TESIS DOCTORAL

Papel de las proteínas de choque térmico

(Heat Shock Proteins, HSP) en la apoptosis

Ana María Marchena López

PROGRAMA DE DOCTORADO EN BIOLOGÍA MOLECULAR Y

CELULAR, BIOMEDICINA Y BIOTECNOLOGÍA

2019
 TESIS DOCTORAL

Papel de las proteínas de choque térmico

(Heat Shock Proteins, HSP) en la apoptosis

Ana María Marchena López

PROGRAMA DE DOCTORADO EN BIOLOGÍA MOLECULAR Y CELULAR,

BIOMEDICINA Y BIOTECNOLOGÍA

2019

Conformidad de los directores:

Fdo.: Dr. D. José Antonio Pariente Llanos Fdo.: Dr. D. Ignacio Bejarano Hernando.
 FACULTAD DE CIENCIAS
DEPARTAMENTO DE FISIOLOGÍA

Avda. de Elvas s/n

06006 Badajoz (SPAIN)

D. José Antonio Pariente Llanos, Catedrático del Departamento de Fisiología de

la Universidad de Extremadura y D. Ignacio Bejarano Hernando, Profesor Ayudante a
Doctor de la Universidad de Cantabria,

CERTIFICAN

Que la Tesis Doctoral presentada por Dña. Ana María Marchena López, con el
título: “Papel de las proteínas de choque térmico (Heat Shock Proteins, HSP) en la
apoptosis”, ha sido realizada bajo nuestra dirección, en el Departamento de Fisiología
de la Facultad de Ciencias de la Universidad de Extremadura, y entendiendo reúne todos
los requisitos establecidos, autorizan su presentación para que pueda ser juzgada por el
tribunal correspondiente.

Y para que así conste a efectos oportunos, firman el presente documento en

Badajoz, a ___ de ________ de 2019.

Fdo. José Antonio Pariente Llanos Fdo. Ignacio Bejarano Hernando

 La realización de la presente Tesis Doctoral se ha llevado a cabo gracias al
apoyo económico de la Junta de Extremadura – Fondo Social Europeo de Desarrollo
Regional (Fondos FEDER, GR18040) y “Asociación Oncológica Esperanza de Vida”.
Dª Ana M. Marchena López ha disfrutado de un contrato perteneciente al Programa de
Ayudas de Investigación para Jóvenes Investigadores en Cáceres de la Fundación
Tatiana Pérez de Guzmán el Bueno (REF: PRE/FT2014-05).

D. Ignacio Bejarano ha disfrutado de una de las Becas de Movilidad al Personal

Docente e Investigador de la Universidad de Extremadura y de los Centros
Tecnológicos de la Comunidad Autónoma de Extremadura en centros extranjeros de
Enseñanza Superior y/o Investigación para el cuso 2016/2017 (DOE nº 14 de 20 de
enero de 2017). Con esta financiación, se pudieron llevar a cabo parte de los
experimentos de esta Tesis Doctoral en el Laboratorio de Biología Aplicada dirigido por
la Profesora Lina Ghibelli en la Universidad de Roma 2 “Tor Vergata” (Italia), que
cuenta con una amplia y reconocida experiencia en el campo de la apoptosis.
ABREVIATURAS

.
NO: óxido nítrico
·
OH: radical hidroxilo
ABD: dominio de union a ATP
ADN: ácido desoxirribonucleico
ADNmt: ADN mitocondrial
AIF: factor inductor de la apoptosis
Akt/PKB: proteína kinasa B
AMPc: adenosín monofosfato cíclico
Apaf-1: factor activador de proteasas apoptóticas 1
APO1: antígeno de apoptosis 1
ARNm: ácido ribonucleico
ATP: adenosín trifosfato
Bad: promotor de muerte asociado a Bcl-2
Bax: proteína x asociada a Bcl-2
Bcl-2: linfoma de células B 2
Bcl-xL: Bcl extra-large
BH: dominio dehomología con Bcl-2
Bid: dominio de interacción con Bcl-2
BiP: proteína de unión a inmunoglobulinas
CARD: dominio de reclutamiento de caspasa
Caspasa: cisteinil-aspartato proteasa
CDC37: proteína de control de la división del ciclo celular
dATP: 2'-deoxiadenosina trifosfato
DD: dominio de muerte
DED: dominio efector de muerte
DISC: complejo de señalización de inducción de muerte
EGFR: receptor del factor de crecimiento epidérmico
ER: retículo endoplásmico
ERK1: kinasa regulada por señal extracelular
ERN: especies reactivas de nitrógeno
ERO: especies reactivas de oxígeno
FADD: dominios de muerte asociados a Fas
FADH2: hidroquinona de flavín adenina dinucleótido (FAD)
Fas: receptor de muerte
FLICE: caspasa-8
FLIP: proteína inhibitoria de FLICE
GMPc: guanosín de monofosfato cíclico
GRP78: proteína regulada por glucosa de 78kDa
GSH: glutation reducido
H2O2: peróxido de hidrógeno
Her2/ERB2:
HSC70: Heat Shock Cognate 70
HSE: elemento promotor de choque térmico
HSP: proteína/s de choque térmico
IAP: proteína inhibidora de apoptosis
ICAD: inhibidor de desoxirribonucleasa activada por caspasa
IkB: inhibidor NF-κB
IRE1: kinasa 1 dependiente de inositol
JNK: kinasa de c-Jun N-terminal
LOX: lipoxigenasa
MAC: canal mitocondrial inducido por apoptosis
MAPK: proteína kinasa dependiente de mitógenos
MAPKAPK: proteína quinasa activada por MAP quinasas
NAD(P)H: dinucleótido nicotinamida y adenina fosfato
NAD: dinucleótido nicotinamida y adenina
NF-κB: factor nuclear potenciador de las cadenas kappa de células B
O2. ⎯: radical superóxido
Omi/htrA2: serina proteasa mitocondrial
ONOO-: peroxinitrito
p53: proteína supresora de tumores
PBD: dominio de unión a péptido
PERK: kinasa relacionada con las proteínas kinasa del retículo endoplásmico
PI3K: fosfoinositol kinasa 3
PKA: proteína kinasa A
PKC: proteína kinasa C
PPTm: poro de permeabilidad transitoria mitocondrial
RAF/Raf-1/cRaf: serina/treonina proteína kinasa
Smac/DIABLO: segundo activador mitocondrial de caspasas/ proteína de unión directa a IAP
SOD: superóxido dismutasa
TNF: factor de necrosis tumoral
TNFR1: receptor 1 de TNF
TRAP1: proteína 1 asociada al receptor de TNF
VEGF: factor de crecimiento endotelial vascular
v-Src: gen que codifica para una oncoproteína tirosina kinasa
ÍNDICE

I. INTRODUCCIÓN 1
I. 1 LEUCEMIA MIELOIDE AGUDA 3

I. 2 PROTEÍNAS DE CHOQUE TÉRMICO 4

I. 2.1 FAMILIAS DE PROTEÍNAS DE CHOQUE TÉRMICO
I. 2.2 FACTORES DE TRANSCRIPCIÓN DE CHOQUE TÉRMICO

I. 3 APOPTOSIS 22
I. 3.1 CAMBIOS MORFOLÓGICOS Y BIOQUÍMICOS
I. 3.2 CASPASAS
I. 3.3 VÍAS DE ACTIVACIÓN DE LA APOPTOSIS
I. 3.4 APOPTOSIS Y ESPECIES REACTIVAS DE OXÍGENO
I. 3.5 EVASIÓN DE LA APOPTOSIS POR CÉLULAS TUMORALES
I. 3.6 AGENTES QUIMIOTERAPEÚTICOS

I. 4 MELATONINA 51
I. 4.1 MECANISMOS DE ACCIÓN DE LA MELATONINA
I. 4.2 MELATONINA Y HSP
I. 4.3 MELATONINA Y APOPTOSIS
I. 4.4 MELATONINA Y AGENTES QUIMIOTERAPEÚTICOS
II. OBJETIVOS 63
III. MATERIALES Y MÉTODOS 67
IV. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 83
V. DISCUSIÓN GENERAL 119
VI. CONCLUSIONES 125
VII. BIBLIOGRAFÍA 129
I. INTRODUCCIÓN
 Introducción

I. 1. LEUCEMIA MIELOIDE AGUDA

Leucemia, del griego λευκός (leukós, “blanco”) y αἷμα (haĩma, "sangre"), hace
referencia a un cáncer de la sangre donde hay exceso de leucocitos. La leucemia
mieloide aguda (LMA) es un tipo de leucemia que consiste en la proliferación
incontrolada y excesiva de glóbulos blancos anómalos en la medula ósea, impidiendo la
producción de otros tipos celulares como plaquetas y glóbulos rojos. La LMA puede ser
secundaria a otra neoplasia, como consecuencia de haber recibido quimioterapia y/o
radioterapia. La LMA representa el 40% de todos los tipos leucemias en el mundo
occidental y su incidencia en España se estima en 15 nuevos casos por millón de
habitantes y año.

En la LMA se da una proliferación anormal y diferenciación de un clon de

células madre mieloides. Alteraciones en el material genético, como mutaciones,
translocaciones y reordenamientos cromosómicos, dan como resultado la formación de
proteínas quiméricas que alteran el proceso de maduración normal de las células
precursoras mieloides [1].

En 2001, la Organización Mundial de la Salud (OMS) introdujo un sistema de

clasificación, seguido de una versión revisada en 2008 [2]. En 2016 salió una nueva
clasificación [3], que se distingue de su predecesora al incorporar información genética
y morfológica, definiendo así seis subtipos de la enfermedad: LMA con anomalías
genéticas recurrentes; LMA con características relacionadas con la mielodisplasia;
LMA relacionada con terapia; AML no específica; Sarcoma mieloide; y, Proliferación
mieloide relacionada con el síndrome de Down (Tabla 1) [4].

Tabla 1. Clasificación según la OMS (2016) de la LMA.

Fuente: De Kouchkovsky et al. [4] Blood Cancer Journal (2016).

3
 Ana M. Marchena

I. 2. PROTEÍNAS DE CHOQUE TÉRMICO

El estrés se considera en la actualidad como una de las grandes epidemias del

siglo XXI. Según la OMS, el estrés es el conjunto de reacciones fisiológicas que prepara
al organismo para la acción, y distingue tres categorías según su origen: estrés
ambiental, producido por la temperatura, radiaciones o sustancias químicas; estrés
fisiológico, relacionado con cambios en el metabolismo, pH o concentración de
oxígeno; y estrés patofisiológico, que puede cursar con la aparición de fiebre,
inflamación, infección o cáncer. Las consecuencias pueden manifestarse a varios
niveles, pudiendo verse comprometida la integridad de los componentes celulares o
ciertas estructuras como el ADN, las proteínas o las membranas lipídicas, pudiendo
incluso en última instancia provocar la muerte de la célula.

Para minimizar los daños ocasionados por ciertos tipos de estrés, los seres vivos
poseen una compleja maquinaria que detecta, regula y responde a cualquier alteración
ambiental que ponga en peligro la homeostasis celular [5]. Entre los sistemas más
antiguos y universales de respuesta al estrés se encuentran unas proteínas conocidas
como proteínas de choque térmico, proteínas de estrés térmico o HSP, del inglés Heat
Shock Proteins, capaz de conferir a la célula un papel citoprotector frente a gran
diversidad de situaciones de estrés [6]. Las proteínas de choque térmico, pertenecen a
una superfamilia de proteínas altamente conservada en la evolución y cuya secuencia
genética es muy similar desde Arqueas hasta el hombre [7].

Las proteínas de choque térmico son esenciales para la supervivencia. Cuanto

más se somete una célula a estrés térmico, mayor tolerancia al mismo presenta en un
fenómeno conocido como termotolerancia. Sin embargo, no es fácil establecer una
respuesta tipo para todos los organismos ya que cada cual presenta una temperatura
óptima para desarrollarse y realizar sus funciones [8]. En líneas generales, la respuesta
a estrés se desata cuando se produce un ascenso de 10-15 ºC por encima de la
temperatura óptima de los organismos, siendo el margen de tan solo 5 ºC cuando el
organismo crece. Mientras la temperatura se mantenga elevada, el organismo seguirá
produciendo HSP, y sólo cuando se alcanza la temperatura normal, la síntesis de
proteínas se restablece [9].

4
 Introducción

Ferrucio Ritossa [10], fue el primero en poner de manifiesto la existencia de

HSP. En 1962, observó en células de las glándulas salivales de Drosophila
melanogaster, que al poco tiempo de incrementar la temperatura ambiental, el
cromosoma presentaba engrosamientos en ciertas regiones del ADN. Estos
“abultamientos” se correspondían con el aumento en la expresión de genes de ciertas
proteínas. Posteriormente, en 1974, Alfred Tissières et al. [11] identificaría estas
proteínas como proteínas del choque térmico. De entre todas ellas, sobresalía una de
70.000 daltons que se la denominó como HSP70.

Atendiendo a su peso molecular, las proteínas de choque térmico se clasifican en

6 familias: HSP100, HSP90, HSP70, HSP60, HSP40 y sHSP, o familia de proteínas de
bajo peso molecular, que incluye proteínas con pesos moleculares entre 15 y 30 kDa
[12]. Algunas proteínas de la familia HSP con alto peso molecular pueden expresarse de
forma constitutiva, mientras que la expresión de otras es inducida por condiciones
estrés. Las HSP de alto peso molecular son chaperonas dependientes de ATP, que van a
requerir de co-chaperonas para modular su conformación y unirse al mismo. Por el
contrario, las HSP de bajo peso molecular son chaperonas independientes de ATP [13].
Entre las diferentes HSP, HSP27 y HSP70 son las más inducidas ante situaciones de
estrés tales como presencia de quimioterapéuticos, presencia de especies reactivas o
irradiación, pudiendo suponer hasta el 15-20% del contenido proteico en condiciones de
estrés. Tanto HSP27 como HSP70 se expresan abundantemente en células tumorales
pudiendo considerarlas como marcadores [14].

A pesar de su nomenclatura, las proteínas de choque térmico, no sólo confieren

protección a las células cuando éstas se ven sometidas a distintos tipos de estrés
(térmico, radiaciones, diversas drogas, infecciones virales, etc.), sino que desempeñan
importantes y muy variadas funciones dentro de la célula [15].

Una de las principales funciones de las HSP es la de actuar como chaperonas

moleculares, es decir, colaboran con otras proteínas para la adquisición de la estructura
terciaria de proteínas en formación. Estabilizan las formas inestables facilitando el
ensamblado, la correcta unión de oligómeros, su transporte a otro compartimento celular
o su degradación. También previenen agregaciones entre polipéptidos y participan en la
reparación y degradación de proteínas anormales [16, 17].

5
 Ana M. Marchena

Las HSP son fundamentales para el control de la temperatura óptima de

numerosos procesos. Entre ellos está el funcionamiento de los receptores de hormonas
esteroideas [18], la actividad y estabilidad de muchas proteínas esenciales para la célula
implicadas en el mantenimiento de la estructura celular [19], en la transducción de
señales [20] o en el control del ciclo celular [21, 22].

La acción citoprotectora de las HSP se lleva a cabo mediante numerosos

mecanismos, cuando el agente causante de estrés desaparece, la síntesis de HSP
desciende y la célula continúa con su metabolismo normal. Sin embargo, cuando el
estímulo que provoca el estrés aumenta o se mantiene en el tiempo, la función
protectora de las HSP resulta insuficiente, viéndose comprometida la viabilidad celular.
En este caso, la síntesis de HSP se detiene y la célula “se suicida”, activando el
denominado programa de muerte celular programada o apoptosis [23, 24].

Parece ser que las HSP están relacionadas con el sistema inmune al tener acción
inmunogénica, debido a que promueven la ubiquitinación de metabolitos tóxicos para su
posterior lisis por el proteosoma. Los productos de degradación del proteosoma van a
actuar como ligandos de las moléculas de clase I del Complejo Mayor de
Histocompatibilidad (MHC), que a su vez serán reconocidos por los linfocitos T. Todo
ello conduce a la activación de la inmunidad de las células T citotóxicas, indispensable
en la lucha contra infecciones virales y cánceres [25].

I. 2.1 FAMILIAS DE PROTEÍNAS DE CHOQUE TÉRMICO

La superfamilia de HSP se compone de varias familias cuyos miembros se

agrupan y nombran según sus pesos moleculares y cuya distribución ocupa los
principales compartimentos celulares (Tabla 2).

6
 Introducción

Tabla 2. Familias de proteínas de choque térmico (HSP).

Familia Nombre Localización Función
Pequeñas HSP HSP22 Citoplasma, núcleo Estabilización citoesqueleto
HSP27 Citoplasma, núcleo Inhibición actina, termotolerancia
HSP32 R. endoplásmico, Citoprotección
mitocondria, núcleo y
membrana plasmática
HSP40 Hsp40 Citoplasma Chaperona
Hsp47 R. endoplásmico Síntesis colágeno
HSP60 HSP60 Mitocondria Chaperona
HSP70 HSP70
HSP72 Citoplasma, núcleo Chaperonas

HSP90 HSP90α Citoplasma Ciclo celular, citoprotección

HSP90β Citoplasma Embriogénesis, transducción
señales
HSP100 HSP110 Citoplasma, núcleo Chaperona

Familia de las pequeñas HSP

Las HSP pequeñas o sHSP, small Heat Shock Proteins, constituyen una familia
cuyos miembros poseen pesos moleculares comprendidos entre los 15 y los 30 kDa
[26]. Estas proteínas comparten muchas secuencias homólogas y van a diferir del resto
de familias, ya que su secuencia codificante está menor conservada [24]. Poseen en su
estructura un dominio α-cristalino próximo al extremo C-terminal, es una secuencia rica
en hojas β, lo que va a favorecer en gran medida la formación de dímeros. El extremo
C-terminal está altamente conservado, en comparación con el extremo N-terminal que
resulta ser más variable. Posee una región muy flexible y polar responsable de la
solubilidad de las sHSP y de la estabilidad de las proteínas y los complejos proteína-
sustrato [27].

Las sHSP están asociadas a períodos de elevada reorganización celular, síntesis

y degradación proteica, como es el caso de la embriogénesis. La acumulación de
proteínas desdobladas induce a las sHSP a formar agregados como señal para el inicio la
apoptosis [28].

 HSP22

HSP22 también se denomina αB-cristalina por ser la proteína estructural más

abundante en el cristalino de vertebrados [29]. Asimismo está presente en fibras

7
 Ana M. Marchena

musculares estriadas con alta capacidad oxidativa, como el corazón y músculo

esquelético, donde se localiza en las bandas z, aunque su localización parece depender
de las condiciones fisiológicas [30]. El estrés térmico o la isquemia disparan su
translocación al núcleo, la formación de agregados y la interacción con las bandas z de
la sarcómera [31].

 HSP27

HSP27 también se la conoce como HSPB1 o srp27, stress response protein 27.
Es el miembro de la familia sHSP mejor estudiado, y aunque en un inicio se describió
como inhibidor de la polimerización de los filamentos de actina, a día de hoy están
caracterizadas muchas de las funciones que desempeña [32].

Las células presentan niveles basales de HSP27 en ausencia de estímulo que las
estrese. Sin embargo, ante una situación de estrés, presencia de citoquinas o factores de
crecimiento, los niveles de HSP27 aumentan, pudiendo permanecer elevados durante
horas [33]. Cuando el estímulo cesa, HSP27 vuelve a presentar niveles basales. Dentro
de las HSP, ha sido descrita por tener una respuesta lenta al estrés ya que mientras que
la mayoría de estas proteínas se acumulan en un corto espacio de tiempo, HSP27
necesita horas para alcanzar niveles similares [14].

El extremo N-terminal resulta esencial para el desarrollo de oligómeros de alto

peso molecular [34]. Los oligómeros de HSP27 se forman a partir de dímeros estables
que se unen entre sí por los dominios de α-cristalina de dos monómeros vecinos (Figura
1.A). Los dímeros estables se unen para formar tetrámeros para finalmente formar
oligómeros inestables de hasta 800 kDa [35]. La oligomerización es un proceso
dinámico que depende de la fisiología de las células, el estado de fosforilación de
HSP27 y la exposición al estrés, existiendo un equilibrio entre los dímeros estables y los
oligómeros inestables [36]. El estrés induce un aumento de la expresión, realizándose
una regulación mediante la fosforilación de HSP27 por kinasas MAPKAPK -2 y -3 en
3 residuos de serina (Ser-15, Ser-78 y Ser-83). La fosforilación desempeña un papel
importante para la formación de oligómeros en las células (Figura 1.B) que a su vez se
relaciona con la actividad chaperona, una alta agregación indicaría gran actividad
chaperona [37].

8
 Introducción

Figura 1. A. Dominios de HSP27. B. Transición de los estados de dimerización y oligomerización de

HSP27 regulado por la fosforilación.
Fuente: Katsogiannou et al. [38] Frontiers in genetics (2014).

Su función como proteína de respuesta a estrés es evidente, siendo gran

responsable de la termotolerancia y la resistencia a drogas [39]. Como se ha
mencionado anteriormente, desempeña un importante papel en la dinámica de los
filamentos de actina que estabiliza el citoesqueleto en diversos tipos celulares, como
células endoteliales o cardiomiocitos [40]. Inhibe la agregación de proteínas [41] y
actúa como chaperona, reparando o eliminando proteínas dañadas [42]. Interviene en
proliferación y diferenciación celular en células leucémicas, considerándose como un
marcador de diferenciación [43, 44]. Inhibe la apoptosis al ser secuestradora de
moléculas como citocromo c, procaspasa-3 o Akt [13]. También está involucrada en el
transporte del receptor de estrógenos, desde el citoplasma al núcleo, por un mecanismo
dependiente de actina [45].

 HSP32

HSP32 o hemoxigenasa (HO) es una enzima que cataliza la degradación del

grupo hemo dando lugar a biliverdina, Fe2+ y monóxido de carbono como productos de
desecho. Esta proteína de 32 kDa contiene 288 residuos de aminoácidos [46]. Se
localiza principalmente en el retículo endoplásmico, aunque también en mitocondria,
núcleo y membrana plasmática [47].

9
 Ana M. Marchena

Los genes HMOX1, HMOX2 y HMOX3 codifican para las isoformas HO-1,
HO-2 y HO-3 respectivamente. La HO-1 es la isoforma más abundante, sobre todo en
cardiomiocitos y es inducida por diversos tipos de estrés, como hipoxia, isquemia,
peróxido de hidrógeno o metales pesados (selenio, cobalto, cadmio o estaño) [48]. HO-2
comparte una similitud del 47% con la secuencia de aminoácidos de HO-1 debido a que
se realizan hasta cinco transcripciones diferentes del mismo gen. A diferencia de la HO-
1 que es inducible, la HO-2 se produce de manera constitutiva y se expresa en
testículos, células endoteliales y cerebro [49]. La HO-3 es estructuralmente muy
parecida a la HO-2, teniendo un 90% de homología con ella y un 50% con la HO-1.
Parece ser que es catalíticamente inactiva y que actuaría en la detección o en la unión
del grupo hemo. HO-3 se expresa en hígado, próstata y riñones [50].

Familia HSP40

 Hsp40

HSP40 o chaperona DnaJ, actúa como proteína auxiliar de otras proteínas.

También actúa evitando la agregación irreversible de proteínas durante la síntesis o en
situaciones de estrés [51].

Figura 2. Esquema de los tres subtipos de la familia HSP40.

Fuente: Song et al. [52] PLoS One (2014).

Se caracteriza por tener 3 dominios (Figura 2). Un dominio bien definido y

altamente conservado de unos 70 aminoácidos, denominado dominio J. El dominio J se
localiza próximo al extremo N-terminal y posee 4 hélices con una torsión entre la 2ª y 3ª
[53]. Esta región interactúa con Hsp70, desempeñando un papel en la regulación de la
actividad ATPasa de Hsp70 (Figura 3) [54]. El dominio central es una región rica en
cisteína que se pliega en forma dependiente de zinc. Esta región está implicada en la
unión de sustrato, junto con el dominio C-terminal, que actúa como chaperona y es
responsable de la dimerización [55].

10
 Introducción

Figura 3. Modelo de plegamiento de proteínas asistido por el complejo HSP70/ HSP40.

Fuente: Hasegawa et al. [56] Frontiers in Neuroscience (2018).

 HSP47

HSP47, también conocida como serpina H1. Las serpinas, del inglés serine
proteinase inhibitors, constituyen una superfamilia de inhibidores de serina proteinasa.
HSP47 se expresa en el retículo endoplásmico y puede ser inducida tanto por estrés
térmico como por estados fisiopatológicos asociados al aumento de la síntesis de
colágeno, como la fibrosis hepática [57]. La proteína se une al colágeno, actuando como
chaperona involucrada en la maduración del mismo [58].

Los miembros de esta familia poseen una estructura secundaria altamente

conservada, formada por un núcleo de tres hojas β alrededor de nueve hélices α. Puede
presentar dos estructuras: monómero (~ 45 kDa) o trímero (~ 147 kDa), siendo ambos
biológicamente activos.

HSP47 se une a procolágeno en el retículo endoplásmico, formando el complejo

procolágeno-HSP47, el complejo se transporta del retículo al complejo de Golgi donde
HSP47 se disocia y vuelve al retículo para ser reutilizada (Figura 4) [59].

11
 Ana M. Marchena

Figura 4. Síntesis y transporte de colágeno asistido por HSP47.

Fuente: Ito et al [59] Seminars in cell & developmental biology (2017).

La síntesis de colágeno es fundamental para numerosos procesos en el

organismo, sin embargo, un exceso de colágeno puede convertirse en una patología que
interfiera en función normal del organismo. El aumento de la expresión de HSP47 se
relaciona con enfermedades donde existe una deposición anormal de colágeno como en
la arteriosclerosis, infarto de miocardio y fibrosis [60]. Se ha visto en células
metastáticas altos niveles de HSP47, lo que sugeriría la posibilidad de usar esta proteína
como marcador de la actividad tumoral [61].

Familia HSP60

La familia HSP60 se localiza principalmente en la mitocondria, aunque ciertos

autores también la sitúan en el citoplasma [62].

En condiciones fisiológicas normales, HSP60 es un oligómero de 60 kDa. Se

compone por monómeros que forman un complejo dispuesto como dos anillos
heptaméricos apilados. Esta estructura de doble anillo forma una gran cavidad central
donde la proteína desplegada se une mediante interacciones hidrófobas (Figura 5.A)
[63]. Cada subunidad de HSP60 tiene tres dominios: el dominio apical, el dominio
ecuatorial y el dominio intermedio, que une a los dos anteriores (Figura 5.B). El
dominio ecuatorial contiene el sitio de unión para ATP y para el otro anillo
heptamérico. El dominio intermedio induce un cambio conformacional cuando se une el
ATP [64]. En su forma inactiva la proteína se encuentra en estado hidrofóbico, cuando
se une ATP el dominio intermedio experimenta un cambio conformacional que expone

12
 Introducción

la región hidrofílica, haciendo que la cavidad central se agrande y permita el

plegamiento de las proteínas [65].

Figura 5. A. Estructura de HSP60. B. AD: dominio apical, ED: dominio ecuatorial, ID: dominio
intermedio.
Fuente: editada de https://hsp60.com [Internet]

Parece ser que la secuencia codificante de HSP60 que codifica para el extremo
N-terminal, difiere entre la proteína citoplásmica y la proteína mitocondrial [66].

HSP60 está implicada en el plegado de proteínas, en la translocación de las

mismas a través de membranas y en la aceleración del ensamblado [67].

Familia HSP70

Los miembros de esta familia han sido los más estudiados en células eucarióticas
[68]. Incluye proteínas con pesos moleculares comprendidos entre los 66 y 78 kDa
codificadas por una familia de 11 genes en humanos. HSP70 está muy conservada
evolutivamente, la proteína humana posee un 73% de homología con la de D.
melanogaster y un 50% con la de E. coli [69]. Muchas de ellas se localizan en el citosol,
como es el caso de la inducible HSP70 (HSP72) o de la constitutiva Hsc70 (HSP73,
Heat shock cognate 73 kDa); otras se encuentran en la mitocondria como mtHSP70 o en
el retículo como GRP78/BiP, siendo ambas constitutivas.

 HSP70

Todas las HSP70 tienen 3 dominios funcionales a destacar (Figura 6) [70]. En el

extremo N-terminal, se localiza el dominio de unión a nucleótido (NBD) que posee
actividad ATPasa. Consiste en dos lóbulos con una hendidura profunda entre ellos, en

13
 Ana M. Marchena

cuya parte inferior de la misma se une ATP y ADP. Este dominio se une a ATP y lo
hidroliza hasta ADP, el intercambio ATP/ADP va a inducir cambios conformacionales
en los otros dos dominios [71]. El dominio de unión al sustrato (SBD) está compuesto
por un subdominio de hoja β de 15 kDa y un subdominio helicoidal de 10 kDa. El
subdominio de la hoja β consiste en hojas β trenzadas dispuesta como un típico barril β
capaz de recluir el esqueleto peptídico del sustrato. El SBD tiene afinidad por los
residuos de aminoácidos neutros e hidrófobos, y es lo suficientemente largo como para
interactuar con péptidos de hasta siete residuos de longitud [72]. El dominio C-terminal
posee una estructura rica en α-hélices que actúa como una "tapa" para el SBD. Cuando
una proteína HSP70 se une a ATP, la tapa está abierta y los péptidos se unen y liberan
con relativa rapidez. Cuando las proteínas Hsp70 están unidas a ADP, la tapa se cierra y
los péptidos se unen estrechamente al dominio de unión al sustrato [73].

Figura 6. A. Organización de los dominios de HSP70; B. Estructuras de HSP70 cerrada y abierta.

Fuente: Fernández-Fernández et al. [74] F1000Research (2018).

El ciclo ATPasa de HSP70 consiste en alternar estados de baja afinidad y

cambios rápidos mientras une ATP, y estados de alta afinidad y cambios lentos de
sustrato mientras une ADP. Teniendo en cuenta que en condiciones fisiológicas
normales la concentración citoplasmática de ATP es elevada, la hidrólisis del ATP es el
paso limitante del ciclo lo que hace que esté constantemente sujeto a regulación [75].

Se han identificado varias proteínas que actúan como co-chaperonas de HSP70,

modulando su actividad mediante la unión a los dominios NBD y SBD. HSP70 y
Hsc70, pueden interaccionar con la proteína BAG a través de interacciones

14
 Introducción

electrostáticas, estimulando la disociación de ADP en presencia de fosfato inorgánico

[76]. HIP es una proteína de 43 kDa que interactúa con el dominio ATPasa de Hsc70.
Actúa estabilizando el estado ADP y estimulando la actividad chaperona [77]. HOP es
una proteína de 60 kDa capaz de formar dímeros. Interactúa con el extremo C-terminal
de HSP70, también con HSP90, para regular la respuesta al estrés [78]. CHIP es una
proteína de 35 kDa que también forma dímeros y compite con HOP por el extremo C-
terminal de HSP70 y HSP90. Actúa inhibiendo la actividad chaperona de las HSP
cuando se une a ellas, también está relacionada con la degradación de proteínas mediada
por ubiquitinación [79].

HSP70 es la proteína más conservada en la evolución. Está presente en

numerosos compartimentos celulares, sobre todo citoplasma y núcleo. Durante un
estímulo estresante su concentración se intensifica en el núcleo, en el citoplasma se une
a polipéptidos recién formados antes de ser liberados por el ribosoma [80]. Los
miembros de la familia HSP70 ejercen funciones como ayudar en el plegamiento de
algunas proteínas recién sintetizadas [81], translocar proteínas a través de membranas
[82], regular la actividad biológica de las proteínas [83], facilitar la degradación de
proteínas inestables [84], crecimiento y desarrollo de las células [85], participación en la
respuesta inmune [86].

También han sido descritos los efectos protectores de HSP70 cuando es aplicada
de forma exógena, en la protección y recuperación celular tras ser sometidas a estrés
[87, 88], tratamiento de enfermedades degenerativas [89] o protección contra
enfermedades infecciosas [90].

HSP70, al igual que HSP90, tiene la capacidad de preservar la función de

proteínas mutadas, como p53 o SOD1, pero ante situaciones como estrés extremo [91],
etapas del desarrollo o la presencia de ciertos fármacos [92], las mutaciones son
insalvables y la funcionalidad queda comprometida. Cuando ya no es posible recuperar
la proteína existe una segunda alternativa que consiste en la ubiquitinación de la
proteína para su posterior degradación [93]. Si ambos mecanismos fracasan, las
proteínas mutadas pueden acumularse y dar lugar a enfermedades como el cáncer (p53),
la esclerosis lateral amiotrófica (SOD1), la enfermedad de Parkinson (α-sinucleina) o de
Huntington (huntingtina) (Figura 7).

15
 Ana M. Marchena

Figura 7. Funciones de HSP70 en respuesta al estrés.

Fuente: Chatterjee et al. [94] International journal of molecular sciences (2017).

Familia HSP90

HSP90 es una de las proteínas más abundantes en eucariotas, llegando a suponer

hasta un 2% de las proteínas totales citoplásmicas en estado basal y pudiendo aumentar
su expresión hasta 4-6% en condiciones de estrés [95]. Esta familia está formada por
cuatro proteínas: las isoformas HSP90α y HSP90β, la mitocondrial TRAP1 y la
GP96/Grp94 en el retículo endoplasmático. Grammatikakis y colaboradores relatan la
existencia de una quinta proteína: HSP90N. Este nuevo miembro, sería una variante de
la HSP90 citosólica pero asociada a membrana y estaría relacionada con la
transformación de las células cancerígenas [96].

HSP90 se encuentra principalmente en forma de dímeros (αα o ββ), a pesar de

que la isoforma α dimeriza más rápidamente que la β. Cada uno de los dímeros posee
tres dominios. El dominio N se localiza en el extremo N-terminal de la proteína, se trata
de un sándwich estructural que delimita el sitio de unión a ATP y a ciertos inhibidores
como la geldanamicina [97]. Posee un segmento a modo de tapa que durante el cambio
conformacional tendrá importancia en el mecanismo catalítico. El dominio N conecta
con el dominio intermedio a través de una hoja-β [98]. El dominio intermedio consta de
tres regiones estructurales bien definidas y que poseen alta afinidad para co-chaperonas
y otras proteínas. El dominio C se sitúa en el extremo C-terminal, en él se encuentra el

16
 Introducción

sitio de reconocimiento de motivos EEVD (glutámico-glutámico-valina-aspártico),

responsable de la interacción con co-factores como inmunofilinas y fosfoproteína 1
inducida por estrés, entre otros. [99] El dominio C posee un sitio de unión a ATP
alternativo, que se vuelve accesible cuando el sitio de unión a ATP del dominio N está
ocupado [100].

El factor de transcripción de choque térmico 1 (HSF1) tiene mayor afinidad por

el promotor del gen codificante para HSP90 que por el de HSP70, esto hace que la
proteína HSP90 se exprese a niveles más altos que la HSP70 y que sea el mayor
represor de HSF1[101]. HSP90α es la forma inducible mientras que la HSP90β se
expresa de forma constitutiva, sin embargo hay estudios de que las dos isoformas
pueden ser inducidas aunque por diferentes estímulos, el isómero α por estrés
fisiológico y el β por factores de crecimiento o signos de diferenciación [102].

Tabla 3. Funciones de las isoformas HSP90α y HSP90β.

HSP90α HSP90β

Regulación ciclo celular Maduración células germinales

Crecimiento celular Estabilización citoesqueleto

Citoprotección Transformación celular

Transducción señales

Embriogénesis

En células no tumorales no sometidas a estrés, HSP90 desempeña una serie de

funciones importantes, que incluyen el plegamiento, el transporte intracelular, el
mantenimiento y la degradación de las proteínas, además de facilitar la señalización
celular. Un gran número de proteínas requieren la ayuda de la HSP90 para mantenerse
activas, aunque requiere de otras co-chaperonas como Cdc37, p23, HOP y CHIP, que le
permiten asociarse con un número significativo de proteínas de señalización incluyendo
receptores esteroideos, tirosinas kinasas como v-Src, y serina/treonina kinasas como
Raf-1 o Akt [103]. Regula la actividad de los receptores de hormonas esteroideas, en
ausencia de la hormona correspondiente el receptor se asocia con varias proteínas
celulares, entre ellas HSP90, que lo mantienen inactivo. En presencia de progesterona,
HSP90 se libera y el receptor cambia su conformación para poder unirse al ADN,

17
 Ana M. Marchena

activando la expresión de los genes correspondientes (Figura 8) [104]. El nivel basal de

HSP90 aumenta con el estrés, pudiendo unirse a los microtúbulos para estabilizar el
citoesqueleto y activar genes para la supervivencia [41].

Figura 8. Translocación del receptor de glucocorticoides del citoplasma al núcleo asistido por
HSP90. GR: receptor de glucocorticoides; 90: HSP90; 51: immunofilina FKBP51; 52: immunofilina
FKBP52; Dyn: dineina.
Fuente: Davies et al. [105] The Journal of biological chemistry (2002).

Las células tumorales sobreexpresan varias proteínas, incluyendo receptores del

factor de crecimiento como EGFR [106] o proteínas de transducción de señales como
PI3K y Akt, entre las funciones de HSP90 está la de estabilizar estas proteínas. Por
tanto, la inhibición de HSP90 puede inducir apoptosis a través de la inhibición de estas
vías de señalización [107]. Otro papel importante de HSP90 es la estabilización de
proteínas mutantes como v-Src, el oncogén de fusión Bcr/Abl y formas mutantes de p53
[108]. También se requiere HSP90 para la inducción del factor de crecimiento
endotelial vascular (VEGF) y la óxido nítrico sintasa (NOS) [109]. Ambos son
importantes para la angiogénesis de novo que se requiere para el crecimiento del tumor
[108]. Además, HSP90 promueve la fase de invasión durante la metástasis asistiendo a
la metaloproteinasa de la matriz 2 (MMP2) [110].

18
 Introducción

Familia HSP100

 HSP104

Estudios inmunológicos estiman que HSP104 se localiza en el aparato de Golgi

de algunos tipos de levaduras, sin encontrar homología con D. melanogaster o el
hombre. Los miembros de esta familia pertenecen a la familia de proteínas AAA+, que
son ATPasas con diversas actividades. Tiene como función regular la
agregación/separación de proteínas, pudiendo revertir la toxicidad de la α-sinucleína
mutante, TDP-43, FUS y TAF15 [111].

 HSP110

Se trata del miembro de mayor tamaño de la familia HSP y está muy ligado a la
familia HSP70, de hecho, se consideran miembros divergentes de esa familia. HSP110
se encuentra preferentemente dentro o cerca del núcleo [112].

En su estructura se diferencian varios dominios. El dominio A comprende desde

los residuos 1 a 394 y es el responsable de la unión a ATP/ADP (NBD). A continuación
está el domino B, desde los residuos 394 al 509. Posee siete hojas-β responsables de la
conexión al sustrato (SBD). Los siguientes 98 residuos de la proteína, desde 510 a 608,
se cargan negativamente para formar un lazo y constituir el dominio L. Los restantes
residuos, del 608 al 858, forman una serie de α-hélices dando lugar al dominio H [113].

Aunque HSP110 posee en su estructura dominios NBD y SBD similares a los de

la familia HSP70 y pueden unir como sustratos proteínas desplegadas para volver a
plegarlas, no muestran los mismos ciclos alostéricos impulsados por ATP. En cambio,
su función principal in vivo parece ser la de actuar como factor intercambiador de
nucleótidos (NEF) para HSP70. El mecanismo por el cual HSP110 induce la liberación
de nucleótidos no está claro, pero es distinto de cómo funcionan otros NEF, ya que
HSP110 primero debe unirse a ATP para asumir una conformación que le permita
unirse a HSP70 [114]. El complejo resultante HSP110:HSP70 es estable y se disocia
solo cuando el ATP se une posteriormente a HSP70 [115].

19
 Ana M. Marchena

I. 2.2 FACTORES DE TRANSCRIPCIÓN DE CHOQUE TÉRMICO

La respuesta al estrés requiere la activación del denominado factor de choque

térmico (HSF) [116]. Este factor conecta con el elemento promotor de choque térmico
(HSE), caracterizado por tener cinco repeticiones del motivo 5'-nGAAn-3 'y situado a
80-150 pares de base por encima del lugar de iniciación de la transcripción. Las
posiciones 3 y 4 del HSE son simétricas, lo que hace que HSF tenga afinidad por unirse
a ellas [117].La unión de HSF conduce a cambios en la organización de la estructura de
la cromatina [118].

Todos los HSF tienen en común: una secuencia conservada hélice-vuelta-hélice

del dominio de unión al ADN, una repetición hidrofóbica de 80 residuos (HR-A/B)
esencial para la trimerización, un dominio responsable de la unión de la proteína y del
HSE y, adyacente a éste, otra repetición hidrofóbica (HR-C) encargada de suprimir la
trimerización a través de la interacción con HR-A/B [119].

Los HSF regulan la síntesis inducida de HSP durante el crecimiento, el

desarrollo y la adaptación. En levaduras e invertebrados existe un único HSF en tanto
que en plantas y vertebrados existen varias isoformas. La existencia de varios HSF aún
no está clara, pero una de las hipótesis sugiere estar relacionada con la redundancia y
especialización de la respuesta [120].

En ausencia de estrés, las HSP se unen a los HSF presentes en el citosol,

manteniéndolos como monómeros inactivos, mientras que en presencia de estrés, los
HSF se separan de las HSP. La activación del HSF1 humano ocurre en al menos dos
pasos. Un primer paso consistente en la formación de un homotrímero capaz de unirse a
HSE pero que carece de actividad transcripcional. Y un segundo paso, donde el trímero
HSF1 se convierte en una forma transcripcionalmente competente, dando inicio a la
síntesis de HSP. La diferencia entre ambos estados es la fosforilación por la PKC o por
otra serina/treonina kinasa de los residuos Ser303, Ser307 y Ser363, lo que sugiere un
papel regulador en la activación de HSF1 [121] (Figura 9).

20
 Introducción

Figura 9. Síntesis de HSP inducida por diferentes tipos de estrés.

Fuente: Kregel [121] Journal of Applied Physiology (2002).

Factor de choque térmico 1

HSF1 es el principal factor de transcripción inducido por estrés en vertebrados,

D. melanogaster y S. cerevisiae [122]. En condiciones normales, HSF1 se encuentra en
forma de monómero fosforilado pero ante un estímulo estresante, HSF1 trimeriza y se
traslada al núcleo.

La familia de proteínas kinasas MAP inhibe la respuesta al estrés a través de

cambios en el estado de fosforilación de HSF1. Esta familia incluye a ERK1 y ERK2
activadas por factores de crecimiento, JNK/SAPK activada por luz ultravioleta,
citoquinas pro-inflamatorias, estrés térmico y rayos x; y p38, activada por
hiperosmolaridad y estrés térmico [123, 124].

Factor de choque térmico 2

Se conoce muy poco sobre HSF2 en comparación con HSF1. Se sabe que
responde a la hemina durante la diferenciación, maduración y embriogénesis, donde
pasa de un estado dimérico inerte a un trímero activo [125].

21
 Ana M. Marchena

Factor de choque térmico 3

En aves, HSF3 ejerce funciones similares a las de HSF1 y HSF2, sin embargo
cuando HSF3 está inhibido, las células quedan claramente comprometidas, incluso en
presencia de los otros. Puede ser activado por el oncogén Myb incluso en ausencia de
estrés [126].

Factor de choque térmico 4

HSF4 se expresa en corazón, cerebro, musculo esquelético y páncreas de

humanos, siendo el único de los cuatro que no es ubicuo. Otra diferencia con los
restantes HSF de vertebrados es que carece de la repetición hidrofóbica HR-C [127].

I. 3 APOPTOSIS

El término apoptosis procede del griego (ἀπόπτωσις), compuesto por ἀπό (apó,
“desde” o “a partir de”) y πτωσις, (ptōsis, “caída”). Inicialmente fue acuñado por los
botánicos para referirse a la caída de las hojas pero a principio de los 70’s Kerr, Wyllie
y Currie lo incorporaron a la biología celular. La apoptosis, también denominada muerte
celular programada, es un proceso activo de muerte celular dependiente de energía. Está
genéticamente regulado por la expresión de genes conservados evolutivamente e
involucra una amplia red de señales tanto para su iniciación como para la ejecución
[128].

Este proceso forma parte de los mecanismos fisiológicos que controlan el

equilibrio tisular, mediante la proliferación y la muerte de las células que componen un
tejido, siendo esencial durante la embriogénesis donde se establecen los patrones
morfofuncionales de los órganos [129]. Además, ha sido descrito como un proceso
altruista a través del cual las células se suicidan silenciosamente para proteger a las
células vecinas [130]. Este “suicidio celular” tiene un papel crucial en la eliminación de
células no deseadas o dañadas, en el desarrollo y función del sistema inmune y en la
protección antitumoral [131].

22
 Introducción

La apoptosis puede desencadenarse por numerosos estímulos estresantes, entre

los que se encuentran hipertermia, presencia de radicales, radiaciones ionizantes,
hipoxia, falta de factores de crecimiento u hormonas, citoquinas, glucocorticoides,
drogas citotóxicas, agentes quimioterapéuticos, etc. [132].

I. 3.1 CAMBIOS MORFOLÓGICOS Y BIOQUÍMICOS DURANTE EL

PROCESO DE APOPTOSIS

Cuando una célula muere por un proceso de apoptosis sufre una serie de cambios
bioquímicos y morfológicos característicos muy marcados y coordinados que difieren
de los descritos en la muerte por necrosis (Figura 10). Se trata de un fenómeno bastante
rápido en el que se dan algunos acontecimientos de manera discreta y otros de forma
más evidente.

Figura 10. Diferencias morfológicas entre apoptosis y necrosis.

Fuente: modificada de Majno et al. [133] American Journal of Pathology (1995).

Uno de los eventos iniciales en la apoptosis es la deshidratación celular. La

pérdida del agua intracelular conlleva la constricción de la membrana y una reducción
considerable del volumen celular. Los orgánulos se aglomeran y se produce una

23
 Ana M. Marchena

reducción del núcleo y una condensación de la cromatina [134]. Simultáneamente se

inicia una serie de eventos bioquímicos que activan distintas endonucleasas
dependientes de Ca2+ y Mg2+ y que cortan el ADN en los espacios internucleosomales.
Esto genera fragmentos de unos 200 pares bases con un patrón característico “en
escalera” cuando se analiza el ADN de las células apoptóticas, considerándose como
marcador del proceso apoptótico [135].

Una característica específica de la apoptosis es la preservación de la integridad

estructural y de la funcionalidad de la membrana plasmática, al menos durante la fase
inicial. La deshidratación celular hace que el citoplasma se condense, produciendo
cambios en la forma y el tamaño celular, dando lugar al característico “blebbing” o
formación de ampollas irregulares en la membrana celular, resultando en la formación
de cuerpos apoptóticos con restos de citoplasma, orgánulos y en ocasiones también
restos nucleares, rodeados por fragmentos de membrana celular [136, 137].

La constricción de la membrana implica una pérdida de contacto con las células

vecinas por alteraciones en las moléculas de adhesión de la membrana plasmática [138].
La pérdida de la asimetría de membrana plasmática debida a la translocación de
fosfolípidos de membrana, como la fosfatidilserina, desde la cara interna de la
membrana plasmática hacia su cara externa. Esta exposición anormal de fosfolípidos
sirve como señal de reconocimiento y los cuerpos apoptóticos son fagocitados por
macrófagos o por células vecinas, evitando así la respuesta inflamatoria local
ocasionada en la necrosis cuando la célula se rompe y libera su contenido al medio
[139].

En ocasiones se produce una pérdida del potencial de membrana mitocondrial

[138], acidificación intracelular, producción de especies reactivas de oxígeno (ERO)
[140], movilización del calcio intracelular [141] y la desorganización del citoesqueleto
celular [142]. Estos cambios bioquímicos son el reflejo de la activación de una
maquinaria intracelular específica que controla este proceso, de la que son
especialmente importantes un conjunto de enzimas proteolíticas llamadas caspasas
[143].

24
 Introducción

I. 3.2 CASPASAS

La inducción y la ejecución de la apoptosis requieren de la coordinación entre

proteínas adaptadoras, receptores de membrana, enzimas y proteínas reguladoras de la
expresión génica.

La familia de las caspasas, son el eje central de la maquinaria celular implicada

en la apoptosis [144]. El término caspasa deriva de cisteinil - aspartato proteasa, ya que
estas enzimas son cisteínas proteasas, caracterizadas porque su actividad catalítica
depende de un residuo de cisteína situado en una secuencia peptídica altamente
conservada del centro activo de la enzima, y porque cortan específicamente su sustrato
después de un residuo de ácido aspártico [143]. La estricta especificidad de las caspasas
no implica una digestión proteica indiscriminada, sino que sólo un grupo de proteínas es
diana para ser procesado.

En mamíferos, la familia de las caspasas se compone de 14 proteínas diferentes

en base a la similitud de la secuencia entre los dominios de las subunidades de su
procaspasa, pudiendo clasificarlas en caspasas inflamatorias o caspasa apoptóticas.

El grupo de caspasas inflamatorias está formado por las caspasas -1, -4, -5, -11, -
12, -13 y -14. Se caracterizan por estar involucradas principalmente en la maduración
proteolítica de las prointerleuquinas -1-β y -18 a sus formas pro-inflamatorias y
biológicamente activas [145]. El grupo de las caspasas apoptóticas está formado por las
caspasas relacionadas con el gen ced-3 de C. elegans y juegan un papel importante en el
desarrollo del proceso apoptótico. Según su función dentro de la cascada apoptótica
podemos distinguir entre caspasas iniciadoras de las apoptosis, como las caspasas -2, -
8, -9, y -10, y las caspasas ejecutoras -3, -6 y -7, encargadas de la ejecución de la
apoptosis degradando directamente múltiples sustratos celulares [146].

Inicialmente las caspasas se sintetizan como zimógenos o precursores

enzimáticos inactivos, denominadas procaspasas. Las caspasas están reguladas
postraduccionalmente de modo que pueden ser activadas rápidamente. Contienen tres
dominios (Figura 11), un prodominio en el extremo N-terminal, una subunidad mayor
(~ 20 kDa) que posee cisteína en el centro activo dentro de un motivo conservado y una
subunidad menor (~ 10 kDa) en el extremo C-terminal. El prodominio y la subunidad
mayor están separados por un lugar de corte con aspartato, y la subunidad mayor está

25
 Ana M. Marchena

separada de la menor por uno o dos motivos de este tipo. La presencia de aspartato en
los motivos de corte para la maduración de las caspasas es consistente con la habilidad
de autoactivarse o de ser activadas por otras caspasas como parte de una cascada de
amplificación [147, 148].

Figura 11. Familia de caspasas. Grupo I: caspasas inflamatorias, Grupo II: caspasas apoptóticas
iniciadoras, Grupo III: caspasas apoptóticas ejecutoras.
Fuente. Lavrik et al. [149] Acta naturae (2009).

Los prodominios cortos de las caspasas ejecutoras no es probable que puedan

mediar interacciones entre proteínas [150]. Sin embargo, las procaspasas inflamatorias y
las apoptóticas iniciadoras poseen prodominios largos, excepto la procaspasa-14, que lo
tiene muy corto o no tiene [151]. El prodominio largo puede contener el dominio efector
de muerte o DED, death effector domain, como en las procaspasas -8 y -10; o bien, el
dominio de reclutamiento de las caspasas o CARD, caspase recruitment-domain, como
en las procaspasas -2 y -9. DED y CARD, pertenecen a la superfamilia de los dominios
de muerte y permiten las interacciones proteína-proteína entre las procaspasas y sus
adaptadores. Además, juegan importantes papeles en la activación de las procaspasas
(Figura 11).

La activación de las procaspasas implica el procesamiento proteolítico en los

residuos de ácido aspártico que separan cada uno de los tres dominios del zimógeno
[152]. Tras la proteolisis, se produce una asociación entre la subunidad grande y la
pequeña para formar un heterodímero y dos heterodímeros se asocian para formar un
tetrámero con dos sitios catalíticos independientes que unirán y cortaran el sustrato
(Figura 12) [153].

26
 Introducción

Figura 12. Clasificación y activación de las caspasas.

Fuente: Tait et al. [154] Nature reviews. Molecular Cell Biology (2010).

La activación de las caspasas puede darse mediante tres mecanismos. En primer

lugar, mediante el procesamiento por otra caspasa, estrategia utilizada para la activación
de las caspasas efectoras con prodominio corto -3, -6 y -7. Todos los dominios de la
proenzima se mantienen y sólo se produce un cambio conformacional al cortar en el
residuo de ácido aspártico. Estas enzimas pueden autoactivarse o ser activadas por otras
caspasas como parte de una cascada de amplificación [155].

En segundo lugar, la activación inducida por proximidad, estrategia utilizada

para la activación de las procaspasas -8, -9 y -10 durante el desarrollo de la apoptosis
extrínseca. Este tipo de activación requiere de la participación de los receptores de
muerte situados en la superficie de la membrana plasmática. Tras la activación, estos
receptores se agregan y reclutan una serie de moléculas adaptadoras y a las procaspasas
formando complejos de señalización de inducción de muerte o DISC, death-inducing
signalling complex [156, 157]. En estas condiciones se aumenta la concentración local
de estas procaspasas lo que permite que varias moléculas inactivas se corten
mutuamente y se activen unas a otras (Figura 13) [158, 159].

27
 Ana M. Marchena

Figura 13. Activación por proximidad a través de DISC.

Fuente: Krammer et al. [160] Nature reviews. Immunology (2007).

La última vía de activación consiste en la asociación con una subunidad

reguladora. Es el mecanismo de activación más complejo y el utilizado por la
procaspasa-9. Requiere de la molécula Apaf-1 para activarse. Apaf-1 presenta 3
dominios funcionales, el extremo N-terminal tiene una secuencia CARD con una alta
homología a la secuencia CARD de la caspasa-9; en la zona central presenta un dominio
de unión del dATP; y, en el extremo C-terminal está el dominio WD-40. El dominio
WD-40 está implicado en la unión proteína-proteína, a través de cual el citocromo c
interacciona con Apaf-1 (Figura 14. a) [161]. La unión del citocromo c y de la molécula
de ATP facilita un cambio conformacional en la estructura de Apaf-1 permitiendo que
oligomerice con otras moléculas de Apaf-1 y forme un heptámero, surgiendo una
estructura denominada apoptosoma, que reclutará procaspasas-9 a través de
interacciones entre los dominios CARD presentes tanto en Apaf-1 como en la
procaspasa 9 [162, 163]. La activación de la procaspasa 9 dentro del apoptosoma se
produce por una proteólisis autocatalítica (Figura 14. b) [164, 165].

La activación de las caspasas no implica una degradación indiscriminada de

proteínas celulares. En la mayoría de los casos, el procesamiento mediado por las
caspasas resulta en la inactivación de la proteína. Las caspasas pueden también activar
proteínas, bien directamente mediante el corte de un dominio de regulación negativa, o
bien indirectamente mediante la degradación de una subunidad inhibidora. La lista de
substratos de caspasas incluye más de 30 proteínas.

28
 Introducción

Figura 14. Mecanismo de formación del apoptosoma.

Fuente: Riedl et al. [166] Nature reviews. Molecular cell biology (2007).

I. 3.3 VÍAS DE ACTIVACIÓN DE LA APOPTOSIS

Tradicionalmente se han descrito dos vías por las que se activa la apoptosis: la
apoptosis intrínseca ó mitocondrial, mediada por el estrés celular o por la lesión en el
ADN; y, la apoptosis extrínseca mediada por ligandos que se unen a sus receptores en la
superficie celular.

Ambas vías producen la activación de las caspasas iniciadoras y convergen en la

activación de las caspasas ejecutoras, responsables de la muerte apoptótica [167].
Además de estas dos vías, se han descrito otras como la vía de activación de caspasas
vinculada al estrés en el retículo endoplásmico [168, 169]. En ocasiones, la activación
de las caspasas no guarda relación con el proceso de apoptosis [170].

Vía intrínseca o mitocondrial

La apoptosis inducida por señales intrínsecas se inicia en la mitocondria, donde

convergen numerosos estímulos citotóxicos y apoptóticos que alteran la permeabilidad
de la membrana mitocondrial externa y la pérdida de su potencial de membrana [171].

La alteración de la permeabilidad mitocondrial externa hace que una serie de

proteínas que en condiciones normales se localizan en el espacio intermembrana de la
mitocondria sean liberadas al citoplasma celular, donde promueven la activación de las
caspasas (Figura 15) [172].

29
 Ana M. Marchena

Figura 15. Vía intrínseca de la apoptosis.

Fuente: Spierings et al. [173] Science (2005).

Se han descrito tres mecanismos por los que se provoca la alteración de la

permeabilidad de la membrana mitocondrial externa durante la apoptosis. El primero,
contempla la formación del complejo del poro de permeabilidad transitoria mitocondrial
(PPTm). El PPTm funciona como un canal aniónico que permite el paso de agua y de
moléculas de hasta 1,5 kDa, y participa en la regulación del Ca2+, el pH, el potencial de
membrana mitocondrial y el volumen de la mitocondria [174].

El segundo mecanismo implica a las proteínas de la familia Bcl-2. Mientras que

las proteínas pro-apoptóticas se insertan en la membrana mitocondrial formando canales
que provocan la despolarización mitocondrial, las proteínas anti-apoptóticas evitan la
salida de factores proapoptóticos por esos canales. [171].

30
 Introducción

El tercer mecanismo englobaría a los anteriores. Se ha demostrado que la

proteína pro-apoptótica Bax interacciona con las proteínas que compone el PPTm,
formando canales iónicos en la membrana interna mitocondrial y constituyendo canales
permeables para el citocromo c en la membrana mitocondrial externa [172, 175].

Las alteraciones en la permeabilidad y el potencial de membrana de la

membrana mitocondrial induce la liberación al citoplasma de moléculas pro-apoptóticas
entre las que se incluyen el citocromo c, Smac/DIABLO, el factor inductor de la
apoptosis (AIF), la proteasa Omi/htrA2 y la endonucleasa G [143]. El citocromo c actúa
activando la molécula adaptadora Apaf-1 con la consecuente activación de la caspasa-9
[176]. La liberación de AIF y la endonucleasa G al citoplasma, y su posterior
translocación al núcleo, contribuyen a la condensación de la cromatina y la
fragmentación del ADN sin la necesidad de la activación de las caspasas [177].

Por su parte, Smac/DIABLO y Omi/HtrA2 facilitan la activación indirecta de las

caspasas al actuar como inhibidores de los inhibidores endógenos de las caspasas como
las IAPs [178].

Vía extrínseca o vía de los receptores de muerte

La vía extrínseca de la apoptosis se inicia con la activación de los receptores de

muerte anclados en la membrana plasmática cuando se unen ligandos específicos a ellos
(Figura 16).

Estos receptores pertenecen a la superfamilia de receptores del factor de necrosis

tumoral (TNF), constituida por más de 20 proteínas con un amplio rango de funciones
biológicas, incluyendo la regulación de la supervivencia y la muerte celular al conectar
las señales extracelulares inductoras de muerte con la apoptosis intracelular [179]. Los
receptores de muerte más conocidos son el APO1/Fas/CD95 (antígeno de apoptosis-1),
el TNFR1 (receptor 1 de TNF) y el TRAILR1 (TNF related apoptosis inducing ligand
receptor 1).

31
 Ana M. Marchena

Figura 16. Vía extrínseca de la apoptosis.

Fuente: Krakstad et al. [180] Molecular cáncer (2007).

Estos receptores se caracterizan porque en la parte intracelular contienen un

dominio de interacción con otras proteínas denominado dominio de muerte o DD
(Death Domain). Dicho dominio es fundamental para la transmisión del estímulo
apoptótico al servir como anclaje para una serie de proteínas señalizadoras que también
poseen DD: la proteína adaptadora FADD, que puede interaccionar directamente con el
receptor, en el caso de Fas y TRAILR1, o indirectamente, a través de otra proteína
adaptadora denominada TRADD (dominios de muerte asociados al TNFR) en el caso
del TNRF1 (Figura 16) [180]. Además, los receptores de muerte poseen en su parte
extracelular entre 2 y 4 dominios ricos en cisteína (CRDs) donde se unen sus ligandos
específicos. La unión del ligando al receptor da lugar al reclutamiento a través de su DD
de las moléculas adaptadoras FADD y TRADD [179]. Estas moléculas adaptadoras

32
 Introducción

contienen dominios efectores de muerte o DED, que interacciona con los DED de las
caspasas -8 y-10 para formar el complejo intracelular multiproteico DISC [156, 157].
Una vez formado, el DISC promueve la activación de la caspasa-8 inducida por
proximidad, la cual comienza a ser rápidamente activada por un mecanismo proteolítico
[156]. Tras este proceso autocatalítico, la caspasa-8 se libera del DISC completamente
activa, pudiendo activar directamente otros miembros ejecutores de la familia de las
caspasas, como la caspasa-3, cuya activación conduce a la fase ejecutora de la apoptosis
(Figura 16) [180].

Vía dependiente del estrés reticular

Existiría una tercera vía de activación de la apoptosis dependiente del estrés del
retículo. La concentración de Ca2+ dentro del retículo genera un estrés oxidativo que
altera las condiciones y las propiedades fisiológicas del interior del retículo afectando a
la actividad de las chaperonas. Esto provoca la acumulación de proteínas sin plegar o
incorrectamente plegadas en el interior del retículo, generando el llamado estrés
reticular. Como respuesta al estrés reticular se inicia la respuesta a proteínas no plegadas
o UPR, Unfolded Protein Response, la cual es mediada por las proteínas PERK (Protein
Kinase-like Endoplasmic Reticulum Kinase), IRE1 (Inositol Requiring Kinase 1) y
ATF-6 (Activating Transcription Factor 6), que promueve la muerte celular [181].

Sin embargo, cuando el daño es muy intenso y la UPR no es capaz de restablecer

las condiciones y propiedades fisiológicas del ER, se inicia la activación de la vía
apoptótica inducida por el estrés reticular y en la que inicialmente participan los
mediadores de UPR [182]. La apoptosis inducida por el estrés reticular se ha descrito
como un proceso heterogéneo y complejo en el que están implicados múltiples factores
como la activación directa de diversas caspasas iniciadoras, las proteínas de la familia
Bcl-2 y la alteración de la permeabilidad de la membrana mitocondrial. [182, 183].

I. 3.4 APOPTOSIS Y ESPECIES REACTIVAS DE OXÍGENO

El estrés oxidativo se define como el desequilibrio a favor de la producción de

especies reactivas de oxígeno con respecto a las defensas antioxidantes de una célula. El
término especies reactivas de oxígeno o ERO, engloba moléculas y radicales libres
derivados del oxígeno molecular (O2). Generalmente son moléculas muy pequeñas,

33
 Ana M. Marchena

altamente reactivas y con un gran poder oxidante debido a una capa de electrones de
valencia desapareados que les permite interaccionar con otras moléculas orgánicas
mediante reacciones de oxido-reducción. Las ERO están involucradas en una gran
variedad de procesos celulares desde la muerte celular tanto por apoptosis como por
necrosis hasta la proliferación celular y carcinogénesis [184].

Generación de ERO

Toda célula aeróbica genera ERO como subproducto de determinadas reacciones

bioquímicas y en respuesta a algunos estímulos [185]. Cualquier proteína o sistema
enzimático capaz de transferir electrones puede generar ERO como resultado de la
reacción de transferencia electrónica. Este es el caso de NAD(P)H oxidasa,
peroxisomas, xantina oxidorreductasa, acilCoA oxidasa, citocromos P-450,
ciclooxigenasas, lipooxigenasa además de pequeñas moléculas autooxidables como
grupos tioles, hidroquinonas, catecolaminas y flavinas [186].

De entre todos, la cadena transportadora de electrones situada en la membrana

mitocondrial interna es el sistema más importante de generación de ERO. La principal
función de este sistema es la transferencia de electrones procedentes del ciclo de Krebs
y de la β-oxidación de los ácidos grasos a través de una serie de complejos donde
sufrirán reacciones de oxido-reducción, transportándose desde el NADH y el FADH2
hasta transferirlos al aceptor final, el O2.

Esta transferencia de electrones está acoplada a la generación de un gradiente

electroquímico de H+ que da lugar tanto a un gradiente de pH, como a una diferencia del
potencial de membrana mitocondrial. Desviaciones en el normal funcionamiento de la
cadena transportadora conducen a un desacoplamiento en la transferencia de electrones,
provocando la generación de radical superóxido (O2.⎯), especie relativamente poco
reactiva, pero potencialmente tóxica, ya que puede iniciar reacciones que den lugar a
otras ERO que sí pueden ser altamente reactivas. La adicción de un segundo electrón o
la dismutación del O2.⎯, de forma espontánea o a través de la superóxido dismutasa,
genera peróxido de hidrógeno (H2O2), una molécula capaz de atravesar las membranas
biológicas [187]. En el H2O2, que no es un radical libre propiamente dicho, la unión
entre ambos oxígenos es muy débil lo que le confiere alta reactividad. El H2O2 puede
ser completamente reducido a agua (H2O) en una reacción catalizada por la catalasa o la

34
 Introducción

glutatión peroxidasa, pero también puede descomponerse fácilmente y ganar otro

electrón para convertirse mediante las reacciones de Fenton y Haber-Weiss en el radical
hidroxilo (·OH), uno de los oxidantes más potentes y con mayor toxicidad de la
naturaleza. Finalmente la incorporación de un cuarto electrón conduce a la formación de
H2O (Figura 17) [188].

Figura 17. Formación de ERO como efecto secundario del flujo de electrones en la mitocondria.
Fuente: Kutschera et al. [189] Theory in biosciences (2013).

El O2.⎯ puede reaccionar con otros radicales como el óxido nítrico (.NO)
generando diversas especies reactivas de nitrógeno o ERN, como el peroxinitrito
(ONOO-), otro potente oxidante. El radical ONOO- suele estar en equilibrio con su
ácido conjugado (ONOOH). Se comporta como un potente oxidante, capaz de reducir
grupos tioles o tioéteres, capaz de nitrar residuos de tirosina, de guanosina y de degradar
carbohidratos, por lo que pueden iniciar la peroxidación lipídica y puede fragmentar el
ADN [190].

Papel de las ERO en la apoptosis

El metabolismo celular depende de un continuo aporte de ATP de la

mitocondria, esencial en la mayoría de los tejidos. Por tanto, cualquier daño en la

35
 Ana M. Marchena

cadena respiratoria podría tener un gran impacto sobre la viabilidad celular. La

concentración de O2.⎯ en la matriz mitocondrial es entre 5 y 10 veces mayor que en el
citosol o en el núcleo [191]. Los radicales libres generados en la mitocondria podrían
inhibir uno o más componentes de la cadena de transporte de electrones, lo que
contribuye a la aparición de una disfunción en condiciones de estrés oxidativo [192].
Por ello, la célula cuenta con un sistema de defensa de detoxificación de ERO, además
de sistemas de reparación de los daños causados por las mismas.

Las ERO son capaces de oxidar indiscriminadamente lípidos, proteínas y ácidos

nucleicos alterando su estructura y su función [193]. Este tipo de reacciones lleva a la
formación de agregados de proteínas y facilita la formación del PPTm, que provoca la
pérdida del potencial de membrana mitocondrial y la liberación de proteínas pro-
apoptóticas, como el citocromo c, desde el espacio intermembrana al citoplasma celular,
que iniciarán la cascada de reacciones que culminan en la apoptosis [194].

Una de las principales dianas de ERO es el ADN mitocondrial (ADNmt), que

codifica para 30 polipeptidos esenciales para la cadena de transporte de electrones y
generación de ATP por fosforilación oxidativa. El ADNmt es especialmente susceptible
debido a su proximidad a la cadena de transporte de electrones y a la falta de histonas
protectoras. Bajo condiciones de estrés oxidativo el ADNmt contiene un número de
entre 10 y 20 veces mayor de bases modificadas que el ADN nuclear. El daño oxidativo
en el ADN es la principal fuente de inestabilidad genómica de la mitocondria y conlleva
a la disfunción respiratoria, envejecimiento prematuro, aparición de cáncer y
enfermedades neurodegenerativas [195].

Un importante mecanismo de toxicidad del O2.⎯ es la oxidación directa e

inactivación de las proteínas hierro-azufre (Fe-S), tales como las aconitasas y las
asociadas liberación de hierro. La aconitasa mitocondrial, posee una centro Fe-S y juega
un papel importante en el ciclo de Krebs catalizando la conversión de citrato a
isocitrato. La inhibición de la aconitasa deriva en una disfunción del ciclo teniendo un
gran impacto en la producción energética y la viabilidad celular. Otra proteína Fe-S que
se ve afectada es la NADH deshidrogenasa del complejo I [196].

La relación entre ERO y apoptosis ha sido puesta de manifiesto en diversos

trabajos realizados por nuestro grupo de investigación. En concreto, ha observado que el

36
 Introducción

tratamiento de plaquetas con su agonista fisiológico trombina, genera H2O2 y

despolariza la membrana mitocondrial induciendo apoptosis, evento que queda inhibido
tras el tratamiento con catalasa. Cuando las plaquetas se trataron con H2O2 exógeno
aumentó significativamente la liberación de citocromo c de la mitocondria y la
activación de la caspasa-9, como consecuencia de tales eventos hubo un aumento en la
activación de la caspasa-3 y la externalización de la fosfatidil serina [140].
Adicionalmente, ha sido puesto de manifiesto que el tratamiento con H2O2 de células de
pancreatoma de rata AR42J induce un aumento en la [Ca2+], despolarización
mitocondrial, liberación de citocromo c y activación de caspasa-3 a través de un
mecanismo que requiere la recaptación mitocondrial de calcio [197]. En células
germinales, como los espermatozoides humanos expuestos a tratamiento con H2O2
hemos observado que existe un aumento de la activación de las caspasas 3 y 9 y
posterior externalización de fosfatidil serina, en un proceso calcio-dependiente [198].
De manera similar, los efectos del H2O2 en células leucémicas humana HL-60 tienen
efectos parecidos, ya que la inducción de la despolarización de membrana mitocondrial
y posterior activación de las caspasas-3 y -9 se llevaba a cabo por procesos calcio-
dependientes [199].

I. 3.5 EVASIÓN DE LA APOPTOSIS POR CÉLULAS TUMORALES

La resistencia que muestran las células tumorales a la apoptosis no implica una

completa evasión a la muerte, pudiendo ocurrir mediante senescencia o necrosis, a
través de vías independientes de caspasas.

Cuando las células tumorales se ven expuestas a la terapia combinada de estrés

térmico y a agentes quimioterapéuticos, presentan una tasa elevada de muerte en
comparación con las células que son únicamente tratadas con quimioterapéuticos [200].
Sin embargo, esto no sucede cuando las mismas células se exponen al calor antes del
tratamiento, ya que terminan por desarrollar resistencia [201].

Las células tumorales presentan algunas características comunes que las hacen
ser resistentes, como la sobreexpresión de las proteínas Bcl-2 [202], survivina [203] y
BAG, cuya localización nuclear durante la radioterapia está asociada a un mal
pronóstico [204].

37
 Ana M. Marchena

Son muchas y variadas las funciones que las HSP desempeñan en la apoptosis, y
aunque en la mayoría de los casos conduce a la inhibición de las vías apoptóticas, el
modo de actuación es complejo y controvertido. Curiosamente, las mismas señales de
estrés que desencadenan la apoptosis también estimulan la expresión y liberación de las
HSP. Sin embargo, la inducción de HSP reprime la apoptosis mediante la inhibición de
factores pro-apoptóticos, como p53, Bax, Bid, Akt, Apaf-1 y Bcl-2 [205]

La sobreexpresión de proteínas de estrés está implicada en la supervivencia de

las células tumorales [206]. HSP27, HSP70 y HSP90 aparecen en altas concentraciones
en células tumorales debido a su capacidad de inhibir la apoptosis [207]. En células no
tumorales p53 y p63 actúan como represores, inhibiendo la transcripción de genes HSP
al unirse a sus promotores [208]. Cuando aumenta la expresión de p53 se produce una
disminución de la proliferación celular, las células permanecen en la fase G1 cuando
deberían proseguir a fase S. En células tumorales se produce un aumento de la
transcripción de HSP debido a que disminuye la expresión de p53 y además aumenta la
expresión de los proto-oncogenes HER2 y c-Myc [209]. Algunos cánceres como
pulmón y mama, presentan mutaciones en p53 resultando en una resistencia a la
apoptosis [210].

Las HSP se asocian a indicadores de estrés o apoptosis y bloquean la muerte

celular, promoviendo supervivencia, proliferación o diferenciación. Pueden evadir el
proceso de apoptosis a varios niveles: regulando las vías de señalización anteriores a la
mitocondria, como la vía Akt; a nivel mitocondrial, controlando la liberación de
citocromo c; y, a nivel post-mitocondrial interactuando con el citocromo c o con
proteínas como Apaf-1 y/o Smac/DIABLO [211].

La sobreexpresión de HSP afecta tanto a la vía intrínseca como a la extrínseca,

previniendo la activación de caspasas, la agregación de proteínas y el daño mitocondrial
en respuesta a estímulos apoptóticos como la acumulación de ERO y daños en el ADN.
Por otro lado, la depleción de estas proteínas es suficiente para desencadenar el proceso
de apoptosis mediante activación de caspasa-3, incluso en ausencia de estímulo
apoptótico [211].

La sobreexpresión de HSP en células tumorales se relaciona también con

muchos procesos clave en la oncogénesis, como la autosuficiencia en señales de

38
 Introducción

crecimiento, la estabilización de proteínas mutantes, la angiogénesis y la metástasis

[212]. Las células tumorales que expresan HSF1 y HSP tienen una elevada tendencia a
invadir otros tejidos y extenderse [213]. Existe una correlación entre los niveles de
HSP27 y HSP70, y la capacidad de invasión y/o metastización tumoral. Ambas son
proteínas citoprotetoras con papeles esenciales en la aparición de células malignas al
evitar la muerte tanto por apoptosis como por senescencia [14].

Las células tumorales dependen en mayor medida de la actividad chaperona de

las HSP que las células sanas para la proliferación y supervivencia debido a que las
oncoproteínas en las células tumorales a menudo están mal plegadas y requieren de
ellas. Esto conduce al planteamiento de desarrollar inhibidores de HSP como posible
terapia del cáncer tanto en el tratamiento preclínico como en el clínico.

HSP27

HSP27 desempeña multitud de funciones durante el estrés celular que daría

respuesta a los efectos citoprotectores observados cuando aumenta la expresión de esta
proteína. Entre ellas se incluiría su papel como chaperona, la interferencia con los
mecanismos de activación de la caspasa o la modulación del estrés oxidativo.

En células estresadas con altos niveles de proteínas dañadas el aumento de la

expresión de HSP27 facilita su reparación promoviendo así la recuperación celular. o la
destrucción, si el daño es irreversible [214]. Esta capacidad de HSP27 puede aumentar
la tasa de supervivencia celular al limitar los niveles de proteínas mal plegadas que, en
última instancia, podría ser responsable de desencadenar la apoptosis. Además, como
chaperona molecular es responsable de la regulación de la apoptosis a través de su
interacción con Akt, ya que la activación de ésta última inhibiría la apoptosis [215].
Durante el estrés celular inducido por peróxido de hidrógeno y calor, la interacción
entre Akt y HSP27 puede contribuir al aumento de la resistencia a la apoptosis en
células que expresan niveles altos de HSP27 [216]

HSP27 también tiene la capacidad de interferir en los mecanismos de activación

de caspasas. Parece ser que HSP27 se concentra en la mitocondria de manera similar a
la proteína antiapoptótica Bcl-2, e incluso podría actuar de igual modo, inhibiendo la
apoptosis al prevenir la liberación del citocromo c desde el espacio intermembrana

39
 Ana M. Marchena

[217]. De este modo, HSP27 regula negativamente la activación de procaspasa-9 por su

incapacidad de interactuar con el citocromo c e impidiendo la correcta formación del
apoptosoma [218] HSP27 también puede inhibir la activación de la caspasa-3 al
interactuar con la procaspasa-3, posiblemente al evitar que caspasas iniciadoras como la
caspasa-9, tengan acceso a las dianas de procesamiento que activan la enzima (Figura
18) [219].

Figura 18. Regulación de la apoptosis por HSP27.

Fuente: Concannon et al. [220] Apoptosis (2003).

La generación de ERO desempeña un papel fundamental en la muerte celular

inducida por numerosos estímulos. Cuando una célula está expuesta a ciertos tóxicos,
como el TNF-α o el peróxido de hidrógeno, los niveles de ERO intracelulares aumentan
rápidamente debido a una disfunción mitocondrial [221]. En este aspecto, HSP27,
protege a las células de las ERO al modular y mantener los parámetros redox dentro de
ellas. Aunque HSP27 carece de actividad desintoxicante de ERO, puede aumentar los
niveles intracelulares de glutation, actuando como un sistema amortiguador que
previene la oxidación de proteínas [222].

HSP27 está presente en etapas específicas de desarrollo en diversos tipos de

cáncer como mama [223], ovario [224], leucemia [225], colon [226] o próstata [227].
Cuando su patrón de fosforilación aparece alterado, alcanzando altos niveles de HSP27
hiperfosforilada, se correlaciona con un mal pronóstico de cáncer [228]. En células

40
 Introducción

leucémicas se ha descrito como marcador de pre-diferenciación ya que su inducción se

produce en etapas tempranas [229]. El papel de HSP27 en la diferenciación puede
deberse a que su expresión aumenta a medida que las células alcanzan la fase no
proliferativa/quiescente en el ciclo celular (G0/G1).

La sobreexpresión de HSP27, no sólo potencia la capacidad tumorogénica [36],

sino también la de metastatizar [230]. Además, desempeña un papel fundamental en la
angiogénesis. La hiperfosforilación de HSP27, requisito para la remodelación del
citoesqueleto, es inducida por VEGF e inhibida por factores fisiológicos anti-
angiogénicos como la endostatina, la fumagilina o la trombospondina-1 [231].

 Inhibidores de HSP27

La inhibición de HSP27 surge en respuesta a sus efectos antiapoptóticos y a la

citoprotección que ofrece contra fármacos quimioterapéuticos [232].

Una de las estrategias más efectiva es el uso de oligonucleótidos antisentido o

siRNA, tanto en cultivos in vitro [233], como en xenoinjertos in vivo [234]. Otra de las
estrategias es actuar sobre los agentes moduladores que disminuyen la función
antiapoptótica de HSP27 [235]. Estos agentes poseen actividad antitumoral en tumores
que expresan altos niveles de HSP27 y pueden tener un potencial clínico significativo
[228].

Tiolutina, es un antibiótico azufrado que actúa como inhibidor de la

transcripción a través de diversas vías comprometiendo la estabilidad del ARNm y la
expresión génica [236]. Se ha visto que es capaz de inhibir la adhesión de células
endoteliales al impedir las interacciones entre HSP27 con componentes del
citoesqueleto como la actina y los filamentos intermedios [237]. Además, puede inhibir
la angiogénesis inducida por células tumorales in vivo mediante la adhesión de células
endoteliales a vitronectina [238].

41
 Ana M. Marchena

HSP70

HSP70 puede interaccionar con múltiples componentes de las vías apoptóticas,

tanto dependientes como independientes de caspasas.

HSP70 tiene la capacidad de interferir en los mecanismos de activación de

caspasas. Aunque el mecanismo exacto aún se desconoce, parece ser que HSP70 puede
asociarse directamente con Apaf-1 y bloquear la formación del apoptosoma, de este
modo regula negativamente la activación de procaspasa-9 [239].

También afecta a algunos factores de transcripción involucrados en la expresión

de la familia Bcl-2. Bcl-2 y Bax son objetivos transcripcionales de la proteína p53
supresora de tumores. La expresión de p53 induce apoptosis en respuesta al daño en el
ADN. Algunos estudios muestran como varios miembros de la familia HSP70,
inducidos (HSP70) o no (Hsc70), son capaces de estabilizar complejos con p53 mutada
y prevenir sus efectos apoptóticos [240]. Así como la presencia de HSP70 en
membranas lisosomales de células tumorales, inhibe la muerte asociada a
permeabilización de los lisosomas [241].

Actúa inhibiendo las proteínas kinasas que regulan la señal de apoptosis. La

regulación negativa de HSP70 facilita la activación de Ask1 inducida por H2O2 y la
subsiguiente apoptosis [242]. HSP70 también se une a JNK y evita su activación [243].

El papel de HSP70 en la regulación de la función NF-κB es más controvertido.

HSP70 citosólica podría inhibir el NF-κB, mientras que la HSP70 asociada a la
membrana plasmática podría activar este factor de transcripción [244] (Figura 19).

Es importante destacar que la actividad ATPasa de HSP70 no parece ser

necesaria para todas estas actividades, ya que la acción de la proteína sobre JNK y AIF
se produce independientemente de la hidrólisis de nucleótidos [245]. Ésta es una
observación a tener en cuenta ya que muchos inhibidores de HSP70 tienen como diana
la actividad ATPasa [246].

42
 Introducción

Figura 19. Regulación de la apoptosis por HSP70.

Fuente: Evans et al. [247] Journal of medicinal chemistry (2010).

Algunos tipos de células tumorales expresan receptores de HSP70 que median

en su internalización teniendo como consecuencia mayor supervivencia y crecimiento
celular [248]. La sobreexpresión de HSP70 potencia la tumorogénesis [249] y suele
relacionarse con tumores malignos en fase avanzada de endometrio [250], riñón [251],
mama [252] y cuello de útero [253].

 Inhibidores de HSP70

La inhibición de HSP70 se centra en dos objetivos fundamentalmente. Por un

lado, el uso de anticuerpos monoclonales de ratón cmHsp70, con capacidad de unión
específica a HSP70 localizada en la membrana de células tumorales [254]; y por otro, el
uso de compuestos químicos que tienen la capacidad de modular directamente la
actividad de HSP70, teniendo la posibilidad de combinarse con los agentes
quimioterapéuticos convencionales [255, 245].

Existen numerosos compuestos químicos que actúan como agentes inhibidores

de HSP70, como análogos de ATP [256], flavonoides [257], imidazoles [258] o
péptidos [259].

43
 Ana M. Marchena

El 2-feniletinesulfonamida (PES) o pifithrin-μ (P-μ), es una sulfonamida (Figura

20) que inhibe la apoptosis mediada por p53, evitando la unión de esta proteína a Bcl-
xL y Bcl-2 en la mitocondria [260]. Se ha visto que P-μ reduce la apoptosis inducida
por radiación γ, ejerciendo una acción protectora en el síndrome hematopoyético letal
[261]. P-μ también interactúa selectivamente con HSP70, donde se une a SBD,
impidiendo la asociación entre HSP70 y muchas de sus co-chaperonas y proteínas
sustrato [262, 263]. La terapia combinada de P-μ con metotrexato, fármaco contra el
cáncer que bloquea la síntesis de purinas y pirimidinas, parece aumentar de forma
sinérgica los efectos citotóxicos en las células de cáncer cervical [264].

Figura 20. Estructura química de pifithrin-μ.

HSP90

HSP90 responde a las señales extracelulares, principalmente aquellas

relacionadas con el desarrollo y renovación [265]. Fue descrita como "capacitadora de
la evolución", ya que permite la acumulación de proteínas mutantes con la consiguiente
aparición de nuevos fenotipos [266]. El papel fundamental de HSP90 en el desarrollo
tumoral queda demostrado por el alto grado de angiogénesis alcanzado durante su
sobreexpresión por el contrario, ésta cesa cuando se produce una inhibición de la
proteína [267].

HSP90 regula y estabiliza muchos factores de transcripción y kinasas implicados

en la apoptosis como p53, JNK, Her2, HIF1α, Raf-1 o Akt [268]. Cuando Akt se activa
puede fosforilar a Bad y a la caspasa-9, desencadenando la señal apoptótica [269]. Por
otra parte, Akt también puede fosforilar a la kinasa IkB, resultando en la activación de
NF-kB e induciendo supervivencia celular [270]. Otro ejemplo de regulación es el
oncogen HER2 en el cáncer de mama [271]. El factor tumorogénico herregulina-β1 se
une a la superficie de las células de cáncer de mama, elevando la expresión de HER2
que al final resulta en la activación de HSF1 y la sobreexpresión de HSP, conduciendo a

44
 Introducción

la supervivencia celular [272]. HER2 se expresa en grandes cantidades en cáncer de

pulmón [273], leucemias [274], próstata [275] y páncreas [276].

HSP90, al igual que HSP70, puede asociarse con Apaf-1 para inhibir la
formación de apoptosoma y la activación de procaspasa-9 [277].

También desempeña un papel importante en la propagación de la apoptosis a

partir de la membrana plasmática [278].

 Inhibidores de HSP90

La inhibición de HSP90 conduce a la degradación de muchas proteínas

implicadas en el desarrollo tumoral, por lo que algunos de sus inhibidores están siendo
probados en terapias anticáncer [279]. Entre ellos, se incluyen productos naturales como
el radicicol y la geldanamicina, así como los derivados semisintéticos de ésta última, el
17-N-alilamino-17-demetoxigeldanamicina (17-AAG) o tanespimicina y el 17-
dimetilaminoetilamino-17-demetoxigeldanamicina (17-DMAG) o alvespimicina (Figura
21). Independientemente de su naturaleza, todos ellos actúan uniéndose al extremo N-
terminal de HSP90, impidiendo la unión del ATP y dando lugar a la acumulación de
proteínas mal plegadas y/o desnaturalizadas que serán degradadas posteriormente [280].

Figura 21. Estructura química de geldanamicina, tanespimicina y alvespimicina respectivamente.

El radicicol es un antibiótico que induce diferenciación de las células HL-60 en

macrófagos [281], suprime la transformación de células NIH 3T3 por oncogenes como
src, ras y mos [282] y suprime la expresión de ciclooxigenasa-2 inducible por
mitógenos [283]. Como modulador de diferenciación celular tiene actividad anti-

45
 Ana M. Marchena

angiogénica in vivo, inhibiendo la proliferación y la producción de activador de

plasminógeno por las células endoteliales vasculares [284].

La geldanamicina es un antibiótico de la familia de las ansamicinas que se aisló

originalmente como un compuesto natural con actividad antifúngica. Se une
específicamente a ABD, ocupando el sitio de unión del ATP de HSP90 e inhibiendo la
actividad ATPasa [285]. Esta unión impide los cambios conformacionales necesarios
para el correcto funcionamiento como chaperona, desregulando las funciones de
plegamiento y degradación de proteínas [286]. La formación de complejos Hsp90 -
proteína sin plegar, y su acumulación, activa el sistema ubiquitina/proteosoma para su
degradación [287]. Entre las proteínas cliente de HSP90 que se ven afectadas se
incluyen una amplia variedad de proteínas de transducción de señales que participan en
la regulación del ciclo celular, el crecimiento, la supervivencia, la apoptosis y la
oncogénesis, como las proteínas quinasas y los receptores de hormonas esteroideas,
reduciéndose considerablemente la señalización intracelular y provocando la muerte de
la célula tumoral [288, 289].

La geldanamicina impide la interacción entre HSP90 y HSF1. HSP90 es el

mayor represor de HSF1 y cuando no forma complejo con él permanece libre, pudiendo
activar la síntesis de otras HSP [290]. También induce la degradación selectiva de
proteínas mutadas involucradas en el desarrollo de tumores como v-Src, Bcr-Abl y p53
[291].

A pesar de todas las ventajas que presenta la geldanamicina su uso como

fármaco se ve limitado al presentar una elevada hepatotoxicidad [292]. El desarrollo de
análogos como tanespimicina o alvespimicina, que poseen diferentes sustituyentes en la
posición 17, puede ser la solución al problema que presenta la geldanamicina, ya que
presentan las mismas características con la ventaja de tener menor toxicidad [293].

17-AAG o tanespimicina, se presenta como un fármaco antitumoral [294]. Se ha

comprobado que 17-AAG puede detener el ciclo celular e inducir apoptosis mediante la
activación caspasas en linfoma [295] glioblastoma [296] y en células miogénicas [297].
También se ha mostrado efectivo en terapias combinadas con quimioterapéuticos, como
doxorrubicina frente a cáncer de mama HER+ [298], cisplatino frente al carcinoma de

46
 Introducción

células escamosas esofágicas [299] o tipifarnib frente a leucemia monocitaria aguda

[300].

17-DMAG o alvespimicina se ha mostrado efectivo en los modelos preclínicos,

teniendo efectos terapéuticos en pacientes con tumores sólidos, tumores sólidos
avanzados o leucemia mieloide aguda [301]. Al igual que los otros inhibidores de
HSP90, 17-DMAG tiene acción antitumoral al inducir diferenciación y apoptosis en la
leucemia linfoide aguda [302] y cáncer de mama [303]. También se ha mostrado
efectivo en el cáncer de páncreas al combinarlo con los quimioterapéuticos gemcitabina
y 5-fluoruracilo [304]. El 17-DMAG puede suprimir también el proceso inflamatorio al
interferir en la señalización a través de la vía NF-κB [305].

HSP60 / HSP10

A pesar de que todas las actuaciones de los miembros de la familia HSP

anteriormente vistos están destinadas a la atenuación/inhibición de la apoptosis, algunos
miembros como HSP60 y HSP10, pueden ejercer una regulación tanto positiva como
negativa de la vía intrínseca [306].

HSP10 forma un complejo en con HSP60 para regular la unión del sustrato y la
actividad ATPasa de ésta última. La mayoría de ellas (60–80%) se localizan en la
mitocondria, donde participan en el plegamiento de las proteínas mitocondriales [307].

Figura 22: Interacción entre HSP60 y Bax

Fuente: Gupta et al. [308] Journal of cellular and molecular medicine (2005).

47
 Ana M. Marchena

El papel de HSP60/HSP10 en la apoptosis no está claro del todo. Por una parte,
puede desempeñar una acción pro-apoptótica al ejercer su función como chaperona,
promoviendo la activación de caspasa-3 al formar un complejo multiproteico con ella
[309, 310].

Por contra, la sobreexpresión combinada de HSP60 y HSP10 ejerce una acción

citoprotectora que se asocia con una disminución en la liberación de citocromo c, la
actividad caspasa y la fragmentación del ADN [311]. Parece ser que HSP60 actuaría de
manera similar a HSP70, es decir, reclutando y manteniendo a BAX en el citosol en una
conformación inactiva, regulando así su función (Figura 22). Además, la sobreexpresión
de HSP60 y HSP10 conduce a un aumento en los mecanismos antiapoptóticos
postranscripcionales vía Bcl-2 y Bcl-xL [308].

I. 3.6 AGENTES QUIMIOTERAPEÚTICOS

Un agente quimioterapéutico o quimioterápico, es un compuesto químico

utilizado para tratar el cáncer, asignando el nombre de quimioterapia al tratamiento. Las
terapias habituales contemplan el uso de agentes citotóxicos o una combinación de ellos
con el fin de mejorar la eficacia, aunque esto no siempre implica obtener los resultados
esperados pudiendo presentarse reacciones adversas.

Sería deseable conseguir una quimioterapia inteligente mediante el uso de

fármacos que tengan como diana exclusiva las células tumorales, sin que afecte a las
células sanas. Este método mejoraría la eficacia del tratamiento, la tolerancia y los
resultados [312].

5-FLUOROURACILO

El 5-fluorouracilo (5-FU) se incluye dentro de los fármacos antimetabolitos

antineoplásicos que inhibe o compite con un metabolito específico en el tratamiento
del cáncer. Heidelberger y colaboradores fueron los primeros en estudiar la actividad
biológica del 5-FU en tumores sólidos a finales de la década de los cincuenta, siendo
uno de los primeros fármacos utilizados en oncología debido a sus propiedades
citostáticas [313].

48
 Introducción

El 5-FU es un análogo del uracilo que posee un átomo de flúor en posición 5

(Figura 23). El 5-FU puede convertirse en 5-fluoroxiuridina monofosfato (F-UMP) a
través de la enzima timidina quinasa, que puede reemplazar el uracilo e incorporarse al
ARN, inhibiendo su procesamiento y por tanto el crecimiento celular [314]. Otro
metabolito, el 5-5-fluoro-2'-desoxiuridina-5'-O-monofosfato (F-dUMP), inhibe la
timidilato sintasa y provoca el agotamiento del trifosfato de timidina (TTP), nucleótido
esencial para la síntesis de ADN [315]. Otros metabolitos del 5-FU pueden incorporarse
tanto al ARN como al ADN, interfiriendo en las funciones de ambos [316].

Figura 23. Estructura química de 5-FU.

El uso de 5-FU, ya sea en monoterapia o en terapias combinadas, altera la

correcta síntesis de proteínas, en particular proteínas estructurales del citoesqueleto y
HSP. La combinación de 5-FU y doxorubicina con inhibidores de HSP90 potencia los
efectos terapéuticos en el cáncer de páncreas [317]. También se ha visto que el perfil de
expresión de HSP27 está estrechamente relacionado con la terapia combinada de 5-FU y
cisplatino en el adenocarcinoma esofágico [318].

CITARABINA

También conocida como arabinósido de citosina (AraC), es un antimetabolito

antineoplásico que inhibe específicamente la fase S del ciclo celular.

La citarabina fue sintetizada por Walwick, Roberts y Dekker en 1959, basándose

en el descubrimiento de Bergman y Feeney de los nucleósidos espongouridina y
espongotimidina, procedentes de la esponja Cryptotethya cripta. No fue hasta 1968
cuando Ellison et al. [319] introdujo la citarabina en clínica para usarla como
tratamiento contra la leucemia.

49
 Ana M. Marchena

La citarabina es un análogo de la citidina, cuyo azúcar es arabinosa en lugar de

ribosa (Figura 24), siendo el primer fármaco utilizado contra el cáncer que modifica el
azúcar de los nucleósidos y no la base [320].

Figura 24. Estructura química de citarabina.

Dentro de la célula, la citarabina se transforma en citarabina-5-trifosfato (ara-

CTP) y compite con citidina por su incorporación al ADN. Debido a que la arabinosa
dificulta estéricamente la rotación de la molécula dentro del ADN, la síntesis del mismo
resulta inhibida durante la fase S del ciclo celular. Otro modo de actuación de la
citarabina es inhibiendo enzimas como las polimerasas, tanto de ADN como de ARN, o
las nucleótido reductasas que resultan indispensables para la síntesis de ADN [321].

Se utiliza para el tratamiento de la leucemia mieloide aguda [322], leucemia

mieloide crónica [323], la leucemia meníngea [324], la eritroleucemia [325] y los
linfomas no hodgkinianos [326]. No siendo muy útil en tumores sólidos [327]. También
posee acción antiviral y puede utilizarse para el tratamiento de la infección por
herpesvirus generalizada sin embargo, al no ser selectiva puede causar supresión de la
médula ósea y otros efectos secundarios graves [328].

ETOPÓSIDO

Etopósido o VP-16, es una podofilina semisintética que contiene un residuo de

D-glucosa (Figura 25). Deriva de la podofilotoxina procedente de la mandrágora
silvestre, Podophyllum peltatum. Se sintetizó por primera vez en 1966 [329].

El etopósido actúa inhibiendo la enzima topoisomerasa II. Una de las funciones

de esta enzima es cambiar el grado de superenrollamiento del ADN mediante el corte de
ambas hebras. Cuando el etopósido se une a la topoisomerasa II y al ADN se forma un

50
 Introducción

complejo ternario estable que impide que los fragmentos de ADN vuelvan a unirse
[330]. Las células tumorales dependen de esta enzima en mayor medida que las células
no tumorales, ya que se dividen más rápidamente, causando daños en el ADN que
promueven la apoptosis de la célula tumoral [331].

Figura 25. Estructura química de etopósido.

Se utiliza para el tratamiento de la leucemia mieloide aguda [332], leucemia

linfocítica aguda [333], cáncer de pulmón [334], cáncer de ovario [335] y cáncer
testicular [336].

I. 4 MELATONINA

La melatonina o N-acetyl-5-metoxitriptamina es una hormona que deriva del

aminoácido esencial triptófano y que está presente en casi todos los seres vivos, desde
algas hasta humanos [337]. Fue descubierta en la década de los 50’s por Lerner et al.
[338], que la aislaron a partir de pinealocitos bovinos.

La melatonina es una indolamina de pequeño tamaño (~232.28 kDa) y de

naturaleza lipófila (Figura 26). Es esencialmente secretada por la glándula pineal y cuya
concentración muestra un patrón de síntesis circadiano que se altera en caso de realizar
una pinealoctomía [339]. Aunque inicialmente su síntesis se atribuía exclusivamente a
la glándula pineal, su secreción se realiza en tejidos como retina [340], células
enterocromafines del intestino [341], plaquetas sanguíneas [342], células mononucleares

51
 Ana M. Marchena

de sangre periférica [343], células de medula ósea [344], piel [345] o tejido ovárico
[346].

Figura 26. Estructura química de la melatonina.

La ruta de biosíntesis de la melatonina se inicia con el aminoácido L-triptófano

procedente de la dieta, que se absorbe y distribuye por el torrente sanguíneo. En la
glándula pineal, el L-triptófano sufre una serie de transformaciones que dan lugar a la
serotonina o 5-hidroxitriptamina (5-HT). La serotonina se acumula y aumenta su
concentración en la pineal para dar finalmente melatonina [347].

La secreción de melatonina al medio extracelular se asume que, dada su

naturaleza lipófila, ocurre mediante difusión simple a través de la membrana de los
pinealocitos, pudiendo atravesar incluso la barrera hematoencefálica [348]. Un proceso
similar de secreción se podría atribuir al resto de tejidos productores de melatonina, en
estos casos la acción que ejerce la melatonina queda limitada al entorno, pudiendo ser
autocrina, intracrina y paracrina [349, 350]. En sangre la melatonina se transporta unida
a la albúmina [351].

Además de su producción endógena, el consumo de alimentos ricos en su

precursor triptófano induce un aumento de los niveles de melatonina en plasma
provocando la estimulación de las funciones inmunológicas innatas, la viabilidad y
capacidad antioxidante en heterófilos [352, 353] llegando además a mejorar el descanso
en tórtola collariza [354].

52
 Introducción

I.4. 1 MECANISMOS DE ACCIÓN DE LA MELATONINA

Acciones dependientes de la unión a receptores

Algunos de los efectos de la melatonina sobre la célula suceden por la unión de

la melatonina a los receptores de alta afinidad acoplados a proteínas G. Puesto que estos
receptores están localizados en la membrana plasmática, los efectos de regulación sobre
la célula acontecen mediante segundos mensajeros intracelulares como [Ca2+]i, GMPc,
diacilglicerol y proteína kinasa C o ácido araquidónico [355, 356].

El receptor de membrana acoplado a proteína G MT1 fue clonado por primera

vez por Ebisawa y colaboradores [357], posteriormente se identificaron los receptores
MT2 y Mel 1c. MT2 se expresa en diferentes tejidos que MT1, y Mel 1c no ha sido
identificado en mamíferos [358]. La melatonina también puede unirse al receptor
huérfano RZRα, el cual tiene 6 isoformas y pertenece a la superfamilia de receptores del
ácido retinoico RORα1, RORα2, RZRα y RZRβ [359]. Cuando la melatonina se une al
receptor huérfano se reprime la expresión del gen de la lipoxigenasa (LOX), enzima
implicada en la producción de ERO en el citosol [360]. En contraste con los receptores
anteriores, existe un receptor de melatonina de baja afinidad identificado y nombrado
por Dubocovich en 1995, conocido como MT3, antiguo ML2 [361]. Inicialmente se
pensó que este receptor estaba acoplado a proteína G, sin embargo estudios posteriores
lo identificaron como quinona reductasa II [362].

Los receptores se distribuyen por diversos tejidos del cuerpo humano como
cerebro [363], intestino [364], ovarios [365] y vasos sanguíneos [366]. Los receptores
neuronales del núcleo supraquiasmático y del hipotálamo participan en la regulación el
ciclo circadiano [367], en tanto que los receptores ubicados en tejidos periféricos están
involucrados en la regulación de la función cardiovascular y de la temperatura corporal
[368].

Acciones independientes de la unión a receptores

Adicionalmente, la melatonina realiza funciones independientes de sus

receptores, mediante su interacción directa con otras sustancias. Entre los compuestos

53
 Ana M. Marchena

que pueden unirse a la indolamina están la calmodulina y la calreticulina, proteínas que

modulan la actividad del Ca2+ [369]. La melatonina también actúa en la regulación de
algunas proteínas quinasas y otras enzimas como la enzima óxido nítrico sintasa
neuronal [370] o del citoesqueleto [371], aunque en la regulación del citoesqueleto se
ven también implicados los receptores de membrana [372].

Otra de las funciones de vital importancia es la capacidad que tiene la

melatonina de capturar radicales libre nocivos y eliminarlos [373]. Esta acción
antioxidante la realiza a través de la cesión de electrones al compuesto oxidante, tan
sólo es necesario la proximidad de ambos compuestos antes de que se produzca el daño
a las moléculas vecinas. Moléculas tales como ADN nuclear, proteínas y lípidos son
protegidas del estrés oxidativo gracias a la ubicuidad de esta indolamina. Se ha visto
que es capaz de neutralizar radical hidroxilo (·OH), anión peroxinitrito (ONOO-), el
oxígeno singlete (1O2), radical superóxido (O2. ⎯), peróxido de hidrógeno (H2O2), óxido
nítrico (.NO) y ácido hipocloroso (HClO). Asimismo, ciertos metabolitos generados de
la actuación de este indol como 3-hidroximelatonina cíclica, AFMK y AMK, tienen
capacidad para interaccionar con los radicales libres, ya que conservan alta capacidad
antioxidante y secuestradora [374].

Además de este efecto antioxidante directo, puede regular los niveles de .NO de
forma indirecta a través de su producción. Dicha síntesis se ve afectada por la inhibición
de la actividad de la enzima óxido nítrico sintasa neuronal (nNOS) debido a la
interacción de la melatonina con el complejo calcio-calmodulina [375]. Uno de sus
derivados, AMK, puede inhibir igualmente la actividad nNOS, lo que sugiere que los
efectos de la melatonina sobre nNOS tienen lugar, al menos en parte, a través de sus
metabolitos [375]. Paralelamente, la melatonina inhibe la expresión y actividad de la
oxido nítrico sintasa inducible (iNOS) y la óxido nítrico sintasa mitocondrial (mtNOS)
[376]. La LOX es otra enzima prooxidante en cuya regulación participa la melatonina.
Tanto a nivel farmacológico como fisiológico, la melatonina inhibe la acción de LOX
disminuyendo la producción de especies reactivas [377].

Por otro lado, se ha demostrado que la melatonina, tanto a dosis fisiológicas (nM
y pM) como farmacológicas (μM y mM), incrementa la expresión de genes y actividad
de las enzimas que constituyen el sistema antioxidante de la célula tales como

54
 Introducción

superóxido dismutasa (SOD), catalasa (CAT), glutation peroxidasa (GSH-Px), glutation

reductasa (GSH-Rd) y glucosa-6-fosfato deshidrogenasa (G6PD) [378]. Glutation
(GSH) es una molécula antioxidante que desempeña un papel fundamental en el control
del estado redox de la célula. GSH se oxida para neutralizar un oxidante potencialmente
tóxico generando disulfuro de glutation (GSSG). La relación GSH/GSSG se utiliza para
medir el estado redox de la célula, o en otras palabras, para medir el estrés oxidativo de
la misma. Puesto que la melatonina estimula en la actividad GSH-Px y GSH-Rd, tiene
gran influencia sobre el metabolismo de GSH en beneficio de su reciclaje cuando es
oxidado a GSSG y manteniendo el equilibrio GSH/GSSG. No obstante, se sabe que
también la melatonina promueve la síntesis de novo de glutation mediante la
estimulación de la enzima responsable de su síntesis [379]. De modo que mediante el
incremento de la expresión y la actividad de dichas enzimas, la melatonina reduce el
número de ERO protegiendo la célula frente al estrés oxidativo y sus consecuencias.

Evidencias experimentales de nuestro grupo de investigación indican que esta

indolamina potencia la capacidad antioxidante de heterófilos de la tórtola collariza tras
la administración tanto de melatonina como de triptófano, especialmente en individuos
ancianos que en condiciones de normales muestran niveles muy bajos de melatonina
circulante. Por lo tanto, la melatonina y su precursor podrían formar parte de
tratamientos frente a enfermedades o procesos que conlleven un excesivo daño
oxidativo [380].

I.4. 2 MELATONINA Y HSP

La melatonina estimula la síntesis de dos de las principales HSP con acción

antiapoptótica, HSP27 y HSP90, en células de carcinoma pancreático humano (PANC-
1) [381]. La melatonina disminuye la apoptosis inducida por estrés térmico a 43 ºC
durante 30 minutos en células HL-60, a través del receptor MT2 y de la activación de
HSP27 [382].

La melatonina puede modular la expresión de HSP70 y HSP90 en hepatocitos

expuestos a H2O2, lo que les permite ser tolerantes al estrés y aumentar su supervivencia
al alterar las funciones de ERK, Akt, y NFκB en las vías de transducción de señales
[383]. Asimismo, la melatonina aumentó la expresión de HSP90 a través del receptor

55
 Ana M. Marchena

MT1 en células espermáticas sometidas a procesos de congelación/descongelación,

aumentando así la viabilidad de esperma descongelado [384].

I.4. 3 MELATONINA Y APOPTOSIS

La melatonina tiene una naturaleza altamente lipofílica que le permite cruzar las
membranas celulares fácilmente y alcanzar cualquier compartimento subcelular,
incluyendo la mitocondria. Cabe destacar el hecho de que esta molécula tenga alta
afinidad y se acumule en altas concentraciones en este compartimento celular [385].

Se han localizado dos sitios de unión en la mitocondria, uno de ellos de baja

afinidad y asociado a la inhibición del PPTm, efecto que hace pensar que la melatonina
previene la apoptosis. El otro sitio de unión presenta alta afinidad y se localiza en el
complejo I, uno de los puntos principales de liberación de electrones [386]. Además, la
melatonina modula el flujo de electrones en el complejo IV, salvaguardando el potencial
de membrana e incrementando la producción de ATP, incluso puede interactuar con las
bicapas lipídicas estabilizando la membrana mitocondrial interna, efecto que junto con
las interacciones con los complejos I y IV podrían explicar, la mejora de la eficiencia de
la cadena de transporte de electrones [387]. Todo ello hace que se produzcan un menor
número de ERO, protegiendo a la célula de posibles daños oxidativos en lípidos,
proteínas y ADN que podrían iniciar los procesos apoptóticos en la célula, tanto
activando caspasas, como causando fragmentación de ADN mediante DNasas.

Por otro lado, la disfunción mitocondrial conduce a la pérdida del potencial de

membrana mitocondrial, disminución de la producción de ATP e iniciación de procesos
apoptóticos, incluida la apertura del PPTm que confiere a la membrana externa la
permeabilidad necesaria para la salida de factores proapoptóticos. En este sentido,
cuando la cardiolipina, anclada a la membrana interna mitocondrial, sufre peroxidación
rompe la unión al citocromo c, el cual, en condiciones de permeabilidad de la membrana
externa, puede liberarse al citosol induciendo la activación de caspasas y así iniciar la
apoptosis intrínseca. Daños irreparables por estrés oxidativos en el ADN harían que el
factor de transcripción p53 activase la transcripción de genes que codifican para
proteínas pro-apoptóticas como NOXA, PUMA o BAX [388].

56
 Introducción

Estudios realizados por nuestro grupo de investigación han demostrado que la

melatonina retrasa la apoptosis inducida por estrés reticular debido a incrementos en la
concentración de calcio citosólico ([Ca2+]c). Se sabe que los incrementos en la [Ca2+]c
tiene una repercusión directa sobre la [Ca2+] mitocondrial, es posible que el papel
protector desempeñado de la indolamina sea a nivel mitocondrial en neutrófilos y
linfocitos humanos [389]. Adicionalmente, cuando leucocitos humanos tratados con
movilizadores de calcio se preincubaron con melatonina, los eventos apoptóticos que
acompañan el aumento de [Ca2+]c, como la activación de Bax, liberación de citocromo c
y la consecuente activación de las caspasas -9 y -3, fueron revertidos, observándose una
recuperación de la viabilidad celular con respecto a aquellos leucocitos que no fueron
preincubados con melatonina [390].

Por otra parte, diferentes estudios experimentales ponen de manifiesto que la

melatonina es capaz de aumentar la señalización de las rutas de supervivencia de la
célula, como la expresión de sirtuina 1 y NF-κB, además el factor antiapoptótico Bcl-xL
o la acetilación de p53, hechos que se vieron aumentados tras el tratamiento con
melatonina [391].

Durante el tratamiento contra el cáncer, la aplicación de la mayoría de agentes

quimioterapéuticos o radiación terapéutica inducen un aumento de la producción de
ERO, con el consecuente daño celular y tisular. Está ampliamente documentado que la
melatonina puede proteger a las células sanas contra los efectos nocivos de estas
terapias [392]. De manera que, la administración de quimioterapéuticos combinados con
melatonina se considerara en ocasiones para atenuar los efectos secundarios de dicho
tratamiento.

Efectos apoptóticos de la melatonina en células tumorales

Durante la primera parte del siglo XX Engel y Bergmann [393, 394], así como
Hofstätter [395] realizaron estudios pioneros tanto experimentales como clínicos sobre
la capacidad antineoplásica de la glándula pineal bovina. Posteriormente Lapin en los
años setenta llevó a cabo importantes estudios experimentales. Fue ella quien organizó
el primer workshop internacional que relacionaba la glándula pineal y el cáncer. Allí,
gracias a los resultados procedentes de diferentes autores se pudo concluir que el papel

57
 Ana M. Marchena

del indol melatonina era muy importante con respecto a la incidencia del desarrollo de
tumores [396]. Una conclusión central de los estudios de Lapin fue que la pinealectomía
estimula el crecimiento del tumor primario y la formación de metástasis lo que conduce
a un descenso de supervivencia [397]. Tal hallazgo concordaba con las observaciones
de otros investigadores, incluso con las de Bindoni [398] quien observó que la
pinealectomía estimula la división celular de los tejidos normales. Sin embargo, los
mecanismos por los que la melatonina inhibe el crecimiento tumoral o induce apoptosis
en células tumorales se desconoce aún. Evidencias experimentales recientes han
mostrado que el papel que desempeña la melatonina es de suma relevancia, ya que se ha
observado que los pacientes con cáncer presentan niveles reducidos de melatonina en
sangre [399].

El crecimiento tumoral es considerado como el desbalance entre la proliferación

y la muerte celular. De este modo, tanto la modulación del ciclo celular como la
inducción de la apoptosis son dos factores a tener en cuenta en el control del
crecimiento del tumor [400]. En contraste con la capacidad antiapoptótica en células no
tumorales, la melatonina tiene un comportamiento muy diferente en células cancerosas,
debido a que la melatonina induce apoptosis en una amplia variedad de células
tumorales a través de diferentes mecanismos de señalización celular [401].

El tratamiento con melatonina de la línea celular leucémica HL-60 provoca un

arresto del ciclo celular de G1 a S a favor del aumento de la fase hipodiploide. Un
aumento de la proteína pro-apoptótica Bax y disminución de la anti-apoptótica Bcl-2
causa la permeabilización de la mitocondria, favoreciendo así el inicio de la apoptosis
intrínseca. Los eventos apoptóticos acontecidos no parecen estar mediados por los
receptores MT1/2 acoplados a proteína G [402].

La melatonina puede inhibir el crecimiento tumoral al promover la apoptosis vía

proteínas MAPK en la línea celular de cáncer de próstata LNCaP. El tratamiento con el
indol activa a JNK y p38 kinasa, mientras que la kinasa regulada por señales
extracelulares, ERK, no mostró variaciones frente al tratamiento [403]. Similares
resultados se obtuvieron en hepatocarcinoma HepG2, donde la melatonina produjo un
arresto del ciclo celular mediado por la activación de JNK 1, 2 y 3 y p38. El tratamiento

58
 Introducción

implica además, la activación de la expresión de p53 sensible a daño en el ADN, que a

su vez activa a p21 inhibiendo a CDK y parando la progresión del ciclo celular [404].

La melatonina puede ejercer un efecto oncostático a través de los receptores

MT1/2, comportándose como un Modulador Selectivo de Receptor de Estrógenos
(SERM). En este caso se inhibe la expresión del gen que codifica para el receptor de
estrógenos α (REα), responsable de la proliferación de este tipo de tumores. Las
propiedades antiestrogénicas de la indolamina le confieren a esta molécula efecto
oncostático en aquellos tumores estrógeno-dependientes, tales como cáncer de mama,
ovario o útero [405].

Otro mecanismo que intenta explicar la acción antiestrogénica de la melatonina

tiene en cuenta que la melatonina se une a la calmodulina e inactiva el complejo
calmodulina/Ca2+. La calmodulina actúa como modulador de la actividad
transcripcional de REα, pero no de REβ, de manera que la sensibilidad a la melatonina
depende de la cantidad de REβ que se exprese [406, 400].

Del mismo modo que la mitocondria es considerada por la melatonina como

diana de sus acciones de supervivencia, es también una diana para la melatonina a la
hora de inducir la muerte en células tumorales. Diferentes grupos de investigación
concluyen que la melatonina provoca en la mitocondria perdida del potencial de
membrana, generación de especies reactivas de oxígeno, permeabilización de membrana
y salida de factores proapoptóticos mitocondriales. Estudios desarrollados en la línea
celular de cáncer de mama MCF-7, demuestran que el indol provoca un
desacoplamiento de la fosforilación oxidativa regulado por la acción de sus receptores
de membrana acoplados a proteína G [407]. Experimentos realizados en la línea celular
linfoblática RAMOS-1 indicaron que el tratamiento con melatonina induce activación
de la vía apoptótica dependiente de mitocondria mediante la despolarización de
membrana mitocondrial, liberación de citocromo c y disminución de Bcl-2 y posterior
activación de caspasa-3 y fragmentación de ADN [408]. Estudios en la línea de
pancreatoma AR42J indican que los efectos nocivos de la melatonina se deben a un
aumento de la [Ca2+] tanto citosólico como mitocondrial, activando así la caspasa-3 de
manera Ca2+-dependiente [409].

59
 Ana M. Marchena

El papel prooxidante de la melatonina en células tumorales está abalado por

varios estudios. En células de hepatocarcinoma HepG2 se ha visto que la melatonina
tiene un comportamiento dual dosis-tiempo dependiente. Así, a tiempos cortos y bajas
concentraciones ejerce una acción antioxidante y por contra, tratamientos largos con
altas concentraciones actúa de manera prooxidante, favoreciendo la generación de ERO,
depleción de GSH y descenso de viabilidad [410]. Se ha demostrado que esta
indolamina tiene una actividad prooxidante y disminuye los niveles de GSH y, por
tanto, aumenta las ERO en células leucémicas [411]. Sin embargo, en células
leucémicas U-937, se ha observado que aunque la existe depleción de GSH, no existe
modificación de la actividad glutation peroxidasa [412].

Ensayos realizados en células de glioma indican que la melatonina sensibiliza

estas células a la apoptosis inducida por TRAIL, este efecto parece estar mediado por la
activación de PKC y desactivación de Akt. Se conoce ampliamente que los receptores
TRAIL activados por TNFα reclutan dominios FADD y estos a su vez activan caspasa-
8, estos resultados podrían explicar la activación de la caspasa-8 en células de
hepatocarcionoma HepG2, puesto que descartaron un aumento de la expresión de Fas-L
[413].

Sin embargo, no todos los estudios realizados apoyan los efectos proapoptóticos
de la melatonina en células tumorales. Existen algunos, que aunque minoritarios,
discrepan de manera parcial o total en la capacidad del indol para inducir apoptosis en
células tumorales o inhibición del crecimiento tumoral. El grupo de Ghibelli en
diferentes ocasiones sostiene que la melatonina induce ERO en células tumorales tales
como U-937, linfoma de Burkitt BL-41 y astrocitoma, pero en ningún caso presentando
efectos tóxicos, sino por el contrario, aumentando la resistencia a la muerte celular
[414]. De igual modo, Pirozhok asegura que la melatonina no juega un papel
prominente en el crecimiento de líneas celulares de cáncer de próstata [415], mientras
que Cos afirma que la melatonina reduce la proliferación de células tumorales
mamarias, pero no existe una clara inducción de apoptosis [416]. Así mismo,
Chetsawang describió cómo la melatonina preserva las células de neroblastoma de la
línea SH-SY5Y de la muerte inducida por peróxido de hidrógeno [417].

60
 Introducción

I.4. 4 MELATONINA Y AGENTES QUIMIOTERAPÉUTICOS

Diversos estudios han destacado el carácter pleitrópico de la melatonina como

molécula reguladora de numerosos procesos fisiológicos mediante su implicación en
diferentes mecanismos moleculares. Sin duda, una de las particularidades más
interesantes de esta molécula es su carácter discriminatorio frente a células sanas y
células tumorales, actuando como agente citoestático y citotóxico sobre estas últimas.
Por sí misma, la melatonina disminuye la incidencia de tumores y limita su crecimiento
in vivo al inhibir la proliferación de las células tumorales e interferir en el
comportamiento metastásico [418, 419], tal como revelan estudios en líneas celulares de
cáncer de mama [420] y modelos animales [421] sin apenas producir efectos adversos
[422].

Los efectos inhibitorios de la melatonina se han descrito para numerosos tipos de

cáncer, como el cáncer de mama [423], el cáncer gástrico [424], el carcinoma de ovario
[425], el carcinoma ductal pancreático [426], leucemia [427] y el carcinoma pulmonar
[428]. En la mayoría de ellos los resultados son positivos tanto en condiciones
experimentales in vitro e in vivo [418]. Los resultados surgidos en los últimos años
también sugieren que la melatonina, ya sea sola o junto con la quimioterapia en
pacientes con cáncer diagnosticados con tumores sólidos avanzados, además de mejorar
los resultados de la regresión del cáncer y la esperanza de vida, ayuda a los pacientes a
tolerar mejor la quimioterapia [429].

La terapia combinada de melatonina con agentes quimioterapéuticos refuerza la

citotoxicidad y la apoptosis estimulada por estos agentes. Así, se ha visto que en
estudios donde se aplicó la terapia combinada de melatonina y el agente
quimioterapéutico etopósido (VP-16) no sólo inhibe el crecimiento de las células
tumorales de hepatocarcinoma en comparación con la monoterapia, sino que además
reduce la toxicidad provocada por el agente quimioterapéutico; pudiendo considerar la
melatonina como potencial tratamiento adyuvante para la quimioterapia y la
radioterapia [430, 431].

Otro ejemplo es el tratamiento con citarabina, donde su uso combinado con la

melatonina en ratas redujo su toxicidad y minimizó el daño producido en médula ósea,

61
 Ana M. Marchena

mejorando los recuentos de todos los tipos celulares en sangre periférica así como el
porcentaje de proteínas totales séricas [432].

El efecto potenciador resultante de la combinación de la melatonina con agentes

quimioterapéuticos ha sido estudiado por nuestro grupo de investigación. En concreto,
ha observado que el tratamiento de 5-fluorouracilo, cisplatino, y doxorubicina junto con
melatonina favorecen la citotoxicidad y la apoptosis inducida por los agentes
quimioterapéuticos en la línea celular AR42J de tumor pancreático de rata [433].
Asimismo, el tratamiento de 5-fluorouracilo y cisplatino combinados con melatonina,
lograron promover acciones citotóxicas y apoptóticas mediadas por la transducción de
señales provocada por la estimulación del receptor MT3, en las líneas celulares HT-29
de adenocarcinoma de colon y HeLa de cáncer cervical [434]. Por otro lado, los
hallazgos sobre el efecto quimiosensibilizante in vitro de la melatonina junto con
cisplatino en las neoplasias malignas del tracto genital femenino parecen ser bastante
consistentes, lo que sugiere que la indolamina podría aplicarse potencialmente como un
agente coadyuvante para mejorar el efecto de la quimioterapia [435, 436]. En resumen,
nuestros resultados indican que la melatonina utilizada in vitro potencia la toxicidad e
incrementa la muerte de las células tumorales, pudiendo considerarse como un potente
agente sinérgico que proporciona un tratamiento eficaz frente al cáncer cuando se
combina con los agentes quimioterapéuticos clásicos.

La melatonina es una hormona con acción anticancerígena efectiva en la

prevención y el tratamiento de diversos tipos cáncer. Aun así, hay que considerar que no
todos los estudios realizados hasta la fecha apuntan a la melatonina como una molécula
que mejore la esperanza de vida y reduzca los efectos adversos de la quimioterapia
[437, 438]. Se ha visto que en pacientes con cáncer avanzado de pulmón o
gastrointestinal la melatonina no mostró ningún efecto beneficioso, por lo que su valor
como adyuvante sigue siendo dudoso [437]. Aunque muchos de los resultados
preliminares y la seguridad de la melatonina hacen considerar a esta hormona como una
posible terapia combinada en el tratamiento contra el cáncer, los datos de los que se
disponen en la actualidad son limitados y los obtenidos en humanos prácticamente
inexistentes, por lo que se requiere de investigaciones adicionales [439].

62
II. OBJETIVOS
 Objetivos

A pesar de los estudios y los avances en el diseño de nuevas terapias, el

desarrollo de quimioresistencia por parte de las células tumorales sigue siendo una
materia pendiente. Las HSP dentro de la célula desempeñan un papel esencial en la
protección conformacional y funcional de las proteínas celulares. Sin embargo, en
células tumorales confieren una sobre-tolerancia a estrés, suponiendo un frente de
resistencia a superar. Las terapias combinadas suponen una ventaja en el tratamiento del
cáncer frente a las monoterapias, ya que combinan diversas estrategias moleculares para
inducir apoptosis en la célula tumoral. Por ello, el OBJETIVO PRINCIPAL de esta
Tesis Doctoral es estudiar las terapias combinadas antileucémicas basadas en las
proteínas HSP como diana principal.

Para abordar este objetivo hemos dividido este trabajo en 3 OBJETIVOS

PARTICULARES:

1. Estudiar la implicación de las proteínas de choque térmico HSP70 y HSP90 en

la resistencia a la hipertermia de las células de leucemia monocitaria aguda U-
937.

2. Investigar las posibles acciones de la hipertermia cuando se utiliza en

tratamientos combinados con agentes antileucémicos cuyos mecanismos de
acción estén basados en la inducción de estrés oxidativo y/o daño en el ADN.

3. Esclarecer el papel de las proteínas de choque térmico HSP70 y HSP90 en las

terapias combinadas de melatonina y agentes quimioterapéuticos en células de
leucemia monocitaria aguda U-937.

65
III. MATERIALES Y MÉTODOS
 Materiales y Métodos

III.1 LISTA DE REACTIVOS

III.1. 1 LÍNEA CELULAR, MEDIOS DE CULTIVO Y SUPLEMENTOS

 Línea celular de Leucemia Monocitaria Aguda U-937 (European Collection

of Cell Cultures - ECACC - ; Salisbury, Reino Unido).
 Medio RPMI-1640 (Lonza Ibérica S.A.U.; Barcelona, España).
 Albumina de suero bovino (Lonza Ibérica S.A.U.; Barcelona, España).
 Estreptomicina/Penicilina (Lonza Ibérica S.A.U.; Barcelona, España).
 L-Glutamina (Lonza Ibérica S.A.U.; Barcelona, España).

III.1. 2 TRATAMIENTOS

 Geldanamicina o GA (Enzo; Barcelona, España).

 Tanespimicina o 17-AAG (Enzo; Barcelona, España).
 Pifithrin-µ o P-µ (Enzo; Barcelona, España).
 Peróxido de hidrógeno (Sigma Aldrich S.A.; Madrid, España).
 Melatonina (Sigma Aldrich S.A.; Madrid, España)
 5-fluorouracilo (Sigma Aldrich S.A.; Madrid, España).
 Citarabina (Sigma Aldrich S.A.; Madrid, España).
 Etopósido o VP-16 (Sigma Aldrich S.A.; Madrid, España).

III.1. 3 ANTICUERPOS

 β-actina: anti-mouse, dilución 1:1000 (Cell Signaling Technology; Leiden,

Holanda).
 HSP70: anti-mouse, dilución 1:250 (Santa Cruz Biotechnology; Santa Cruz,
California).
 HSP90 α/β: anti-mouse, dilución 1:500 (Santa Cruz Biotechnology; Santa
Cruz, California).
 HSP27: anti-mouse, dilución 1:1000 (Cell Signaling Technology; Leiden,
Holanda).
 HSF-1: anti-rabbit, dilución 1:1000 (Cell Signaling Technology; Leiden,
Holanda).

69
 Ana M. Marchena

 Caspasa-3: anti-rabbit, dilución 1:1000 (Cell Signaling Technology; Leiden,

Holanda)
 Caspasa-3 clivada: anti-rabbit, dilución 1:250 (Cell Signaling Technology;
Leiden, Holanda).
 Caspasa-8: anti-mouse, dilución 1:250 (Cell Signaling Technology; Leiden,
Holanda).
 Caspasa-9: anti-mouse, dilución 1:250 (Cell Signaling Technology; Leiden,
Holanda).
 Anti-rabbit, dilución 1:1000 y 1:5000 (GE Healthcare, little Chalfont, UK).
 Anti-mouse, dilución 1:1000 y 1:5000 (GE Healthcare, little Chalfont, UK).

III.1. 4 OTROS REACTIVOS

 Ácido etilendiaminotetraacético (EDTA; Sigma Aldrich S.A., Madrid,

España).
 Albumina de suero bovino (BSA) (Sigma Aldrich S.A., Madrid, España).
 Azida sódica (Sigma Aldrich S.A., Madrid, España).
 Azul Tripano o Trypan Blue (Sigma Aldrich S.A.; Madrid, España).
 Azul-bromofenol (Sigma Aldrich S.A., Madrid, España).
 Bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-ilo)-2,5-difeniltetrazol o MTT (Sigma
Aldrich S.A.; Madrid, España).
 Chaps (Sigma Aldrich S.A., Madrid, España).
 Cloruro potásico (KCl; Panreac, Castellar del Vallés, España).
 Cloruro sódico (NaCl; Panreac, Castellar del Vallés (Barcelona), España).
 Dimetilsulfóxido o DMSO, (Panreac; Barcelona, España).
 DL-ditiotreitol (DTT; Sigma Aldrich S.A., Madrid, España).
 Fosfato potásico monobásico (KH2PO4; Panreac, Castellar del Vallés
(Barcelona), España).
 Fosfato sódico (Na2HPO4; Panreac, Castellar del Vallés, Barcelona, España).
 Glicerol (Sigma Aldrich S.A., Madrid, España).
 Glicina (Sigma Aldrich S.A., Madrid, España).
 HEPES (Sigma Aldrich S.A., Madrid, España).
 Hoechst 33342 (Life Technologies S.A.; Eugene, USA).

70
 Materiales y Métodos

 MES (Sigma Aldrich S.A., Madrid, España).

 Mini-PROTEAN precastgels (Bio-Rad, Barcelona, España).
 Nonidet-P40 (Sigma Aldrich S.A., Madrid, España)
 Pierce™ ECL Western Blotting Substrate (ThermoFisherScientific,
Rockford, EEUU).
 Reactivo Bradford (Bio-Rad, Barcelona, España).
 Sacarosa (Sigma AldrichS.A., Madrid, España)
 Tampón de electroforesis - TGS (Bio-Rad, Barcelona, España).
 Tampón de transferencia - TG (Bio-Rad, Barcelona, España).
 Tris/HCl (Sigma Aldrich S.A., Madrid, España).
 Tritón (Sigma Aldrich S.A., Madrid, España).
 Trizma-base (Sigma Aldrich S.A., Madrid, España).
 Tween 20 (Sigma Aldrich S.A., Madrid, España).

III.2 CULTIVO DE CÉLULAS U-937

La línea de células de leucemia monocitaria aguda U-937 se cultivó en medio

RPMI-1640 suplementado con un 10% de suero bovino fetal (FBS), 2 mM de L-
glutamina y 100 U/mL de antibiótico estreptomicina/penicilina a 37 ºC y en atmósfera
húmeda con 5% de CO2 y 95% de O2 (Memmert, ICO). El cultivo se hacía crecer en
suspensión de manera exponencial en flask con tapón ventilado de 25 cm2 con una
concentración celular entre 0,1 x 106 y 1 x 106 células/mL, revisando que su tiempo de
duplicación, característico de este tipo celular, fuera de 24 horas.

El pasaje celular se realizaba en condiciones de esterilidad en una campana de

flujo laminar (CYTOSTAR Telstar; Terrassa, España). La concentración celular de
trabajo se ajustó a 1 x 106 células/mL, controlando su densidad mediante recuento en
cámara de Neubauer. La mortalidad de las células se analizó mediante la exclusión de
azul tripano. Sólo se consideró una mortalidad inferior al 5% como apta para la
realización de los experimentos.

71
 Ana M. Marchena

III.3 METODOLOGÍA

III.3. 1 INDUCCIÓN DE ESTRÉS TÉRMICO

Los cultivos celulares, control o pretratados, se sometían a 1 hora de estrés

térmico a 42 ºC en flask de poliestireno, y sumergiéndolos en un baño de agua
termostatizado hasta cubrir el nivel del cultivo (Figura 27). Al finalizar, se extraían las
alícuotas necesarias de cada tipo de muestra durante un periodo post-estrés de
recuperación de 1, 2, 4 y 6 horas a 37 ºC (Figura 28).

Figura 27. Inducción de estrés térmico a los cultivos celulares

ESTRÉS TÉRMICO RECUPERACIÓN

Condiciones T=0 T=1 T=2 T=4 T=6

pre-estrés 1 h a 42 ºC 1 h a 37 ºC 2 h a 37 ºC 4 h a 37 ºC 6 h a 37 ºC

Muestra
Muestra
Muestra
Muestra
Muestra
Muestra

Figura 28. Esquema experimental de inducción de estrés térmico

72
 Materiales y Métodos

III.3. 2 INDUCCIÓN DE ESTRÉS OXIDATIVO

Para la inducción de estrés oxidativo se utilizó peróxido de hidrógeno. Se partió

de un stock inicial comercial de peróxido de hidrógeno con una concentración 8 M
para obtener las concentraciones de 1 µM, 10 µM, 100 µM, 500 µM y 1 mM y se
determinó la viabilidad celular tras 1, 2, 4 y 24 horas de incubación con cada una de
las concentraciones ensayadas. Una vez estudiado el efecto dosis/tiempo dependiente
se eligió la concentración de 500 µM con un periodo de incubación de 6 horas.

Los cultivos celulares se sometieron a 6 horas de estrés oxidativo con 500 µM

de H2O2 en flask de poliestireno en un incubador a 37 ºC y 5% de CO2. A
continuación, se estudió el efecto de dicho estrés sobre la funcionalidad de las HSP
durante un periodo post-estrés de recuperación de 1, 2, 4 y 24 horas (Figura 29).

ESTRÉS RECUPERACIÓN
OXIDATIVO

Condiciones T=0 T=1 T=2 T=4 T = 24

pre-estrés 6 h con H2O2 1 h a 37 ºC 2 h a 37 ºC 4 h a 37 ºC 24 h a 37 ºC

Muestra
Muestra
Muestra
Muestra
Muestra
Muestra

Figura 29. Esquema experimental de inducción de estrés oxidativo

III.3. 3 TRATAMIENTO CON INHIBIDORES DE HSP

Los cultivos celulares se incubaron durante 24 horas a concentraciones de 100

y 500 nM con geldanamicina (GA) o tanespimicina (17-AAG), inhibidores de HSP90.
Pifithrin-µ (P-µ), inhibidor de HSP70, se incubó durante 24 horas a concentraciones de
1 y 5 µM. Finalmente, se establecieron las siguientes condiciones experimentales:
concentración de 500 nM y 24 horas de incubación para geldanamicina y
tanespimicina; y, concentración de 1 µM y 24 horas de incubación para pifithrin-µ.

73
 Ana M. Marchena

III.3. 4 TRATAMIENTO CON MELATONINA

Los cultivos celulares se incubaron con melatonina (Mel) durante 24 horas a una
concentración de 1 mM, en presencia o ausencia de los inhibidores de HSP70 y HSP90
y/o los agentes quimioterapéuticos citarabina, etopósido y 5-fluoruracilo.

III.3. 5 TRATAMIENTO CON AGENTES QUIMIOTERAPÉUTICOS

Los cultivos celulares se preincubaron con los agentes quimioterapéuticos

citarabina (50 µM), etopósido (50 µM) y 5-fluorouracilo (1 mM) durante 6 horas a 37
ºC en presencia o ausencia de los inhibidores de HSP70 y HSP90 y/o melatonina a las
dosis y tiempos anteriormente indicados.

III.3. 6 RECUENTO CELULAR

La proliferación celular se estudió mediante contaje celular con cámara de

Neubauer en microscopio invertido, el recuento se realizó al objetivo de 20x.
Adicionalmente se comprobó la supervivencia celular mediante tinción con azul tripano,
una mortalidad inferior al 5% se consideraba como apta para la realización de los
experimentos.

III.3. 7 ESTUDIO DE LA VIABILIDAD CELULAR

La viabilidad celular se determina mediante la técnica del bromuro de dimetil-

tiazolil-tetrazolio (MTT), basada en la capacidad de las células viables en reducir el
grupo tetrazolio del MTT por la acción de la enzima mitocondrial succinato-
deshidrogenasa, a un compuesto de color azul (formazán). La reducción enzimática de
la sal de tetrazolio ocurre sólo en células activas metabólicamente, pero no en células
muertas, siendo por tanto un indicador de la funcionalidad mitocondrial. La cantidad de
células vivas es proporcional a la cantidad de formazán producido.

Las células se distribuyeron en eppendorfs 250 µL de la suspesión celular de

cada tipo de muestra, siendo la concentración del control de 106 células/mL
aproximadamente. Posteriormente se adicionaron 300 µL de una solución que contenía
50 µL del sustrato MTT ([stock] = 5 mg/mL) y 250 µL de medio RPMI-1640 sin
suplementar, a continuación, se incubaron durante 1 hora a 37º C y oscuridad.
Transcurrido este tiempo, se centrifugaron las muestras a 150 g durante 5 minutos.

74
 Materiales y Métodos

Posteriormente se retiró el sobrenadante mediante aspiración, y el pellet se resuspendió

en 300 µL de DMSO para disolver los cristales de formazán. Por último, se transfirieron
150 µL de cada tratamiento a una placa de 96 pocillos de poliestireno (Greiner Bio-
One) para su lectura en el lector de placa (Figura 30). La densidad óptica se cuantificó
en un lector de placas automático (NanoQuant Infinite M200; Tecan, Austria), a 530
nm, usando 630 nm como longitud de onda de referencia. Los datos obtenidos se
presentan como incrementos normalizados con respecto al control
(experimento/control).

Figura 30. Lector de placas y placa conteniendo las muestras para el estudio de viabilidad celular

III.3. 8 ESTUDIO DE LA MORFOLOGÍA APOPTÓTICA

La morfología apoptótica se estudió mediante la sonda fluorescente Hoechst

33342. Por su comportamiento lipófilo, este compuesto puede atravesar fácilmente
las membranas y unirse al ADN, permitiendo visualizar núcleos y mitocondrias. El
Hoechst 33342 se excita por luz ultravioleta con una longitud de onda de 350 nm y
emite fluorescencia azul/cían con un máximo de emisión de 461 nm. Cuando el
fluorógeno se une a la cromatina nuclear permite ver si el núcleo tiene morfología
apoptótica, en cuyo caso se aprecia un núcleo multilobular característico al
microscopio de fluorescencia.

Para su determinación, se depositaron 50 μL de suspensión celular de cada tipo

de muestra en una placa de poliestireno de 96 pocillos (Greiner Bio-One). A

75
 Ana M. Marchena

continuación, se añadió 1 μL/pocillo de Hoechst 33342 a la suspensión celular y se

dejó incubar durante 20 - 30 minutos a temperatura ambiente y oscuridad,
posteriormente se realizó el contaje celular en microscopio invertido de
epifluorescencia (Eclipse TS 100, Nikon; Barcelona, España) con el filtro azul/cian
(Figura 31). Los valores se expresan como porcentajes de células que contienen
núcleos con morfología apoptótica de 300 células mediante el contaje en diferentes
campos seleccionados al azar.

Figura 31. Microscopio invertido y campo con muestra para el estudio de la morfología apoptótica.

III.3. 9 CUANTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS TOTALES

La cuantificación de proteínas totales con el reactivo de Bradford se basa en la

unión de las mismas a un colorante, el Azul de Coomassie. Las proteínas van a unirse al
colorante en medio ácido, generando un complejo proteína-colorante y produciéndose
un viraje de color de marrón a azul, siendo proporcional la intensidad de color a la
concentración de proteínas.

La cantidad de proteína total se utilizó como referencia en la determinación de la

actividad caspasa y la cuantificación de proteínas específicas mediante western blotting.
Se depositaron 5 μL/pocillo de cada muestra en placa de 96 pocillos (GreinerBio-One)
sobre los cuales se adicionaron 100 μL del reactivo Bradford. Las mediciones de
absorbancia se realizaron en un lector de placas (Infinite M200; Tecan, Austria) a una
longitud de onda de 595 nm. La absorbancia de cada muestra es directamente
proporcional a la cantidad de proteína presente en ellas, estimándose mediante una

76
 Materiales y Métodos

curva de referencia con concentraciones 50 µg/mL, 100 µg/mL, 500 µg/mL y 1000
µg/mL de un estándar de proteína de albúmina de suero bovino (BSA).

III.3. 10 DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD CASPASA

Las caspasas tienen la capacidad de hidrolizar la unión de un fluoróforo de un

sustrato, pudiendo cuantificarse su actividad enzimática de manera directamente
proporcional a la fluorescencia que emite dicho fluoróforo cuando es liberado. Las
células se incuban con el sustrato específico para cada tipo de caspasa, que
habitualmente se conjuga con un radical fluorescente del tipo AMC (7-amino-4-
metilcumarina) para las caspasas 3 y 9. Las que las caspasas activadas pueden procesar
el enlace peptídico en el sustrato específico, liberando el radical fluorescente. La
fluorescencia es un indicador directamente proporcional a la actividad caspasa en el
ensayo, pudiéndose monitorizar mediante un lector de placas (NanoQuant Infinite
M200; Tecan, Austria) a una longitud de onda de excitación de 360 nm y una longitud
de onda de emisión a 460 nm.

Una suspensión celular de 2 x 106 células de cada muestra se centrifugó durante

5 minutos a 700 g. Los pellets se resuspendieron en 100 μL de tampón fostato salino
(PBS) para obtener una concentración aproximada de 2 x 106 células/100 μL. 15 µL de
suspensión reaccionaron con 50 µL del tampón de ensayo específico de caspasa (Tabla
4) en placa de 96 pocillos especiales para fluorescencia (Greiner Bio-One). La
fluorescencia emitida se monitorizó cada 3 minutos durante 40 minutos. La pendiente
de la fase lineal de la emisión de fluorescencia se consideró como valor relativo de
cinética enzimática de las caspasas. La actividad caspasa se estimó como el incremento
de la pendiente de la curva de tiempo de cada tratamiento con respecto a la
concentración de proteínas.

Tabla 4. Composición de los tampones de las caspasas

Buffer para caspasa 3 y 8 Buffer para caspasa 9

HEPES 0.1 M MES 0.1 M
Ajustar a pH 7.5 Ajustar a pH 6.5
Sacarosa 10% PEG 10%
Chaps 0.1% Chaps 0.1%

77
 Ana M. Marchena

III.3. 11 ANÁLISIS DE PROTEÍNAS POR WESTERN BLOTTING

La identificación y cuantificación de proteínas mediante western blotting, se

basa en una electroforesis discontinua en gel de poliacrilamida, que separa las proteínas
según la carga o/y el peso molecular de las mismas, seguida de una transferencia a una
membrana de nitrocelulosa. Finalmente, la proteína de interés se detecta mediante la
unión antígeno-anticuerpo, pudiendo cuantificarla por densitometría.

Preparación de las muestras: una suspensión celular de 2 x 106 células de cada

tipo de muestra se centrifugó durante 5 minutos a 700 g, los pellets se resuspendieron en
60 μL de tampón fostato salino (PBS) (Tabla 5) para obtener una concentración
aproximada de 2 x 106 células/60 μL. Para obtener los lisados celulares de las muestras
se utilizó un tampón de extracción, Laemmli’s buffer 2x suplementado con ditiotreitol
(DTT) al 5%, posteriormente cada muestra se sometió a un pulso de sonicación para
romper las células a 50 W/20 KHz durante 5 segundos (Vibra Cell, Sonics & Materials).
Las proteínas se desnaturalizaron hasta su estructura primaria mediante calor seco en
termobloque durante 10 minutos a 75 ºC. Por último, las muestras se centrifugaron
durante 5 minutos a 14000 g, quedando ya dispuestas para realizar la separación de las
proteínas.

Tabla 5. Composición del tampón fosfato salino (PBS)

NaCl 0,1370 M
KCl 0,0027 M
Na2HPO4 0,0122 M
KH2PO4 0,0018 M
Ajustar a pH 7.4

Cuantificación de las proteínas: la concentración de proteínas totales de cada

muestra se determinó mediante el método de Bradford, utilizando una curva con
concentraciones conocidas de BSA como referencia (ver apartado 3.9 Cuantificación de
proteínas totales por Bradford). De esta forma, se añadió la misma cantidad de
proteínas de cada muestra.

Electroforesis SDS-PAGE (electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecil

sulfato sódico): la separación de las proteínas se realizó atendiendo a su carga y a su
peso molecular mediante electroforesis (EPS 301; GE Healthcare Bio-Sciences, Suecia).

78
 Materiales y Métodos

Para ello las muestras procesadas se cargaron en un gel de poliacrilamida (Mini-

PROTEAN precast gels; BioRad, España) colocado en una cubeta de electroforesis
(Mini-PROTEAN Tetra; BioRad, España) y cubierto por el tampón de electroforesis
conteniendo SDS (Tabla 6). Posteriormente se somete a una corriente eléctrica inicial
de 100 V hasta que las muestras salen de los pocillos, pasando a 150 V hasta que el
frente de electroforesis recorre todo el gel.

Tabla 6. Composición del tampón de electroforesis

TGS 10x (Bio-Rad) 10%

Agua destilada 90%

Transferencia de proteínas: tras la electroforesis, se realizó una

electrotransferencia semiseca de las proteínas desde el gel de poliacrilamida a una
membrana de nitrocelulosa, ya que es un soporte mucho más manejable para las
siguientes etapas. El gel, la membrana y varias capas de papel de filtro se colocaron
formando un sándwich y se dispusieron en la unidad de transferencia junto con el
tampón de transferencia (Tabla 7) durante 90 minutos a 50 mA/cm2 (TE 77 PWR;
Amersham Bio-Sciences, Suecia).

Tabla 7. Composición del tampón de transferencia

TG 10x (Bio-Rad) 10%

Agua destilada 90%

Bloqueo de la membrana: antes de incubar la membrana con los anticuerpos

primarios específicos, se llevó a cabo un bloqueo de la misma para evitar uniones
inespecíficas. La membrana se mantuvo durante 1 hora en agitación suave con una
solución al 5% de leche desnatada en polvo en tampón tris salino – Tween 20 (TBST)
1x (Tablas 8 y 9).

Tabla 8. Composición del tampón tris salino – Tween (TBST) 10x

Tris-base 0.2 M
NaCl 1,37 M
Tween 20 1%
Ajustar a pH 7.6

79
 Ana M. Marchena

Tabla 9. Composición del tampón tris salino – Tween (TBST) 1x

TBST 10x 10 %
Agua destilada 90 %

Detección de la proteína de interés: el inmunoblotting se realizó con una

solución conteniendo el anticuerpo primario específico de la proteína a cuantificar
(Tabla 10). La membrana se incubó con eta solución durante toda la noche a 4 ºC en
agitación continua (Rotamax 120; Heidolph Instruments, Alemania). Después de 3 ó 4
lavados vigorosos de la membrana con TBST 1x en un agitador orbital, se realizó la
incubación con la solución que contenía el anticuerpo secundario (Tabla 11) específico
para la cadena pesada del anticuerpo primario. El anticuerpo secundario está conjugado
con una peroxidasa de rábano que permite su posterior detección. Tras 1 hora de
incubación a temperatura ambiente en agitación, se procedió a lavar la membrana para
eliminar el anticuerpo secundario no unido.

Tabla 10. Solución para el anticuerpo primario

TBST 1X 5 mL
Leche en polvo 10 %
Azida sódica 0,025 %
Anticuerpo primario Dilución 1:250 - 1:1000
Mantener a 4 ºC

Tabla 11. Solución para el anticuerpo secundario

TBST 1X 5 mL
Leche en polvo 2,5 %
Anticuerpo secundario Dilución 1:5000 ó 1:1000

Análisis: cuando el anticuerpo secundario contacta con el sustrato de la

peroxidasa se inicia una reacción quimioluminiscente (Figura 32). El revelado se realizó
en una cámara oscura incubando durante 5 minutos con una solución ECL que contiene
el sustrato de la peroxidasa que lleva unida el anticuerpo secundario. El resultado final
se detectó como la impresión de la quimioluminiscencia en forma de manchas sobre
papel fotográfico (Amersham HyperfilmTM ECL; GE Healthcare, Reino Unido). El

80
 Materiales y Métodos

tamaño e intensidad de las manchas se analizó por densitometría mediante el programa

informático Image J. Los resultados se expresan como diferencias en los porcentajes de
densidad óptica entre las manchas de las diferentes muestras.

Figura 32. Esquema de la emisión de la señal quimioluminiscente

III.4 TRATAMIENTO ESTADÍSTICO

Los datos obtenidos se expresaron como la media ± EEM (error estándar de la

media). Para comparar entre los diferentes tratamientos, la significación estadística se
calculó mediante el análisis de la varianza de una vía (ANOVA) seguido por el test de
Tukey para comparaciones múltiples. Los valores de P ≤ 0,05 se consideraron
estadísticamente significativos. El software utilizado para el análisis estadístico y diseño
de gráficas fue Graphpad Prism 6.01 para Windows.

81
 Ana M. Marchena

82
IV. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
 Resultados y discusión

CAPÍTULO 1. PAPEL DE LA PROTEÍNA DE CHOQUE TÉRMICO HSP70 EN

LA RESISTENCIA A LA HIPERTERMIA DE LAS CÉLULAS DE LEUCEMIA
MONOCITARIA AGUDA U-937.

Para abordar el primer objetivo, nos planteamos estudiar el efecto del estrés
térmico (HS) sobre la viabilidad de las células leucémicas U-937. Para ello, las células
se expusieron a 42 ºC, durante 1 hora. A continuación, se sometieron a un periodo de
recuperación a 37 ºC, y posteriormente se midió su actividad metabólica durante 1, 2, 4
y 6 horas. Los valores muestran que el estrés térmico indujo una disminución gradual y
dependiente del tiempo en la viabilidad celular. A partir de 1 hora a 37 ºC tras el HS ya
se apreció una disminución significativa de la viabilidad celular (P < 0,05). La
viabilidad celular alcanzó un valor mínimo tras 4-6 horas de recuperación a 37 ºC
(Figura 33).

Figura 33. Efecto del estrés térmico (HS) sobre la viabilidad celular en células U-937. Las células se
trataron previamente durante 24 horas con 1 μM de pifithrin-µ (P-μ) o el vehículo (control, Ctrl), luego se
indujo el HS durante 1 h a 42 ºC (eje de abscisa de -1 h a 0 h). La viabilidad celular se evaluó mediante el
ensayo MTT antes y después del HS en diferentes momentos (0-6 h). Los valores se presentan como
medias ± SEM de 8 experimentos independientes y se expresan como un aumento del número de veces
sobre el valor de actividad en ausencia de HS (experimental/control). *P < 0,05 en comparación con el
control en ausencia de HS. #P < 0,05 en comparación con los valores de control correspondientes en
tiempo tras HS.

85
 Ana M. Marchena

Para investigar la posible participación de HSP70 en la resistencia a la

disminución de la viabilidad celular inducida por el HS, las células U-937 se
preincubaron durante 24 horas con pifithrin-µ (2-feniletinesulfonamida, P-µ), un
inhibidor de HSP70. La exposición a HS tras el pretratamiento con 1 µM P-µ redujo de
manera significativa (P < 0,05) la viabilidad celular con respecto a los valores de los
mismos tiempos de las muestras sometidas a HS en ausencia de P-µ (Figura 33).

Para examinar si los efectos del HS en la viabilidad celular estaban relacionados

con la muerte celular por apoptosis, analizamos la actividad de la caspasa-3, -8 y -9 en
células U-937 sometidas a HS. Como se muestra en la Figura 34, el HS causó un
aumento estadísticamente significativo (P < 0,05) en la actividad enzimática de la
caspasa-3, -8 y -9 (Figura 34A). Este aumento se produjo de manera tiempo-
dependiente, alcanzando el valor máximo a las 4 horas del período de recuperación.
Para confirmar los hallazgos previos sobre la actividad enzimática de las caspasas, se
determinó mediante Western blot el precursor inactivo de la caspasa-3, la procaspasa-3,
en células U-937 sometidas a HS. Así, cuando las células se sometieron a un estrés
térmico, se observó también una activación de la caspasa-3 dependiente del tiempo (P <
0,05), como revela la disminución de la cantidad en la forma inactiva de la procaspasa-3
(Figura 34B). Acorde con los resultados presentados en la Figura 33, la incubación
previa de las células con 1 µM de P-µ durante 24 horas fue capaz de aumentar
significativamente (P < 0,05) la actividad enzimática de las caspasas -3 y -8, pero no de
la caspasa-9 tras 4 horas de recuperación después del HS en comparación con el control
(Figura 34C). El análisis de la expresión de procaspasa-3 mediante Western blot
corroboró una disminución de la misma (P < 0,05), cuando las células estaban
pretratadas con 1 μM P-µ, en comparación con el control (Figura 34D), lo que sugiere
que la chaperona HSP70 dificulta, al menos en parte, la activación de la caspasa-3
inducida por HS en células de leucemia U-937 previniendo la progresión de la
apoptosis.

86
 Resultados y discusión

Figura 34. Efecto del estrés térmico (HS) sobre la actividad caspasa en células U-937. Las células se
pretrataron durante 24 horas con 1 μM de pifithrin-µ (P-μ) o el vehículo (control, Ctrl), luego se indujo el
HS durante 1 h a 42 ºC (eje de abscisa de -1 h a 0 h). La actividad enzimática de caspasa-3, -8 y -9 se
estimó como se describe en Materiales y Métodos. (A) Valores de activación de caspasa-3, -8 y -9 con
respecto al tiempo. (B) Actividad enzimática de caspasa-3, -8 y -9. (C) Contenido procaspasa-3 con
respecto al tiempo tras HS. (D) Contenido de pro-caspasa-3 en células pretratadas durante 24 h con 1 μM
de pifithrin-µ (P-μ); Las muestras se recolectaron a las 4 h de cese del HS. El Western blot se realizó con
el anticuerpo específico anti-pro-caspasa-3 (8G10) y utilizando anti-β-actina (8H10D10) como referencia
de carga de proteínas. El histograma muestra la cuantificación procaspasa-3 (32 kDa) con respecto a la β-
actina (45 kDa). Los valores presentan las medias ± SEM de 4-8 experimentos independientes, y expresan
el número de veces sobre el valor de las muestras no estresadas (experimental/control). *P < 0,05 en
comparación con los valores de control. #P < 0,05 en comparación con los valores de control en
condiciones de estrés.

También se determinó el porcentaje de células que presentaba morfología

nuclear apoptótica mediante microscopía de fluorescencia con tinción de la cromatina
nuclear con Hoescht 33342. Como se muestra en la Figura 35, el porcentaje de células
apoptóticas aumentó más de un 20% tras el HS en comparación con las células control.
Además, cuando las células se preincubaron con 1 µM P-µ durante 24 h, el porcentaje
de células apoptóticas aumentó significativamente (P < 0,05) a 38,5 ± 3,6% (Figura 35).

87
 Ana M. Marchena

Figura 35. Efecto del estrés térmico (HS) en la apoptosis de células U-937. Las células se pretrataron
24 horas con 1 μM de pifithrin-µ (P-μ) o el vehículo (control), luego se indujo el HS durante 1 h a 42 ºC,
las muestras se recolectaron tras 4 h de cese del HS. (A) El histograma muestra el porcentaje de células
con morfología nuclear apoptótica. Los valores se presentan como las medias ± SEM de 8 experimentos
independientes. *P < 0,05 en comparación con los valores de control. #P < 0,05 en comparación con los
valores de control en condiciones de estrés. (B-D) Los núcleos se tiñeron con Hoechst 33342, se
visualizaron en un microscopio de contraste de fases Nikon Eclipse TS 100 y las imágenes se capturaron
usando una cámara digital Nikon (DSQi1Mc). Se muestra un campo representativo de cada grupo
experimental.

Para esclarecer los efectos del HS en la modulación de la expresión de HSP,

cuantificamos los niveles de las proteínas HSP27, HSP70 y HSP90 en células U-937
sometidas a HS, entre 2 y 8 horas después de finalizar el estrés térmico. Como se
muestra en la Figura 36, la cuantificación de los niveles celulares de HSP90 mediante
Western blot manifiesta que el HS indujo una disminución tiempo-dependiente en la
expresión de HSP90, alcanzando el valor mínimo tras 6 horas de recuperación del HS a
37 ºC. Los resultados revelan la existencia de un nivel basal de HSP70 en células
control debido a la expresión constitutiva de la misma con los que cuenta la célula. No
obstante, el HS indujo un aumento de la expresión de HSP70 en células U-937 a las 2
horas de su finalización. El HS no alteró los niveles de expresión de HSP27 de manera
significativa (Figura 36).

88
 Resultados y discusión

Figura 36. Efecto del estrés térmico (HS) en la expresión de las proteínas de estrés térmico (HSP)
con respecto al tiempo en células U-937. Las células se sometieron a HS (42 ºC, 1 h), las muestras se
recolectaron antes (control, Ctrl) y entre 2-8 horas tras el cese del HS. A) El Western blot se realizó con
un anticuerpo específico anti-HSP90 (F-8), anti-HSP70 (N27F3-4), anti-HSP27 (G31), utilizando el
anticuerpo anti-β-actina (8H10D10) como referencia y control de carga de proteínas. B) El histograma
muestra las medias ± SEM (experimental/control) de 4 experimentos independientes. *P < 0,05 en
comparación con los valores de control.

Figura 37. Efecto del estrés térmico (HS) y la inhibición de HSP70 sobre el contenido de proteínas
de estrés térmico (HSP) en células U-937. Las células se pretrataron 24 horas con 1 μM de pifithrin-µ
(P-μ) o el vehículo (control, Ctrl), luego se indujo HS (42 ºC, 1 h). Las muestras se recogieron tras 4
horas del cese de HS. A) El Western blot se realizó con un anticuerpo específico anti-HSP90 (F-8), anti-
HSP70 (N27F3-4), anti-HSP27 (G31), y se utilizó anticuerpo anti-β-actina (8H10D10) como referencia y
control de carga de proteínas. B) El histograma muestra la expresión de proteínas HSP. Los valores se
presentan como las medias ± SEM (experimental/control) de 4 experimentos independientes. *P < 0,05 en
comparación con los valores de control. #P < 0,05 en comparación con los valores de control en
condiciones de estrés.

89
 Ana M. Marchena

Siguiendo esta línea de resultados, la preincubación con 1 µM P-µ indujo una

sensibilización al HS, lo que se tradujo en una disminución notable, no sólo en la
expresión de HSP70, sino también de HSP90 (Figura 37). Lo cual podría explicar el
aumento del número de células apoptóticas cuando las células tratadas con P-µ, carentes
de actividad HSP70, se someten a HS (Figura 35), en coherencia con estudios previos
[440].

La chaperona HSP70 participa en el correcto plegamiento de proteínas de nueva

síntesis para garantizar su funcionalidad [441]. Por tanto, aunque ciertos niveles de
HSP70 son constitutivos en la célula, su expresión está inducida por la acumulación de
proteínas mal plegadas durante las etapas iniciales de estrés, constituyendo parte de la
"respuesta al estrés". En condiciones estresantes para la célula, HSP70 se une a las
proteínas desplegadas para favorecer su destrucción. Cuando el estrés cesa, HSP70
vuelve a disminuir hasta niveles previos a los del estrés, y la fisiología celular procede
regularmente [442]. Sin embargo, en ocasiones las alteraciones causadas por el factor
estresante superan la capacidad de respuesta al estrés, y los daños conducen la célula
hacia la apoptosis [442]. En base a esto, el descenso de la viabilidad celular de las
células U-937 (Figura 33) indica que las condiciones experimentales de estrés
excedieron la capacidad de los mecanismos de respuesta a estrés. Las células de
leucemia tienen altos niveles de HSP70, para preservar el correcto funcionamiento de
sus proteínas en condiciones sostenidas de estrés celular. Por ello no es de extrañar que
la inhibición de HSP70 con P-µ haya mostrado una notable actividad anti-leucémica
[443]. Nuestros datos muestran que la pérdida de viabilidad celular debido a HS se
acentuó debido a la inhibición de HSP70. Esto apunta a que HSP70 participa, al menos
parcialmente, en la respuesta al estrés de las células U-937 (Figura 33).

En paralelo a la pérdida de la viabilidad celular inducida por HS (Figura 33) se

produjo una activación dependiente del tiempo de caspasa-3, y -8 (Figura 34).
Adicionalmente, las imágenes de microscopía evidencian la morfología nuclear
apoptótica de las células U-937 causada por HS. Por otro lado, los hallazgos de Samali
et al. [444] demuestran que la hipertermia promueve la apoptosis en las células U-937.
Por tanto, las evidencias son lo suficientemente robustas para afirmar que el HS induce
apoptosis también en nuestro modelo experimental (U-937). Los estudios de Samali et
al. [444] mostraron un rápido aumento de los niveles de HSP70 como parte de la
respuesta a estrés térmico. Del mismo modo, aquí mostramos una disminución de

90
 Resultados y discusión

viabilidad celular (Figura 33) acompañada de un aumento simultáneo de los niveles de

HSP70 (Figura 36). Después del incremento de expresión de HSP70, los niveles
disminuyeron (Figura 36) y se desencadenó la muerte celular apoptótica (Figura 35),
como corroboró la activación de las caspasas-3, -8 y -9 (Figura 34). Samali et al. [444]
indujeron hipertermia en las mismas condiciones que nosotros utilizamos (42 ºC, 1 h), y
además sobre la misma línea celular de leucemia (U-937) mostrando valores crecientes
de los niveles de HSP70 después del choque térmico. Sin embargo, nuestros datos
indican que el notable aumento de HSP70 inducido por HS, fue seguido de una caída de
los niveles de HSP70, volviendo estos a los niveles basales previos a los inducidos por
HS (Figura 36). Por otro lado, Yu et al. [440] demostraron que aplicando un tratamiento
apoptogénico de hipertermia en células U-937 se induce la activación de las caspasas-3
y -8. A pesar de que no demuestran la activación de la caspasa-9 en su estudio, afirman
que la apoptosis inducida por HS cursa por vía intrínseca ya que sí mostraron eventos
apoptóticos estrechamente relacionados con la apoptosis mitocondrial, como la
despolarización de membrana mitocondrial, generación de peróxidos intracelulares y la
liberación de citocromo c. La activación de la caspasa-9 que experimentaron nuestras
células, no sólo está de acuerdo con el citado estudio, sino que además, lo complementa
con la activación de esta proteasa que funcionaría como un “gatillo” para la activación
de proteasas ejecutoras de la apoptosis. Yu et al. [440] también concluyeron que los
bajos niveles de HSP70 favorece la progresión de la apoptosis al desmontar este
mecanismo de protección, como muestran nuestros resultados (Figura 36).

Los resultados aquí descritos muestran una disminución simultánea de HSP70 y

HSP90 (Figura 36), que se produce en un contexto paralelo de pérdida de viabilidad
celular (Figura 33). Estudios demuestran que HSP70 y HSP90 interactúan con proteínas
de supervivencia que confieren resistencia a la apoptosis, y por ello estas HSP han sido
consideradas como dianas en estudios para vencer la quimioresistencia que presenta la
leucemia [445, 94]. Teniendo en cuenta que ambas HSP juegan un papel importante en
la resistencia a la apoptosis [445, 94], la eliminación de las mismas por mecanismos
como el proteasoma y/o lisosoma, desempeñan una función facilitadora para un
funcionamiento normal de la maquinaria apoptótica, y la consecuente eliminación de las
células dañadas. A pesar de que HSP70 aumenta inicialmente para defender las células
U-937 de la hipertermia, las alteraciones causadas son tales que conducen a las células a
un destino fatal. De modo, que todo parece indicar que HSP70 y HSP90 son eliminadas

91
 Ana M. Marchena

con el fin de no obstaculizar el proceso apoptótico (Figura 36). Tanto es así que cuando
aplicamos HS a células U-937 carentes de actividad HSP70, disminuyó la viabilidad
celular (Figura 33), aumentó actividad caspasa-8 y -3 (Figura 34) y la apoptosis (Figura
35), las células experimentaron una disminución adicional de los niveles de HSP70 y
HSP90 (Figura 37).

HSP27 ha sido descrita por tener una respuesta lenta al estrés ya que mientras
que la mayoría de estas proteínas se acumulan en un corto espacio de tiempo, HSP27
necesita horas para alcanzar niveles similares [14], siendo gran responsable de la
termotolerancia y la resistencia a drogas [39]. Interviene en proliferación y
diferenciación celular en células leucémicas, considerándose como un marcador de
diferenciación [43, 44]. Aunque ciertos estudios apuntan a que HSP27 es parte de la
respuesta al estrés [94], nuestro sistema celular no muestra modulación de HSP27
inducida por HS (Figura 36). Por otro lado, Bruey et al. [217] sostienen que HSP27 sólo
inhibe la activación de caspasas que cursan por la vía apoptótica intrínseca mediante el
secuestro del citocromo c. El aumento en la actividad caspasa-9 que produjo el HS no se
vio incrementado como en el caso de la caspasa-3 cuando se adicionó pifithrin-µ
(Figura 34C). Además, los niveles de HSP27 no se vieron afectados a las 4h de HS, con
o sin pifithrin-µ, manteniendo los valores de las condiciones basales (Figura 37). Por
tanto, entendemos que la activación de la caspasa-9 no está bloqueada, al menos
totalmente por la acción de HSP70 en las células U-937 (Figura 34A). A pesar de que
este resultado mantiene la coherencia con los estudios de Bruey y cols. [217], se
necesitaría un estudio adicional para esclarecer el papel de HSP27 en la respuesta al
estrés en células de leucemia U-937, enmarcándolo como un potencial objetivo para
mejorar la eficiencia de la activación de la apoptosis por vía mitocondrial.

92
 Resultados y discusión

CAPÍTULO 2. PAPEL DE LA PROTEÍNA DE CHOQUE TÉRMICO HSP90 EN

LA RESISTENCIA A LA HIPERTERMIA DE LAS CÉLULAS DE LEUCEMIA
MONOCITARIA AGUDA U-937.

Para abordar otro de los objetivos de esta tesis, nos propusimos estudiar el efecto
de HSP90 sobre la proliferación de las células de leucemia monocitaria aguda U-937.
Para ello, 2 mL de suspensión celular, a una confluencia de 0,5 x 105 células/mL, fueron
tratados durante 24 h (tiempo de duplicación) con los inhibidores de HSP90,
geldanamicina (GA) o tanespimicina (17-AAG), ambos con una concentración de 500
nM. El recuento celular en cámara de Neubauer indicó que tanto el tratamiento con GA
como con 17-AAG, disminuyeron notablemente la proliferación celular (P < 0,05) con
respecto a las células con HSP90 activa. En otras palabras, el control aproximadamente
duplicó la concentración inicial en 24 h, mientras que las células tratadas con los
inhibidores de HSP90 apenas sufrieron cambios en su confluencia en este tiempo
(Figura 38A).

A continuación, para esclarecer el papel de HSP90 en la proliferación celular,

analizamos la distribución de las células en las diferentes fases del ciclo celular en
presencia de inhibidores de esta proteína. En los perfiles de distribución de las fases del
ciclo se apreció que las células U-937 tratadas con inhibidores de HSP90 no mostraron
cambios con respecto al control, es decir, no hubo arresto del ciclo celular en ninguna
fase en particular. Sin embargo, se evidenció un aumento de células apoptóticas
representadas en el segmento subG1 (Figura 38). Estos resultados en conjunto indican
que la ralentización de la proliferación afectaría a todas las fases del ciclo por igual.
Además, las diferencias que se aprecian en el recuento de células con HSP90 inhibida
con respecto al control se deben principalmente a un bloqueo de la proliferación, más
que a una inducción de muerte celular. Hay estudios que han analizado el ciclo celular
bajo condiciones de inhibición de HSP90 en células tumorales, tales como células de
cáncer de vejiga [446]. Este estudio sostiene que la proliferación celular se ve irrumpida
por un arresto en fase G2/M acompañado de un incremento de la apoptosis [446]. Lo
cual es coherente dado que la ciclina dependiente de kinasa-2 (Cdk2), o incluso la
proteína Wee1 [447], que regulan el ciclo en esta fase son proteínas clientes de HSP90,
y por tanto dependiente de ella para su correcto funcionamiento [446, 448], no siendo
pocos los estudios que muestran la interacción de HSP90 con diversas proteínas
reguladoras de cualquiera de las diferentes fases ciclo celular [449], además de ciertos

93
 Ana M. Marchena

factores de crecimiento que resultan esenciales en células tumorales [450]. Por lo que no
es de extrañar que se haya descrito que en células tumorales el bloqueo de HSP90 ha
producido catástrofe mitótica por depleción de reguladores mitóticos como Wee1, plk-1,
Aurora B y surivivina, favoreciendo así una apoptosis aberrante [451].

Figura 38. Papel de HSP90 en la proliferación celular en células U-937. Las células se trataron 24
horas con 500 nM de geldanamicina (GA), 500 nM de tanespimicina (17-AAG) o el vehículo (control,
Ctrl). A) La confluencia celular se cuantificó mediante cámara de Neubauer. Los valores se presentan
como medias ± SEM de 8 experimentos independientes. *P < 0,05 en comparación con el control. B-D)
Las células U-937 fijadas y teñidas con yoduro de propidio se analizaron por citometría de flujo para
estudiar las fases del ciclo celular. Los perfiles de ciclo celular son los más representativos de 4
experimentos independientes.

Dado que la inhibición de HSP90 parecía dificultar la proliferación de las células

de leucemia, nos planteamos estudiar el papel de dicha inhibición en la sensibilidad de
las células U-937 a un estrés térmico posterior. Para ello, bajo condiciones de inhibición
de la actividad HSP90 se indujo un choque térmico (HS, 1 h, 42 ºC) a células U-937 y
se valoraron los efectos mediante el ensayo de viabilidad celular MTT. Los resultados
en la Figura 39 expresan la viabilidad celular, cada uno de los valores representado es el
ratio de disminución de las células estresadas con respecto a una muestra no estresada.
Los resultados indican que el HS causó una diminución tiempo dependiente de la
viabilidad de las células U-937. La inhibición de HSP90 no modificó dicha perdida de
viabilidad celular, ya que no se observaron diferencias significativas con respecto a los
valores control y muestras experimentales para los mismos puntos de tiempo (Figura
39).

94
 Resultados y discusión

Figura 39. Efecto del estrés térmico (HS) sobre la viabilidad celular en células U-937. Las células se
trataron previamente durante 24 horas con 500 nM de geldanamicina (GA), 500 nM de tanespimicina (17-
AAG) o el vehículo (control, Ctrl); luego se indujo el HS durante 1 h a 42 ºC (eje de abscisa de -1 h a 0
h). La viabilidad celular se evaluó mediante el ensayo MTT a lo largo del tiempo, antes del HS y después
en diferentes momentos (0-6 h). Los valores se presentan como medias ± SEM de 8 experimentos
independientes y se expresan como un aumento del número de veces sobre el valor de actividad en
ausencia de HS (experimental/control). *P < 0,05 en comparación con los valores de viabilidad inicial.

Para estudiar el efecto de la inhibición de HSP90 en la inducción de la apoptosis

por estrés térmico, las células U-937 se pretrataron durante 24 h con 500 nM GA o 500
nM 17-AAG previo al HS (1 h, 42 ºC). Tras 4 h del término del HS se cuantificó por
microscopía el porcentaje de células que presentaban morfología nuclear apoptótica
(Figura 40A). Los resultados muestran un incremento significativo del ratio de células
con morfología nuclear apoptótica analizadas 4 h después del HS con respecto al control
(P < 0,05; Figura 40B). También se apreció un aumento significativo del ratio de células
apoptóticas inducido por la inhibición de HSP90 con respecto al control (P < 0,05;
Figura 40B). Aunque, dicha inhibición no produjo diferencias adicionales en el elevado
ratio de células apoptóticas inducido por HS (Figura 40B). Sin embargo, si observamos
en conjunto estos resultados (Figura 39 y Figura 40), podemos ver que la inhibición de
HSP90 mostró un efecto citostático que redujo la proliferación celular a niveles
inapreciables, y además este efecto no interfirió con la capacidad apoptogénica del
estrés térmico sobre las células U-937. Por tanto, el efecto de HS no se ve alterado por
la presencia de inhibidores de HSP90 en cuanto a resultados de viabilidad celular e
inductor de la apoptosis, pero hay que tener presente que en dichas condiciones las
células prácticamente no están proliferando, por lo que resulta más eficiente.

95
 Ana M. Marchena

Figura 40. Efecto del estrés térmico (HS) en la apoptosis de células U-937. Las células se pretrataron
durante 24 horas con 500 nM de GA, 500 nM de 17-AAG o el vehículo (control, Ctrl), luego se indujo el
HS durante 1 h a 42 ºC, las muestras se recolectaron tras 24 h de inhibición y tras 4 h de cese del HS. (A)
Los núcleos se tiñeron con Hoechst 33342, se visualizaron en un microscopio de fase de contraste Nikon
Eclipse TS 100 y las imágenes se capturaron usando una cámara digital Nikon (DSQi1Mc). Se muestra un
campo representativo de cada grupo experimental. (B) El histograma muestra el porcentaje de células con
núcleos apoptóticos. Los valores se presentan como las medias ± SEM de 8 experimentos independientes.
*P<0.05 en comparación con los valores de control. #P<0.05 en comparación con los valores de
inhibición en ausencia de HS.

Dado que el tratamiento conjunto de inhibidores de HSP90 y HS inducían

apoptosis en células U-937, analizamos la actividad enzimática de las caspasa-3, -8 y -9
por su papel clave en las vías de señalización apoptótica. La inhibición de HSP90 indujo
un aumento significativo (P < 0,05) en la actividad de las caspasa-3, -8 y -9 con
respecto al control (Figura 41A). Igualmente, las células U-937 fueron sometidas a HS
observamos un notable incremento con respecto al control (P < 0,05) en la actividad de
las tres caspasas analizadas. El HS causó un aumento significativo en la actividad
caspasa-3 y -8 de las células U-937 pretratadas con GA o 17-AAG (P < 0,05), sin
embargo, la actividad caspasa-9 no experimentó variación significativa con respecto a la
activación inducida por los agentes inhibidores. Por otro lado, se aprecia que este
aumento en la actividad de las caspasas inducido por el tratamiento combinado (GA+
HS o 17-AAG + HS) es notablemente inferior (P < 0,05) que el generado por el HS en
una célula con actividad HSP90 (Figura 41A). Siendo la caspasa-3 una proteasa
ejecutora en la que convergen las principales rutas apoptóticas, nos propusimos
cuantificar los niveles de procaspasa-3. En coherencia con los valores de actividad
enzimática, los niveles de procaspasa-3 disminuyeron significativamente tanto por la
inhibición de HSP90 como por el HS (P < 0,05). El tratamiento térmico combinado con
la inhibición de HSP90 indujo un mayor procesamiento de la procaspasa-3 con respecto
a las células no estresadas térmicamente (P < 0,05). Sin embargo, y en concordancia con
los valores de actividad enzimática, no se observaron diferencias significativas entre el
tratamiento combinado y el HS en términos de activación de caspasa-3 (Figura 41B).

96
 Resultados y discusión

Figura 41. Efecto del estrés térmico (HS) sobre la actividad caspasa en células U-937. Las células se
pretrataron durante 24 horas con 500 nM de geldanamicina (GA), 500 nM de tanespimicina (17-AAG) o
el vehículo (control, Ctrl), posteriormente se indujo el HS durante 1 h a 42 ºC seguido de un periodo de
recuperación de 4 h. (A) Valores de activación de caspasa-3, -8 y -9. La actividad enzimática de caspasa-
3, -8 y -9 se cuantificó como se describe en Materiales y Métodos. (B) Valores del contenido de
procaspasa-3. El Western blot se realizó con el anticuerpo específico anti-procaspasa-3 (8G10) y
utilizando anti-β-actina (8H10D10) como referencia de carga de proteínas. El histograma muestra la
cuantificación procaspasa-3 con respecto a la β-actina. Los valores presentan las medias ± SEM de 4
experimentos independientes y expresan el número de veces sobre el valor de las muestras no estresadas
(experimental/control). *P < 0,05 en comparación con los valores de control. #P < 0,05 en comparación
con los valores de inhibición en ausencia de HS. □P < 0,05 en comparación con los valores de control en
condiciones de estrés.

Se sabe que la expresión de proteínas HSP es muy elevada en las células

tumorales en general, y en células de leucemia en particular. A este respecto estudiamos
los niveles de HSP90, HSP70 y HSP27 en las condiciones apoptogénicas descritas
debido al tratamiento combinados de inhibición de HSP90 y HS. Los resultados de
Western blot no mostraron alteraciones en los niveles de HSP90, ni en presencia de sus
inhibidores GA y 17-AAG, ni tras el HS (Figura 42B). Sin embargo, GA y 17-AAG
indujeron un aumento de los niveles de HSP70 y HSP27. Cabe pensar, que estando en
condiciones de inapreciable proliferación y aumento de la apoptosis las células estén
estresadas y manifiesten un aumento de la expresión de los niveles de HSP70 y HSP27
(P < 0,05). El HS sólo tuvo efecto sobre la expresión de HSP70, a las 4 h del cese del
mismo, que se vio aumentada de manera significativa con respecto al control (Figura
10B; P < 0,05). Cuando se inhibió HSP90, el HS tuvo un efecto inductor (P < 0,05) de
la expresión de HSP70 y de HSP27, aunque estos niveles no fueron significativos con
respecto a los valores de expresión de HSP70 y HSP27 inducidos por los inhibidores. Es
decir, parece ser que la ausencia de actividad HSP90 promueve la expresión de HSP70

97
 Ana M. Marchena

y HSP27, probablemente mediado por HSF, y el HS no incrementó los niveles de

HSP70 y HSP27 de manera adicional (P < 0,05; Figura 42B).

Figura 42. Efecto del estrés térmico (HS) en la expresión de las proteínas de choque térmico (HSP)
en células U-937. Las células se pretrataron durante 24 horas con 500 nM de geldanamicina (GA), 500
nM de tanespimicina (17-AAG) o el vehículo (control, Ctrl), posteriormente se indujo el HS durante 1 h a
42 ºC seguido de un periodo de recuperación de 4 h. A) El Western blot se realizó con un anticuerpo
específico anti-HSP90 (F-8), anti-HSP70 (N27F3-4), anti-HSP27 (G31), y se utilizó anticuerpo anti-β-
actina (8H10D10) como referencia y control de carga de proteínas. B) El histograma muestra la expresión
de proteínas HSP. Los valores se presentan como las medias ± SEM de 4 experimentos independientes.
*P < 0,05 en comparación con los valores de control. #P < 0,05 en comparación con los valores en
condiciones de estrés (HS+4 h).

Cuando las células están bajo condiciones de estrés térmico y ausencia de

actividad HSP90, los resultados obtenidos muestran una elevada expresión de HSP70 y
HSP27 (Figura 42) aún, cuando la proliferación celular es prácticamente nula (Figura
33) y la apoptosis es elevada (Figura 40 y 41). Inicialmente podría parecer un resultado
contradictorio con respecto al desarme del mecanismo de “respuesta a estrés” que
sostiene el Capítulo 1 de los resultados de esta Tesis Doctoral. Sin embargo, hay que
tener en cuenta que aún desconocemos lo que sucedería con los niveles de HSP70 y
HSP27 a tiempos más largos de exposición. Aunque observando los valores de la
tendencia de viabilidad celular con respecto al tiempo (Figura 39) y como disminuyen
los niveles de HSP cuando la célula entra en apoptosis (Figura 36) sería lógico
hipotetizar que estos niveles elevados de HSP70 y HSP27 preceden a un descenso de
los mismos. Lo cual estaría en línea también con los estudios de Yu et al. [440] sobre el
descenso de los niveles de HSP70 en condiciones apoptogénicas.

98
 Resultados y discusión

No obstante, estudios llevados a cabo en células de leucemia U-937 han descrito

que niveles elevados tanto de HSP70 [452], como de HSP27 [219] previenen la
activación de caspasas mediada por citocromo c. Aunque los niveles de HSP70 y
HSP27 aparecen elevados al tratar las células con inhibidores de HSP90 y HS (Figura
42) con respecto al tratamiento de HS por sí solo, es probable que se trate de un hecho
transitorio. En el Capítulo 1 mostramos una correspondencia entre la disminución de los
niveles HSP70 con la progresión de la apoptosis (Figura 36). Es muy probable que
HSP70 y/o HSP27, estén dificultando en parte la activación de las caspasa-3, -8 y -9,
cuando las células son tratadas con HS en ausencia de actividad HSP90 (Figura 41). La
pérdida tiempo-dependiente de la viabilidad celular y su tendencia decreciente (Figura
39) hace pensar que tanto los niveles de HSP70 y HSP27 como la reducida actividad de
las caspasas sean hechos relacionados y que ocurren de forma transitoria en células de
leucemia U-937. No obstante, la comprobación de esta hipótesis requeriría de estudios
adicionales.

Por otro lado, HSP27 ha sido descrita como una proteína partícipe de la
respuesta a estrés, cuyos niveles aumentan de manera más lenta que el resto de
miembros HSP presentes en la respuesta al estrés [14]. Futuros estudios en los que se
llevasen a cabo la inhibición de la actividad HSP27, podrían esclarecer si los elevados
niveles de esta proteína tienen alguna implicación en la disminución de la actividad
caspasa observada cuando las células U-937 son tratadas con HS en condiciones de
inhibición de HSP90 con respecto al tratamiento de HS por sí solo (Figura 42). De
confirmarse que HSP27 representa un obstáculo para una mayor activación de la vía
intrínseca de la apoptosis, sería de gran interés investigar la doble inhibición de HSP27
y HSP90 como procedimiento sensibilizador a la hipertermia en células leucémicas U-
937.

En resumen, la inhibición de HSP90 interrumpe drásticamente la proliferación

celular de células de leucemia monocitaria U-937 sin alterar los efectos proapoptóticos
de un posterior tratamiento de hipertermia. Es decir, el uso combinado de inhibidores de
HSP90 e hipertermia tiene un efecto citostático y apoptogénico en células de leucemia
U-937.

99
 Ana M. Marchena

CAPÍTULO 3. EFECTO DE LA HIPERTERMIA EN PRESENCIA DE

AGENTES OXIDANTES O QUIMIOTERAPÉUTICOS

El aumento de la actividad oxidativa que sobrepasa la capacidad de los

mecanismos antioxidantes disponibles en la célula genera el fenómeno conocido como
estrés oxidativo. Cuando los daños oxidativos son irreparables, la célula sana inicia los
procesos de apoptosis. Las células tumorales, en términos generales, son más tolerantes
a cualquier tipo de estrés y el inicio de las vías apoptóticas está seriamente dificultado.
No obstante, superado cierto umbral de daño, la célula tumoral iniciaría igualmente los
procesos de apoptosis de la misma manera que ocurre en células sanas. Se sabe que el
tratamiento con fármacos antitumorales, como etopósido [453] y citarabina [454] en
células U-937, genera estrés oxidativo y parte de su acción está basado ello. Ejercen una
acción específica en la célula tumoral, consiguiendo activar las vías de señalización
apoptóticas en modo particular en este tipo de células.

Para estudiar los efectos del estrés oxidativo sobre células U-937 bajo estrés
térmico (HS), en primer lugar, nos planteamos caracterizar el efecto apoptogénico de un
agente oxidante como el peróxido de hidrógeno (H2O2). Con este fin, las células U-937
en fase de crecimiento exponencial (0,5-1x106 células/mL) fueron incubadas con H2O2 a
diferentes tiempos (1, 2, 4 y 24 h) y concentraciones crecientes (1, 10, 100, 500 µM y 1
mM). Acorde con resultados publicados anteriormente por nuestro grupo de
investigación en células leucémicas HL-60 [455], el H2O2 indujo una disminución
tiempo y dosis dependiente en la viabilidad de las células U-937. La mayor
concentración de H2O2 (1 mM) durante el mayor tiempo de exposición (24 h) tuvo
como resultado la reducción más acentuada de la viabilidad celular (Figura 43A). Los
procesos apoptóticos en células leucémicas, como U-937, se pueden evidenciar
aproximadamente a las 3 h de recibir el estímulo apoptótico. En virtud de ello, tomamos
como referencia el tiempo de 4 h para cuantificar la proporción de células apoptóticas
inducidas por concentraciones crecientes de H2O2. El H2O2 causó un aumento en el ratio
de células que mostraban morfología nuclear apoptótica directamente proporcional a su
concentración, siendo el mayor efecto a la dosis de 1 mM H2O2 (Figura 43B).

100
 Resultados y discusión

Figura 43. Efecto del estrés oxidativo sobre la viabilidad celular y apoptosis en células U-937. A)
Histograma dosis/tiempo-respuesta de la viabilidad celular (MTT) al agente oxidante peróxido de
hidrógeno (H2O2). Las células se trataron con 1 μM, 10 μM, 100 μM, 500 μM y 1 mM de H 2O2. La
viabilidad celular se evaluó mediante el ensayo MTT a las 1 h, 2 h, 4 h y 24 h de la incubación con el
H2O2. Los valores se presentan como medias ± SEM de 8 experimentos independientes y se expresan
como un aumento del número de veces sobre el valor de actividad en ausencia de H2O2
(experimental/control). B) Las imágenes de microscopía de fluorescencia (Hoescht 33342) muestran la
morfología nuclear de células U-937 tratadas con concentraciones crecientes de H2O2 tras 4 h de
tratamiento. Los valores se expresan como medias del porcentaje de células con morfología nuclear
apoptótica. *P < 0,05 en comparación con los valores de control.

Citarabina (AraC) y etopósido (VP-16) son dos agentes quimioterapéuticos

comúnmente utilizados en tratamientos de leucemia aguda [319, 332]. Para estudiar la
incidencia que tienen dichos agentes quimioterapéuticos sobre la viabilidad celular de
estos compuestos. Tratamos las células U-937 con 50 µM citarabina y 50 μM etopósido,
y a continuación llevamos cabo el ensayo de viabilidad celular MTT a diferentes
tiempos (0, 1, 2, 4 y 6 h). Los resultados indicaron una disminución significativa (P <
0,05) de la viabilidad celular con respecto al control a partir de las 2 h de tratamiento.
Los valores experimentaron una disminución progresiva hasta el último de los puntos
monitorizados (Figura 44A). De manera simultánea se cuantificó el ratio de núcleos
apoptóticos en las células U-937 a los mismos puntos de tiempo. Los resultados
indicaron un aumento significativo (P < 0,05) en el ratio de células que presentaban

101
 Ana M. Marchena

núcleos con morfología apoptótica a partir de las 4 h con respecto al control (Figura
44B y 44C).

Figura 44. Efecto de los quimioterapéuticos sobre la viabilidad celular y apoptosis en células U-937.
Las células se trataron previamente durante 4 horas con 50 µM de etopósido (VP-16) o 50 µM de
citarabina (AraC). A) La viabilidad celular se evaluó mediante el ensayo MTT a diferentes tiempos (0-6
h). B) Cuantificación de la morfología apoptótica. Los núcleos se tiñeron con Hoechst 33342, se
visualizaron en un microscopio de fase de contraste Nikon Eclipse TS 100 y las imágenes se capturaron
usando una cámara digital Nikon (DSQi1Mc). Los valores de A y B representan las medias ± SEM de 8
experimentos independientes y se expresan como un aumento del número de veces sobre el valor de
actividad en ausencia de quimioterapéuticos (experimental/control). *P < 0,05 en comparación con el
control. C) Muestra los campos más representativos de cada grupo experimentales cuantificados en B a
las 4 h de tratamiento.

Caracterizados los efectos del HS (1 h, 42 ºC) en las células U-937 (Capitulo 1),
sabemos que estas no desarrollan resistencia en dichas condiciones de hipertermia.
Hemos visto que el principal mecanismo de proteínas HSP que participa en la respuesta
a estrés disminuye sus niveles, y a continuación las células leucémicas U-937 entran en
apoptosis de manera progresiva.

Estudios previos presentan la terapia combinada de estrés térmico y agentes

quimioterapéuticos, como una herramienta exitosa induciendo apoptosis en
comparación con las células que son únicamente tratadas con quimioterapéuticos [200].

102
 Resultados y discusión

En vista de nuestros resultados, nos planteamos estudiar el efecto del HS previo

a un estímulo apoptótico en células U-937. Para ello, las células U-937 se sometieron a
HS y 2 h después de su cese, se trataron con 500 µM H2O2, 50 µM citarabina o 50 µM
etopósido durante 4 h. A continuación, se cuantificaron los valores de viabilidad celular
y el ratio de células con morfología nuclear apoptótica. Los resultados de MTT indican
que la disminución de la viabilidad celular inducida por H2O2 o etopósido no se vio
significativamente alterada por la exposición previa de las células a HS. Sin embargo,
no fue así en las células tratadas con citarabina, en las que el HS indujo una disminución
adicional estadísticamente significativa (P < 0,05) en la viabilidad celular con respecto a
la disminución que había causado el tratamiento de citarabina por sí solo (P < 0,05)
(Figura 45A). No obstante, el tratamiento combinado de HS y citarabina no superó los
efectos que tuvo el HS por sí solo sobre la viabilidad celular. Por otro lado, la
cuantificación de células con morfología apoptótica mantuvo el mismo patrón de
resultados que la determinación de viabilidad. El HS no causó alteraciones en la acción
proapoptótica inducida por estrés oxidativo (H2O2) o por etopósido (P < 0,05; Figura
45B); sin embargo, sí promovió un aumento significativo en la capacidad apoptogénica
de citarabina sobre las células U-937 (P < 0,05; Figura 45B). Aunque de nuevo, el
tratamiento combinado de HS y citarabina no superó los efectos que tuvo el HS por sí
solo sobre el aumento del ratio de células U-937 con morfología apoptótica.

Figura 45. Efecto de la hipertermia (HS) frente al estrés celular causado por quimioterapéuticos y
peróxido de hidrógeno en células U-937. Las células se sometieron a HS durante 1 h a 42 ºC y 2 h
después de su cese, se trataron con 500 µM de peróxido de hidrógeno (H2O2), 50 µM de citarabina (AraC)
o 50 µM de etopósido (VP-16) durante 4 h. A) La viabilidad celular se evaluó mediante el ensayo MTT
como se describe en Materiales y Métodos. B) Porcentaje de células con morfología nuclear apoptótica.
Los valores se presentan como medias ± SEM de 8 experimentos independientes y se expresan como un
aumento del número de veces sobre el valor en ausencia de tratamiento (experimental/control). *P < 0,05
en comparación con el control. #P < 0,05 en comparación con los valores de los quimioterapéuticos en
ausencia de estrés.

103
 Ana M. Marchena

La hipertermia se ha aplicado con éxito como tratamiento único o combinado en

diferentes tipos de cáncer [200]. Los resultados de nuestros estudios in vitro indican que
los tratamientos combinados no presentan diferente capacidad antileucémica que el
tratamiento de HS de manera independiente. No obstante, en este punto, nos planteamos
valorar la toxicidad que podría derivar el tratamiento hipertérmico en combinación con
los agentes quimioterapéuticos en leucocitos, como las células parentales sanas de la
leucemia. A partir de sangre fresca (< 1 hora después de su extracción) aislamos
leucocitos por centrifugación en gradiente de ficoll. Lavados los leucocitos fueron
sometidos a las mismas condiciones de HS (1 h, 42 ºC) y tras el cese se añadió a las
células 500 µM H2O2, 50 µM etopósido o 50 µM citarabina durante 4 h. Pasado el
tiempo de tratamiento se cuantificaron los cambios en la viabilidad celular de los
leucocitos por el método de exclusión de Trypan Blue en cámara de Neubauer. A
diferencia del patrón de respuesta que tiene lugar en las células U-937, los resultados
indican que HS, no sólo no causa aumento de la mortalidad en leucocitos sanos, sino
que además, disminuye de manera significativa (P < 0,05) el daño causado por los
agentes quimioterapéuticos a los leucocitos (Figura 46A). Para estudiar si la mortalidad
inducida por la toxicidad de los tratamientos es de origen apoptótico analizamos la
actividad de la caspasa-3 (Figura 46B). Los resultados indican que HS disminuyó de
manera estadísticamente significativa (P < 0,05) los valores de activación de caspasa-3
con respecto a los valores controles. De la misma manera, el aumento de la actividad
caspasa-3 (P < 0,05) causado por los agentes quimioterapéuticos en leucocitos
experimentó una drástica atenuación debido a la aplicación previa de HS (P < 0,05;
Figura 14 B). Sin embargo, se puede observar que el tratamiento de hipertermia por sí
solo no induce toxicidad alguna en leucocitos, a diferencia de los tratamientos
combinados (Figura 46). Si tenemos en cuenta que sobre las células de leucemia U-937
el tratamiento de hipertermia, por sí solo, es tan efectivo como el combinado con
agentes quimioterapéuticos (Figura 45), este último no resultaría ventajoso ya que
presenta igual actividad antileucémica y una aparente mayor toxicidad sobre células
sanas (Figura 46). Con esta afirmación estaríamos descuidando los resultados que
indican una desorganización progresiva del mecanismo de “respuesta a estrés”
relacionado con las proteínas HSP (Capítulos 1 y 2) que conllevaría una disminución de
la tolerancia a estrés, y conduce la célula leucémica hacia la apoptosis. Lo cual podría
explicar por qué estudios previos señalan que la terapia combinada de estrés térmico y a
agentes quimioterapéuticos presenta una mayor tasa de apoptosis en células tumorales

104
 Resultados y discusión

[200]. Aunque estos resultados hasta ahora no se ajustan a nuestros valores obtenidos
(Figura 45), no sería descartable que en si en células U-937 retrasásemos la adición de
los tratamientos quimioterapéuticos, o insultos estresante adicionales, podríamos
obtener resultados más efectivos al enfrentarnos a células más vulnerables (Figura 36).
Como han demostrado otros estudios [212, 235] y se puede observar en nuestros
resultados (Capítulos 1 y 2), los niveles de HSP van a determinar la resistencia o
vulnerabilidad de las células a la quimioterapia. Así nuestros resultados instan a estudiar
para cada tipo celular las condiciones adecuadas de hipertermia valorando las
variaciones de los niveles de HSP. El objetivo sería ajustar los tratamientos combinados
a una baja actividad HSP, y consecuentemente una mayor vulnerabilidad de la célula
tumoral.

En cuanto a las células sanas, nuestros resultados apuntan hacia el HS como un

tratamiento protector frente a los efectos tóxicos secundarios que presentan los
tratamientos antileucémicos.

Figura 46. Efecto de la hipertermia (HS) frente al estrés celular causado por quimioterapéuticos y
peróxido de hidrógeno en leucocitos. Los leucocitos se sometieron a HS durante 1 h a 42 ºC y 2 h
después de su cese, se trataron con 500 µM de peróxido de hidrógeno (H2O2), 50 µM de citarabina (AraC)
o 50 µM de etopósido (VP-16) durante 4 h. A) La viabilidad se evaluó mediante Trypan Blue tal y como
se describe en Materiales y Métodos. B) Valores de activación de caspasa-3. La actividad enzimática de
caspasa-3 se estimó como se describe en Materiales y Métodos. Los valores se presentan como medias ±
SEM de 8 experimentos independientes y se expresan como un aumento del número de veces sobre el
valor en ausencia de quimioterapéuticos (experimental/control). *P < 0,05 en comparación con los
valores control. # P < 0,05 en comparación con los valores en ausencia de estrés térmico. ○P < 0,05 en
comparación con los valores en condiciones de estrés térmico (HS).

105
 Ana M. Marchena

CAPÍTULO 4: PAPEL DE LA PROTEÍNA HSP70 EN LAS TERAPIAS

COMBINADAS DE MELATONINA Y AGENTES QUIMIOTERAPÉUTICOS
EN CÉLULAS DE LEUCEMIA MONOCITARIA AGUDA U-937.

HSP70 es una chaperona que se sobreexpresa en condiciones de estrés celular.

Niveles elevados y sostenidos en el tiempo de HSP70 están vinculados con la
adquisición de tolerancia al estrés, facilitando la evasión de la apoptosis y generando
condiciones ideales para el desarrollo de tumores. HSP70 se convierte por tanto en una
excelente diana a la que apuntar con las estrategias anticáncer [14]. Por otro lado,
resultados previos publicados por nuestro grupo de investigación demuestran que la
melatonina posee efectos adyuvantes al combinarse con agentes quimioterapéuticos
[435]. Este hecho, junto con los resultados anteriormente expuestos en esta Tesis en los
que hemos caracterizado los efectos de la inhibición de HSP70 en células U-937
(Capítulo 1), nos llevó a plantearnos estudiar los posibles efectos de la inhibición de
HSP70 en el tratamiento combinado de melatonina y agentes quimioterapéuticos en
células de leucemia monocitaria aguda U-937.

En primer lugar, quisimos analizar el efecto de la melatonina y P-µ en la

proliferación de las células U-937. Para ello, 0,5 x 106 células/mL se incubaron durante
24 h con 1 mM melatonina y 1 µM P-µ. Los recuentos celulares en cámara de Neubauer
tras 24 h de incubación indican que el control había duplicado la concentración celular
en el cultivo, como era de esperar. Sin embargo, la melatonina inhibió de manera
estadísticamente significativa (P < 0,05) la proliferación celular. El tratamiento de P-µ
durante 24 h no causó alteraciones evidentes en el número de células tras 24 h, lo cual
es coherente con los resultados anteriores (Figura 47). Cuando las células U-937 se
coincubaron durante 24 h con melatonina y P-µ se obtuvo un efecto sensibilizador, dado
que el tratamiento conjunto indujo una disminución de la proliferación
significativamente más intensa que la melatonina y que P-µ de manera independiente (P
< 0,05; Figura 47). Puesto que la inhibición de HSP70 por sí sola no presentaba ninguna
modulación sobre la proliferación, estos resultados nos indican que no es una proteína
imprescindible para la progresión del ciclo celular de las células U-937, aunque sí
parece protegerlas de los efectos antiproliferativos de la melatonina.

106
 Resultados y discusión

Figura 47. Papel de la inhibición de HSP70 en la proliferación de células U-937. Las células se
trataron 24 horas con 1 mM de melatonina (Mel), 1 μM de pifithrin (P-μ) o el vehículo (control, Ctrl). La
proliferación celular se evaluó tras 24 horas de incubación mediante cámara de Neubauer como se
describe en Materiales y Métodos. Los valores del histograma se presentan como medias ± SEM de 8
experimentos independientes. *P < 0,05 en comparación con los valores de control. #P < 0,05 en
comparación con los valores de melatonina. □P < 0,05 en comparación con los valores de pifithrin-µ.

Conociendo las condiciones de proliferación en las que se encuentran las células

U-937 a las 24 h de incubación con melatonina y P-µ, quisimos estudiar su respuesta a
los agentes quimioterapéuticos citarabina (50 µM), etopósido (50 µM) y 5-fluorouracilo
(1 mM), en dichas condiciones. Para ello, en las mismas condiciones de incubación con
melatonina y P-µ, las células se trataron con dichos agentes quimioterapéuticos durante
4 h. Posteriormente se analizaron los valores de viabilidad celular por el método MTT.
Los resultados obtenidos indican que la combinación de melatonina con citarabina
presenta valores significativamente inferiores a los presentados por ambos tratamientos
de manera independiente (P < 0,05; Figura 48A). El patrón de comportamiento fue
similar cuando citarabina se sustituyó por etopósido o 5-fluorouracilo (Figura 48B y
48C). Por otro lado, cuando las células se pretrataron con P-µ, no presentaron una
mayor sensibilidad a citarabina (Figura 16A), similares resultados se obtuvieron con
etopósido (Figura 48B) o 5-fluorouracilo (Figura 48C). Es decir, no se apreciaron
diferencias significativas en la viabilidad celular de la línea U-937 entre las células
tratadas con agentes quimioterapéuticos en presencia y ausencia de actividad HSP70.
Aunque el tratamiento combinado de melatonina con el inhibidor P-µ (Mel+P-µ) mostró
una capacidad antiproliferativa superior a la obtenida por los compuestos de manera
independiente (Figura 47), la viabilidad celular no disminuyó de manera significativa
cuando las células se trataron combinando melatonina y P-µ con respecto al tratamiento
con melatonina de manera independiente (Figura 47). Sin embargo, la incubación de las

107
 Ana M. Marchena

células con melatonina y el inhibidor de HSP70 favoreció que el tratamiento con

quimioterapéuticos indujese la mayor disminución (P < 0,05) de la viabilidad celular,
superando los valores de melatonina, P-µ, quimioterapéuticos, el tratamiento combinado
de melatonina con P-µ (Mel+P-µ), e incluso con respecto al efecto aditivo de la
melatonina con quimioterapéuticos (Mel+Ara-C, Mel+VP-16, Mel+5-FU).

Figura 48. Papel de HSP70 en la viabilidad celular de células U-937 tratadas con melatonina y
agentes quimioterapéuticos. Las células se trataron 24 horas con 1 mM de melatonina (Mel), 1 μM
pifithrin-µ (P-μ) o el vehículo (control, Ctrl). Los agentes quimioterapéuticos 50 μM de citarabina (Ara-
C), 50 μM de etopósido (VP-16) y 1 mM de 5-fluorouracilo (5FU) se incubaron 4 horas antes de evaluar
la viabilidad celular mediante el ensayo MTT. (A) Viabilidad celular en presencia de Ara-C. (B)
Viabilidad celular en presencia de VP-16. (C) Viabilidad celular en presencia de 5FU. Los valores se
presentan como medias ± SEM de 8 experimentos independientes. *P < 0,05 en comparación con los
valores de control. #P < 0,05 en comparación con los valores de melatonina. □P < 0,05 en comparación
con los valores de pifithrin-µ. &P < 0,05 en comparación con los valores de quimioterapéutico. ○P < 0,05
en comparación con los valores de melatonina + quimioterapéuticos. P < 0,05 en comparación con los
valores de melatonina + pifithrin-µ.

108
 Resultados y discusión

Para concretar el efecto de la inhibición de HSP70 sobre el tratamiento

combinado de la melatonina con los agentes quimioterapéuticos, llevamos a cabo la
cuantificación del ratio de células que presentaban núcleos con morfología apoptótica.
Para ello, con las mismas dosis y condiciones de incubación con melatonina y P-µ (24
h), se trataron las células con los agentes quimioterapéuticos 50 μM citarabina, 50 μM
etopósido y 1 mM 5-fluorouracilo durante 4 h y a continuación se cuantificaron los
porcentajes de células apoptóticas por microscopía. Los resultados evidencian un
aumento significativo del tratamiento combinado de melatonina y los agentes
quimioterapéuticos con respecto a los valores de estos compuestos por separado (P <
0,05; Figura 49). El P-µ por sí solo no causó alteraciones evidentes con respecto a los
valores de apoptosis de las células control, sin embargo, cuando se combinó con agentes
quimioterapéuticos se mantuvieron los valores del ratio de apoptosis con respecto a los
valores inducidos por los agentes quimioterapéuticos por sí mismos. La incubación
durante 24 h con melatonina y P-µ causó un aumento de la apoptosis con respecto al P-
µ por sí sólo (P < 0,05). En estas condiciones de proliferación mínima que induce el
tratamiento conjunto de melatonina y P-µ, cuando se añadió un agente
quimioterapéutico, sólo etopósido mostró un aumento adicional significativo en el ratio
de células con morfología nuclear apoptótica (P < 0,05; Figura 49B).

Si observamos en conjunto los valores de proliferación, viabilidad y apoptosis, la

inhibición de HSP70 en células de leucemia monocitaria aguda U-937 favorece el efecto
antiproliferativo de melatonina en combinación con agentes quimioterapéuticos.
Además, se aprecia una disminución de la actividad metabólica y aumento de la
apoptosis. Estos resultados indican que los efectos de los agentes quimioterapéuticos
son potenciados por la melatonina, la administración adicional de P-µ mantuvo al
menos las mismas condiciones proapoptóticas en situación de mínima proliferación
(Figura 49).

109
 Ana M. Marchena

Figura 49. Papel de la HSP70 en la apoptosis de células U-937 tratadas con melatonina y agentes
quimioterapéuticos. Las células se trataron 24 horas con 1 mM de melatonina (Mel), 1 μM de pifithrin-µ
(P-μ) o el vehículo (control, Ctrl). Los agentes quimioterapéuticos 50 μM de citarabina (Ara-C), 50 μM
de etopósido (VP-16) y 1 mM de 5-fluorouracilo (5FU) se incubaron 4 horas antes de evaluar la
morfología apoptótica. Los núcleos se tiñeron con Hoechst 33342, se visualizaron en un microscopio de
fase de contraste Nikon Eclipse TS 100. El histograma muestra el porcentaje de células con morfología
nuclear apoptótica (A) Morfología apoptótica en presencia de Ara-C, (B) Morfología apoptótica en
presencia de VP-16 y (C) Morfología apoptótica en presencia de 5FU. Los valores se presentan como las
medias ± SEM de 8 experimentos independientes. *P < 0,05 en comparación con los valores de control.
#P < 0,05 en comparación con los valores de melatonina. □P < 0,05 en comparación con los valores de
pifithrin-µ. &P < 0,05 en comparación con los valores de quimioterapéutico. οP < 0,05 en comparación
con los valores de melatonina + VP-16. P < 0,05 en comparación con los valores de melatonina + P-μ.

De acuerdo con nuestros resultados previos, la melatonina potenció la capacidad

antileucémica de los agentes quimioterapéuticos utilizados [435], disminuyendo la
viabilidad celular y promoviendo la apoptosis. Esta capacidad potenciadora de los
agentes quimioterapéuticos no la mostró el inhibidor de HSP70. P-µ tampoco
incrementó la apoptosis cuando las células se trataron con la combinación de melatonina
y agente quimioterapéutico (excepto en el caso de etopósido, Figura 49), sin embargo, sí
disminuía la viabilidad celular por debajo de lo inducido por la combinación de
melatonina y quimioterapéuticos (Figura 48). Este último efecto, probablemente sea
debido a la gran capacidad citostática que presenta la melatonina sobre las células U-
937 tratadas con el inhibidor de HSP70.

110
 Resultados y discusión

Aunque sea de manera transitoria, las células respondieron al estrés con un

ligero aumento de los niveles de HSP70 (Figura 36, 37 y 42). Recientes estudios han
indicado que la melatonina puede inhibir la resistencia generada por elevados niveles de
HSP70 y HSP27 en células tumorales, pudiendo deberse a su actividad catalasa [456].
Existen evidencias que señalan una alteración redox como el inicio de la respuesta a
estrés, elevando los niveles de HSP70 y HSP27. Debido a que la actividad catalasa de la
melatonina impidió la elevación de HSP70 y HSP27, acentuando los efectos
antileucémicos de la hipertermia [70].

La melatonina presenta actividad catalasa dentro de la célula, debido a su

capacidad antioxidante neutraliza especies reactivas del oxígeno como el H2O2, lo que
normalmente se cumple en células no tumorales [457]. Sin embargo, una amplia
literatura y nuestras evidencias experimentales indican que la melatonina presenta
efectos prooxidantes tanto en células tumorales en general [433, 435], como en células
leucémicas en particular [401, 458]. Por ello, hipotetizar que la melatonina mediante
actividad catalasa evita la respuesta a estrés es una idea bastante controvertida y digna
de ser estudiada. No obstante, permanece una coherencia entre nuestros resultados
(Figura 41 y 42) y los de Beere y cols. en que la disminución de los niveles de HSP70
coinciden con una mayor activación de caspasas [459]. Es muy probable, que la bondad
de la melatonina como agente potenciador o suplementario antileucémico radique en
incidir en múltiples dianas dentro de célula tumoral [400]. Aunque aún se mantiene
estudios de los mecanismos que utiliza la melatonina para impedir la respuesta a estrés
en células leucémicas.

En resumen, el tratamiento combinado de agentes quimioterapéuticos y

melatonina tiene una gran capacidad apoptogénica en células de leucemia monocitaria
aguda U-937. Aunque esta capacidad de tratamiento combinado no se vea alterada por
la inhibición de HSP70, sí favorece la quiescencia de células U-937 que presentasen
resistencia a la apoptosis. Estos resultados instan a llevar a cabo la puesta a punto de
tratamientos a largo plazo que conlleven una reducción progresiva del número de
células viables. No obstante, la inhibición de HSP70 en el tratamiento combinado de
melatonina y agentes quimioterapéuticos muestra efectos citostáticos y citotóxicos en
células de leucemia U-937.

111
 Ana M. Marchena

CAPÍTULO 5: PAPEL DE LA PROTEÍNA HSP90 EN LAS TERAPIAS

COMBINADAS DE MELATONINA Y AGENTES QUIMIOTERAPÉUTICOS
EN CÉLULAS DE LEUCEMIA MONOCITARIA AGUDA U-937.

En condiciones normales, las células leucémicas sobreexpresan HSP90 como

elemento de resistencia y evasión de la apoptosis [267]. El conocimiento de este hecho
ha permitido situar a HSP90 en el punto de mira de ciertos tratamientos antileucémicos.
No obstante, en ciertas ocasiones este tratamiento resulta inefectivo y las células
muestran resistencia al mismo. Así, las terapias antitumorales combinadas cobran
sentido porque abordan diversas dianas moleculares en el mismo momento y sobre el
mismo sujeto. Estudios anteriores llevados a cabo por nuestro grupo de investigación
señalan la melatonina como un efectivo adyuvante en el tratamiento de células
tumorales con agentes quimioterapéuticos [435]. Por ello, y conforme al estudio
descrito en el Capítulo 4, nuestro objetivo ha sido estudiar los efectos de la inhibición
de HSP90 en los tratamientos combinados de melatonina y agentes quimioterapéuticos
clásicos como citarabina, etopósido y 5-fluorouracilo.

En primer lugar, evaluamos las condiciones de proliferación en las cuales se

encontraban las células antes de adicionar los agentes quimioterapéuticos. Para ello, 0,5
x 106 células/mL se incubación durante 24 h con 1 mM melatonina y 500 nM 17-AAG,
inhibidor de HSP90. Los recuentos en cámara de Neubauer muestran una duplicación de
la población celular en este período, de acuerdo con la naturaleza de la línea celular U-
937. De manera similar a los resultados del capítulo anterior, la melatonina disminuyó
de manera estadísticamente significativa la concentración celular con respecto al control
(P < 0,05; Figura 50). La inhibición de HSP90 por el 17-AAG durante 24 h también
causó un descenso significativo de la proliferación, obteniéndose valores aproximados a
la mitad del control (P < 0,05; Figura 50). Esto apunta hacia un bloqueo casi total de la
proliferación celular, lo que concuerda con los valores expuestos en el Capítulo 2
(Figura 38), y donde la literatura sugiere que la proliferación celular sea muy
dependiente de HSP90 [451]. Cuando las células U-937 se coincubaron durante 24 h
con melatonina y 17-AAG se obtuvieron valores significativamente menores que con la
melatonina por sí sola (P < 0,05), pero no diferentes a los de las células tratadas con 17-
AAG. Esto indica que la inhibición de HSP90 es la causa principal del bloqueo de la
proliferación cuando se tratan las células U-937 con melatonina y 17-AAG (Figura 50).

112
 Resultados y discusión

Figura 50. Papel de la inhibición de HSP90 en la proliferación de células U-937. Las células se
trataron 24 h con 1 mM de melatonina (Mel), 500 nM de tanespimicina (17-AAG) o el vehículo (control,
Ctrl). La proliferación celular se evaluó tras 24 horas de incubación mediante cámara de Neubauer como
se describe en Materiales y Métodos. Los valores del histograma se presentan como medias ± SEM de 8
experimentos independientes. *P < 0,05 en comparación con los valores de control. #P < 0,05 en
comparación con los valores de melatonina.

Para estudiar la participación de HSP90 sobre los efectos que el tratamiento

combinado con melatonina y quimioterapéuticos tienen sobre las células U-937,
llevamos a cabo la incubación de las células con 1 mM melatonina y 500 nM 17-AAG
durante 24 h. Posteriormente, las células se incubaron durante 4 h con 50 μM citarabina,
50 μM etopósido y 1 mM 5-fluorouracilo. Los resultados indican que el tratamiento
combinado de melatonina y quimioterapéuticos induce una disminución
estadísticamente significativa comparada con la originada por dichos tratamientos de
manera independiente (P < 0,05; Figura 51). En coherencia con los resultados de
proliferación, la inhibición de HSP90 indujo una disminución de la viabilidad celular
con respecto al control (P < 0,05; Figura 51). Estas células, en una situación de baja
división y actividad metabólica inducida por 17-AAG, no sufrieron variaciones en sus
valores de viabilidad celular cuando se les administró citarabina. Este efecto del
tratamiento combinado (17-AAG + AraC) sobre la viabilidad celular es atribuible al
inhibidor 17-AAG, ya que no se apreciaron diferencias significativas cuando el 17-AAG
actuaba sobre las células por sí solo con respecto al combinado con este
quimioterapéutico (Figura 51A).

Sorprendentemente, la combinación de melatonina y 17-AAG redujo de manera

significativa los valores de viabilidad celular (P < 0,05; Figura 51A, séptima barra),
incluso por debajo de los valores obtenidos en las células tratadas con 17-AAG y

113
 Ana M. Marchena

citarabina (P < 0,05; Figura 51A, sexta barra). No se observaron variaciones en la

viabilidad celular cuando las células se trataban con 17-AAG o con citarabina en
presencia de melatonina (Figura 51A, cuarta vs séptima barra). Tampoco se apreciaron
modificaciones de estos valores de viabilidad celular cuando se administró citarabina a
las muestras incubadas con melatonina y 17-AAG. Igualmente, se analizó el efecto de
agentes quimioterapéuticos etopósido y 5-fluorouracilo sobre la viabilidad celular de
células U-937 tratadas el inhibidor de HSP90 y melatonina. Los resultados muestran un
patrón similar, donde el tratamiento de inhibición de HSP90 tiene mayor respuesta (P <
0,05) sobre la viabilidad celular si se combina con melatonina que con etopósido o 5-
fluorouracilo (Figura 51B y 51C). La adición de melatonina, y no los agentes
quimioterapéuticos, fue capaz de conseguir un efecto adicional sobre la disminución de
la viabilidad celular.

Figura 51. Papel de HSP90 en la viabilidad celular de células U-937 tratadas con melatonina y
agentes quimioterapéuticos. Las células se trataron 24 horas con 1 mM de melatonina (Mel), 500 nM de
tanespimicina (17-AAG) o el vehículo (control, Ctrl). Los agentes quimioterapéuticos 50 μM de
citarabina (Ara-C), 50 μM de etopósido (VP-16) y 1 mM 5-fluorouracilo (5FU) se incubaron 4 horas
antes de evaluar la viabilidad celular mediante el ensayo MTT. (A) Viabilidad celular en presencia de
Ara-C, (B) Viabilidad celular en presencia de VP-16 y (C) Viabilidad celular en presencia de 5FU. Los
valores se presentan como medias ± SEM de 8 experimentos independientes. *P < 0,05 en comparación
con los valores de control. #P < 0,05 en comparación con los valores de melatonina. □P < 0,05 en
comparación con los valores de 17-AAG. &P < 0,05 en comparación con los valores de los
quimioterapéuticos.

114
 Resultados y discusión

Para caracterizar los efectos antileucémicos que presentaban las diferentes

combinaciones de tratamiento y tener mejor criterio en cuanto a la efectividad de los
mismos en células U-937, llevamos a cabo la cuantificación del ratio de células que
adoptan morfología nuclear apoptótica. Con las mismas condiciones experimentales que
el ensayo anterior, es decir, incubación de las células con 1 mM melatonina y 500 nM
17-AAG (24 h), y posterior tratamiento con los agentes quimioterapéuticos 50 μM
citarabina, 50 μM etopósido y 1 mM 5-fluorouracilo durante 4 h, se cuantificaron los
porcentajes de células apoptóticas por microscopía.

Los resultados ponen de manifiesto un efecto proapoptótico aditivo cuando se

combinan melatonina y los quimioterapéuticos, que resultó significativamente mayor
que estos compuestos administrados de manera independientes (P < 0,05; Figura 52).
Como ya se ha descrito en resultados anteriores, la inhibición de HSP90 induce un
ligero aumento, aunque significativo (P < 0,05) en el ratio de células apoptóticas con
respecto a los valores control. Interesantemente, y en concordancia con los resultados de
viabilidad celular, no se apreció ningún efecto proapoptótico cuando las células se
trataron con los quimioterapéuticos en presencia del inhibidor 17-AAG (Figura 52). El
tratamiento combinado de melatonina y 17-AAG mostró un efecto apoptogénico
significativamente mayor (P < 0,05) que el inducido por los quimioterapéuticos, en las
mismas condiciones de inhibición de HSP90 (Figura 52). En condiciones de tratamiento
con melatonina y 17-AAG, la adición del agente quimioterapéuticos no aportó un
ulterior efecto observable en el ratio de células U-937 con morfología apoptótica
(Figura 52). Los resultados también indican que el tratamiento con melatonina y 17-
AAG es significativamente menos apoptogénico con respecto a la combinación de
melatonina con cualquiera de los quimioterapéuticos (P < 0,05; Figura 52).

115
 Ana M. Marchena

Figura 52. Papel de la HSP90 en la apoptosis de células U-937 tratadas con melatonina y agentes
quimioterapéuticos. Las células se trataron 24 horas con 1 mM de melatonina (Mel), 500 nM de
tanespimicina (17-AAG) o el vehículo (control, Ctrl). Los agentes quimioterapéuticos 50 μM de
citarabina (Ara-C), 50 μM de etopósido (VP-16) y 1 mM de 5-fluorouracilo (5FU) se incubaron 4 horas
antes de evaluar la morfología apoptótica. Los núcleos se tiñeron con Hoechst 33342, se visualizaron en
un microscopio de fase de contraste Nikon Eclipse TS 100. El histograma muestra el porcentaje de células
con morfología nuclear apoptótica (A) Morfología apoptótica en presencia de Ara-C, (B) Morfología
apoptótica en presencia de VP-16 y (C) Morfología apoptótica en presencia de 5FU. Los valores se
presentan como las medias ± SEM de 8 experimentos independientes. *P < 0,05 en comparación con los
valores de control. #P < 0,05 en comparación con los valores de melatonina. □P < 0,05 en comparación
con los valores de 17-AAG. &P < 0,05 en comparación con los valores de quimioterapéutico. ○P < 0,05
en comparación con los valores de melatonina + quimioterapéutico.

Claramente, los agentes quimioterapéuticos utilizados no ejercen ningún efecto

en las condiciones de baja proliferación causada por la inhibición de HSP90. Este
resultado está enmarcado en un contexto celular de baja replicación de ADN, que
representa la diana de estos y mucho de los agentes quimioterapéuticos utilizados
tradicionalmente. Sin embargo, en el mismo contexto la melatonina ejerce una acción
apoptogénica mayor, ya que sus dianas antitumorales son variadas [400].

La inhibición de HSP90 en el tratamiento de 24 h combinado de melatonina y

agentes quimioterapéutico, no aportó efectividad adicional con respecto al uso de
melatonina y 17-AAG en células U-937. Sin embargo, y dado que la apoptosis inducida
es mayor si la melatonina se combina con quimioterapéuticos que con el inhibidor de
HSP90, podríamos pensar que el tratamiento en el primer caso es potencialmente más
efectivo. No obstante, debemos tener en cuenta que la inhibición de HSP90 causa un
bloqueo casi total de la proliferación celular (Figura 50), y que la melatonina aporta a la

116
 Resultados y discusión

inhibición de HSP90 un potente efecto apoptogénico, ya que es capaz de inducir

apoptosis sobre células leucémicas quiescentes. Aunque los valores de viabilidad celular
(Figura 51) nos indican que no hay diferencias entre los tratamientos de melatonina con
quimioterapéuticos y melatonina con 17-AAG a las 24 h, serían necesarios más estudios
a tiempos más largos para ver el progreso de ambos tratamientos. De este modo se
podría esclarecer cual de las combinaciones, melatonina con quimioterapéuticos o
melatonina con 17-AAG, presentaría mayor proliferación tras varios días. Además, sería
de gran interés estudiar cómo la melatonina hace frente a la quimioresistencia y efectos
secundarios generados por 17-AAG o agentes quimioterapéuticos, y el papel que juegan
en ello las proteínas HSP participantes en la “respuesta a estrés”.

117
 Ana M. Marchena

118
V. DISCUSIÓN GENERAL
 Discusión general

Entre las leucemias agudas, la leucemia mieloide aguda (LMA) es el tipo más
común y el que causa una alta mortalidad, presentando gran heterogeneidad biológica y
clínica [463]. La relevancia del pronóstico resulta determinante y, aunque se ha
avanzado en la búsqueda de marcadores, un alto porcentaje de pacientes carece de una
anomalía específica que permita detectarla, por lo que el uso de tratamientos efectivos
contra ella resulta crucial [1]. Aunque en la mayoría de los pacientes se logra una
remisión completa de la enfermedad muchos de ellos sufren recaídas debido a la
resistencia a la quimioterapia. Debido a esto, evitar la quimiorresistencia en la leucemia
se ha convertido en uno de los principales objetivos en la actualidad para las
investigaciones en este campo [464]. La línea celular U-937 es una línea celular
leucémica aislada a partir del linfoma histiocítico de un paciente masculino de 37 años,
usándose tradicionalmente para estudiar el comportamiento y la diferenciación de los
monocitos [460]. Las células U-937 proliferan en cultivo en suspensión suplementado y
tienen una tasa de división celular de 24 horas. Pertenecen a la serie mieloide, por lo que
en presencia de estímulos adecuados pueden madurar y diferenciarse, adoptando la
morfología y las características de los macrófagos maduros [461].

Las células tumorales, tienen la capacidad de eludir los puntos de control celular
mediante diversos mecanismos con el fin de evitar el proceso de apoptosis y mantener
su supervivencia. En este sentido, las proteínas de choque térmico (HSP), constituyen
uno de los sistemas universales más antiguos de respuesta a gran diversidad de
situaciones de estrés [6]. De entre todos sus miembros, HSP90, HSP70 y HSP27 se
sobreexpresan en condiciones de estrés, presencia de quimioterapéuticos, presencia de
especies reactivas o irradiación, lo que los hace ser buenos marcadores [14, 95].

Los estudios de los últimos años, aunque escasos, apuntan al uso de inhibidores
de HSP como posible tratamiento antitumoral, sobre todo de HSP90, cuya evaluación
preclínica se encuentra fase II/III. Aunque la efectividad de los inhibidores a modo de
monoterapia ha sido documentada, es la terapia combinada con agentes
quimioterapéuticos la que mejores resultados ofrece hasta la fecha. El modo de
actuación puede variar aunque generalmente se produce una acción sinérgica entre los
compuestos [465, 466] que inicia diferentes acciones, como la degradación de proteínas
involucradas en las principales características del cáncer [467] o transformar tumores no
inmunogénicos para mejorar su reconocimiento por parte del sistema inmunológico
[468, 469].

121
 Ana M. Marchena

En esta Tesis doctoral hemos querido estudiar el papel que desempeñan las HSP
más relevantes en el proceso de apoptosis de las células tumorales de LMA, HSP27,
HSP70 y HSP90, utilizando como modelo la línea celular U-937. Para ello, hemos
hecho uso de diversos estímulos como hipertermia, peróxido de hidrógeno, agentes
quimioterapéuticos y melatonina, así como de inhibidores específicos de estas proteínas,
que nos han permitido esclarecer su implicación en mecanismos de supervivencia y
muerte.

HSP70 y HSP90 resultan indispensables para el normal desarrollo de las células

tumorales. El uso de inhibidores específicos de HSP90 (GA y 17-AAG) tuvo un efecto
citostático en células de leucemia U-937. Cuando el inhibidor se combinó con
hipertermia, además ocasionaba un efecto apoptogénico. Sin embargo, la inhibición de
HSP70 (P-μ) aunque no tuvo efecto citostático potenció la capacidad apoptótica de la
hipertermia. Similares conclusiones fueron realizadas por Samali et al. [23], quienes
además sostienen que ante leves estímulos estresantes (no apoptogénicos) las células
pueden desarrollar una tolerancia inmediata al mismo, pudiendo incluso crear
resistencia frente a posteriores insultos ambientales.

La hipertermia como herramienta terapéutica consiste en producir un

calentamiento entre 41 ºC y 45 ºC, que cuando se combina con agentes
quimioterapéuticos se denomina termoquimioterapia [470]. Se ha visto que la
hipertermia incrementa la sensibilidad del tumor a los agentes quimioterapéuticos [471]
y actúa como adyuvante de la quimioterapia fomentando su acumulación en los tejidos
tumorales [472]. Con objeto de ampliar la información obtenida en nuestro primer
objetivo sobre la respuesta celular de la línea U-937 al estrés, y así comparar su
comportamiento con respecto al HS por sí solo, decidimos utilizar terapias combinadas
de hipertermia con peróxido de hidrógeno (H2O2) como molécula inductora de estrés
oxidativo; y, con etopósido y citarabina como quimioterapéuticos [319]. En esta Tesis
hemos utilizado una terapia citotóxica, consistente en administrar una única y elevada
dosis de quimioterapéutico, como sugiere el grupo de Ghibelli [453], desencadenando
en células leucémicas una respuesta celular a la citotoxicidad producida por el
compuesto y promoviendo una rápida activación de la apoptosis [453, 462]. Asimismo,
podemos observar que el tratamiento con hipertemia no modificaba la capacidad
antileucémica de los quimioterapéuticos empleados o del peróxido de hidrógeno en
células de leucemia monocitaria aguda U-937, sino que además parece actuar como

122
 Discusión general

mecanismo protector frente a los efectos tóxicos secundarios que presentan los
tratamientos antileucémicos, haciendo del HS un aliado eficaz en el uso de terapias
combinadas como se describía al inicio de este párrafo.

Más allá de los roles fisiológicos habituales que desempeña la melatonina, esta
indolamina tiene la capacidad de modular el proceso de apoptosis [473], destacando su
acción dual como agente antioxidante, antiinflamatorio y “optimizador” del
funcionamiento de la mitocondria en células no tumorales [474], que contrasta con su
acción citotóxica en células tumorales, donde tiene efectos pro-apoptóticos y
antiproliferativos [475, 476]. Durante los tratamientos contra el cáncer, la aplicación de
la mayoría de agentes quimioterapéuticos o radiación inducen un aumento de la
producción de ERO, con el consecuente daño celular y tisular. La terapia combinada de
los agentes quimioterapéuticos con melatonina, actúa de forma sinérgica induciendo
apoptosis en las células tumorales mientras que protege a las células sanas contra los
efectos nocivos de estas terapias [405]. Además, la melatonina induce arresto del ciclo
celular en las células tumorales [404]. Nuestros resultados muestran que el tratamiento
combinado de agentes quimioterapéuticos y melatonina tiene una gran capacidad
apoptogénica y antiproliferativa en células de leucemia monocitaria aguda U-937. Esta
capacidad de tratamiento combinado no se ve afectada por la inhibición de HSP70 o
HSP90. Además, cuando se aplicó monoterapia con melatonina ésta consiguió inducir
apoptosis en células leucémicas quiescentes. Teniendo en cuenta estas evidencias, junto
con la literatura ya existente, podría considerarse este tipo de terapias combinadas con
melatonina para aumentar la tolerancia del paciente a una concentración mayor del
agente anticancerígeno, aumentando así la efectividad del tratamiento y disminuyendo
los efectos secundarios.

La complejidad de las vías moleculares utilizadas por las células tumorales para
evadir la apoptosis, junto con la diversidad que presenta el desarrollo tumoral en cada
paciente, suponen un desafío a la hora de encontrar características comunes que
permitan diseñar tratamientos efectivos. El uso de monoterapias habituales que utilizan
una única diana para combatir las células tumorales ha terminado por generar resistencia
en las mismas, por lo que se hace necesario desarrollar nuevas terapias más efectivas.
Las proteínas de estrés o HSP, se presentan como una estrategia transversal de
supervivencia a tener en cuenta entre diferentes tipos de células tumorales. El uso de
nuevas terapias combinadas permite abordar este problema desde varias perspectivas;

123
 Ana M. Marchena

terapias sensibilizadoras a otras terapias, como la inhibición de HSP70; sinérgicas,

como la inhibición de HSP90; protectoras, como la hipertermia; o bien, combinar todas
estas acciones mediante el uso de melatonina. Si bien son necesarios muchos más
estudios que arrojen luz a este tipo de terapias combinadas, nuestro estudio nos acerca a
contar con medios más eficaces y/o menos agresivos para combatir la LMA.

124
VI. CONCLUSIONES
 Conclusiones

En la presente Tesis Doctoral hemos estudiado terapias combinadas

antileucémicas basándonos en el papel esencial desempeñado por las HSP en la célula
tumoral, utilizando como modelo las células de leucemia monocitaria aguda U-937. En
virtud de los resultados obtenidos podemos realizar las siguientes conclusiones:

1. La inhibición de HSP70 termosensibiliza las células de leucemia monocitaria

aguda U-937, disminuye los niveles de HSP70 y HSP90, y favorece el proceso
de apoptosis.

2. La inhibición de HSP90 interrumpe drásticamente la proliferación celular de

células de leucemia monocitaria aguda U-937 aunque no altera los efectos
proapoptóticos de un tratamiento de hipertermia posterior. Es decir, el uso
combinado de inhibidores de HSP90 e hipertermia compagina un efecto
citostático y apoptogénico en células de leucemia U-937.

3. El tratamiento de hipertemia no modifica la capacidad antileucémica de los

quimioterapéuticos citarabina, etopósido o de agentes oxidantes en células de
leucemia monocitaria aguda U-937, además actúa como mecanismo protector
frente a los efectos tóxicos secundarios que presentan los tratamientos
antileucémicos.

4. El tratamiento combinado de agentes quimioterapéuticos y melatonina tiene una

gran capacidad apoptogénica en células de leucemia monocitaria aguda U-937.
Aunque esta capacidad de tratamiento combinado no se ve alterada por la
inhibición de HSP70, sí que favorece la quiescencia de células U-937 que
presentan resistencia a la apoptosis.

5. La inhibición de HSP90 disminuye drásticamente la proliferación de las células

U-937 y hace que los agentes quimioterapéuticos que interfieren en la
replicación del ADN no ejerzan su acción antitumoral. Esto no ocurre en el caso
de la melatonina, que sí consigue inducir apoptosis en células leucémicas
quiescentes. Por tanto, el tratamiento combinado de melatonina e inhibición de
HSP90 muestra efectos antiproliferativos y proapoptóticos en células de
leucemia monocitaria aguda U-937.

127
 Ana M. Marchena

128
VII. BIBLIOGRAFÍA
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