la concentración de proteína
desconocida de una solución., basado en la absorbancia de la solución después de agregar el
tinte.

Metodología
Materiales y Reactivos

5
  Material
o 45 tubos de ensaye con tapón de rosca
o 2 matraces aforados de 100 mL
o 5 matraces aforados de 250 mL
o 2 vasos de precipitados de 500 mL
o 5 vasos de precipitados de 100 mL
o 1 matraz aforado de 1000 mL
o 1 probeta de 50 mL
o 4 pipetas de 1 mL
o 2 pipetas de 5 mL
o 2 pipetas de 10 mL
o 1 frasco ámbar de 1 L2 gradillas
o 1 micropipeta de 10-20 μL
o 1 micropipeta de 100-200 μL
o 1 micropipeta de 1000 μL
o 2 microceldas para espectrofotómetro (1.5 mL)
o 2 celdas de vidrio para espectrofotómetro
o Papel seda
o Piseta con agua destilada
o Puntas azules y amarillas para micropipetas

 Reactivos
o Ácido 3,5-dinitrosalicílico (DNS)
o Hidróxido de sodio
o Sulfito de sodio anhidro
o Fenol
o Sulfato de cobre
o Tartrato doble de sodio y potasio
o Carbonato de sodio
o Reactivo Folin-Ciocalteu
o Glucosa o dextrosa
o Reactivo de Bradford
o Albúmina de huevo o invertasa
o Agua destilada

 Equipo
o Parrilla de calentamiento
o Baño María
o Agitador magnético
o Vórtex
o Espectrofotómetro

Diagrama de flujo

6
1. Preparar 100 mL de una
I.Azucares solución patrón de glucosa con
una concentración de 1.0 g/L.
 3. Agregar 1 mL del
reactivo DNS (ver Anexo I)
a cada tubo y agitar.
2. Con la solución anterior,
preparar por duplicado la
curva patrón.

4. Calentar en un baño de
agua en ebullición durante
5 minutos. 5. Enfriar en agua corriente
o en un baño de hielo.

7. Leer la densidad óptica (DO) en

cada tubo a 575 nm, con el 6. Agregar 8 mL de agua
espectrofotómetro previamente destilada a cada tubo y agitar.
calibrado con el blanco (tubo 1).

III. Proteína soluble: 1. Preparar 100 mL de solución

patrón de albúmina de huevo
método de Bradford
7 (100 mg/L).
 3. Adicionar a cada uno de
los tubos 0.2 mL del reactivo de
Bradford (Bio-Rad Protein
Assay Dye Reagent
Concentrate, 500-0006). 2. Preparar por triplicado la
curva patrón.

4. Homogenizar la mezcla
con ayuda de un vórtex. 5. Dejar reposar los tubos a
temperatura ambiente
durante 5 min.

7. La muestra problema a analizar

(0.8 mL), se somete al mismo
tratamiento que la curva patrón. Si 6. Leer la DO a 595 nm, con el
el valor de la DO supera el valor espectrofotómetro previamente
más alto de la curva patrón, debe calibrado con el blanco (tubo1).
repetirse la
determinación.haciendo una

8
Tabla 1. Elaboración de la curva patrón de azúcares reductores.

Tabla 3. Elaboración de la curva patrón de proteína soluble

9
 Resultados y discusión.
En la primera parte “Azucares reductores” se realizaron cálculos para la preparación de las
disoluciones, partiendo de la fórmula:

Este método para cuantificación de azucares reductores determina los grupos carbonilos (C=O)
de los azucares reductores en base a una reacción redox, el reactivo DNS provoca una oxidación
en los azucares y a su vez, una reducción endotérmica: Si un mol de reactivo DNS reacciona
con un mol de azúcar, la reacción permite conocer la cantidad de azucares reductores presentes
en la muestra.
El procedimiento se llevó a cabo sin embargo las muestras no cambiaron de color al colocarse
en baño María. El equipo discutió las razones por la cuales no reaccionó: Incorrecto manejo de
las muestras y material de laboratorio o cálculos erróneos.
Prueba de Brandford.

Muestra. Datos.
2 0.208
4 0.345
6 0.375
8 0.463
10 0.666
Muestra desconocida. 0.517

En la segunda parte “Prueba de Bradford” se realizaron cálculos para la preparación de las

disoluciones, partiendo de la fórmula:

10
Se presentaron inconveniente durante la manipulación y rotulación de las muestras, los datos
arrojados por el espectrofotómetro se presentaron en desorden en el cual la curva no tenía
validación. Al asignar un dato a la concentración dada, la curva se presentó en mejor estado.
Se realizó también la graficación de los datos con la muestra de concentración desconocida
proporcionada por el docente.

La muestra de concentración desconocida muestra un declive en comparación a la sexta

muestra, al colocarse en contraste a la curva, se puede deducir que la concentración se encuentra
entre los 4.5 g/L.
Los percances presentados durante la primera parte fueron discutidos por el equipo para el
progreso en futuras prácticas: Marcar los tubos correctamente y con el material adecuado,
practicar la preparación y teoría sobre las diluciones fueron las más sobresalientes.
Para finalizar la discusión sobre la práctica “Prueba de Bradford” Se presenta la gráfica con los
datos correspondientes, el coeficiente de correlación no alcanza a 1 pero no se aleja mucho por
lo que la curva se acerca a buenos resultados.

11
 Conclusión

En conclusión, la elaboración de la practica en general nos ha dejado la experiencia de

sobrellevar y asumir los errores de la elaboración de la misma, en nuestro caso tuvimos algunos
errores sin embargo tratamos de solucionarlos como equipo, el conocimiento obtenido fue muy
grato ya que gracias a la elaboración de la practica pudimos entender y ver físicamente la teoría
vista en clase de una mejor manera., Fuimos capaces de interpretar nuestros resultados arrojados
por el espectrofotómetro y discutimos los errores sucedidos en nuestras diluciones, así como
también de darle una buena interpretación a nuestra curva de calibración de ambos casos, con el
reactivo de Bradford, también comprobamos las propiedades principales de las proteínas, en
este caso la albumina, en general hicimos un buen uso de los materiales y reactivos.

12
 Referencias bibliográficas
Carrillo U. (2016). “Realización de curvas de calibración para proteínas y azucares”. PDF.
Recuperado de: https://sites.google.com/site/enzineticupiig/bradford-y-dns

Burgos J. (2018). “Cuantificación de azúcares reductores del sustrato en residuos de piña con el
método de ácido 3,5-Dinitrosalicílico”. Recuperado de: file:///C:/Users/hp/Downloads/326-
Texto%20del%20art%C3%ADculo-791-1-10-20210603.pdf

Díaz M. (2006). “Determinación de azúcares reductores totales en jugos mezclados de caña de

azúcar utilizando el método de ácido 3,5-Dinitrosalicílico”. PDF. Recuperado de:
https://www.redalyc.org/pdf/2231/223120664006.pdf

(2021, Febrero 16). Obtenido de Proteínas:

https://cuidateplus.marca.com/alimentacion/diccionario/proteinas.html

13
Samuel Antonio Sánchez Amador. (s.f.). Psicologia y mente . Obtenido de Método de Bradford:
qué es y cómo funciona: https://psicologiaymente.com/cultura/metodo-bradford?
msclkid=4f69f26db87111ecb06834c1b701d5bb

14