Guia Practica Virtual - Bioquimica 2021 - 2 PDF

3B-2
GUÍA DE PRÁCTICAS
Unidad Académica: MEDICINA HUMANA
BIOQUÍMICA
AUTOR
Dr. NESQUEN JOSÉ TASAYCO YATACO
2021
F-CV3-3B-2
Bioquímica – Medicina Humana – Universidad Wiener Página 1

INTRODUCCIÓN
El curso de Bioquímica intenta introducir al estudiante a algunos de los procedimientos

experimentales usados en bioquímica. Incluye análisis de cinética enzimática,
carbohidratos, lípidos, respiración tisular, lipoproteínas, transaminasas, examen de
orina y hemoglobina. El estudiante también se familiarizara con algunos de los equipos
frecuentemente usados en las prácticas de bioquímica.
Las prácticas serán llevadas a cabo en grupos de tres o cinco estudiantes. Usted
puede escoger compañeros, o puede preguntar para que lo asignen a un grupo. Antes
de cada práctica de laboratorio, el estudiante debe leer en especial el fundamento y
procedimiento de la práctica, esta lectura proveerá información y entendimiento sobre
los procedimientos a ser desarrollados. Si esto no se hace, usted desperdiciara mucho
tiempo de clase, también encontrara difícil responder las preguntas de la práctica que
deben ser entregadas cada día.
El objetivo de la ciencia es hacer teorías. Las teorías científicas explican los hechos y
predicen con alto grado de probabilidad la ocurrencia de hechos similares. La
secuencia del método científico es: observar, plantear problemas, hacer hipótesis,
experimentar y formular teorías. Cada uno de los procesos del método científico,
tomado aisladamente, forma parte de la actuación cotidiana de todos los seres
humanos, pero, en su conjunto, utilizados sistemáticamente, constituyen la más
poderosa herramienta que ha diseñado la humanidad para conocer y controlar a la
naturaleza. El método científico se inicia con la observación. Lo que no puede
observarse, directa o indirectamente por medio de instrumentos o de modificaciones
de la conducta, no puede ser investigado por la ciencia. La observación debe ser
repetida en forma independiente por observadores diversos. Las observaciones
únicas, que no se repiten ni actuales ni potencialmente, no pueden ser objeto de
estudio científico.
El objetivo de la experimentación es comprobar la validez de la hipótesis. Si los

experimentos demuestran que la hipótesis es errónea, se hace una nueva y se la
sujeta a comprobación. El procedimiento puede prolongarse por mucho tiempo al
formular nuevas hipótesis y tratar de comprobarlas experimentalmente. La situación
ideal en la experimentación consiste en reducir el problema a dos alternativas posibles
que puedan contestarse con claridad, afirmativa o negativamente; pero en muchas
ocasiones los resultados del experimento sólo conducen a soluciones parciales. La
experimentación es la parte más ardua del método científico. Cada experimento es un
caso en sí mismo; el conocimiento anterior y la experiencia ayudan técnicamente para
decidir la forma en que una hipótesis puede ser comprobada experimentalmente.
El Autor

I. PRÁCTICA Nº 1: DIGESTIÓN DE CARBOHIDRATOS
1.1. MARCO TEÓRICO
Los carbohidratos son los más abundantes de todos los compuestos orgánicos en
la naturaleza. En las plantas, la energía del Sol convierte dióxido de carbono y agua
en el carbohidrato glucosa. Muchas moléculas de glucosa forman parte de las
largas cadenas de polímeros, como la del almidón, que almacena energía, o la de
la celulosa, que constituye el marco estructural de la planta. Cerca del 65% de los
alimentos de la dieta común humana consisten en carbohidratos. Todos los días se
utilizan carbohidratos, conocidos como almidones, en alimentos como pan, pasta,
papas y arroz. Otros carbohidratos denominados disacáridos incluyen sacarosa
(azúcar de mesa) y lactosa en la leche. Durante la digestión y el metabolismo
celular, los carbohidratos se oxidan en las células para proporcionar energía al
cuerpo y suministrar átomos de carbono a las células para construir moléculas de
proteínas, lípidos y ácidos nucleicos. El carbohidrato más importante en la
alimentación es la glucosa, la cual La digestión del almidón se produce en el
intestino delgado gracias a la presencia de enzimas digestivas producidas por las
glándulas salivares, el páncreas y la pared intestinal. Estas enzimas son: La alfa
amilasa salivar, la alfa amilasa pancreática y la amilo 1,6 glucosidasa de la pared
intestinal. Las alfa amilasas son enzimas que actúan a pH neutro y en presencia
de iones cloro. Rompen los enlaces amilo 1,4 dando como resultado
oligosacáridos y glucosa. Existen dos formas de evaluar la actividad enzimática de la
amilasa: Por desaparición de sustrato: forma como desaparece el almidón el que
se aprecia por la reacción del lugol, y por formación de producto: forma como
aparecen carbohidratos reductores (glucosa) en el medio, los que se aprecian por
reducción del cobre.
En nuestra práctica evaluaremos la actividad enzimática de la amilasa sobre el

almidón mediante la reacción del remanente de almidón frente al yodo a mayor
decoloración, mayor actividad enzimática.

1.2. COMPETENCIA
Realiza, valora y explica la digestión de carbohidratos por enzimas digestivas

según condiciones normales o patológicas en el organismo humano
1.3. MATERIALES, EQUIPOS Y REACTIVOS
MATERIALES
Imágenes de digestión de polisacáridos
Propiedades de los reactivos empleados en la hidrólisis del almidón
Uso de equipos de laboratorio
Tutorial de digestión de carbohidratos
Patologías asociadas
Aplicaciones prácticas
Artículos de investigación (desarrollo de seminarios)
1.4. PROCEDIMIENTO
1. Digestión de Polisacáridos

2. Propiedades de reactivos empleados en la hidrólisis del almidón
Reactivo Propiedades físicas y químicas

Almidón
HCl
Saliva
Solución yodada
3. Equipos de laboratorio
Materiales Usos y manejo

Espectrofotómetro
Baño María
Baño María
Espectrofotómetro

4. Tutorial sobre procedimiento de técnica de digestión de carbohidratos
Preparar cuatro tubos de ensayo como se indica:
TUBO 1 2 3 4
Almidón 1% (mL) 2 2 2 2
Buffer fosfato pH 6,6 (mL) 1 1 1 0
HCL 0,3N (mL) 0 0 0 3,4
Suero fisiológico (mL) 3 2,4 0 0
Agua destilada (mL) 0 0 2,4 0
Colocar en Baño María a 37 ºC por 5 minutos. Agregar
Solución de saliva (mL)
Colocar en Baño María a 37 ºC por 20 minutos
Pasado este tiempo tomar 0,5 mL de cada tubo y preparar cuatro tubos más de
acuerdo a:
TUBO 1 2 3 4
Digestión tubo 1 (mL) 0, 5 0 0 0
Digestión tubo 2 (mL) 0 0,5 0 0
Digestión tubo 3 (mL) 0 0 0,5 0
Digestión tubo 4 (mL) 0 0 0 0,5
HCL 0,05N (mL) 5 5 5 5
Solución yodada (mL) 0,5 0,5 0,5 0,5
Dejar en reposo por 15 minutos. Leer al fotocolorímetro con filtro rojo (660nm)
5. Seminarios
a. Síndrome de mala absorción de carbohidratos
b. Galactosemia y Fructosemia
1.5. RESULTADOS
1. Tutorial respecto a interpretación de lecturas de absorbancias del

espectrofotómetro

2. Escriba las características de la digestión de carbohidratos según lo indicado en
la tabla siguiente
¿Qué sucede en este sitio con la digestión de

Lugar de digestión
carbohidratos?
Boca
Estómago
Intestino
1.6. CUESTIONARIO
1. Explique cómo se realiza la hidrólisis del almidón
2. ¿Cómo se produce la digestión del almidón en el intestino delgado?
3. ¿Cuál es el mecanismo de acción de la somatostatina en la absorción de los

carbohidratos?
4. Esquematice el metabolismo de la glucosa
1.7. FUENTES DE INFORMACIÓN
1. LEHNINGER. Principios de Bioquímica. Editorial Omega. Quinta Edición. 2009

2. HARVEY, R. Bioquímica. Editorial Lippincott Williams & Wilkins. 2011
3. MURRAY K.R. and MAYES P. Bioquímica de Harper. Editorial Manual
Moderno. México.2006.
4. ALVARADO C. Repasando Bioquímica y Nutrición. Lima. 2da. Edición. 2012

II. PRÁCTICA Nº 2: ABSORCIÓN DE CARBOHIDRATOS
2.1. MARCO TEÓRICO
Después de la digestión de los carbohidratos por efecto de amilasas salivar y

pancreática, amilo 1,6 glucosidasa, y disacarasas tenemos como resultado
monosacáridos: glucosa, fructosa, galactosa, que deberán ser absorbidos por la
mucosa intestinal para su ingreso a la circulación sanguínea. Los carbohidratos se
absorben en el yeyuno mediante dos mecanismos, la simple difusión favorecida
por la gradiente de concentración y el transporte activo, aún contra la gradiente. El
orden de facilidad en la absorción es de galactosa glucosa: ribosa.
El borde en cepillo de las células intestinales tiene varios sistemas trasportadores.

Un transportador de glucosa dependiente del sodio (SLGT1) se enlaza tanto a la
glucosa como al sodio en sitios separados aumentando el sodio intracelular. La
energía necesaria para este transporte se obtiene de la hidrólisis del ATP
vinculado a una bomba de sodio que intercambia sodio con potasio.
También participa un transportador facilitador independiente del sodio llamado

GLUT 5. La hidrólisis de los polisacáridos, oligosacáridos y disacáridos es muy
rápida por lo que usualmente los procedimientos de absorción se saturan con
rapidez.
La diabetes dependiente de insulina cursa con un aumento de la concentración de

glucosa en sangre (glicemia), que se produce de manera repentina y además es
severa. Una hiperglucemia superior a 126 mg/dl detectada en más de una ocasión
en ayunas, además se considera también un valor mayor a 200 mg/dl en cualquier
momento son indicativos de posible diabetes, diagnóstico que debe confirmarse
con otras pruebas.

La determinación de glucosa sanguínea es una prueba muy frecuente en
bioquímica y se puede llevar a cabo tanto por métodos químicos como
enzimáticos, siendo estos últimos los más específicos.
Hay dos tipos de métodos químicos:
a. Reducimétricos, que se basan en la capacidad reductora de la glucosa. Debido

a la presencia en la muestra de otros compuestos reductores, estos métodos dan
cifras superiores a las correspondientes a la glucosa verdadera. Ejemplos son el
método de Folin-Wu y el de Somogy-Nelson.
b. Furfurálicos: se basan en la capacidad de la glucosa para formar furfural al

sufrir deshidratación en un medio ácido. Un ejemplo es el método que emplea
orto-toluidina.
En cuanto a los métodos enzimáticos:
a. Método de la hexoquinasa: emplea las enzimas hexoquinasa y glucosa-6-

fosfato deshidrogenasa. Por cada molécula de glucosa se forma una de NADPH,
que puede medirse espectrofotométricamente a 340 nm. Es el método de
referencia recomendado por las organizaciones internacionales.
b. Método de glucosa oxidasa y peroxidasa (GOD-POD): es el que se utiliza en

esta práctica para medir los niveles de glucosa sanguínea de la muestra problema
y de los estándares. Se explica a continuación:
En el método GOD-POD, en un primer paso la glucosa oxidasa cataliza la

oxidación de la D-glucosa a ácido D-glucónico con formación de peróxido de
hidrógeno. Éste es utilizado por la peroxidasa para oxidar a la 4-aminofenazona y
al fenol, dando lugar a una quinonaimina coloreada. La intensidad de color será
proporcional a la concentración de glucosa presente inicialmente. El esquema de
la reacción es el siguiente:

2.2. COMPETENCIA
Realiza la determinación de glucosa en sangre y explica los valores obtenidos

según estado normal o patológico de los pacientes.
2.3. MATERIALES Y REACTIVOS
MATERIALES
Imágenes de metabolismo de la glucosa
Instructivo del Kit para análisis de niveles de glucosa en muestra de sangre
Uso de equipos de laboratorio (espectrofotómetro, centrífuga, Baño María)
Procedimiento para evaluar niveles de glucosa en sangre
2.4. PROCEDIMIENTO
1. Absorción y metabolismo de la glucosa

2. Fundamentos de métodos de análisis de glucosa en muestras biológicas
La medición de la Glucosa sanguínea es importante en el diagnóstico y

tratamiento de la diabetes y otras patologías, tales como hipoglicemia y problemas
renales, entre otras.
Fundamentos del método. La glucosa reacciona con el reactivo enzimático que

contiene una mezcla de las enzimas Glucosa Oxidasa (GOD) y Peroxidasa (POD).
En la primera etapa la Glucosa es oxidada a Ac. Glucónico por la acción de la
enzima GOD, liberándose como producto H2O2, el cual en una reacción mediada
por la enzima POD, reacciona con el Ac. p-Hidroxibenzoico y 4- Aminoantipirina
produciendose un compuesto coloreado con un máximo de absorción a 505 nm.,
en cantidad proporcional a la cantidad de Glucosa presente en la muestra.

3. Equipos de laboratorio
Materiales Usos y manejo
Espectrofotómetro
Centrifuga
Baño María
Centrífuga

4. Tutorial de procedimiento para evaluar niveles de glucosa en sangre
La muestra de sangre extraída del paciente será centrifugada y se separará el

suero. Hacer una dilución del suero midiendo exactamente en un tubo de ensayo
0.2 ml de suero y agregar 4.8 ml de agua destilada, mezclar hasta homogenizar.
Luego se preparan los siguientes tubos:
Tubos Blanco Standard Muestra

Muestra (suero diluído) -- -- 20 uL
Estándard de glucosa -- 20 uL --
Reactivo de glucosa 2 mL 2 mL 2 mL
Incubar los tres tubos en Baño María de 37ºC por 10 minutos. Mezclar bien la
solución. Leer las absorbancias en el espectrofotómetro a 505 nm
Obtención de muestra de sangre
Centrifugación de muestra de sangre

Preparación de la muestra y estándar
Incubación de la muestra y estándar en Baño María

Muestras luego de la incubación y colocadas en celdas para lectura en el
espectrofotómetro
5. Seminarios
a. Enfermedad de Cori, McArdle, Pompe, Anderson
b. Deficiencia de glucosa-6-fosfato deshidrogenasa
2.5. RESULTADOS
Resultado de lecturas de absorbancia en el espectrofotómetro

2.6. CUESTIONARIO
1. Explique el mecanismo de absorción de la glucosa por la membrana celular
2. ¿Cuál es la concentración normal de insulina en sangre?
3. ¿Cuál es el mecanismo de acción de la insulina?
4. ¿Cuáles son los criterios de diagnóstico de la diabetes mellitus?
5. ¿Cuáles son las diferencias entre la diabetes mellitus tipo 1 y la diabetes

mellitus tipo 2?


III. PRÁCTICA Nº 3: ANÁLISIS DE GLUCOSA POST PRANDIAL
3.1. MARCO TEÓRICO
La vía metabólica más importante para la glucosa es la vía glicolítica. Está

presente, naturalmente, en todos los tejidos y es responsable del
aprovechamiento energético de la glucosa y aún de otros carbohidratos. Tiene dos
formas de manifestarse: la forma anaeróbica cuando la concentración de oxígeno
es baja, produce ácido pirúvico y ácido láctico, y genera escasamente dos
moléculas de ATP, tal como se aprecia en la siguiente fórmula global.
GLUCOSA + 2ADP + Pi 2 lactato + 2ATP + 2H2O
Cuando la glicólisis transcurre en presencia abundante de oxígeno, tiene como

producto final el ácido pirúvico, el cual se transforma en acetil CoA mediante el
proceso de decarboxilación oxidativa, en ingresa al Ciclo de Krebs donde produce
moléculas de ATP.
Las pruebas de tolerancia a la glucosa oral fueron utilizadas por mucho tiempo
para diagnóstico de Diabetes Mellitus o intolerancia disminuida, pero ya no se
utilizan de rutina, pero si pueden servir tanto para la Diabetes como para la
intolerancia. Importante es recalcar que los niveles importantes en ambos casos
son los obtenidos a las dos horas, y que la cantidad de glucosa a ingerir debe ser
de 75 gramos. El disolver 75 gramos en por lo menos 300 ml de agua hace la

solución más agradable al paladar y por lo tanto tendrán más aceptación por parte
del paciente.
En caso de la prueba de tolerancia de 75 gramos en adultos, en niños se debe

utilizar una cantidad de glucosa correspondiente al peso del niño (1,75 g de
glucosa por Kg de peso). Es de suma importancia recordar que antes de iniciar
cualquier prueba de tolerancia a la glucosa oral, se debe pedir una muestra de
orina al paciente, para hacerle un análisis cualitativo de glucosa. Esto debido a
que si el paciente presenta glucosuria, no se debe realizar la prueba de tolerancia,
ya que la glucosuria indica en la gran mayoría de los casos, niveles sanguíneos
de glucosa elevados y la ingesta de altas concentraciones de glucosa le podría
provocar al paciente un shock hiperglicémico.
Existen otras pruebas de tolerancia que son aceptadas tanto por la Organización
Mundial de la Salud como por la American Diabetes Association, estas son las
relacionadas con la Diabetes Mellitus Gestacional.
La curva de tolerancia a la glucosa para tamiz de la Diabetes mellitus Gestacional

(DMG) consiste en la ingesta en ayunas de 50 gramos de glucosa, se mide la
glicemia a la hora, si los niveles son menores a 140 mg/dl se desecha la DMG, si
los niveles son iguales o mayores a 140 mg/dl se debe proceder a hacer la prueba
confirmatoria para DMG. Esta consiste en ingerir en ayunas 100 gramos de
glucosa y hacer una curva de tres horas. Si dos de los niveles obtenidos en dicha
curva sobrepasan los valores indicados en la siguiente tabla, se hace el
diagnóstico de DMG.
La prueba de glucosa postprandial viene a ser una prueba de tolerancia a la

glucosa acortada, donde solo se considera el valor basal y el de las dos horas.
3.2. COMPETENCIA
Realiza la prueba de tolerancia oral a la glucosa e interpreta y explica los

resultados según criterios establecidos para el diagnóstico de la diabetes mellitus

MATERIALES
Esquema propuesto para diagnóstico de diabetes mellitus
Instructivo del Kit para análisis de niveles de glucosa en muestra de sangre
Procedimiento para evaluar niveles de glucosa en sangre
3.4. PROCEDIMIENTO
1. Esquema propuesto para diagnóstico de diabetes mellitus

2. Tutorial de procedimiento para evaluar niveles de glucosa en sangre
Se determinará la glicemia en muestras obtenidas a una persona en forma basal,

a los 30 min, 60 min y 120 min. Luego de tomar la muestra sanguínea basal se le
da de tomar al paciente 75 gr de glucosa disuelto en 300 mL de agua con unas
gotas de limón. Las muestras de sangre extraídas de la persona serán
centrifugadas y se separarán los sueros. Para la determinación de las glicemias
se utilizará el método de la glucosa oxidasa – peroxidasa (GOD-POD).
Muestra Muestra Muestra Muestra

Tubos Blanco Standard
0 min 30 min 60 min 120 min
Muestra --- --- 20 ul 20 ul 20 ul 20 ul
Standard --- 20 ul --- --- --- ---
Reactivo de glucosa 2 mL 2 mL 2 mL 2 mL 2 mL 2 mL
Incubar los tubos en Baño María de 37ºC por 10 minutos. Leer las absorbancias
para cada una de los tubos en el espectrofotómetro a 505 nm.
3.5. RESULTADOS
Resultados de absorbancia en muestra basal

Resultados de glucosa en muestra basal
Resultados de absorbancia post prandial a las 2 horas
Resultados de glucosa post prandial a las 2 horas

Seminarios
a. Mecanismos bioquímicos y fisiopatología de la Diabetes mellitus
b. Complicaciones y criterios de control de la diabetes mellitus
3.6. CUESTIONARIO
1. Con los datos de glicemia obtenidos en el experimento construir en un papel

milimetrado una gráfica de tiempo vs. Glicemia y apreciar la curva de tolerancia a
la glucosa.
2. Como sería esta curva en el caso de una persona normal, un diabético y un

intolerante a la glucosa.
3. ¿Qué importancia tiene la detección de micro albuminuria en una persona?
4. ¿Qué son y en qué casos se hace un dosaje de péptido C y de insulina en un

paciente diabético.
5. ¿Cuáles son las complicaciones agudas y crónicas de la diabetes?


IV. PRÁCTICA Nº 4: ESPECTROFOTOMETRÍA
4.1. MARCO TEÓRICO
Se denomina Análisis Colorimétrico al conjunto de métodos de análisis

cuantitativos que se fundamentan en la medición de la intensidad de la luz
transmitida a través de una solución coloreada, ya sea que se trate de sustancias
naturalmente coloreadas ò que se han hecho de tal calidad mediante reacciones
químicas adecuadas.
Cuando una haz de luz (luz incidente, Io) atraviesa una solución, una parte de la
radiación queda absorbida por las moléculas del soluto coloreado, sufriendo una
reducción de su intensidad (Luz transmitida, I), proporcional a la capacidad de
absorción de dichas moléculas.
Casi todas las sustancias en solución tienen la capacidad de absorber en forma

selectiva determinadas radiaciones luminosas unas más que otras dejándolas
pasar. La longitud de onda en la que las moléculas de dicha sustancia absorbe
con mayor intensidad la luz, se denomina “longitud de máxima absorción” o
“lambda máximo”.
Si consideramos que cada molécula absorbe una determinada cantidad de luz, la

intensidad de la luz transmitida por una solución disminuirá en relación con el
aumento del número de moléculas que se interpongan entre la fuente luminosa y
el observador. Este número varía de acuerdo con la concentración del soluto y el
espesor del recipiente que contiene la solución, estos factores están considerados
en la “Ley de Lambert y Beer”, que rige los principios de la Espectrofotometría y
cuyas formas de expresión son:
Log (Io/I) = E.b.c = A = D.O.
Donde:
Io = Intensidad de la luz incidente.

I = Intensidad de la luz transmitida.
E = Coeficiente de extinción molar, valor constante dependiendo de la naturaleza
de la Sustancia y de la longitud de onda
b = Espesor del recipiente en cm.
c = Concentración de la solución.
A = D.O. = Absorbancia (A) aumenta conforme disminuye la Transmitancia (T) y la
relación entre ambas es logarítmica
Los fotocolorímetros y los espectrofotómetros reportan sus resultados bajo dos
formas: absorbancia o luz absorbida por las partícula de la solución y

transmitancia o luz transmitida luego de atravesar el tubo con la solución. La
transmitancia se expresa en valores numéricos entre 0 y 100%, es decir que una
solución que no tiene particular trasmitirá el 100% y una perfectamente opaca el
0%. La absorbancia, también llamada densidad óptica DO, se expresa en valores
semilogarítmicos entre 0 y 2 correspondiendo el 0 a aquella solución que no tiene
partículas y por lo tanto no absorbe la luz.
Para encontrar la concentración de una solución problema, debemos comparar su

lectura frente a un blanco – agua destilada o reactiva sin modificarse – con la
lectura de un patrón o solución estándar bajo las mismas condiciones. Una
solución estándar es generalmente una que contiene el problema con una
concentración perfectamente medida en el laboratorio.
CALCULO DE LA CONCENTRACIÓN DE UNA SOLUCION PROBLEMA:
Para calcular la concentración de una solución problema con el empleo de un

Espectrofotómetro, existen dos formas:
- Método de la curva standard o curva de calibración.
- Factor de calibración.
a) CURVA STANDARD: Este método consiste en utilizar varios estándares de

concentraciones conocidas y progresivas para luego construir un gráfico en un
sistema de coordenadas en el que se colocan las lecturas en las ordenadas (Eje
Y) y las concentraciones en las abscisas (Eje X). En la recta obtenida (Función
lineal), se puede extrapolar la absorbancia o densidad óptica de la muestra
problema, hallando la concentración de la misma en el eje de las abscisas.
b) FACTOR DE CALIBRACIÓN (Fc): El factor de calibración es un término que

se relaciona con la concentración de una sustancia con su absorbancia, es decir
la intensidad que absorbe una sustancia de concentración conocida (Standard o
Patrón).
Así tenemos:
Fc = [ Stándard ] / A
Donde:
Fc = factor de calibración
A = absorbancia del tubo standard
[Standard] = concentración del standard
Con el factor de calibración se puede determinar la concentración de una muestra

desconocida o problema (MP), conociendo su absorbancia.
Si la muestra problema y el standard es procesado de la misma manera

(diluciones) se podrá usar directamente la siguiente fórmula:
[ MP ] = A. Fc

Si la muestra problema sufre diluciones previas se encontrará el factor de dilución
(Fd) que es matemáticamente la inversa de la dilución (dil) y esta a su vez es:
Dil = Vol / Vol o
Donde:
Vol = Volumen de la muestra problema tomada para hacer la dilución.

Vol o = Volumen total.
Para este segundo caso cuando se quiere saber la concentración de una muestra
problema se procederá usando la siguiente fórmula:
[ MP ] = A. Fc. dil
Donde:
A = Absorbancia de la muestra problema.

Fc = Factor de calibración.
Dil = Factor de dilución.
[MP] = Concentración de la muestra.
4.2. COMPETENCIA
Usa correctamente el espectrofotómetro y determina la concentración de muestra

problema
Tutorial de aplicación de método espectroscópico

Uso del espectrofotómetro
Procedimiento para curva de calibración por método espectroscópico

4.4. PROCEDIMIENTO
1. Tutorial de aplicación de método espectroscópico
La pendiente de la recta se calcula mediante regresión lineal

2. Tutorial de preparación de disoluciones y curva de calibración en el
espectrofotómetro
Preparación de una curva de calibración: el experimento consiste en preparar

tubos de concentración creciente de un colorante y leerlos al espectrofotómetro,
llevando a cero (0) el aparato con agua destilada. Construir una gráfica usando
papel milimetrado para las lecturas hechas en DO (densidad óptica) o papel
semilogarítmicos para las lecturas hechas en % transmitancia.
Para el efecto, preparar cinco tubos de acuerdo al esquema y leer las soluciones
al espectrofotómetro a 540 nm de longitud de onda. Practicar esta lectura tanto en
DO como en % de transmitancia.
Con los datos obtenidos construir en un papel milimetrado la gráfica de

absorbancia en el eje de las Ordenadas vs concentración de azul de metileno en
el eje de las Abscisas.
Una vez obtenida la curva de calibración, medir la absorbancia de las muestras

desconocidas 1 y 2.
Calcular la concentración de la muestra problema por los siguientes métodos:
a. Gráficamente extrapolando su absorbancia en la curva de calibración.
b. Usando Factor de Calibración, multiplicando su absorbancia por el factor de

calibración del standard.
Tubos Nº
Contenido
1 2 3 4 5
mL de azul de metileno (5 mg/mL) 2 4 6 8 10
mL agua destilada 8 6 4 2 0
Preparación de los tubos de ensayo

4.5. RESULTADOS
Resultados de lectura de absorbancia y transmitancia de cada tubo de

ensayo
CONCENTRACION
A=(A=2-logT%) %T
(mg/ml)
1mg/ml 0.016 97.1%
2mg/ml 0.026 94.4%
3mg/ml 0.049 89.6%
4mg/ml 0.084 82.9%
5mg/ml 0.124 75.4%
Muestra desconocida 1 0.010 98.2%
Muestra desconocida 2 0.032 93.4%

4.6. CUESTIONARIO
1. Explique el mecanismo de funcionamiento de un espectrofotómetro.
2. Grafique el espectro de luz, tanto en el rango visible como no visible con sus
respectivas longitudes de ondas.
4. Qué relación matemática existe entre Absorbancia y Transmitancia?
5.- Construya una curva de calibración con los siguientes valores:
Standard 1 Standard 2 Standard 3 Standard 4 Standard 5

Concentración 5 mg/dL 10 mg/dL 20 mg/dL 30 mg/dL 40 mg/dL
Absorbancia 0.025 0,050 0.100 0.150 0.200
Con la curva obtenida hallar la concentración de las siguientes muestras,

sabiendo que sus absorbancia fueron:
Muestra A........................0.015
Muestra B........................0.125
Muestra C........................0.350

3. MURRAY K.R. and MAYES P. Bioquímica de Harper. Editorial Manual Moderno.
México.2006.

V. PRÁCTICA Nº 5: RESPIRACIÓN TISULAR
5.1. MARCO TEÓRICO
Se llama respiración tisular al intercambio gaseoso que se produce entre la sangre

y los diferentes tejidos del cuerpo. La sangre oxigenada en los pulmones llega a
rodear a las células de los distintos tejidos transportada por los capilares de la
arteria aorta. En ese punto se produce la respiración tisular, que es un proceso de
intercambio: Por un lado, el oxígeno pasa desde la sangre hacia las células por
difusión a través de la membrana celular. A su vez, desde estas pasan hacia la
sangre el dióxido de carbono y el vapor de agua de desecho. La sangre
carboxigenada es transportada de regreso por los capilares venosos hasta las
venas cavas, y de éstas al corazón, para ser enviada nuevamente a los pulmones
y las células de nuestro cuerpo. El respirar se hace sin darse cuenta, ya que es
algo que se ejecuta en forma mecánica, incorporando oxígeno cuando inspiras y
expeliendo anhídrido carbónico cuando espiras. Para mantenerse activas, las
células del organismo necesitan oxígeno. El sistema respiratorio realiza esta
función mediante la respiración, que es un proceso involuntario, controlado por los
centros respiratorios ubicados en el tronco cerebral. Lo accionan ciertos órganos y
estructuras como las vías respiratorias o aéreas (cavidad nasal, faringe, laringe,
tráquea y bronquios) y los pulmones. Luego de que el aire llega a los pulmones, el
suministro de oxígeno es transportado por la sangre, para distribuirlo a todos los
tejidos del cuerpo. Paralelamente, este sistema se encarga de expulsar el dióxido
de carbono hacia el exterior del organismo.
En la respiración tisular se aprovecha la energía almacenada en los nutrientes

(glucosa, ácidos grasos, aminoácidos) a través del Acetil CoA, mediante procesos
de oxidación. Durante el proceso de oxidación del Acetil CoA se forman
equivalentes reductores en forma de hidrógeno o electrones que ingresan a la
cadena respiratoria, localizada en las mitocondrias y genera moléculas de ATP.
El punto final del transporte de los electrones por la cadena respiratoria es el
oxígeno. Dos átomos de hidrógeno se unen a ½ molécula de oxígeno para forma
una molécula de agua. El proceso oxidativo de los nutrientes se puede seguir por
el consumo de oxígeno.
5.2. COMPETENCIA
Analiza la respiración tisular y explica el significado clínico en procesos normales y

patológicos en el organismo humano
Fundamentos de la cadena transportadora de electrones

Procedimiento experimental de la respiración tisular

5.4. PROCEDIMIENTO
1. Tutorial respecto a la cadena transportadora de electrones

Teoría quimiosmótica de Mitchel
Exportación del ATP desde la matriz hacia el citoplasma

2. Tutorial respecto al procedimiento experimental de la respiración tisular
El experimento estudia la respiración tisular mediante la manometría. Un

manómetro es un instrumento que mide los cambios en la presión de los gases.
Está basado en el principio de vasos comunicantes, si colocamos un líquido en
dos recipientes que se comunican entre sí, ambas ramas serán iguales siempre
que sobre ellas exista la misma presión si una de ellas disminuye los niveles de
líquido se desigualan. El equipo consta de un ambiente cerrado.
Preparar dos frascos de acuerdo al siguiente esquema:
Frasco Nº 1
Solución de Potter pH 7,4 (mL) 3
Succinato de potasio 0,5M (mL) 0,3
Agua destilada (mL) 0,7
Homogenizado (mL) 0,5
Cerrar bien los frascos. Incubar a temperatura ambiente. Medir cada 2 minutos la
modificación del nivel del manómetro.
5.5. RESULTADOS
1. Dibuja las partes que conforman el mitocondrias e indica sus funciones y

características

2. Explica cómo se obtiene el valor de producción de ATP 2.5 y 1.5 por
NADH+H y FADH2 respectivamente.
2 ATP
1.5 ATP
5.6. CUESTIONARIO
1. ¿Qué es la manometría y explique el fundamento de la técnica?
2. ¿Qué es respiración interna y externa?
3. Explique el mecanismo de producción de ATP en las células
4. ¿Cuál es la concentración de gases en la sangre?
5. ¿Qué es acidosis y alcalosis respiratoria?


VI. PRÁCTICA Nº 6: COLESTEROL, FRACCIONES LIPOPROTEICAS
6.1. MARCO TEÓRICO
El nivel sérico de colesterol ha sido objeto en los últimos años de numerosas

investigaciones tanto en individuos sanos como enfermos. Desde un punto de
vista médico la determinación de colesterol en forma aislada tiene utilidad
diagnóstica limitada. Sin embargo, su concentración varía de manera más o
menos predecible en un gran número de condiciones clínicas. Se ha visto que el
colesterol es uno de los factores contribuyentes a la formación de ateromas dado
que las complicaciones arterioescleróticas prevalecen en individuos
hipercolesterolemicos. Diversos estudios epidemiológicos han permitido observar
además, que el riesgo de contraer enfermedad cardíaca coronaria (ECC) para los
individuos (varones de más de 40 años) con colesterolemia menor ò igual a 200
mg% es 3 veces menor que entre individuos con más de 230 mg% y 6 veces
menor que entre individuos con más de 260 mg%.
Sin embargo, actualmente se sabe que es necesario conocer además la

distribución de las lipoproteínas encargadas del transporte: HDL (lipoproteínas de
alta densidad), considerada como el “factor protector” y LDL (lipoproteínas de baja
densidad), consideradas como el verdadero “factor de riesgo”. Las funciones
biológicas inherentes a los distintos grupos de lipoproteínas, las variaciones en su
composición y los resultados de los diversos estudios epidemiológicos, indican
que los valores aislados de colesterol HDL y colesterol LDL no pueden tomarse
como índices predicativos de riesgo, sino que es necesario conformar un perfil
Lipidico con los valores de colesterol total, colesterol LDL y colesterol HDL.
Fundamento del método de colesterol; el colesterol es oxidado enzimáticamente

por la colesterol oxidasa (CHOD), previa hidrólisis enzimática de los esteres
mediante una lipasa de origen fungal. El agua oxigenada generada en la
oxidación, produce la copulación oxidativa del fenol con la 4-aminofenazona (4-
AF) mediante una reacción catalizada por la peroxidasa. El producto es una
quinonaimina roja con absorbancia máxima a 505 nm.
Fundamentos del método HDL colesterol en suero: Las lipoproteínas de alta

densidad (HDL) se separan precipitando selectivamente las lipoproteínas de baja
y muy baja densidad (LDL y VLDL) mediante el agregado de Sulfato de Dextrán
de PM 500,000 en presencia de iones Mg++. En el sobrenadante separado por
centrifugación, quedan las HDL y se realiza la determinación del colesterol ligado
a las mismas, empleando el sistema más conveniente.

Fundamentos del método LDL colesterol en suero: Las lipoproteínas de baja
densidad (LDL) se separan del suero precipitándolas selectivamente mediante el
agregado de polímeros de alto peso molecular. Luego de centrifugar, en el
sobrenadante quedan las demás lipoproteínas (HDL y VLDL), el colesterol ligado
a las mismas se determina empleando el sistema más conveniente. Por diferencia
entre el colesterol total y el determinado en el sobrenadante, se obtiene el
colesterol unido a las LDL.
6.2. COMPETENCIA
Realiza y valora el análisis de colesterol total, HDL y LDL en muestras de suero y

explica los resultados de los valores obtenidos relacionando con el estado normal
o patológico en los pacientes.
Imágenes de metabolismo de lípidos

Instructivo del Kit para análisis de niveles Colesterol total, HDL y LDL
Procedimiento para evaluar niveles de Colesterol total, HDL y LDL
6.4. PROCEDIMIENTO
1. Absorción y síntesis de lípidos
Absorción de colesterol

Síntesis de colesterol

2. Fundamento de análisis de colesterol en muestra de sangre
El colesterol se determina por acción de las enzimas Colesterol esterhidrolasa y

Colesterol oxidasa. La primera libera el colesterol de los ésteres de colesterol, y la
segunda oxida el colesterol libre produciéndose peróxido de hidrógeno, el cual en
presencia de la enzima peroxidasa reacciona con el sistema cromogénico dando
origen a un compuesto coloreado que absorbe a 505 nm
3. Tutorial respecto al procedimiento para evaluar niveles de Colesterol total,

HDL y LDL
a. Determinación de Colesterol en suero: En tres tubos colocar:

Standard --- 20 uL ---
Muestra --- --- 20 uL
Reactivo de trabajo 2 mL 2 mL 2 mL
Incubar 15 minutos en Baño María a 37 ºC, leer en el espectrofotómetro a 505 nm
b. Determinación de HDL colesterol en suero: En un tubo medir 0.5 ml de

muestra y agregar 0.05 ml (50 ul) de Reactivo Precipitante. Homogenizar agitando
(sin invertir) durante 20 segundos. Dejar 30-40 minutos en refrigeración (4-10°C).
No colocar en el congelador. Centrifugar a 3000 rpm. por 03 minutos. Usar el
sobrenadante como muestra.
En tres tubos colocar:

Muestra (sobrenadante) --- --- 100 uL
Incubar 15 minutos en Baño María a 37 ºC, leer en el espectrofotómetro a 505 nm.
c. Determinación de LDL colesterol en suero: En un tubo, colocar 0.2 ml (200

ul) de suero problema y añadir 0.1 ml (100 ul) de Reactivo Precipitante.
Homogenizar agitando (sin invertir) durante 20 segundos. Dejar 15 minutos en un
baño de agua a 20-25°C. Centrifugar a 3000 rpm. por 03 minutos. Usar el
sobrenadante como muestra.

En tres tubos colocar:

Muestra (sobrenadante) --- --- 100 uL
Incubar 15 minutos en Baño María a 37 ºC, leer en el espectrofotómetro a 505 nm.
Obtención de muestra de sangre y centrigugación
Preparación de la muestra y determinación de absorbancia en

espectrofotómetro

4. Seminarios
a. Arteroesclerosis
b. Trombosis
c. Infarto al miocardio
6.5. RESULTADOS
Valores de referencia
HDL
Colesterol Total

LDL
6.6. CUESTIONARIO
1.- ¿Qué es riesgo coronario?
2.- Explique qué es la arterioesclerosis
3.- Describa como se produce la biosíntesis de colesterol dentro del organismo.
4.- Explique que es el colesterol VLDL y como se calcula.
5.- Que rol cumplen los triglicéridos y como se realiza su metabolismo.


VII. PRÁCTICA Nº 7: ANÁLISIS DE TRIGLICÉRIDOS
7.1. MARCO TEÓRICO
Los triglicéridos forman la mayor parte del peso seco del tejido adiposo,
constituyendo por lo tanto una potente forma de almacenamiento de energía. El
movimiento de ácidos grasos entre los distintos compartimientos del organismo,
se produce con gran rapidez en respuesta a diversos estímulos (dieta, actividad
física, stress, edad, etc.). Por este motivo es de esperar que los triglicéridos (uno
de los más importantes vehículos para el transporte de ácidos grasos) varíen
también su concentración en respuesta a estos factores fisiológicos.
Sin embargo, el equilibrio de estos mecanismos puede verse alterado,

conduciendo a niveles anormales de triglicéridos circulantes. La persistencia de
esta condición, se asocia con numerosas patologías, tales como enfermedad
hepática, renal, Hiperlipidemias esenciales, etc.
Un caso que resulta de particular interés es el aumento de triglicéridos en

individuos obesos, en los cuales tiene importancia pronostica, respecto a la
probabilidad de desarrollar enfermedad cardíaca coronaria. Alrededor del 50% de
los lípidos de las lesiones ateromatosas que ocurren en las arterias coronarias son
triglicéridos, por lo que es posible relacionar a los triglicéridos con la patogénesis
de la arteriosclerosis coronaria. Este punto de vista está sustentado por el hecho
de que un gran porcentaje de pacientes con infarto de miocardio también exhiben
Hipertrigliceridemia.
Para la determinación de triglicéridos en suero se usará la determinación

enzimática de glicerol a partir de glicéridos.
Los métodos enzimáticos se basan en la determinación del glicerol contenido en

las moléculas de los triglicéridos, tras la hidrólisis (química ò enzimática) para
remover los ácidos grasos. La determinación enzimática del glicerol ha sido usada
durante muchos años; sin embargo, en estos métodos se empleaba la hidrólisis
alcalina de los triglicéridos. El reciente desarrollo del uso de enzimas (lipasa,
usualmente combinada con una proteasa) para catalizar la hidrólisis, ha
posibilitado el empleo de métodos directos, rápidos y específicos. Los sistemas
totalmente enzimáticos eliminan el uso de reactivos cáusticos, extracción con
solventes, baños de altas temperaturas y mezclas de adsorción para la remoción
de Fosfolípidos. Estudios recientes se han concentrado en desarrollar reactivos
con lipasas, que hidrolizan completamente los triglicéridos.
Fundamentos del método: Se producen reacciones químicas basadas en la

determinación química de glicerol a partir de glicéridos.
La primera etapa consiste en que los triglicéridos son hidrolizados

enzimáticamente por una lipoproteína lipasa específica, produciendo glicerol y
ácidos grasos.
Lipoproteína lipasa

Triglicéridos ----------------------- Glicerol + 3 ácidos grasos
En una segunda etapa el glicerol se fosforila a glicerol-1-fosfato en presencia de

glicerolkinasa.
Glycerol kinasa
Glycerol + ATP -------------------- Glicerol-1-P + ADP
En una tercera etapa el derivado fosforilado se oxida mediante la glicerol fosfato

oxidasa (GPO), con producción de agua oxigenada.
GPO
Glicerol-1-fosfato + O2 ----------------- H2O2 + dihidroxiacetonafosfato
Finalmente el agua oxigenada así formada produce la unión oxidativa del fenol y
la 4-aminofenazona, en reacción catalizada por la peroxidasa (POD), con
formación de una quinonaimina roja.
POD
2 H2O2 + 4-AF + clorofenol -------------4-(p-benzoquinona monoimino) fenazona + 4 H2O
7.2. COMPETENCIA
Realiza y valora el análisis de triglicéridos en muestras de suero y explica los

resultados de los valores obtenidos relacionando con el estado normal o
patológico en los pacientes
Imágenes referidas a los triglicéridos

Instructivo del Kit para análisis de triglicéridos
Procedimiento para evaluar niveles de triglicéridos

7.4. PROCEDIMIENTO
1. Triglicéridos

2. Fundamentos de análisis de triglicéridos en muestra de sangre
Los triglicéridos son hidrolizados por una lipasa específica liberando ácidos grasos
y glicerol. El glicerol es fosforilado por la enzima gliceroquinasa y posteriormente,
el glicerol-1-fosfato es oxidado a dihidroxiacetona fosfato por la enzima glicerol-
fosfato oxidasa, generándose peróxido de hidrógeno. Posteriormente, en una
reacción del tipo Trinder, el peróxido de hidrógeno reacciona con 4-
Aminoantipirina y el ácido 3,5-Dicloro-2-Hidroxi-bencensulfónico para producir por
medio de la enzima peroxidasa un compuesto coloreado en cantidad proporcional
a la concentración de triglicéridos presente en la muestra, midiéndose la
absorbancia a 520 nm
3. Tutorial respecto al procedimiento de análisis de triglicéridos en sangre
En tres tubos de ensayo marcados B (Blanco), S (Standard) y M (Muestra),

colocar:

Muestra --- --- 20 uL
Mezclar: Incubar 5 minutos en Baño María a 37ºC. Enfriar y leer en
espectrofotómetro a 505 nm llevando el aparato a cero con agua destilada.
Obtención y centrifugación de muestra de sangre

Lectura de absorbancia en el espectrofotómetro
4. Seminarios
a. Hipertrogliceridemia
b. Betaoxidación de ácidos grasos
7.5. RESULTADOS
Para hallar la concentración de triglicéridos en el suero problema, se debe utilizar

la siguiente expresión
Valores de referencias:
Deseable : < 150 mg%.

Moderadamente elevado a elevado : 150 – 199 mg%.
Elevado : 200 – 499 mg%.
Muy elevado : > 500 mg%.
7.6. CUESTIONARIO
1.- Describa las características principales de los lípidos y su clasificación.
2.- Explique la importancia biológica de los triglicéridos.

3.- ¿Cómo se produce la digestión y absorción de los triglicéridos?
4.- Mencione la proporción de triglicéridos dentro de las lipoproteínas y la acción

de la lipasa lipoproteíca.
5.- Enumere los diferentes métodos tanto químicos como enzimáticos para el
dosaje de triglicéridos.


VIII. PRÁCTICA Nº 8: ANÁLISIS DE TRANSAMINASAS
8.1. MARCO TEÓRICO
La alanina aminotransferasa (ALT o GPT) es una enzima unilocular

(citoplasmática) cuya mayor actividad se localiza en el tejido hepático. La
destrucción o cambio de permeabilidad de las membranas celulares provoca la
liberación de ALT a la circulación sanguínea. Los mayores aumentos de actividad
ALT en suero, se producen como consecuencia de alteraciones hepáticas. En el
caso de hepatitis virales, el aumento de ALT precede a la aparición de ictericia,
alcanzando un máximo luego de la observación de dicho síntoma. Si los valores
permanecen elevados luego de 6 semanas, debe pensarse en la posibilidad de
una hepatitis activa o en el comienzo de una hepatitis crónica, por lo que es de
utilidad las determinaciones seriadas de la enzima. La determinación de ALT
adquiere importancia diagnóstica cuando sus valores se comparan con los de
otras enzimas de similar origen tisular, permitiendo así completar el perfil
enzimático de órganos como el hígado.
Fundamentos del método: Basado en el siguiente esquema reaccionante:
GPT
L-alanina + 2-oxoglutarato --------------------- piruvato + L-glutamato
LDH
piruvato + NADH + H+ --------------------------- L-lactato + NAD+
Una de las reacciones generales de los aminoácidos es la transaminación o

trasporte de un grupo amino de un aminoácido a un cetoácido, trasformado al
primero en cetoácido y al segundo en aminoácido.
Esta transformación posibilita la formación de carbohidratos a partir de

aminoácidos, esto es el fenómeno de la neoglucogénesis.
LA ecuación general de estas reacciones es:
R=CH-COOH + R-C-COOG R-C-COOH+R-CH-COOH
Nh2 O NH2
En el caso de nuestro experimento la transaminasa que estudiaremos es la

transaminasa glutámico pirúvica que transforma el alfa cetoglutárico (cetoácido)
en glutámico (aminoácido) y a la alanina (animoácido) en pirúvico (cetoácido).
8.2. COMPETENCIA
Realiza la determinación de TGP y explica el funcionamiento hepático y

diagnóstico de hepatopatías

Instructivo del Kit para análisis de transaminasas

Procedimiento para evaluar niveles de transaminasas
8.4. PROCEDIMIENTO
1. Fundamento del método
La determinación de ASAT se realiza acoplando su acción transaminasa a la

acción de la enzima MDH en presencia de NADH.
El L-Aspartato reacciona con el alfa-Cetoglutarato en presencia de ASAT

formándose Oxaloacetato y Glutamato. El Oxaloacetato producido es reducido por
la enzima MDH con la consiguiente oxidación del NADH a NAD.
La actividad de la ASAT se mide determinando la disminución de absorbancia a

340 nm según el NADH sea oxidado a NAD.
TÉCNICA
Llevar el reactivo a la temperatura de reacción (30ºC o 37°C.). Ajustar el

espectrofotómetro a cero con blanco de agua destilada.

2. Seminarios
a. Enfermedades hepáticas
b. Evaluación de la función hepática

8.5. RESULTADOS
Determine el cambio de Absorbancia por minuto (∆A/min) tanto para el calibrador

como para las muestras
Rangos de referencias
Los rangos de referencia que se enumeran a continuación están tomados de la

bibliografía existente.
Hasta 22 U/L a 30°C.
Hasta 34 U/L a 37°C.
8.6. CUESTIONARIO
1. En un análisis ¿Qué significa los resultados de TGO y TGP?
2. ¿Qué indica la elevación de las transaminasas?
3. ¿Cuáles pueden ser las causas de la elevación de las transaminasas?
4. ¿Cómo disminuir los valores de las transaminasas?


IX. PRÁCTICA Nº 9: LÍQUIDOS CORPORALES: EXAMEN DE ORINA
9.1. MARCO TEÓRICO
El análisis de orina de rutina incluye pruebas químicas para pH, proteínas,

glucosa, cetonas y sangre oculta. Algunos laboratorios también incluyen pruebas
de bilirrubina, urobilinógeno y nitrito, según el tipo de tira reactiva que utilice.
Desde la introducción de tiras reactivas simples y múltiples, cintas de prueba y

tabletas, el examen químico de la orina se ha convertido en un procedimiento
sensible y rápido. Actualmente es posible analizar hasta nueve pruebas diferentes
en menos de 60 segundos. Existen dos marcas básicas de tiras reactivas y cada
una posee tiras reactivas con posibilidad de medir desde una hasta nueve
reacciones diferentes.
Una tira reactiva es esencialmente, una banda angosta de plástico con pequeños
tacos adheridos. Cada taco contiene reactivos para una reacción diferente, lo que
permite la determinación simultánea de varias pruebas. Un requerimiento crítico
es que las reacciones de las tiras sean leídas en el momento prescrito después de
haber sido sumergidas en la muestra, luego deben ser comparadas
cuidadosamente con la carta de colores proporcionada por el fabricante. Con el
objeto de obtener resultados exactos y confiables con las tiras reactivas, deben
tomarse ciertas precauciones para ayudar a mantener la reactividad de los
reactivos. Las tiras no deben estar expuestas en medios húmedos, a la luz directa
del sol, al calor ni a sustancias volátiles, debiendo ser almacenadas en su envase
original. Dicho envase no debe ser guardado en el refrigerador no ser expuestos a
temperaturas superiores a 30ºC. Estos envases contienen un desecante, pero aun
así las tiras no deben quedar expuestas a la humedad. Sacar sólo la cantidad de
tiras necesarias por vez y luego cerrar herméticamente el envase. Si los bloques
de color de la tira no se parecen a los bloques "negativos" de la carta de colores,
si ha pasado la fecha de vencimiento impresa en el envase, las tiras deben ser
descartadas. Si la muestra de orina fue refrigerada debe dejarse que alcance la
temperatura ambiente antes de efectuar las pruebas.
El procedimiento para usar las tiras reactivas es el siguiente:
• Sumergir completamente las áreas de prueba de la tira en orina fresca, bien

mezclada y sin centrifugar y retirar la tira en forma inmediata. Debe tenerse
cuidado de no tocar las áreas reactivas.
• Eliminar el exceso de orina de la tira tocando con el borde de éste el frasco que
contiene la muestra. Las tiras deben sostenerse en posición horizontal.
• En el tiempo determinado comparar las áreas reactivas con la correspondiente

carta de colores del envase, la lectura deben hacerse con buena iluminación para
lograr una comparación exacta del color.
Al mismo tiempo que se introducen mejoras en las características de las tiras

reactivas pueden modificarse las indicaciones para su uso. Esto puede significar
una diferencia en los tiempos o en los reactivos utilizados; por eso es importante
seguir siempre las últimas indicaciones del fabricante.

Aún con el amplio uso de estos rápidos y convenientes procedimientos de
análisis, sigue siendo necesario comprender los principios básicos de las
pruebas, así como la técnica correcta en que deben de usarse. A continuación se
mencionarán brevemente los principios en que se basan dichos estudios, con las
tiras reactivas.
PH: En las tiras reactivas utilizan dos indicadores, el rojo de metilo y el azul de
bromotimol, que cubren la escala de pH entre 5 y 8,5 o 9. Los colores van del
anaranjado al amarillo y del verde al azul. Los resultados pueden informarse en
unidades enteras o bien valores intermedios (media unidad). Si se necesita una
lectura más precisa, pueden hacerse las mediciones utilizando un potenciómetro
con electrodo de vidrio. El momento de lectura del pH no es un elemento crítico;
sin embargo, es recomendable que el pH sea leído en forma inmediata ya que de
este modo se evitarán lecturas erróneas por rebosamiento (run-over).
PROTEÍNAS: Este método colorimétrico se basa en el concepto conocido como

"error proteico de los indicadores", un fenómeno que se caracteriza por que el
punto de cambio de color de algunos indicadores de pH es diferente en presencia
de proteínas. Por lo general el indicador cambia del amarillo al azul (o verde) entre
pH 3 y pH 4, pero en presencia de proteína el cambio de color se produce entre el
pH 2 y el pH 3 en consecuencia, en presencia de proteína se produce un "error"
en el comportamiento del indicador.
GLUCOSA: Con tiras reactivas impregnadas con la enzima glucosa oxidasa

puede detectarse sólo glucosa. Estas tiras utilizan las dos reacciones enzimáticas
secuenciales siguientes:
Glucosa + O2 GLUCOSA OXIDASA ácido glucónico
H2O2 + cromógeno PEROXODASA cromógeno oxidado + H2O
El cromógeno que se utiliza varía con las diferentes tiras reactivas.
CETONAS: Las tiras reactivas contienen reactivos el nitroprusiato de sodio y un

amortiguador alcalino. La reacción con el ácido diacético de la orina forma un
color castaño. Esta tira no reacciona con acetona ni con el b -hidroxibutírico.
Pueden ocurrir resultados positivos falsos (trazas o menos) en los casos en que la
muestra de orina sea muy pigmentada o cuando posee grandes cantidades de
metabolitos de la levodopa. Algunas muestras con elevada densidad y pH pueden
dar reacciones positivas falsas (trazas, 5 mg/dL).
SANGRE OCULTA: El procedimiento de detección de sangre oculta con tiras se

basa en la actividad tipo peroxidasa de la hemoglobina y de la mioglobina, que
catalizan la oxidación de un indicador por la acción de un peróxido orgánico. Las
tiras reactivas permiten la detección de eritrocitos intactos, así como la
hemoglobina libre y mioglobina. Los hematíes intactos de la orina se hemolizan al
contactar con el taco reactivo. La hemoglobina liberada reacciona con el reactivo
dando puntos verdes sobre un fondo amarillo o anaranjado. Entonces, la
presencia de hematíes intactos da una reacción de color verde punteado, mientras

que la de hemoglobina libre y la mioglobina dan una coloración uniforme de color
verde o del verde al azul oscuro.
BILIRRUBINA Y UROBILINÓGENO: Las tiras reactivas se basan en la reacción

de acoplamiento de una sal de diazonio con la bilirrubina en un medio ácido.
Difieren, sin embargo, en la sal de diazonio utilizada y en el color que aparece.
Para obtener resultados exactos el color de la tira debe ser comparado

cuidadosamente con el de la carta de colores.
NITRITO: En el medio ácido del área reactiva el nitrito reacciona con el ácido p-
arsanílico formando un compuesto de diazonio. Este compuesto se une luego con
la 1, 2, 3, 4-tetrahidro-benzo (h) quinolina-3-ol produciendo un color rosado. La tira
se lee a los 40 segundos. Cualquier grado de color rosa uniforme debe
interpretarse como prueba de nitrito positiva y sugiere la presencia de 105 o más
organismos por mL de orina. El desarrollo de color rosa no debe considerarse
como prueba positiva. Si el color rosado uniforme es débil es mejor verlo
colocando la tira sobre el fondo blanco.
9.2. COMPETENCIA
Realiza pruebas químicas en muestras de orina e interpreta y explica los

resultados según técnicas analíticas de laboratorio clínico
Kit para análisis de orina

Uso de materiales de laboratorio
Procedimiento para análisis de orina

9.4. PROCEDIMIENTO
1. Coloque las muestras de orina en un beacker
2. Observe los aspectos físicos de las muestras: Color, Aspecto, densidad; anote
los resultados
3. Tome una tira reactiva y sumerja la zona de análisis dentro de cada muestra
por un lapso de 10 a 15 segundos
4. Retire la tira reactiva con cuidado, elimine el exceso y compare el color de cada
uno de los parámetros contra el cuadro de valores correspondiente. Anote los
resultados
5. Elimine la tira en la bolsa de bioseguridad correspondiente
Obtención de muestra de orina

9.5. RESULTADOS
Muestra 1 Muestra 2
LEUCOCITO 70 + LEUCOCITO 70+
NITRITOS (-) NITRITOS (-)
UROBILINOGENO (-) UROBILINOGENO (-)
PROTEINAS (-) PROTEINAS 15
PH 6.0 acido PH 6.0 acido

HEMOGLOBINA (-) HEMOGLOBINA (-)
DENSIDAD 1020 DENSIDAD 1030
CETONAS ( +++ ) CETONAS ( +++ )
BILIRRUBINA (-) BILIRRUBINA (-)

GLUCOSA (-) GLUCOSA (-)
ASC ( ++ ) o 20 ASC ( +++ ) o 30
9.6. CUESTIONARIO
1. ¿Es grave la glucosuria y/o proteinuria?
2. ¿Cuáles son los síntomas de tumor en riñón o vejiga?
3. Si el paciente tiene presencia de sangre en la orina y dolor en el vientre ¿Qué

puede ser?
4. ¿Por qué puede elevarse la bilirrubina?
5. ¿Qué significa la presencia de cuerpos cetónicos en el análisis de orina?
1. VOET. Bioquímica. Editorial Panamericana 3ra edición. 2006

2. STRYER, L. Bioquímica. Editorial Reverté S.A. 2006.
5. CHAMPE, P. Bioquímica. McGraw-Hill Interamericana. México. 2006

X. PRÁCTICA Nº 10: ANÁLISIS DE CREATININA
10.1. MARCO TEÓRICO
La creatinina es un producto de desecho que fabrican los músculos a un ritmo

constante como parte de la actividad diaria normal. El torrente sanguíneo lleva la
creatinina hacia los riñones, que se encargan de extraerla de la sangre durante el
proceso de filtración y de eliminarla a través de la orina. El análisis de creatinina
en la orina mide la cantidad de esta sustancia que contiene la orina. Se puede
hacer de forma independiente o junto con otros análisis que determinan la
cantidad de otras sustancias que contiene la orina. Unos riñones sanos filtran la
sangre para eliminar los productos de desecho que el cuerpo no puede utilizar.
Una concentración baja de creatinina en la orina puede hacer pensar en una
enfermedad renal, ciertos trastornos musculares y neuromusculares, o una
obstrucción de las vías urinarias. Si los resultados del análisis son anormales, se
llevarán a cabo pruebas complementarias para hacer un diagnóstico específico. El
análisis de depuración (o aclaramiento) de creatinina mide qué cantidad de
creatinina se elimina a través de la orina durante varias horas. También se suelen
hacer análisis de sangre para medir la cantidad de creatinina contenida en la
sangre. Esto facilita información a los médicos sobre lo bien que están
funcionando los riñones. Es posible que un médico solicite un análisis de
creatinina en orina junto con otros análisis de orina, incluso aunque no sospeche
la existencia de un problema renal. Puesto que la creatinina se filtra a una
velocidad prácticamente constante, los médicos comparan la concentración de
creatinina con las concentraciones de otras sustancias para saber si están
excretando a una velocidad normal. La Creatinina reacciona con el picrato alcalino
en medio tamponado, previa desproteinización con ácido pícrico, obteniéndose un
cromógeno que se mide a 510 nm.
10.2. COMPETENCIA
Realiza la determinación de creatinina en muestras de orina y explica los

resultados según estado normal o patológico de los pacientes
Kit para análisis de creatinina

Uso de materiales y equipos de laboratorio
Procedimiento para análisis de creatinina

10.4. PROCEDIMIENTO
Recolectar orina de 24 horas. Medir la diuresis, tomar una alícuota y efectuar una
dilución 1:50 de la misma. Luego en tres tubos de ensayo preparar lo siguiente:

Standard --- 0,5 mL ---
Orina diluía (1:50) --- --- 0,5 mL
Agua 1 mL 0,5 mL 0,5 mL
Reactivo 1 2 mL 2 mL 2 mL
Reactivo 2 0,5 mL 0,5 mL 0,5 mL
Mezclar por inversión: Incubar 20 minutos a temperatura ambiente. Leer en
espectrofotómetro a 510 nm

10.5. RESULTADOS
Cálculo de los resultados:
M
Creatinina en orina (mg/24 horas) = ------ x 20 mg/l x 50 x V
S
Siendo:
V = volumen de la diuresis expresado en litros/24 horas.

M = Absorbancia neta del tubo muestra.
S = Absorbancia neta del tubo standard
Valores de referencia: 900 a 1,500 mg/24 horas
10.6. CUESTIONARIO
1.- Con los datos obtenidos en los experimentos, realizar la valoración nutricional
de dicha persona sabiendo que es varón, pesa 60 Kg, su talla es 1,56 m y su
volumen urinario en 24 horas fue de 1000 ml.
2.- Cómo hubiera sido la valoración nutricional en el caso que la persona hubiera
sido mujer?
3.- Mencione las características generales de las proteínas y su clasificación.
4.- ¿Qué son las globulinas y cuáles son sus clases?
5.- Describa los métodos de dosaje tanto químicos como enzimáticos para
proteínas totales, albúmina, globulina y Creatinina.



XI. PRÁCTICA Nº 11: POTENCIOMETRÍA
La potenciometría es el procedimiento de elección para la medida del pH. El pH

en una expresión numérica que corresponde al logaritmo de la inversa de la
concentración de iones H+. La potenciometría se basa en la diferencia de
potencial (voltaje) entre dos electrodos, el de medida y el de referencia, ambos
sumergidos en la solución y bajo condiciones de equilibrio.
El instrumento consta de un ELECTRODO DE REFERENCIA que se mantiene

constante durante la medida, un ELECTRODO DE MEDIDA que varía de acuerdo
a la concentración de hidrógeno de la solución y un dispositivo o potenciómetro
que mide la diferencia de potencial. El electrodo de referencia puede ser de dos
clase: de calomel, mercurio metálico y cloruro mercurioso y de plata y cloruro de
plata. El potencial de ese electrodo depende de la solución de cloruro de potasio
en que está sumergido internamente.
El electrodo de medida, es también llamado electrodo de vidrio, está constituido

por un tubo de vidrio cuyo extremo es particularmente selectivo al paso de iones
hidrógeno. En su interior hay ácido clorhídrico HCl 0,1 M y un alambre de plata,
cloruro de plata, indica que es igual al voltaje opuesto de la celda de medida.
Conectando la celda desconocida al circuito se produce un desnivel de voltaje que
debe corregirse hasta alcanzar el punto nulo. La magnitud de la corrección puede
leerse como fuerza electromotriz o como pH directamente.
En la práctica se ha usado los electrodos de pH para medir la concentración de

otros iones. Los electrodos tienen una membrana adicional que sólo es selectiva
al paso de determinado electrolito, sodio, potasio, calcio son medidos bajo esta
manera con facilidad. También existe el electrodo de CO 2 que deja pasar
moléculas se este gas las que modifican el pH y por lo tanto son medidas con el
electrodo de vidrio de pH.
11.2. COMPETENCIA
Realiza, analiza y explica el uso del potenciómetro y los valores de pH obtenidos

en cada muestra
Uso del Potenciómetro y materiales de laboratorio

Procedimiento para medición de pH

11.4. PROCEDIMIENTO
Titulación de un ácido débil con una base fuerte.
Se trata de determinar el pH de un grupo de tubos con varios niveles de titulación

de ácido acético con hidróxido de sodio. Cuando se titula un ácido débil con una
base fuerte se produce un aumento de pH inicialmente rápido para luego hacerse
lento, dentro de ciertos márgenes y al final se alcaliniza rápidamente. La
identificación del cambio de pH en cierto período de la titulación, se debe a la
formación transitoria de una combinación de ácido débil y la sal correspondiente.
En el caso del experimento será la combinación de ácido acético y acetato de
sodio y son los componentes ordinarios de una solución amortiguadora o solución
buffer. Para la experiencia preparar 11 tubos de acuerdo al siguiente esquema:
Agua
Tubo Nº A cético 0,1 N (mL) mL NaOH 0,1 N
Destilada (mL)
1 5,0 0,0 5,0
2 5,0 0,5 4,5
3 5,0 1,0 4,0
4 5,0 1,5 3,5
5 5,0 2,0 3,0
6 5,0 2,5 2,5
7 5,0 3,0 2,0
8 5,0 3,5 1,5
9 5,0 4,0 1,0
10 5,0 4,5 0,5
11 5,0 5,0 0,0

11.5. RESULTADOS
Realizar la gráfica de pH obtenido de cada tubo. El número de tubo en el eje de

las X y el valor de pH en el eje de las Y.
Tubo N° Ac.Acético NaOH H2O pH

1 5 ml 0.0 5.0 2.235
2 5 ml 0.5 4.5 4.010
3 5 ml 1.0 4.0 4.295
4 5 ml 1.5 3.5 4.559
5 5 ml 2.0 3.0 4.684
6 5 ml 2.5 2.5 4.807
7 5 ml 3.0 2.0 5.054
8 5 ml 3.5 1.5 5.292
9 5 ml 4.0 1.0 5.707
10 5 ml 4.5 0.5 5.971
11 5 ml 5.0 0.0 11.395
12 5 ml 5.5 0.0 11.872

11.6. CUESTIONARIO
1. ¿Qué es potenciometría y explique el fundamento de esta técnica?
2. Realice un listado de fluidos biológicos con su pH
3. ¿Qué es acidosis metabólica y en qué patológicos suele presentarse?


XII. PRÁCTICA Nº 12: CINÉTICA ENZIMÁTICA: EFECTO DEL PH Y LA
TEMPERATURA
Las enzimas son catalizadores proteicos, que aceleran la velocidad de una

reacción bioquímica. Estas reducen la energía de activación, que es esencial para
el inicio de cualquier tipo de reacción química. Con un requisito de bajo consumo
de energía para la activación, la reacción tiene lugar más rápidamente. El
rendimiento global de una enzima depende de varios factores, tales como la
temperatura, el pH, los cofactores, los activadores y los inhibidores. La velocidad
de una reacción química y/o la actividad de la enzima, está muy influenciad por la
estructura de la enzima. En otras palabras, un cambio en la estructura de la
enzima afecta a la velocidad de reacción. Cuando se producen los cambios de pH
de un medio en particular, esto conduce a la alteración en la forma de la enzima.
No sólo en las enzimas, el nivel de pH puede afectar también a las propiedades
de la carga y la forma del sustrato. Dentro de un nivel estrecho de pH, los cambios
en las formas estructurales de las enzimas y los sustratos, pueden ser reversibles.
Pero para un cambio significativo en los niveles de pH, la enzima y el sustrato
pueden someterse a la desnaturalización. En tales casos, no pueden identificarse.
Por consiguiente, no habrá reacción como tal. Esta es la razón de por qué el pH
afecta la actividad enzimática. Hablando sobre la conexión entre el pH y las
enzimas y/o los efectos del pH sobre las enzimas, todas y cada una de las
enzimas se caracterizan por un pH óptimo. En este nivel de pH específico, una
enzima en particular cataliza la reacción al nivel más rápido, que en cualquier otro
nivel de pH. Por ejemplo, la enzima pepsina (una enzima proteasa) que cataliza
las proteínas, es más activa a un pH ácido, mientras que la enzima tripsina (otra
enzima proteasa), se comporta mejor en un pH ligeramente alcalino. Por lo tanto,
el pH óptimo de una enzima, es diferente al de la otra enzima.
El pH, se define como la medida de la naturaleza ácida o alcalina de una solución.

Para ser más precisos, el pH indica la concentración de los iones de hidrógeno
disueltos (H+) en una solución en particular. Un aumento o una disminución en el
pH, cambia la concentración de los iones en la solución. Estos iones alteran la
estructura de las enzimas, y a veces, del sustrato, ya sea debido a la formación de
los enlaces adicionales o la rotura de los enlaces ya existentes. En la última
instancia, la composición química de las enzimas y el sustrato cambian. Además,
el lugar activo de la enzima cambia, después de que el sustrato ya no puede
identificar la enzima. Cuando la reacción se ajusta a un nivel de pH, es diferente
del valor óptimo. Entonces, la velocidad de reacción o la actividad de las enzimas
no será la misma que la anterior. A veces, no hay ninguna reacción en absoluto.
Esto ocurre, cuando se producen los cambios en la estructura del lugar activo y el
sustrato. Por lo tanto, para que la reacción química tenga lugar, es necesario
ajustar el pH de la solución de tal forma, que es adecuada tanto para la enzima,
como para el sustrato. De esta forma, los efectos del pH sobre la actividad de las
enzimas, se puede estudiar en la práctica.
La velocidad de las reacciones enzimáticas aumenta, por lo general, con la

temperatura, dentro del intervalo en que la enzima es estable y activa. La

velocidad por lo general se duplica por cada 10°C de aumento térmico. La
actividad enzimática máxima se alcanza a una temperatura óptima, luego la
actividad decrece y finalmente cesa por completo a causa de la desnaturalización
progresiva de la enzima por acción de la temperatura. A bajas temperaturas, las
reacciones disminuyen mucho o se detienen porque decrece la cinética molecular,
pero la acción catalítica reaparece cuando la temperatura se eleva a valores
normales para la enzima. No olvidar que una enzima humana típica posee su
óptimo a 37 ºC, en cambio otros organismos como, por ejemplo, las bacterias
termófilas resistentes a altas temperaturas tienen su óptimo de actividad cercano
a los 80 ºC.
12.2. COMPETENCIA
Reconoce los factores que afectan la actividad enzimática y explica el efecto de

cambios de pH y temperatura en el organismo humano en condiciones normales y
patológicas.
Uso de equipos y materiales de laboratorio

Procedimiento para evaluación de cinética enzimática (pH y Temperatura)
12.4. PROCEDIMIENTO
Efecto del pH
El pH actúa sobre los grupos ionizados que pertenecen a los centros activos de
las enzimas. Los grupos que pierden la ionización pierden la capacidad de
interaccionar con el sustrato. Cada enzima tiene un pH óptimo de trabajo.
Preparar 5 tubos como se indica:
Tubos Nº 1 2 3 4 5
pH 1,0 1,5 6,0 9,5 11,0
Albúmina (mL) 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0
HCL 1N (mL) 2,0 0,5 - 0 -
Na2CO3 (mL) - - - 0,5 2,0
Agua destilada (mL) - 1,5 2,0 1,5 -
Pre incubar los cinco tubos más un tubo conteniendo 20 mL de pepsina al 1% a
37ºC por 5 minutos. Luego añadir rápidamente 3 mL de la pepsina 1% pre
incubada a cada uno de los tubos 1–5. Mezclar e incubar a 37ºC por 10 min.
Observar la diferencia o leerla en el espectrofotómetro con filtro azul (420 nm).

Efecto de la temperatura.
Todo aumento de temperatura incrementa la actividad enzimática por aumento de

la energía de activación. Pero paralelamente se va produciendo una
desnaturalización parcial de la enzima que la inactiva.
Preparar 5 tubos como se indica
Tubo Nº 1 2 3 4 5
Albúmina (mL) 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0
HCl 1N (mL) 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5
Agua destilada (mL) 3,5 3,5 3,5 3,5 3,5
Preparar otros 5 tubos con
Tubo Nº 6 7 8 9 10
Pepsina 1% (mL) 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0
Incubar por 5 minutos de acuerdo al siguiente esquema de temperatura:
Tubo Nº 1y6 2y7 3y8 4y9 5 10

Temperatura 0 ºC Amb 37 ºC 70 ºC 37 ºC 100 ºC
Agregar los respectivos tubo Nº 6 al Nº 10 a los que hay que incubar a las
temperaturas a que se pre-incuban los tubos 1 – 5.

12.5. RESULTADOS
12.6. CUESTIONARIO
1. ¿Qué es el centro activo y qué es complejo enzima sustrato?

2. Explique cuáles son los principales factores que afectan a la actividad
enzimática.
3. ¿Qué es un inhibidor y de cuántos tipos puede ser la acción que realizan?
4. Diferencia entre cofactor y coenzima.
5. Explica qué es un catalizador y por qué es necesaria su existencia para que las
células desarrollen su actividad.



XIII. PRÁCTICA Nº 13: CINÉTICA ENZIMÁTICA: EFECTO DE LA
CONCENTRACIÓN, SUSTRATO
Las enzimas son las proteínas más notables de la naturaleza; sin ellas, la vida
como la conocemos no sería posible. Las enzimas son catalizadores, esto es,
aceleran la velocidad de las reacciones sobre las que actúan sin consumirse en el
proceso. El poder catalítico de las enzimas es mucho mayor que el de los
catalizadores inorgánicos, algunas de ellas están limitadas solo por la velocidad
con que colisionan con sus sustratos; son catalizadores perfectos. Aunque las
reacciones que ocurren en la célula son termodinámicamente favorables, la
velocidad a la cual transcurren la mayoría de ellas es extremadamente lenta; sin la
presencia de las enzimas, las reacciones necesarias para sostener la vida
ocurrirían a una velocidad incompatible con ésta. Además de su enorme poder
catalítico, las enzimas son altamente específicas por sus sustratos y tienen la
capacidad de regular su velocidad en respuesta a las concentraciones de sustrato
y la presencia de inhibidores, activadores, reguladores alostéricos, etc. Así pues,
las enzimas desempeñan un papel central en los procesos biológicos, son las
responsables de degradar y sintetizar las moléculas que nos forman y de extraer,
transformar y utilizar toda la energía relacionada con estos procesos. Las enzimas
son las responsables de regular y coordinar todas las reacciones que ocurren en
un organismo para lograr el delicado balance que representa la vida. El primer
modelo matemático que explicó de manera general la cinética de las enzimas no
alostéricas, donde la velocidad de la reacción se incrementa hiperbólicamente
conforme aumenta la concentración de sustrato, fue propuesto en 1913 por
Leonor Michaelis y Maud Menten. Este modelo postula la idea central de que la
enzima y el sustrato libres establecen un equilibrio rápido con el complejo enzima-
sustrato; en un segundo paso más lento, este complejo se rompe liberando el
producto y regenerando la enzima libre. La ecuación de Michelis-Menten explica la
relación entre la velocidad de la reacción catalizada por una enzima y la
concentración de sustrato a través de los dos parámetros de la ecuación, Vmax y
Km. El estudio de las enzimas es de suma importancia dentro de las ciencias
médicas; las enzimas están implicadas en el origen, diagnóstico y tratamiento de
una gran cantidad de patologías y es claro que en el futuro, su preponderancia
será cada vez mayor. Por ejemplo, la deficiencia de algunas enzimas, como las
proteasas de la coagulación en la hemofilia, es causa de enfermedades
hereditarias. La presencia anormal de algunas enzimas en el torrente sanguíneo
ayuda a diagnosticar el daño específico de tejidos, este es el caso de la amilasa y
lipasa en las patologías pancreáticas y las transaminasas en las enfermedades
hepáticas. Las enzimas son también el blanco de varios fármacos: el ácido acetil
salicílico inhibe a la ciclooxigenasa, el omeprazol a la ATPasa de protones y el
captopril a la enzima convertidora de angiotensina; estas inhibiciones redundan en
un efecto terapéutico. La capacidad de producir enzimas recombinantes abrió la
posibilidad de utilizarlas rutinariamente con fines terapéuticos, tal es el caso de la
estreptocinasa para la terapia fibrinolítica en el infarto agudo al miocardio. Es claro
que todas estas aplicaciones no serian posibles sin la previa y profunda
comprensión de la estructura y función de estas fascinantes moléculas.

13.2. COMPETENCIA
Explica el efecto de los cambios de la concentración del sustrato en la actividad

enzimática y lo relaciona con el organismo humano en condiciones normales y
patológicas.

Procedimiento para evaluación de cinética enzimática (efecto de la concentración
de la enzima y el sustrato)
13.4. PROCEDIMIENTO
Efecto de la Concentración de la Enzima
Aunque las enzimas no se destruyen ni con las reacciones, el aumento de

ellas en la cubeta de reacción incrementa la velocidad
Preparar 5 tubos como se indica
Tubo Nº 1 2 3 4 5
Albúmina (mL) 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0
HCl 1N (mL) 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5
Agua destilada (mL) 1,5 2,5 3,5 4,0 4,5
Pepsina 1 % (mL) - - - - -
Incubar los 5 tubos a 37 ºC por 5 minutos y enseguida añadir
Tubo Nº 1 2 3 4 5
Pepsina incubada (mL) 3,0 2,0 1,0 0,5 0,1
Incubar por 5 minutos a 37 ºC. Observar al espectrofotómetro a 420 nm contra

una lectura de agua
Efecto de la Concentración del Sustrato
Si es una reacción enzimática incrementamos progresivamente la concentración

del sustrato, aumentará la velocidad enzimática (velocidad inicial) hasta un punto
en que la velocidad llega a una meseta plana que no modifica aunque sigamos
aumentando el sustrato, habremos saturado la enzima.

Preparar 6 tubos como se indica:
Tubo Nº 1 2 3 4 5 6
Albúmina (mL) 2,0 3,0 4,0 5,0 6,0 7,0
HCl 1N (mL) 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5
Agua destilada (mL) 7,0 6,0 5,0 4,0 3,0 2,0
Pepsina 1 % (mL) - - - - - -
Leer a 420 nm. Anotar los resultados:
Incubar a 37ºC. Colocar 0,5 mL que pepsina pre-digerida. Incubar por otros 5
minutos a 37ºC. Leer al espectrofotómetro a 420 nm. Restar la segunda lectura de
la primera. Graficar y comentar los resultados.

13.5. RESULTADOS
El tubo que contenía 3 mL de pepsina, se observó que tenía una mayor

absorbancia, y conforme esta iba disminuyendo hasta el primer tubo que solo
contenía 0,1 mL de pepsina marcaba una absorbancia de 0.020
0.3
0.255
0.25
0.2
0.164
0.15 0.123
0.112
0.1
0.05
0.02
0
0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5
En el segundo trabajo se observo que el tubo que contenía 7 mL de pepsina

tubo una absorbancia de 0,140 y esta fue reduciéndose hasta el primer tubo
que contenía 2 mL de pepsina, el cual contenía una absorbancia de 0.048
0.16
0.14
0.14
0.12
0.1
0.077
0.08 0.071
0.061
0.06 0.053
0.048
0.04
0.02
0
0 1 2 3 4 5 6 7 8

13.6. CUESTIONARIO
1. ¿Cómo se define la velocidad de un proceso enzimático? ¿Qué efecto tiene

sobre ella la cantidad de sustrato presente en el medio de reacción?
2. Diferencias entre inhibición competitiva y no competitiva.
3. Principales tipos de coenzimas.
4. En los enzimas alostéricos, ¿es lo mismo el centro activo que el centro

alostérico?


XIV. PRÁCTICA Nº 14: ALIMENTOS Y HEMOGLOBINA
El cuadro más comúnmente relacionado con la disminución de hemoglobina

sérica es la anemia, que en la mayoría de los casos ocurre como signo o
complicación de otra enfermedad, a veces no relacionada directamente con
trastornos en el sistema sanguíneo. Existen situaciones en las que, por el
contrario, la concentración de hemoglobina se encuentra anormalmente elevada
debido a una superproducción de glóbulos rojos. La única condición natural y
fisiológica que afecta los niveles de hemoglobina es la altitud, puesto que frente a
bajas presiones de oxígeno atmosférico se produce una compensación mediante
el incremento en el número de glóbulos rojos y, por ende, en la concentración de
hemoglobina circulante.
El método a emplear tiene como fundamento la transformación previa de la

hemoglobina en cianmetahemoglobina (HiCN), que es muy estable y posee un
color característico cuya absorbancia a 540 nm es proporcional a la cantidad de
hemoglobina que contenga la sangre. Los distintos compuestos de hemoglobina,
excepto la sulfohemoglobina que casi nunca es significativa, se transforman en
HiCN según el siguiente proceso:
Hemoglobina + Ferricianuro potásico ------- metahemoglobina
Metahemoglobina + Cianuro potásico ------ cianmetahemoglobina
14.2. COMPETENCIA
Realiza el dosaje de hemoglobina en muestra de sangre y explica los resultados

según estado normal o patológico del paciente
Determina el IMC, valora y explica las posibles implicaciones y riesgos en los

pacientes

Procedimiento para análisis de hemoglobina

14.4. PROCEDIMIENTO
Homogeneizar perfectamente la muestra antes de usar. Preparar los siguientes

tubos:
Tubos Standard (S) Desconocido (D)

Reactivo 5 mL 5 mL
Standard 20 uL ----
Muestra ---- 20 uL
Medir primero el Standard y luego usar la misma micropipeta, enjuagando tres
veces en el propio reactivo antes de agregar cada muestra. Mezclar y luego de
tres minutos leer en espectrofotómetro a 540 nm llevando el aparato a cero con
Reactivo.
El color de reacción es estable al menos 24 horas por lo que la absorbancia debe

ser leída dentro de este lapso.
14.5. RESULTADOS
El cálculo se realiza mediante la siguiente fórmula:
Standard (g/l)
Hemoglobina (g/l) = D x Factor Factor =
S
Valores de Referencia
Grupo de Edad Hemoglobina gramos/100 mL

Niños al nacer 13,6 – 19,6
Niños de 1 año 11,3 – 13,0
Niños de 10 – 12 años 11,5 – 14,8
Mujeres no Embarazadas 11,5 – 14,5
Mujeres gestantes Mínimo 11,0
Hombres adultos 13,0 – 16,0

INDICE DE MASA CORPORAL (IMC)
Se usa como indicador nutricional y se halla dividiendo el Peso (en Kilogramos)

entre la estatura al cuadrado (en metros).
Masa (Kg)
IMC = -----------------
(altura (m))2
El IMC, a pesar que no hace distinción entre los componentes grasos y no grasos
de la masa corporal total, es el método más usado para evaluar el grado de riesgo
de la salud asociado a la obesidad.

APELLIDOS Y NOMBRES
EDAD
SEXO
TALLA
PESO
IMC
CONDICIÓN
14.6. CUESTIONARIO
1. ¿Qué es la anemia y cuáles son los tipos de anemia?
2. Explique los esquemas de tratamiento en casos de anemia
3. ¿Cuáles son y cómo se determina los datos antropométricos en los pacientes?


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3B-2

Dr. NESQUEN JOSÉ TASAYCO YATACO

Bioquímica – Medicina Humana – Universidad Wiener Página 1

El curso de Bioquímica intenta introducir al estudiante a algunos de los procedimientos

El objetivo de la experimentación es comprobar la validez de la hipótesis. Si los

Bioquímica – Medicina Humana – Universidad Wiener Página 2

1.1. MARCO TEÓRICO

En nuestra práctica evaluaremos la actividad enzimática de la amilasa sobre el

Bioquímica – Medicina Humana – Universidad Wiener Página 3

Realiza, valora y explica la digestión de carbohidratos por enzimas digestivas

1.3. MATERIALES, EQUIPOS Y REACTIVOS

Bioquímica – Medicina Humana – Universidad Wiener Página 4

Reactivo Propiedades físicas y químicas

Materiales Usos y manejo

Bioquímica – Medicina Humana – Universidad Wiener Página 6

Preparar cuatro tubos de ensayo como se indica:

a. Síndrome de mala absorción de carbohidratos

1. Tutorial respecto a interpretación de lecturas de absorbancias del

Bioquímica – Medicina Humana – Universidad Wiener Página 7

¿Qué sucede en este sitio con la digestión de

1. Explique cómo se realiza la hidrólisis del almidón

2. ¿Cómo se produce la digestión del almidón en el intestino delgado?

3. ¿Cuál es el mecanismo de acción de la somatostatina en la absorción de los

4. Esquematice el metabolismo de la glucosa

1.7. FUENTES DE INFORMACIÓN

1. LEHNINGER. Principios de Bioquímica. Editorial Omega. Quinta Edición. 2009

Bioquímica – Medicina Humana – Universidad Wiener Página 8

2.1. MARCO TEÓRICO

Después de la digestión de los carbohidratos por efecto de amilasas salivar y

El borde en cepillo de las células intestinales tiene varios sistemas trasportadores.

También participa un transportador facilitador independiente del sodio llamado

La diabetes dependiente de insulina cursa con un aumento de la concentración de

Bioquímica – Medicina Humana – Universidad Wiener Página 9

Hay dos tipos de métodos químicos:

a. Reducimétricos, que se basan en la capacidad reductora de la glucosa. Debido

b. Furfurálicos: se basan en la capacidad de la glucosa para formar furfural al

En cuanto a los métodos enzimáticos:

a. Método de la hexoquinasa: emplea las enzimas hexoquinasa y glucosa-6-

b. Método de glucosa oxidasa y peroxidasa (GOD-POD): es el que se utiliza en

En el método GOD-POD, en un primer paso la glucosa oxidasa cataliza la

Bioquímica – Medicina Humana – Universidad Wiener Página 10

Realiza la determinación de glucosa en sangre y explica los valores obtenidos

2.3. MATERIALES Y REACTIVOS

1. Absorción y metabolismo de la glucosa

Bioquímica – Medicina Humana – Universidad Wiener Página 11

La medición de la Glucosa sanguínea es importante en el diagnóstico y

Fundamentos del método. La glucosa reacciona con el reactivo enzimático que

Bioquímica – Medicina Humana – Universidad Wiener Página 12

Materiales Usos y manejo

Bioquímica – Medicina Humana – Universidad Wiener Página 13

La muestra de sangre extraída del paciente será centrifugada y se separará el

Tubos Blanco Standard Muestra

Obtención de muestra de sangre

Centrifugación de muestra de sangre

Bioquímica – Medicina Humana – Universidad Wiener Página 14

Incubación de la muestra y estándar en Baño María

Bioquímica – Medicina Humana – Universidad Wiener Página 15

a. Enfermedad de Cori, McArdle, Pompe, Anderson

b. Deficiencia de glucosa-6-fosfato deshidrogenasa