Bloque Iii - Tecnología Enzimática

CyTA – UBU Biotecnología Alimentaria
BLOQUE III – TECNOLOGÍA ENZIMÁTICA
10. INTRODUCCIÓN A LA TECNOLOGÍA ENZIMÁTICA
1. La tecnología enzimática como herramienta de la biotecnología.
Recordemos que la biotecnología es la ciencia de los métodos que permiten la obtención

de productos a partir de materia prima, mediante la intervención de organismos vivos.
El uso de microorganismos vivos o de alguno de sus componentes para obtener o

modificar productos, mejorar plantas o animales o desarrollar microorganismos para
objetivos específicos.
Las enzimas, son herramienta de la biotecnología, son componentes de los organismos

vivos, por ello se estudian las enzimas en el campo de la biotecnología, más
concretamente de la biotecnología alimentaria.
2. Introducción a la tecnología enzimática de las enzimas.
La tecnología enzimática consiste en la obtención, manipulación y modificación de

enzimas para su aplicación y utilización.
Esto implica las siguientes etapas, que se verán en los próximos temas con más detalle:
- Producción.
- Aislamiento.
- Purificación.
- Aplicación. La aplicación de las enzimas en un determinado proceso se puede
hacer en forma:
o Libre.
o Inmovilizada.
Que se aplique de una u otra forma depende de diversos factores que se
analizarán más adelante, cuando hablemos de las enzimas inmovilizadas.
En muchas ocasiones estas etapas se realizan en a pequeña escala, por ejemplo, en

un laboratorio, y que luego es necesario su escalado industrial.
171
Uno de los aspectos más importantes es la caracterización de las enzimas de interés,

pero de poco sirve obtener una enzima en grandes cantidades si no es viable su
aplicación en un proceso determinado.
También podemos recurrir a la ingeniería genética para conseguir “enzimas mutadas”

con propiedades mejoradas de cara a una aplicación concreta.
Son muchas las aplicaciones de las enzimas en distintos sectores, incluyendo el

agroalimentario. Algunas de las aplicaciones son:
Arroyo, M.; Acebal, C. y de la Mata, I. (2014). "Biocatálisis y biotecnología". Arbor, 190 (768):
a156.
172
Aplicación práctica de la tecnología enzimática.
En que sectores se aplican fundamentalmente las enzimas y cual es el impacto

económico de la aplicación de enzimas en la industria. En definitiva, cual es la aplicación
práctica de las enzimas.
A modo de ejemplo:
http://themoneyroller.com/2016/07/20/advanced-enzymestechnologies-limited-ipo/
Nos fijamos en las aplicaciones y en el volumen de negocio (billones de dólares).
- La aplicación de enzimas en la IA y bebidas supuso en 2017 un 27% del total,

estimaciones que se mantienen para 2022.
- En cuanto al volumen de negocio, hay un incremento importante de las
estimaciones.
Otro aspecto importante en relación a la aplicación practica de las enzimas tiene que
ver con su demanda.
- Porcentajes de demanda por regiones en 2017 y la estimación para 2022.

- Aunque la mayor demanda se produce en Norteamérica, en Europa (oeste) las
previsiones de demanda para 2022 se han incrementado 4 puntos con respecto
a 2017.
173
Otro aspecto interesante es que, a pesar de la gran demanda, la producción de enzimas

se encuentra concentrada en unas pocas empresas.
Una de las principales productoras de enzimas es la empresa danesa “Novozymes”.
174
Porque se utilizan enzimas en la industria, que ventajas presentan e

inconvenientes.
La aplicación de enzimas en la industria, además de buscar la rentabilidad industrial y

económica, busca la reducción de los costes sobre el medio ambiente, al disminuir el
uso de productos químicos contaminantes.
Las enzimas son catalizadores muy potentes:
- Son muy eficaces. Catalizan reacciones frecuentemente 108-1011 veces más

rápidas que los catalizadores no enzimáticos.
- El rango de las reacciones catalizadas es extremadamente alto, pudiéndose
catalizar muchos más tipos de reacciones que con los catalizadores químicos.
- Son muy específicas en cuanto al tipo de reacción catalizada. Esto permite
modificar selectivamente determinados componentes individuales en un medio
de reacción sin afectar a otros.
175
Las ventajas se deben a su elevado poder catalítico y su especificidad:
- Se incrementan las posibilidades de control de los procesos. Controlando el

medio de reacción (pH, temperatura, …) vamos a poder controlar el proceso;
además, debido a su especificidad, vamos a poder actuar sobre un determinado
compuesto específico.
- Mejoran los rendimientos.
o Debido a que trabajan en condiciones suaves, se reducen costes, por
ejemplo, si se compara con los catalizadores químicos, normalmente
estos últimos necesitan grandes cantidades de energía.
o Si se comparan con el uso de microorganismos, estos suelen necesitar
nutrientes complejos y a menudo caros como fuente de energía.
o En el caso de su aplicación en la industria alimentaria, al operar en
condiciones suaves, no altera la estructura y las propiedades deseadas
del alimento.
Debido a su alta especificidad:
- Se eliminan reacciones secundarias.

- No se forman subproductos no deseados.
- Se reconoce exclusivamente un componente específico de una mezcla.
Inconvenientes:
- Costosas de purificar. Algunas enzimas son costosas de purificar.

o Enzimas para uso médico: más costosas; requieren un elevado grado de
pureza.
o Enzimas comerciales que se producen en masa: costes de producción
menores; solo se purifican hasta el grado necesario dependiendo de su
aplicación. No obstante, la seguridad sigue siendo un requerimiento
importante.
- Presentan una estabilidad limitada en estado puro. Cuando se purifica una
enzima pierde estabilidad (al no encontrarse en su matriz original). Una vez
purificada, debe ser preparada para mantener su actividad durante el
almacenamiento y hasta su uso final. La formulación del producto debe favorecer
la estabilidad y la actividad de la enzima.
176
- Los valores de temperatura y pH óptimo son diferentes para cada enzima. Cada
enzima presenta valores de temperatura y pH óptimos diferentes, de modo que
no se pueden estandarizar los procesos; hay que caracterizar las condiciones de
operación particulares en cada caso.
Podemos concluir que:
Para ser útiles, y por tanto utilizables, las enzimas deben hacer que un producto
elaborado con su ayuda tenga alguna ventaja, como, por ejemplo:
- Que su calidad sea superior a la del producto tradicional.

- Que reduzca los costes de producción.
- Que se puedan obtener productos que no existían previamente o solo en
cantidades limitadas, debido a su reducida disponibilidad a partir de fuentes
naturales.
177
11. PRODUCCIÓN INDUSTRIAL DE ENZIMAS
1. Introducción.
La producción industrial de enzimas es un campo muy extenso, por lo que veremos

aspectos generales. Antes de empezar, vamos a ver como comenzó la utilización de
enzimas a nivel industrial.
Fuente: Wood BJ (1998). Microbiology of Fermented Foods. Thomson Science, United

Kingdom.
Aunque las enzimas se utilizan desde hace muchos años, el desarrollo de una verdadera
industria no comienza hasta finales del siglo XIX.
- El uso de enzimas se inició en 1874: producción de renina a partir de estómagos

de ternero para la fabricación de queso.
- En 1890, Takamine desarrolló la producción, a partir de A. oryzae, de takadiasa,
una mezcla de amilasas y proteasas para ayuda digestiva.
- En 1954 se lleva a cabo el primer escalamiento industrial (producción de enzimas
por fermentación sumergida).
- El principal desarrollo de la industria se dio con la incorporación de las proteasas
en los detergentes durante los años 60.
178
- La introducción generalizada de la fermentación (años 60) y la llegada de la

ingeniería genética, han contribuido significativamente a la expansión de la
producción industrial de enzimas.
En la actualidad, enzimas a la carta: los microorganismos son ahora la principal fuente

de enzimas para una amplia variedad de aplicaciones.
La producción industrial de enzimas requiere de las siguientes

etapas:
- Selección de la fuente.
- Aislamiento.
- Purificación.
Se trata de un proceso integrado en el que las tres etapas están relacionadas, de modo
que:
- La fuente de la enzima puede condicionar tanto los procedimientos de extracción

como los de purificación.
- La aplicación final de la enzima puede determinar el grado de purificación
requerido.
- La escala a la que se realice la operación puede delimitar las técnicas que, en la
práctica se pueden aplicar.
Veremos como se relacionan estos procesos a lo largo de tema.
2. Fuentes de enzimas.
Las fuentes de obtención de enzimas son: animal, vegetal y microbiana.
Para la obtención de enzimas a gran escala es importante seleccionar la fuente que sea
capaz de sintetizar una gran cantidad de la enzima deseada.
Hasta los años 30 las principales fuentes eran animales y vegetales. Hoy en día, la gran
mayoría de las enzimas con de origen microbiano.
179
- Animal. Aunque en poca cantidad se producen enzimas como:

o Pepsina (mucosa gástrica).
o Tripsina (páncreas).
o Quimosina (estómago de ternero).
Con fines analíticos y medicinales se pueden preparar encimas
altamente purificadas de algunos órganos (hígado, páncreas,
…).
- Vegetal. En pequeña cantidad en comparación con las fuentes microbianas.

Algunas de las enzimas de origen vegetal que se producen son:
o Amilasas (cereales).
o Papaína (papaya).
o Ficina (higuero).
o Bromelina (piña).
Surgieron problemas asociados a la utilización de fuentes animales y vegetales para

cubrir la demanda creciente de enzimas, así como los tiempos de generación de las
mismas, el control sanitario de los animales, la estacionalidad de los vegetales o la
elevada cantidad de subproductos que se obtienen.
Esto condujo a la utilización de microorganismos como fuente para la producción de

enzimas a partir de los años 70.
- Microbiana. La inmensa mayoría de las enzimas que se utilizan son microbianas

(bacterias y hongos). Algunos ejemplos de microorganismos utilizados:
o Aspergillus niger.
o Mucor miehei.
o Bacillus subtilis.
o Saccharomyces cerevisiae.
Es muy importante la selección del microorganismo: tienen que ser considerados

seguros (GRAS, generally recognized as safe).
180
Presentan una serie de ventajas:

ECONOMICAS:
o Producción a gran escala: pueden producirse rápidamente y en grandes
cantidades.
o Menores costes de producción, en comparación con animales y plantas.
o Facilidad de extracción (se verán las técnicas más adelante)
o Predictibilidad en el rendimiento de la enzima: se estandariza el método
de producción de forma que se puede conocer la cantidad de enzima que
se puede obtener, cuál va a ser su actividad, …
o Ausencia de variaciones estacionales: son independientes de la
ubicación y de la temporada del año.
TÉCNICAS:
o Enorme variedad de vías metabólicas: el metabolismo microbiano es muy

variado; se puede obtener un producto de interés utilizando un tipo u otro
de microorganismo y/o controlando el medio de cultivo, las condiciones
de crecimiento, …
o Amplio rango de condiciones ambientales: existen microorganismos que
viven en condiciones extremas, como termófilos y halófilos, que
presentan enzimas mucho más resistentes a la desnaturalización en
condiciones extremas de temperatura o salinidad elevadas,
respectivamente.
o Corto tiempo de generación: se reproducen rápidamente.
o Se pueden “modificar” para generar “enzimas a la carta”.
3. Producción de enzimas por fermentación.
La mayor parte de las enzimas industriales se producen por fermentación sumergida.
Para ello, se seleccionan las condiciones óptimas de producción: composición del

medio, pH, temperatura, operación en continuo o en discontinuo.
181
Hay dos aspectos importantes para controlar la producción microbiana de enzimas:
- Síntesis de enzimas en función del crecimiento microbiano: si nos fijamos en el

gráfico, cada enzima se produce en un momento determinado del crecimiento
microbiano, por lo que es necesario conocer dicho momento para optimizar el
proceso de producción.
- Control genético. Los microorganismos producen dos tipos de enzimas:

o Enzimas constitutivas:
• Se encuentran en proporción minoritaria respecto al total de
enzimas.
• Están implicadas en general en aspectos centrales del
metabolismo.
• Se producen continuamente al margen de la presencia o no de
ningún sustrato.
o Enzimas inductivas:
• Es un grupo mucho más amplio.
• Son sintetizadas en proporciones muy bajas hasta que un
sustrato adecuado pasa a estar disponible por el organismo,
entonces ese sustrato o un producto de su degradación induce un
gran incremento de la síntesis.
• A este sustrato se le denomina inductor.
182
En la siguiente tabla se muestran algunas enzimas de interés obtenidas por

fermentación.
Fuente: Hernández A (2003). Microbiología industrial. Editorial Universidad Estatal a

Distancia, Costa Rica.
183
4. Extracción y purificación de enzimas.
El primer paso para el aislamiento y purificación de una enzima es su extracción.
El método de extracción depende de:
- Naturaleza de la fuente. En general, tejidos animales o vegetales, más blandos,

se trituran fácilmente picándolos o batiéndolos. Los microorganismos son más
robustos desde el punto de vista mecánico, necesitando métodos más vigorosos.
- Escala de operación: pequeña o gran escala; no todas las técnicas disponibles
son adecuadas para trabajar a gran escala.
- Estabilidad de la enzima. Hay enzimas que son más inestables y precisan
técnicas más cuidadosas que otras.
- Pureza en la que se necesite. Si van a ser de pureza muy elevada el proceso de
extracción habrá de ser más cuidadoso; no se deberán usar técnicas o
materiales que puedan dar lugar a la contaminación del producto final.
- Localización celular. Va a condicionar la técnica a utilizar:
Algunos de los métodos de extracción más utilizados son:
- Químicos.
o Álcalis (pH 11-12.5). Se somete el medio a un pH alcalino; se rompen
membranas; el éxito del tratamiento depende de la estabilidad de la
enzima a esos valores de pH; a pequeña y gran escala.
o Lisozima y EDTA. Se rompen paredes celulares; más susceptibles
bacterias Gram+; proceso caro, por lo que no se utiliza a gran escala.
o Detergentes. Se rompen membranas; importante controlar bien el
proceso para no precipitar proteínas.
o Choque osmótico. Ruptura de membranas; para extracción de enzimas
periplasmáticas (recuerda que es el espacio periplasmático).
184
- Físicos.
o Sonicación. Células en medio líquido se someten a
ultrasonidos. Útil a escala de laboratorio, no a gran
escala (dificultad de transmitir suficiente potencia a
grandes volúmenes).
o Congelación y descongelación. Se rompen membranas. Inconvenientes:
se pueden formar cristales; puede perderse actividad enzimática.
o Cizalla líquida. Se pasa una suspensión celular a través de una válvula,
con un pequeño orificio, a presiones muy elevadas; la rotura celular se
produce por caída brusca de presión.
o Trituración o agitación con abrasivos. Se mezcla una suspensión celular
con un agente que actúa como abrasivo (perlas de vidrio) y se somete a
trituración o agitación.
Una vez extraída la enzima de interés comienza la purificación necesaria para eliminar
del medio restos celulares, …
Vamos a ver cuales son las principales etapas en la purificación de un extracto

enzimático:
- Eliminación de ácidos nucleicos.

o La lisis celular, producida en la extracción, puede dar lugar a la liberación
de ácidos nucleicos (depende del tipo celular, siendo más frecuente en
procariotas), lo que produce:
• Problemas de viscosidad (importante a escala industrial).
• Interferencia en procesos cromatográficos.
o Para eliminar los ácidos nucleicos, se pueden utilizar los siguientes
métodos:
• Precipitación con policationes de elevado peso molecular (p.e.
polietilenimina). Importante: eliminar residuos del polímero (o de
unidades monoméricas del mismo) al finalizar el proceso.
Proceso caro.
• Enzimático (con nucleasas). Método fácil, eficiente y económico.
El más utilizado.
185
- Eliminación de restos celulares. Para eliminar restos celulares se utilizan

fundamentalmente dos técnicas:
CENTRIFUGACIÓN.
o Separación de componentes en base a sus diferencias de tamaño, forma
y densidad que hace que el efecto de la gravedad sea diferente.
o Se utiliza a media escala. A gran escala se utilizan centrífugas de flujo
continuo (los sólidos depositados quedan en el recipiente y el
sobrenadante clarificado va siendo descargado continuamente).
FILTRACIÓN.
o Método de separación física utilizando filtros o membranas.
o Si las soluciones a filtrar son gelatinosas o viscosas, es necesario utilizar
auxiliares de filtrado, o ajustar las condiciones de precipitación, para
lograr un precipitado floculante, que si se puede filtrar.
o Se puede utilizar a gran escala.
- Purificación y concentración son las siguientes etapas en la producción de

enzimas y pueden producirse de manera simultánea en algunos casos.
Existen diversos métodos. La elección de uno u otro depende de la fuente
biológica y de la concentración de la enzima, y se basan en las distintas
propiedades físico-químicas de las proteínas.
186
La elección de un determinado procedimiento es cuestión de ensayo y error: hay

que probar procedimientos y seleccionar.
Estos son los métodos que vamos a ver, algunos de los más habituales.
o Precipitación.
 Precipitación por salado.
Es uno de los métodos más utilizados en las primeras etapas.
La solubilidad de las proteínas depende en gran medida de la concentración salina

(fuerza iónica) del medio.
Las proteínas se mantienen disueltas gracias a interacciones con el agua. Cuando se

añade sal a una solución de proteína, una parte del agua forma enlaces ion-dipolo con
la sal. Al haber menos agua disponible para hidratar las proteínas, comienzan a
interactuar hidrofóbicamente entre ellas.
La concentración salina de una disolución se puede expresar como fuerza iónica (I):
A bajas concentraciones, la presencia de sales incrementa la solubilidad de las

proteínas (“salting-in”).
A elevada concentración de sal se produce la agregación y precipitación de las proteínas

(“salting-out”).
Una de las sales más utilizadas es el sulfato amónico. Esto es debido a su gran
solubilidad, ausencia de efectos perjudiciales para la mayoría de las enzimas, no ser
cara y, en algunos casos, por su efecto estabilizante de ciertos enzimas.
187
La solubilidad de una proteína dada varía en función del tipo de ion.
En la siguiente figura vemos la solubilidad de la carboxihemoglobina en distintos tipos

de sales.
Fuente: Voet D y Voet JG (2006). Bioquímica (3ª Edición). Editorial Médica

Panamericana, S.A.
La solubilidad de la carboxihemoglobina en su punto isoeléctrico en función de la fuerza

iónica y el tipo de ión. S y S+ son las solubilidades de la proteína en solución salina y en
agua pura, respectivamente. Se graficó el logaritmo del cociente entre ambas
solubilidades para poder colocar las curvas de solubilidad en una misma escala.
Tomado de Green, AA. J Biol Chem 1932; 95, 47.
La concentración de sal a la que precipita una proteína varía, de una proteína a otra, lo
que puede utilizarse para fraccionar proteínas  Precipitación por salado.
Mediante el ajuste de la por salado concentración salina de una solución que contiene
una mezcla de proteínas hasta el punto inmediatamente inferior al de precipitación de la
proteína de interés pueden eliminarse de la solución proteínas contaminantes. Si se
elimina el precipitado (centrifugación o filtración), quedaría en disolución la proteína de
interés, que podría precipitarse incrementando de nuevo la concentración salina (Voet
D y Voet JG, 2006).
188
 Modificación del pH.
El pH influye en la solubilidad de las proteínas, ya que en el punto isoeléctrico (carga

neta 0) la solubilidad es mínima.
Se denomina precipitación isoeléctrica al proceso de precipitación de proteínas en sus

puntos isoeléctricos.
Recuerda el concepto
de punto isoeléctrico
189
 Disolventes orgánicos.
Los solventes orgánicos polares (metanol, etanol, acetona, …) pueden provocar la

precipitación de las proteínas a determinadas concentraciones.
Cuando se van añadiendo cantidades recientes de solventes orgánicos, las moléculas

de proteína interaccionan más con otras moléculas de proteína que con el agua. La
formación de complejos entre las proteínas continúa hasta que se alcanza un punto en
el que la proteína precipita.
La adición de sal a un medio en el que se han añadido solventes orgánicos aumenta la

solubilidad de la proteína.
o Separación en dos fases líquidas.

Un sistema en dos fases se prepara mezclando soluciones inmiscibles,
por ejemplo:
• polietilenglicol + dextrano.
• polietilenglicol + sulfato amónico.
Las proteínas y los restos celulares se reparten entre las dos fases, lo
que permite la separación de componentes según la fase en la que se
localicen.
190
Las ventajas de este método son:
• Es un método suave.
• Muchos de los polímeros utilizados estabilizan proteínas.
• Generalmente rendimiento elevado de recuperación proteica.
• Pocas dificultades para realizar a gran escala.
La localización de una determinada enzima en una de las fases depende

de:
• Peso molecular de la enzima.

• pH y fuerza iónica de la mezcla.
• Presencia de iones polivalentes.
Por lo que hay que determinar experimentalmente las condiciones

óptimas de reparto para cada enzima.
o Cromatografía en columna es uno de los métodos más empleados para

la purificación de proteínas.
Se utiliza en fases finales, en extractos parcialmente purificados y
concentrados.
Recordemos que la cromatografía es un método físico de separación en
el cual los componentes a separar se distribuyen entre dos fases, una
inmóvil (fase estacionaria) y otra (fase móvil) que se mueve en una
dirección determinada a través de la primera. (IUPAC).
• Fase estacionaria: sólida o líquida.
• Fase móvil: líquida o gaseosa.
191
Puede ser de distintos tipos y se puede clasificar en base a distintos

criterios:
• Naturaleza fase móvil y estacionaria (p.e. líquido-líquido).
• Polaridad fase estacionaria (normal, fase reversa).
• Forma lecho cromatográfico (plana, en columna).
• Mecanismo de retención (reparto, filtración en gel, intercambio
iónico, adsorción, afinidad)
FILTRACIÓN EN GEL.
Separación de moléculas en base a su tamaño.
La fase estacionaria está compuesta por microesferas de un material

hidratado poroso, como el dextrano, la agarosa o la poliacrilamida.
192
CROMATOGRAFÍA DE INTERCAMBIO IÓNICO.

Separación de moléculas en base al signo y la magnitud de las cargas
netas de las proteínas a un pH determinado.
La matriz (fase estacionaria) retarda el paso de las moléculas de carga
opuesta.
La matriz es un polímero sintético (resinas) con grupos cargados:
• Intercambiadores catiónicos (grupos negativos).
Ejemplo: carboximetil (CM)-celulosa.
• Intercambiadores aniónicos (grupos positivos).
• Ejemplo: dietilaminoetil (DEAE)-celulosa.
193
CROMATOGRAFÍA DE ADSORCIÓN.
Las moléculas se adsorben físicamente por uniones de Van der Waals o
enlaces de hidrógeno a la superficie de una matriz (fase estacionaria).
Una de las más utilizadas es la hidroxiapatita (forma insoluble de fosfato
de calcio).
CROMATOGRAFÍA DE AFINIDAD.
Se basa en la unión de las proteínas a moléculas específicas.
194
o Electroforesis en continuo.
La electroforesis es una técnica para la separación de las moléculas
según la movilidad de éstas en un campo eléctrico.
En la electroforesis en flujo continuo se pasa una corriente continua de
muestra sobre el buffer que se mueve en forma vertical entre dos capas.
Los electrodos están en la parte lateral y hay un sistema de enfriamiento
por refrigerantes.
o Ultrafiltración y diálisis.
Estos métodos se utilizan en las últimas fases, normalmente para la
eliminación de sales.
En ambos casos se utilizan membranas semipermeables.
La diálisis se suele utilizar a pequeña escala (laboratorio); no es
adecuada a gran escala (es cara, se requiere un elevado volumen de
agua).
La ultrafiltración se diferencia de la diálisis en que se aplica presión. Se
utiliza a gran escala.
195
- Concentrado y envasado.
o A pequeña escala se suelen preparar las enzimas liofilizadas, aunque
también se pueden encontrar en otros formatos.
o A gran escala se suelen envasar formando grano o cápsulas, o como
soluciones concentradas.
196
5. Consideraciones legales para la producción de enzimas.
Aunque las enzimas son productos naturales, las compañías responsables de su

producción se esfuerzan en asegurar que sus productos no planteen riesgo a los clientes
y consumidores.
En la mayor parte de los países la normativa que se aplica a la producción de enzimas

es la que controla los productos químicos.
Existen asociaciones, como la Asociación de Manufactureros y Formuladores de

productos enzimáticos (AMFEP) fundada en 1977, que representan, promueven y
defienden los intereses, el uso seguro y los marcos reguladores de productores de
enzimas.
197
A modo de ejemplo, se muestra la página web de Novozymes en la que informa sobre

el cumplimiento de la normativa aplicable: https://www.novozymes.com/es/regulatory-
compliance.
198
Tema 12. INMOVILIZACIÓN DE ENZIMAS
1. INTRODUCCIÓN
En el tema 10, en el apartado de introducción, se indicó que las enzimas se podían

aplicar en forma libro o inmovilizada.
En este tema vamos a ver qué se entiende por enzimas inmovilizadas, qué métodos de
inmovilización existen y cómo afecta el proceso de inmovilización a las propiedades de
las enzimas, entre otros aspectos.
Empezamos definiendo qué se entiende por enzimas inmovilizadas... El

término enzima inmovilizada fue adoptado por primera vez en la Primera
Conferencia sobre Tecnología Enzimática (1971, New Hampshire, USA):
 “Enzimas confinadas físicamente o localizadas

en una región definida del espacio con retención
de su actividad catalítica, y que pueden ser
utilizadas repetida y continuadamente”
Aunque las enzimas son catalizadores eficientes y efectivos, no siempre son ideales
para aplicaciones prácticas. Algunas de sus ventajas pueden convertirse en desventajas
en algunos casos. Así, por ejemplo, generalmente son inestables y es difícil utilizarlas
con disolventes orgánicos o a temperaturas elevadas.
 Para intentar solventar estos problemas se desarrolló una nueva tecnología

basada en la inmovilización de enzimas.
 Para hacernos una idea de la importancia de la inmovilización de enzimas vamos
a fijarnos en datos científicos…
La primera enzima (invertasa) se

inmovilizó en 1916 ...
...desde entonces más de 10000

publicaciones... y la cifra sigue
creciendo...
199
Cuando se aplica una enzima inmovilizada las ventajas deben superar a inconvenientes.
INCONVENIENTES
 Posibles alteraciones de la enzima: pueden producirse cambios en las

propiedades, pérdida de actividad, etc.
 Mayores costes: hay que tener en cuenta los costes asociados a la inmovilización
en si misma (soporte, proceso de inmovilización, etc.)
 Limitaciones en la transferencia de masa: a veces, la propia presencia del soporte

puede limitar el movimiento de las moléculas (sustrato, producto, cofactores,...)
VENTAJAS
 Aumento de la estabilidad de la enzima: protección frente a cambios de pH, Ta,

fuerza iónica, contaminación y acción de proteasas.
 Posibilidad de reutilización: utilizar más veces disminuyen los costes del proceso.
 Posibilidad de uso en procesos en continuo: esto es especialmente importante

para que el catalizador inmovilizado se mantenga en un ambiente constante, lo
que es determinante para la estabilidad de la enzima.
 Aumenta la facilidad de recuperación y purificación de los productos: porque es

más fácil retirar la enzima del medio de reacción al estar inmovilizada.
2. TÉCNICAS DE INMOVILIZACIÓN
2.1. - Clasificación de las enzimas inmovilizadas
En esta tabla se
esquematizan las principales
técnicas de inmovilización
según la clasificación que se
acaba de indicar. Se señala
con letras la equivalencia
con la clasificación anterior.
Este es el esquema que se

seguirá a lo largo del tema.
200
Existen distintas técnicas para inmovilizar enzimas. Una primera clasificación las divide
en tres grandes grupos en función de si tras la inmovilización la enzima permanece
soluble o no….
A. Enzimas modificadas con técnicas adecuadas hasta ser insolubles en agua.
B. Enzimas solubles utilizadas en reactores equipados

con membranas de ultrafiltración semipermeables, que
permiten el paso de los productos de reacción,
reteniendo las moléculas de enzima dentro del reactor.
C. Enzimas cuya movilidad ha sido restringida al unirlos con macromoléculas, pero

de forma que la molécula global formada sea aún soluble en agua.
A. ENZIMAS INMOVILIZADAS INSOLUBLES
A.1. Inmovilización por atrapado
Esta técnica supone la localización de la enzima dentro de la red

espacial de una matriz polimérica o de una membrana, de forma que se
evita la liberación de la proteína sin impedir la penetración del substrato.
Se suele utilizar con enzimas en las que las moléculas de producto y de substrato son
relativamente pequeñas (para que puedan moverse a través de la matriz) La enzima no
está unida al soporte de ninguna manera.
o Existen distintos tipos de inmovilización por atrapado:
 En geles
 Las enzimas quedan atrapadas en los espacios intersticiales

de geles poliméricos entrecruzados insolubles en agua.
 Se pueden utilizar distintos tipos de geles (p.e. alginato, quitosano,
poliacrilamida).
201
 En fibras
 Las enzimas quedan atrapadas dentro de las
microcavidades de fibras sintéticas.
 Para la elaboración de las fibras se utilizan aparatos
similares a los utilizados en la industria textil.
 Uno de los polímeros más utilizados es el acetato
de celulosa (es económico y resistente).
 Microencapsulado
 Consiste en atrapar a las enzimas en membranas poliméricas

semipermeables esféricas con diámetros entre 5- 300 m.
 El microencapsulado se puede llevar a cabo en
liposomas, que son vesículas constituidos por
fosfolípidos dispuestos en forma de bicapas concéntricas
muy ordenadas, separadas por compartimentos acuosos.
A.2. Inmovilización por enlace a un soporte
Es el método más antiguo y común de inmovilización de enzimas. El enlace puede

establecerse mediante...
 Adsorción física
 Unión iónica
 Quelación o unión metálica
 Unión covalente
Existen una gran variedad de soportes, con características muy diferentes; sin embargo,
hay una serie de propiedades, consideradas ideales, que debería de tener un soporte.
Así, el soporte ideal es aquel que...
 Incremente la interacción de la enzima con el sustrato

 Disminuya la inhibición por producto
 Cambie el valor de pH óptimo hasta el valor deseado
 Frene el crecimiento microbiano
 Sea fácilmente recuperable
 Sea estable en solución
 Sea rígido mecánicamente y tenga un grado de compactación bajo si se
emplea en reactores de lecho fijo.
202
Vamos a ver las principales características de cada uno de estos tipos de

inmovilicación…
 Adsorción física
 Se basa en la adsorción física de las moléculas de enzima en la superficie
de una matriz sólida poniendo en contacto una solución acuosa de la
enzima con el soporte.
 La unión depende de las condiciones del proceso: pH, naturaleza del
solvente, fuerza iónica, concentración de enzima y de soporte, tiempo y
temperatura.
 Las fuerzas de unión entre enzima y soporte son relativamente débiles
(enlaces de H, interacciones hidrofóbicas, fuerzas de Van der Waals).
 Al ser uniones débiles, se puede producir la
desorción de la enzima del soporte, lo que
puede ser un problema o una ventaja si se
quiere reutilizar el soporte (p.e. soportes caros).
En esta tabla se recogen algunos soportes utilizados para la inmovilización por

adsorción:
Tabla 1. Adsorción a portadores para la inmovilización de la enzimas
Tipo de Portador Portador Enzima utilizada

Óxido de aluminio Glucosamilasa
Bentonita Invertasa
Inorgánico
Vidrio Lipasa
Gel de fosfato cálcico Aspartasa
Glucosa oxidasa
α-amilasa
Carbón activo β-amilasa
Glucoamilasa
Orgánico
Invertasa
Almidón α-amilasa
Tanino- Glucosa-isomerasa
aminohexilcelulosa Aminoácilasa
203
 Unión iónica
 Se basa, principalmente, en la unión iónica de las moléculas de enzima a
soportes sólidos que contienen restos cambiadores de iones.
Los cambiadores de iones se clasifican en aniónicos y catiónicos,

dependiendo de su capacidad para cambiar aniones (cloruro o hidroxilo) o
cationes (iones hidrógeno y sodio).
Algunos de los soportes utilizados son: DEAE-celulosa

(dietilaminoetilcelulosa) o CM-celulosa (carboximetilcelulosa)
 La fuerza de unión es más fuerte que en la adsorción física, pero menor

que en el enlace covalente.
 Se pueden utilizar soportes orgánicos (derivados de polisacáridos como
dextrano y celulosa), soportes inorgánicos (p.e. sílice) o polímeros
sintéticos (principalmente derivados del poliestireno)
 Quelación o unión metálica

 Esta técnica implica el uso de metales de transición como forma de activar
la superficie del soporte, permitiendo el acoplamiento directo de la enzima
sin transformación química previa del soporte a través de la formación de
quelatos.
 La unión es reversible.
 Algunos ejemplos de soportes son:
quítina, ácido algínico, gelatina o
celulosa.
 Como metales se pueden utilizar el
titanio o el zirconio (circonio).
204
 Unión covalente
 Se basa en la unión covalente de la enzima a matrices insolubles en agua.
 La metodología consiste en activar grupos químicos del soporte para que
reaccionen con las cadenas laterales de los aminoácidos accesibles en la
superficie de la proteína.
 La unión es irreversible.
 La unión de la enzima al
soporte debe implicar
grupos funcionales que no
sean esenciales para la
acción catalítica. Para ello,
es importante proteger el
centro activo de la enzima
(p.e. realizando el proceso
en presencia de un sustrato
o un inhibidor competitivo).
En esta tabla se muestran los grupos químicos de los aminoácidos más

empleados para la inmovilización de enzimas por unión covalente.
A.3. Inmovilización por entrecruzamiento (cross-linking)
Se basan en la formación de enlaces covalentes entre las

moléculas de enzima, mediante reactivos bi- o
multifuncionales, dando lugar a la formación de agregados
tridimensionales entrecruzados totalmente insolubles en agua.
En esta imagen se muestra uno de los métodos más utilizados para este tipo de
inmovilización, que consiste en usar glutaraldehído como agente entrecruzante...
205
B. ENZIMAS INMOVILIZADAS SOLUBLES SIN TRANSFORMACIÓN QUÍMICA
Supone el confinamiento físico de las enzimas utilizando membranas semipermeables,

fibras huecas o membranas de ultrafiltración.
En estas imágenes se pueden ver algunas estrategias utilizadas para el confinamiento

físico de las enzimas, en ambos casos en reactores que trabajan en continuo.
 En a) las enzimas se localizan en el reactor y se evita que escapen utilizando

membranas de ultrafiltración.
 En b) las enzimas se localizan en el interior de fibras huecas.
 En c) vemos como la presencia de una membrana impide la salida de la enzima
(E) pero no del producto (P).
 En d) observamos lo que sucede en una fibra hueca; se permite la entrada de
sustrato (S) y la salida de producto (P), pero la enzima permanece en el interior
de la fibra.
C. ENZIMAS INMOVILIZADORAS SOLUBLES CON TRANSFORMACIÓN QUÍMICA
Consiste en la preparación de conjugados enzima-polímero solubles en agua.
Se lleva a cabo mediante reacciones similares a las empleadas en el acoplamiento

químico de enzimas a polímeros insolubles.
Su uso es limitado, ya que es tiene como desventaja

la necesidad de una laboriosa purificación una vez
finalizado el proceso de catálisis enzimática.
206
3. PROPIEDADES DE LAS ENZIMAS INMOVILIZADAS
No existe un método ideal de inmovilización. Cada uno presenta unas determinadas

características, como podemos observar en la tabla adjunta.
Además, la elección de un método u otro, así como de un soporte determinado, depende

de importantes factores, como el tipo de enzima, cómo afecta la inmovilización a las
propiedades de la enzima y la aplicación final.
Cuando una enzima es inmovilizada su microambiente y su estructura tridimensional

pueden cambiar, lo que puede hacer que sus propiedades sean diferentes a las de la
enzima libre.
De cara a la aplicación de una enzima inmovilizada, es esencial conocer cómo va a

afectar la inmovilización a sus propiedades.
Las propiedades de las enzimas inmovilizadas van a depender del tipo de enzima, del
soporte y del tipo de asociación que se establezca entre ambos.
Vamos a ver, brevemente, como afecta la inmovilización a las propiedades de las

enzimas.
¿Cómo afecta la inmovilización a las propiedades de las enzimas?
 Efecto sobre la actividad enzimática
 Efectos conformacionales e impedimentos estéricos
 Reparto desigual limitada y difusión estabilidad
 Efectos del pH
 Efectos sobre la estabilidad enzimática
207
 Efectos sobre la actividad enzimática
La actividad de una enzima inmovilizada, en comparación con su forma soluble, se

puede ver afectada principalmente por las siguientes razones...
a) Efectos conformacionales e impedimentos estéricos
La inmovilización puede producir la inactivación total o parcial de una enzima

si como consecuencia del proceso se altera la estructura de la proteína
(ejemplo (c) de la figura o se ve afectado algún grupo esencial del centro activo
de la enzima).
También puede suceder que, tras la inmovilización, debido a impedimentos

estéricos (ejemplo (d) de la figura), el sustrato no pueda acceder al centro activo
de la enzima.
(a) Enzima libre
(b) Enzima inmovilizada activa
(c) Enzima inmovilizada inactiva

(perturbación estructural en la proteína)
(d) Enzima inmovilizada inactiva

(impedimento estérico)
b) Reparto desigual y difusión limitada
Como consecuencia de la inmovilización se puede producir un reparto

desigual de solutos, de modo que la concentración de éstos en el microentorno
de la enzima y el grueso de la disolución sea distinta. Esto puede ser debido a
interacciones hidrofóbicas o electrostáticas de estos solutos con el soporte de
inmovilización.
En esta imagen se
muestran dos ejemplos de
reparto desigual entre el
microentorno de la enzima
y el grueso de la disolución.
208
Por otra parte, se puede producir una difusión limitada de moléculas de soluto
debido a la presencia física de la matriz, lo que puede conducir al agotamiento
de las moléculas de sustrato y la acumulación del producto alrededor de las
enzimas.
En esta imagen se muestra un ejemplo

de cómo la presencia física del soporte
afecta a la difusión de los solutos. Así, se
observa como alrededor de la enzima (E)
va disminuyendo la cantidad de sustrato
(S) y aumentando la de producto (P).
c) Efecto del pH
El entorno de una enzima inmovilizada es diferente al de la enzima libre, sobre

todo cuando se encuentra unida a un soporte cargado eléctricamente.
Las curvas pH-actividad pueden verse distorsionadas, desplazadas o

ensanchadas como consecuencia de la inmovilización.
En la figura se muestra el efecto de un soporte sobre el perfil de pH de la

quimotripsina...
Si el soporte es polianiónico, los grupos cargados negativamente atraen una

delgada capa de protones (H+), creando alrededor de la enzima un
microambiente más ácido (al tener una mayor concentración de protones) que
el que hay en el grueso de la disolución. Por lo tanto, lo que se observa es un
desplazamiento aparente en el pH
óptimo de la enzima hacia valores
más básicos que la enzima libre, ya
que donde se mide el pH es en el
grueso de la disolución.
Si el soporte es policatiónico,
ocurre el efecto contrario, y lo que
se observa es un cambio aparente
de pH hacia el lado ácido.
209
 Efectos sobre la estabilidad enzimática
La estabilidad de una enzima es una función compleja que depende de su

naturaleza intrínseca, de las condiciones de inmovilización y de las condiciones de
reacción.
Cuando se habla de estabilidad es importante distinguir entre:
a) Estabilidad operacional
La inmovilización puede incrementar o no la estabilidad operacional de una

enzima. A veces, el incremento en la estabilidad operacional en solo aparente,
como se puede observar en la figura adjunta...
Si nos fijamos en la figura observamos que, aparentemente, la enzima

inmovilizada es más estable que la libre, pues su actividad relativa (en %) es
mayor que para la enzima libre. Así, se ve que durante un tiempo mantiene un
100% de actividad, para luego descender
bruscamente. Esto se explica porque, debido a
restricciones difusionales, solo una parte de la
enzima inmovilizada es activa al comienzo de su
uso. El resto queda como actividad en reserva que
se va manifestando durante un tiempo. La pérdida
de actividad con el tiempo se manifiesta cuando
se pierde la actividad enzimática tamponante.
b) Estabilidad térmica
La actividad catalítica de las enzimas aumenta cuando se eleva la temperatura.

Sin embargo, las enzimas son proteínas generalmente inestables al calor, por lo
que habitualmente las reacciones enzimáticas no pueden llevarse a cabo a
temperaturas altas. En este sentido, la inmovilización puede producir
incrementos o descensos, o bien no influir, en la estabilidad frente a la
temperatura de las distintas enzimas.
En esta figura se muestra un ejemplo de como la

inmovilización incrementa la estabilidad de una
enzima inmovilizada, en este caos celobiosa
inmovilizada en dextrano. Como se puede ver, a
partir de los 65oC, la actividad relativa de la enzima
inmovilizada es superior a la de la enzima libre.
210
En esta otra figura se representa la estabilización de

una enzima mediante dos técnicas de inmovilización
distintas. Como consecuencia de la inmovilización la
estructura terciaria de la enzima adquiere una mayor
rigidez, y se hace más resistente a la desactivación
térmica.
4. APLICACIONES DE LAS ENZIMAS INMOVILIZADAS
Las enzimas inmovilizadas tienen numerosas aplicaciones. A nivel industrial, se pueden

aplicar en numerosos sectores, como la industria química, farmacéutica y, por supuesto,
alimentaria.
En cualquier caso, y en función de todo lo que hemos visto en el tema, que una enzima
se pueda utilizar inmovilizada dependerá, entre otros factores, de la enzima, del
proceso, del tipo de soporte, de la relación coste/beneficio, etc…
Una aplicación muy interesante es en analítica, formando parte de biosensores. El

biosensor actuaría transformando una respuesta biológica, como la transformación de
un sustrato en producto, en una señal eléctrica cuantificable.
211
Tema 13. PRINCIPALES APLICACIONES DE LAS ENZIMAS EN LA

INDUSTRIA ALIMENTARIA
1. INTRODUCCIÓN
La aplicación de enzimas para la producción de alimentos no es nada

nuevo. La producción de muchos alimentos y bebidas tradicionales,
como el queso, el yogur, el pan, la cerveza, o el vino se producen en
parte gracias a la acción de enzimas presentes de forma natural en el
alimento o producidas por microorganismos presentes en los alimentos.
El avance en el conocimiento de los procesos

bioquímicos implicados en la producción de estos
y otros alimentos, así como...
...el gran avance experimentado en la producción industrial de

enzimas, han conducido al desarrollo de numerosas
aplicaciones de las enzimas en la industria alimentaria, algunas
de las cuales veremos a lo largo de este tema...
Antes de empezar con las aplicaciones, hay que tener en cuenta con qué finalidad se
utilizan las enzimas en la industria alimentaria…
▪ Las enzimas alimentarias son utilizadas con un fin

tecnológico en cualquier fase de la fabricación,
transformación, preparación, tratamiento, envase,
transporte o almacenamiento de los alimentos.
▪ Se pueden aplicar libres y/o inmovilizadas, según
el tipo de enzima, del proceso, etc.
212
Aunque no vamos a hablar de legislación, es importante conocer que las enzimas

alimentarias se encuentran reguladas, y que se está en proceso de elaboración la lista
comunitaria de enzimas autorizadas.
En este enlace puedes encontrar más información sobre enzimas alimentarias:
http://www.aecosan.msssi.gob.es/AECOSAN/web/seguridad_alimentaria/subdetalle/en
zimas_alimentarias.htm
Este es el reglamento que regula las enzimas alimentarias: Reglamento (CE) no 1332/2008
del Parlamento Europeo y del Consejo, de 16 de diciembre de 2008 sobre enzimas alimentarias y por el
que se modifican la Directiva 83/417/CEE del consejo, el Reglamento (CE) no 1493/1999 del Consejo, la
Directiva 2000/13/CE, la Directiva 2001/112/CE del Consejo y el Reglamento (CE) no 258/97.
2. ENZIMAS EN EL PROCESADO DE PROTEÍNAS
Empezamos con la aplicación de enzimas

en el procesado de proteínas. Las proteínas
no sólo son importantes desde el punto de
vista nutricional, sino también tecnológico.
Las proteínas no sólo contribuyen a la textura y sabor de los alimentos, sino que
presentan numerosas propiedades tecnofuncionales que hace que sean ampliamente
utilizadas como ingredientes en la industria alimentaria...
▪ Textura y sabor de los alimentos,...

▪ Propiedades tecnofuncionales (espumantes, gelificantes, emulsificantes, ...)
Propiedad Aplicación
Emulsificación Carnes, Blanqueadores de café, Aderezos ensalada
Hidratación Masas, Carnes
Viscosidad Bebidas, Masas
Gelatinización Salchichas, Gelatinas, Queso
Espumosidad Coberturas, Merengues, Cabello de Ángel
Unión cohesiva Productos texturizados, Masas
Textura Comidas texturizadas
Solubilidad Bebidas
Estas propiedades de las proteínas implican normalmente su

modificación. En este proceso desempeñan un papel fundamental
las enzimas, entre las que destacan las proteasas y transglutinasas.
213
2.1. - Proteasas
Las proteasas catalizan la hidrólisis de uniones peptídicas. Estas enzimas se pueden

aplicar en distintos sectores de la industria alimentaria.
En este apartado nos vamos a centrar en dos aplicaciones de las proteasas

relacionadas con el procesado de proteínas: industria cárnica y producción de
hidrolizados proteicos.
✓ Industria láctea
✓ Panificación
✓ Elaboración de cerveza
✓ Industria cárnica
− Las proteasas, en la industria cárnica, se pueden utilizar para el

ablandamiento de la carne, aunque su uso está limitado actualmente.
− Para entender porque se aplican, hay que recordar como se produce la

transformación del músculo en carne (en la maduración intervienen
proteasas endógenas; este proceso se puede acelerar añadiendo proteasas
de forma exógena).
− Tradicionalmente se han empleado proteasas de origen vegetal, como la

papaína o la bromelina.
Recordar...Transformación del músculo en carne...
214
✓ Hidrolizados proteicos
− Las proteasas se utilizan para la obtención de hidrolizados proteicos, cuyas

propiedades les hacen muy útiles para las siguientes aplicaciones en la
industria alimentaria:
 Debido a sus propiedades nutricionales se utilizan en alimentación

especializada (p.e. elaboración de fórmulas infantiles), ya que presentan
hipoalergenicidad, mayor digestibilidad, o bioactividad (algunos péptidos
presentan esta característica).
 Las propiedades tecnológicas (p.e. capacidad espumante, gelificante,...)

que presentan estos hidrolizados hace que se utilicen como ingredientes
en la industria alimentaria.
− Las aplicaciones de los hidrolizados depende de sus propiedades, y las

propiedades de los hidrolizados dependen principalmente de los siguientes
factores...
 Proteasas utilizadas: existen distintos tipos de proteasas que difieren,

entre otras cosas, en el modo de acción (p.e. endo- y exopeptidasas) o
en la especificidad que muestran por los aminoácidos implicados en el
enlace peptídico. Esto va a influir en las características del hidrolizado
resultante.
 Fuente de proteínas: el tipo de proteína de partida también influye sobre

las características de los hidrolizados. Entre las fuentes de proteína que
se pueden utilizar se encuentran los subproductos cárnicos y pesqueros,
vegetales,...
 También influyen las condiciones del proceso (p.e. tiempo, temperatura)

y grado de hidrólisis (GH)
215
Según el GH el hidrolizado resultante va a tener una determinada aplicación...
enlaces peptídicos hidrolizados

GH (%) = · 100
enlaces peptidicos totales
→ GH = 1-10% : Mejora propiedades funcionales
→ GH > 10% : Alimentación especializada
3. INDUSTRIA DEL ALMIDÓN Y SUS DERIVADOS
Otra importante aplicación de las enzimas es en la industria del almidón y derivados.

Empezamos recordando la importancia del almidón, no sólo desde el punto de vista
nutricional, si no también desde el tecnológico.
Importancia del almidón en la industria alimentaria...
➢ Nutricional: recordar la importancia de los glúcidos (como el almidón) en una

alimentación equilibrada...
➢ Tecnológica:
− Propiedades funcionales: el almidón es añadido
durante el procesado de muchos alimentos por sus
propiedades funcionales (espesante, gelificante,
estabilizante de emulsiones y sustituto de grasa).
− Obtención de jarabes o siropes: mediante la hidrólisis enzimática del almidón
se obtienen compuestos (p.e. dextrinas, jarabes de glucosa,...) con gran
potencial de uso en la industria alimentaria como ingredientes para la
elaboración de michos productos como bebidas, helados, galletas,...
216
3.1.- Hidrólisis enzimática del almidón para la obtención de jarabes o siropes...
Vamos a ver brevemente cómo se

produce la hidrólisis enzimática del
almidón para la obtención de jarabes
o siropes. Antes de nada, recuerda
cuál es la composición y estructura
del almidón, que ya has visto en
asignaturas de cursos precedentes…
Las enzimas que se van a utilizar serán aquellas capaces de romper los enlaces que
mantienen unidos a las unidades de glucosa. En esta tabla se muestran las principales
enzimas que se utilizan en la industria del almidón. Se han agrupado según el tipo de
enlace que rompen.
Lo importante es fijarse en
que los productos
resultantes de la hidrólisis
del almidón van a ser
diferentes según las
enzimas que se utilicen.
217
Se han indicado las principales enzimas que se utilizan pero, ¿en qué momento se
aplican? Para ello, veamos cuáles son las principales etapas que tienen lugar en el
procesado industrial del almidón…
GELATINIZACIÓN: Se calienta el
almidón en agua para que los
gránulos de almidón se abran y
puedan actuar las enzimas
hidrolíticas.
LICUEFACCIÓN: Hidrólisis parcial

del almidón hasta dextrinas.
SACARIFICACIÓN: Obtención de
jarabes de glucosa y maltosa a
partir de las dextrinas.
Este proceso es dependiente de...

▪ La estructura y tamaño del gránulo de almidón.
▪ La relación amilosa/amilopectina, que no es la misma en todos los almidones.
▪ La combinación de enzimas utilizada, tendiendo en cuenta que hay distintos tipos.
▪ Las condiciones del proceso (p.e. tiempo y temperatura).
4. ENZIMAS EN PRODUCTOS DE PANADERÍA Y BOLLERÍA
Los productos e panificación son alimentos horneados, como pan,

pasteles, pastas, galletas,… Se trata de productos diferentes, por lo que
las enzimas que se apliquen dependerán del producto final a obtener.
¿Qué enzimas se utilizan en panificación?
Como el principal componente de

las masas de panificación es la
harina de trigo, se utilizarán
aquellas enzimas que actúen sobre
los componentes de la harina...
218
ENZIMA EFECTO
Hidrolizan el almidón, dando lugar a la producción de
azúcares fermentables por las levaduras, lo que incrementa
la velocidad de fermentación, mejora del volumen y textura
Amilasas del producto.
Además, los azúcares que se generan mejoran el sabor, el
color de la corteza y la calidad de tostado del pan
(Recordar: reacciones de Maillard).
Producción de dextrinas de bajo peso molecular que
-amilasa impiden la retrogradación del almidón » Prolongación de la
maltogénica
vida útil de los productos panificados .
Cataliza la siguiente reacción:
glucosa → ac. glucónico + H2O2
Glucosa oxidasa
El peróxido de hidrógeno, al ser un agente oxidante, actúa

sobre los grupos tiol del gluten, y favorece la formación de
enlace disulfuro, reforzando así la proteína. Por lo tanto,
refuerza el gluten mejorando la fuerza de la masa.
Proteasas Se suelen utilizar en la fabricación de galletas porque

debilitan el gluten. Se evita así el uso de agentes
reductores que actúen sobre el gluten.
Lipasas Modifica los lípidos naturales presentes en la harina

mejorando la estructura y estabilidad de la masa, ya que
favorece retención del gas.
Asparaginasa Reduce la cantidad de acrilamida formada durante el

horneado, al reducir los niveles de asparagina (La
acrilamida se forma a partir de la asparagina)
En 2017 se publicó el Reglamento (UE) 2017/2158 de la Comisión por el que se

establecen medidas de mitigacvión y niveles de referencia para reducir los niveles de
acrilamida en los alimentos
219
5. ENZIMAS EN PRODUCTOS LÁCTEOS
Existe una amplia tradición en la aplicación de enzimas en el sector lácteo, siendo quizás
la más conocida la actividad de proteasas ácidas para el cuajado de la leche… Otra
de las enzimas más utilizadas en los últimos años es la -galactosidasa o lactasa, ya
que los productos lácteos sin lactosa son muy demandados por el consumidor.
La lactasa hidroliza la lactosa en sus monosacáridos constituyentes. Se aplica

fundamentalmente con la siguiente finalidad:
- Fabricación de productos para intolerantes a la lactosa
- Incrementar el dulzor de productos lácteos sin necesidad de
azúcares añadidos (mayor poder edulcorante de la glucosa)
- Para evitar los problemas de
cristalización de la lactosa en
productos lácteos (p.e. helados)
6. ENZIMAS EN CERVECERÍA
En la industria cervecera también se pueden utilizar enzimas. Para entender en qué

etapas se pueden aplicar y con qué finalidad, veamos en primer lugar las principales
etapas que tienen lugar en la elaboración de cerveza…
Brevemente, la elaboración de cerveza requiere de agua, cebada malteada, adjuntos

(cebada, maíz, arroz, trigo y sorgo), lúpulo y levadura. El proceso implica extraer y
romper los carbohidratos y la proteína de la malta y de los adjuntos. Como resultado se
forma una disolución rica en carbohidratos y proteínas que puede ser usada como fuente
de nutrientes para la fermentación de las levaduras.
Los principales cambios biológicos que ocurren en este proceso son catalizados por
enzimas endógenas producidas naturalmente por la cebada y por las levaduras.
Veamos entonces con qué finalidad se añaden enzimas de forma exógena.
220
Cuando la malta no es de una calidad adecuada o cuando se utilizan grandes cantidades

de adjuntos, se pueden añadir enzimas en la etapa de maceración (amilasas y
proteasas). Con ello, utilizando materias primas de menor calidad, se pueden mejorar
los rendimientos del proceso y la calidad del producto final.
❖ Amilasas: licuefacción de adjuntos

❖ Amilasas + proteasas: sustitución
de malta por cebada malteada
Durante el proceso de maduración de la cerveza se forma un compuesto amargo, el

diacetilo, que se transforma en un compuesto no amargo, la acetoina, por medio de una
reductasa de la levadura. Este proceso es lento. Sin embargo, se puede acelerar
mediante la adición de una enzima, la -acetolactato descarboxilasa, con lo que el
tiempo de maduración de la cerveza disminuye.
Durante la fermentación se pueden añadir enzimas

para evitar problemas posteriores. Por ejemplo, una
de las enzimas que se añaden es -glucanasa, que
degrada los -glucanos, polisacáridos complejos que
pueden dar problemas durante la filtración.
221
7. ENZIMAS EN OTROS PRODUCTOS DE INTERÉS COMERCIAL
Las enzimas tienen otras aplicaciones muy interesantes, a partir de las que hemos visto.
Sin entrar en detalles, señalamos dos importantes sectores en los que se aplican
enzimas, como son en el procesado de frutas o en la industria vinícola…
Un ejemplo, en el procesado de frutas se utilizan enzimas para la clarificación de

zumos. La utilización de pectinasas y/o celulasas/hemicelulasas, favorece la filtración
de los zumos, al reducir la viscosidad, por lo mejora en rendimiento del proceso.
Además, contribuye a una menor turbidez de los zumos.
Aquí se muestra un ejemplo de una empresa que vende enzimas, en este caso para el
procesado de zumos... por si te interesa buscar información...
https://www.enzymedevelopment.com/e s/applications/juice/
222
8. USOS ANALÍTICOS
Las enzimas se pueden utilizar con fines analíticos de dos formas:
✓ Para el análisis de alimentos: p.e. en la determinación

de sustancias como glucosa o etanol.
✓ Determinando la presencia de actividades enzimáticas.
Por ejemplo, para verificar la eficacia de un tratamiento
térmico, como la pasterización de la leche.
Para determinar si el tratamiento de pasteurización de la leche

ha sido correcto se determinan dos actividades enzimáticas: la
peroxidasa y la fosfatasa alcalina.
Relaciones tiempo-temperatura para la inactivación de los

enzimas de la leche.
Se considera que el tratamiento ha sido correcto si la actividad

fosfatasa alcalina es negativa y la peroxidasa es positiva.
Ejemplo de laboratorio que determina estas dos actividads enzimáticas
→ Análisis de la peroxidasa en leche: El método innovador de CDR permite cuantificar

fácil y rápidamente peroxidasa en la leche. La prueba puede llevarse a cabo en muestras
microscópicas tal cual y requiere el uso de un reactivo precargado en cubetas desechables.
La persistencia de la actividad lacto-peroxidasa en la leche pasteurizada proporciona una buena
indicación de la calidad de un producto, ya que solo se puede poner una leche cruda de buena
calidad microbiológica a través de un proceso de pasteurización suave para no inactivar esta
enzima. Los métodos tradicionales a menudo son cualitativos (presente / no presente) y, por lo
tanto, solo pueden indicar si se ha realizado el proceso térmico. La cuantificación de la
lactoperoxidasa en la leche pasteurizada permite, en cambio, determinar la calidad nutricional de
la leche. Mayor valor de peroxidasa significa que la leche ha conservado sus características
originales.
https://www.cdrfoodlab.es/alimentos -bebidas-analisis/peroxidasa-leche/
→ Análisis de la Fosfatasa alcalina (ALP) en la leche: La fosfatasa alcalina (ALP) es

una enzima normalmente presente en la leche cruda y se inactiva en condiciones de tratamiento
térmico. La temperatura de inactivación de ALP es ligeramente más alta que la requerida para la
destrucción de bacterias patógenas. Por lo tanto, la prueba ALP en leche pasteurizada se utiliza
para verificar si el proceso de calentamiento de la pasteurización se realiza correctamente.
https://www.cdrfoodlab.es/alimentos-bebidas- analisis/fosfatasa-alcalina-leche/
223

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CyTA – UBU Biotecnología Alimentaria

BLOQUE III – TECNOLOGÍA ENZIMÁTICA

10. INTRODUCCIÓN A LA TECNOLOGÍA ENZIMÁTICA

1. La tecnología enzimática como herramienta de la biotecnología.

Recordemos que la biotecnología es la ciencia de los métodos que permiten la obtención

El uso de microorganismos vivos o de alguno de sus componentes para obtener o

Las enzimas, son herramienta de la biotecnología, son componentes de los organismos

2. Introducción a la tecnología enzimática de las enzimas.

La tecnología enzimática consiste en la obtención, manipulación y modificación de

En muchas ocasiones estas etapas se realizan en a pequeña escala, por ejemplo, en

Uno de los aspectos más importantes es la caracterización de las enzimas de interés,

También podemos recurrir a la ingeniería genética para conseguir “enzimas mutadas”

Son muchas las aplicaciones de las enzimas en distintos sectores, incluyendo el

Aplicación práctica de la tecnología enzimática.

En que sectores se aplican fundamentalmente las enzimas y cual es el impacto

Nos fijamos en las aplicaciones y en el volumen de negocio (billones de dólares).

- La aplicación de enzimas en la IA y bebidas supuso en 2017 un 27% del total,

- Porcentajes de demanda por regiones en 2017 y la estimación para 2022.

Otro aspecto interesante es que, a pesar de la gran demanda, la producción de enzimas

Una de las principales productoras de enzimas es la empresa danesa “Novozymes”.

Porque se utilizan enzimas en la industria, que ventajas presentan e

La aplicación de enzimas en la industria, además de buscar la rentabilidad industrial y

Las enzimas son catalizadores muy potentes:

- Son muy eficaces. Catalizan reacciones frecuentemente 108-1011 veces más

Las ventajas se deben a su elevado poder catalítico y su especificidad:

- Se incrementan las posibilidades de control de los procesos. Controlando el

Debido a su alta especificidad:

- Se eliminan reacciones secundarias.

- Costosas de purificar. Algunas enzimas son costosas de purificar.

Podemos concluir que:

- Que su calidad sea superior a la del producto tradicional.

11. PRODUCCIÓN INDUSTRIAL DE ENZIMAS

La producción industrial de enzimas es un campo muy extenso, por lo que veremos

Fuente: Wood BJ (1998). Microbiology of Fermented Foods. Thomson Science, United

- El uso de enzimas se inició en 1874: producción de renina a partir de estómagos

- La introducción generalizada de la fermentación (años 60) y la llegada de la

En la actualidad, enzimas a la carta: los microorganismos son ahora la principal fuente

La producción industrial de enzimas requiere de las siguientes

- La fuente de la enzima puede condicionar tanto los procedimientos de extracción

Veremos como se relacionan estos procesos a lo largo de tema.

Las fuentes de obtención de enzimas son: animal, vegetal y microbiana.

- Animal. Aunque en poca cantidad se producen enzimas como:

- Vegetal. En pequeña cantidad en comparación con las fuentes microbianas.

Surgieron problemas asociados a la utilización de fuentes animales y vegetales para

Esto condujo a la utilización de microorganismos como fuente para la producción de

- Microbiana. La inmensa mayoría de las enzimas que se utilizan son microbianas

Es muy importante la selección del microorganismo: tienen que ser considerados

Presentan una serie de ventajas:

o Enorme variedad de vías metabólicas: el metabolismo microbiano es muy

3. Producción de enzimas por fermentación.

La mayor parte de las enzimas industriales se producen por fermentación sumergida.

Para ello, se seleccionan las condiciones óptimas de producción: composición del

Hay dos aspectos importantes para controlar la producción microbiana de enzimas:

- Síntesis de enzimas en función del crecimiento microbiano: si nos fijamos en el

- Control genético. Los microorganismos producen dos tipos de enzimas:

En la siguiente tabla se muestran algunas enzimas de interés obtenidas por

Fuente: Hernández A (2003). Microbiología industrial. Editorial Universidad Estatal a

4. Extracción y purificación de enzimas.

El primer paso para el aislamiento y purificación de una enzima es su extracción.