ESCUELA DE MICROBIOLOGIA

FISIOLOGÍA MICROBIANA
PRÁCTICA N° 6

METABOLISMO MICROBIANO:
UTILIZACIÓN DE CARBOHIDRATOS

Tomada de: https://www.slideshare.net/JulioGarridoOvando/entner-doudoroff

OBJETIVO GENERAL

Determinar la capacidad de un microorganismo de fermentar un(os) carbohidrato(s)

especifico(s) incorporado(s) en un medio base y de utilizar una sustancia específica como
única fuente de carbono.

OBJETIVOS ESPECÍFICOS

- Reconocer las propiedades que ofrecen los medios de cultivo en la identificación de las
bacterias en el laboratorio.
- Comprender el fundamento de las pruebas bioquímicas empleadas para la evaluación del
metabolismo microbiano.
- Identificar la capacidad que tienen ciertas bacterias para utilizar sustratos como glucosa,
sacarosa y lactosa, como fuente de carbono para sus requerimientos nutricionales.
- Establecer el tipo de fermentación empleada por los microorganismos evaluados con
base en los resultados de las pruebas desarrolladas.

INTRODUCCIÓN

El metabolismo microbiano es el conjunto de procesos por los cuales un microorganismo

obtiene la energía y los nutrientes (carbono, por ejemplo) que necesita para vivir y
reproducirse. Los microorganismos utilizan numerosos tipos de estrategias metabólicas
distintas y las especies pueden a menudo distinguirse en función de estas estrategias. El
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metabolismo se produce por secuencias de reacciones químicas catalizadas

enzimáticamente. Las características metabólicas específicas de un microorganismo
constituyen el principal criterio para determinar su identidad, papel y hábitat en la naturaleza
y su utilidad en procesos industriales.

Los distintos tipos de metabolismo microbiano se pueden clasificar de acuerdo a tres

criterios:

- La forma en que el organismo obtiene el carbono para la construcción de la masa celular.

- Las estrategias empleadas para obtener los equivalentes reductores para la
conservación de la energía o sus reacciones biosintéticas.
- La manera en que el organismo obtiene energía para vivir y crecer.

Teniendo en cuenta la fuente a través de la cual los organismos obtienen el carbono para la
construcción de la masa celular, los organismos se clasifican en:

- Autótrofo: producen su masa celular y materia orgánica a partir del dióxido de carbono
(CO2), que es inorgánico, como única fuente de carbono, usando la luz o sustancias
químicas como fuente de energía.
- Heterótrofo: utilizan como sustancias nutritivas las materias orgánicas ricas en energía
(carbohidratos, lípidos, proteínas), sintetizadas por organismos autótrofos u otros
organismos heterótrofos, pues son incapaces de transformar materia inorgánica en
orgánica.
- Mixótrofo: el carbono se obtiene tanto de compuestos orgánicos como fijando el CO2.

La mayoría de los microorganismos son heterótrofos y viven de los nutrientes que toman
de otros seres vivos (comensales o parásitos) o de materia orgánica muerta de todo tipo
(saprófitos). La fermentación es un tipo específico de metabolismo heterótrofo. Consiste en
un proceso metabólico de óxido-reducción que ocurre en un medio ambiente anaerobio y,
en el cual, en lugar de oxígeno un sustrato orgánico sirve como aceptor final de electrones.
Una gran variedad de compuestos puede ser fermentados, entre ellos los azúcares,
especialmente las hexosas como la glucosa. Los productos de fermentación son
frecuentemente ácidos orgánicos, alcoholes y otras sustancias de bajo peso molecular,
incluidos gases como hidrogeno y CO2. La fermentación se denomina según los productos
finales predominantes:

- Fermentación homoláctica: se produce solo ácido láctico.

- Fermentación heteroláctica: se produce ácido láctico, etanol y CO2.
- Fermentación acida mixta: se produce etanol, ácido acético, ácido fórmico, CO2 y H2.
- Fermentación alcohólica: se produce solo etanol.

Las bacterias que fermentan carbohidratos son por lo general anaerobios facultativos. El ciclo
fermentativo de carbohidratos más importante es el ciclo de Embden-Meyerhof-Parnas, que
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consiste en una secuencia de reacciones enzimáticas que convierten la glucosa en piruvato

y luego en productos de fermentación. Sin embargo, también puede producirse por la
derivación de pentosa o el ciclo de Entner-Doudoroff.

El tipo de carbohidrato fermentado y los productos finales varían con cada especie
bacteriana y depende del sistema enzimático existente en la especie y las condiciones del
medio ambiente. Por esta razón, el patrón de fermentación de un microorganismo es de
gran valor taxonómico.

En el laboratorio se emplean pruebas bioquímicas que permiten observar la fermentación

de algún carbohidrato como puede ser maltosa, glucosa, sacarosa y lactosa, entre otros. Es
así como existen medios diferenciales que permiten estudiar la capacidad que tiene un
microorganismo para producir ácido y gas a partir de la glucosa, sacarosa y lactosa en un
único medio, e inclusive permite observar la producción de H 2S. Los caldos para
fermentación tienen indicadores de pH, cuyo cambio de color evidencia la producción de
ácidos. Además, para detectar la posible producción de gas, se coloca dentro del caldo una
campana de Durham (tubo invertido).

MEDIOS DE CULTIVOS Y PRUEBAS BIOQUÍMICAS

A. TSI (triple sugar iron - triple azúcar hierro): es un medio de cultivo diferencial en tubo
que permite evaluar si un microorganismo fermenta determinados carbohidratos, así
como si produce o no H2S. Los carbohidratos que pueden ser fermentados en este medio
son glucosa (fondo del tubo), sacarosa (parte media) y lactosa (parte superior). El cambio
de color de rojo a amarillo (indicador rojo fenol) indica fermentación de alguno de los
carbohidratos ya sea en el fondo o la parte superior1.

Procedimiento:
1. Tomar una colonia aislada y sembrar el medio TSI por punción centrada con un asa recta
hasta tocar el fondo del tubo y por estría en el pico de flauta (tendido). Toda la siembra
se realiza con el mismo inóculo inicial, no se debe volver a tomar colonia.
2. Incubar 24 horas a 35°C.
3. Analizar los resultados.

Resultados:
Se debe leer el tubo siempre superficie/fondo. El cambio de color o reacción positiva se
indica con la letra A (ácido). Reacción negativa o no cambio de color se indica con la letra K
(alcalino).
A/A: pico de flauta amarillo o ácido y fondo amarillo o ácido. Fermentación de los tres
azucares.
K/K: pico de flauta rojo o alcalino y fondo rojo o alcalino. No hay fermentación de azucares,
usa las peptonas.
K/A: pico de flauta rojo o alcalino y fondo amarillo o ácido. Fermentación de glucosa. Lactosa
o sacarosa no fermentada.
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K/A y producción de H2S: pico de flauta rojo o alcalino y fondo ácido negro: fermentación
de glucosa, no fermentación de latosa y producción de H2S.
Producción de gas: formación de burbujas o desplazamiento del medio
Producción de H2S: ennegrecimiento del medio.

B. Caldo de fermentación para carbohidratos (base rojo fenol): Mide la capacidad de la

bacteria evaluada para utilizar hidratos de carbonos, basada en la presencia de un sistema
enzimático que le permite degradar el azúcar (carbohidrato) presente en el medio y usarlo
como fuente de energía1. El medio utilizado contiene tripteína que provee la fuente de
carbono y nitrógeno, NaCl como estabilizante osmótico e inhibidor de flora
acompañante, el rojo de fenol es el indicador de pH. Adicionalmente al medio se le
adiciona el azúcar correspondiente al 1% p/v (glucosa, maltosa, xilosa, sacarosa).

Procedimiento:
1. Tomar una colonia a partir de un cultivo puro e inocular el caldo de fermentación. Mezclar
suavemente.
2. Incubar a 35°C por 18 – 24 horas.

Resultados:
Positivo: fermentación del azúcar evidenciada por el cambio de color de rojo a amarillo.
Negativo: no fermentación del azúcar, sin cambio en el color.

C. Voges Proskauer en caldo RMVP (rojo metilo-voges proskauer): Determinar la

capacidad de los microorganismos para generar, a partir de la fermentación de la glucosa,
un producto final neutro: acetil-metilcarbinol (AMC, acetoína), o ácido: ácido acético,
ácido fórmico, ácido láctico1. El medio utilizado para esta prueba es el caldo RMVP (rojo
metilo Voges-Proskauer) y contiene: polipeptona, glucosa y fosfato dipotásico (K 2HPO4)

Procedimiento:
1. Tomar una colonia aislada e inocular el caldo RMVP.
2. Incubar a 35°C por 18-24 horas en aerobiosis.
3. Luego de observar el crecimiento, revelar adicionando 6 gotas de α-naftol al 5% (reactivo
A) y mezclar.
4. Adicionar seguidamente 3 gotas de hidróxido de potasio al 40% (reactivo B).
5. Mezclar suavemente durante 30 segundos a 1 minuto de modo que el medio esté
expuesto al oxigeno atmosférico para oxidar la acetoína y obtener una reacción de
cambio de color.
6. Permitir que los tubos reposen durante 15 minutos para exponer al oxígeno antes de
intentar interpretar el color (la reacción generalmente es inmediata).

Resultados:
Positivo: color rosado-rojo en la superficie del medio (presencia de acetoína).
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Negativo: color amarillo en la superficie del medio (similar al color del reactivo). Se puede
observar un color cobrizo, pero es un resultado negativo, resultado de la mezcla de los dos
reactivos.

Nota:
- α-naftol al 5%: es un intensificador del color, aumenta la sensibilidad de la prueba sin
disminuir la especificidad.
- KOH al 40%: absorbe el CO2 (agente oxidante)

D. Rojo metilo en caldo RMVP: permite evaluar la capacidad de un microorganismo para

producir y mantener estables los productos finales ácidos a partir de la fermentación de
la glucosa.

Procedimiento:
1. Tomar una colonia aislada e inocular el caldo RMVP.
2. Incubar a 35°C por 18-24 horas en aerobiosis.
3. Luego de observar el crecimiento, revelar adicionando 5 gotas de rojo metilo.
4. Interpretar el color (la reacción es inmediata).

Resultados:
Positivo: el reactivo rojo metido adicionado permanece con un color rojo brillante estable
en la superficie del medio (pH 4,4) indicando la producción de ácido a partir de la
fermentación de la glucosa.
Negativo: color amarillo en la superficie del medio (pH 6)

E. Caldo Malonato: Determinar microorganismos capaces de utilizar metabólicamente

malonato sódico como única fuente de carbono 1. Su utilización alcaliniza el medio que
contiene azul del bromotimol como indicador

Procedimiento:
1. Tomar una colonia aislada e inocular el caldo malonato.
2. Incubar a 35°C por 18-24 horas en aerobiosis.

Resultados:
Positivo: reacción alcalina, color azul pálido a azul Prusia oscuro en todo el medio (utilización
del malonato).
Negativo: sin cambio de color, se mantiene verde. No se observa crecimiento.
Microorganismo incapaz de crecer con malonato sódico como única fuente de carbono.

F. Prueba de citrato: permite determinar la capacidad de un microorganismo de utilizar el

citrato como única fuente de carbono resultando en crecimiento y alcalinización del
medio1.
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Procedimiento:
3. Tomar una colonia aislada e inocular el medio citrato por estría en superficie.
4. Incubar a 35°C por 18-24 horas en aerobiosis.

Resultados:
Positivo: crecimiento del microorganismo con un intenso color azul en el pico de flauta
(alcalinización del medio)
Negativo: ausencia de crecimiento y no hay cambio de color, el medio permanece verde.

G. Agar Salmonella Shigella (SS), agar MacConkey y agar Xilosa Lisina Desoxicolato
(XLD): estos son agares selectivos y diferenciales que permiten evaluar en algunos casos
más de una característica metabólica.

Procedimiento:
1. Tomar una colonia aislada e inocular el medio
2. Realizar siembra por agotamiento en estría
3. Incubar a 35°C por 18-24 horas en aerobiosis
4. Analizar el crecimiento obtenido

DESARROLLO DEL LABORATORIO

1. TALLER COLABORATIVO: UTILIZACIÓN DE CARBOHIDRATOS

Orientaciones generales:

- Esta actividad se realizará en el tiempo de trabajo independiente, quedará como tarea

para la próxima sesión de laboratorio.
- El taller se elaborará en los mismos grupos asignados para cada mesón de laboratorio.
- A cada grupo se le asignarán medios de cultivos o pruebas bioquímicas para revisar su
fundamento teórico.
- Revisar el fundamento de los medios de cultivo y pruebas utilizadas. En la guía se
proporciona un resumen que debe ser complementado con una investigación de cada
prueba (ver material de consulta en Moodle).

Actividades:

A. Preparación del fundamento teórico:

• Deben preparar dos diapositivas para explicar el fundamento, procedimiento e
interpretación de los medios o pruebas asignados. De cada medio se debe mencionar
su composición, indicador de pH y reveladores en el caso que se deba revelar la
prueba.
• Diseñar una actividad complementaria de aprendizaje. Se deberá elaborar una
estrategia para reforzar el conocimiento emitido a sus compañeros y por tanto
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aplicarlo al grupo (crucigrama, sopa de letras, quien quiere ser millonario, preguntas
abiertas, kahoot, entre otros).
• Para esta actividad se evaluará: profundización de fundamentos, forma de
presentación, implementación de estrategia. La presentación se realizará en el
próximo laboratorio (total tiempo exposición e implementación estrategia 15
minutos)

PROCEDIMIENTO EN EL LABORATORIO:

PARTE I

1. A cada grupo le será entregará una bacteria crecida en agar MacConkey para estudiar
su capacidad metabólica:

Mesón 1: Escherichia spp.

Mesón 2: Klebsiella spp.
Mesón 3: Pseudomonas spp.
Mesón 4: Citrobacter spp.

2. Realizar una lámina con solución salina para colorear con Gram, observar en el
microscopio e informar morfología y tinción.
3. Inocular los siguientes medios con la cepa asignada:

a) TSI
b) Caldo rojo de fenol: Base, Glucosa, lactosa, sacarosa
c) Citrato
d) Caldo RM-VP
e) Medio Hugh-Leifson (sólo mesón 3).

4. Sembrar en estría por agotamiento el medio sólido, en Agar McConkey o XLD según
lo indicado por el docente.
5. Se realizará una búsqueda en la literatura que permita definir cuál es el
comportamiento del microorganismo asignado en cada uno de los medios o pruebas
bioquímicas. El resultado investigado debe ser analizado por el grupo e interpretado
según el fundamento de la prueba y se comparará con los resultados obtenidos la
próxima semana.

PARTE II (próximo laboratorio):

6. Dar lectura e interpretación a cada uno de los medios sembrados y revelar si es

necesario.
7. Cada estudiante debe elaborar los respectivos análisis de las diferentes pruebas
realizadas en la práctica, para ello se debe documentar muy bien con el fin de hacer
una correcta interpretación de los resultados. Se recomienda leer previamente el
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material complementario para cada prueba y revisar los videos para poder discutir
los resultados en el laboratorio.

Referencias

1. MacFaddin J.F. (2003). Pruebas bioquímicas para la identificación de bacterias de

importancia clínica. 3era Edición. Médica Panamericana. Capitulos: 5, 7, 18, 25, 27, 40.