9/21/2020 El microsporidio Perezia sp.

y la enfermedad de algodón del camarón « Global Aquaculture Advocate

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Health & Welfare

El microsporidio Perezia sp. y la

enfermedad de algodón del camarón
Monday, 23 September 2019
By Jee Eun Han, DVM, Ph.D. , Seung Chan Lee , Seul Chan Park  and Marc Le Groumellec,
DVM, Ph.D.

Detección por histopatología, y por nuevos métodos de

hibridación in situ y PCR

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En este estudio se analizaron muestras de camarones infectados con

microsporidios, incluido el camarón tigre negro (Penaeus monodon),
recolectadas en Madagascar, Mozambique y el Reino de Arabia
Saudita y con signos clínicos de enfermedad del camarón de algodón.
Foto de Darryl Jory.

Los microsporidios son parásitos intracelulares obligados en una variedad de huéspedes, desde invertebrados hasta
humanos. La investigación de microsporidios se ha centrado más en hospedadores terrestres, pero
aproximadamente el 50 por ciento de los géneros conocidos de microsporidios infectan hospedadores acuáticos
como crustáceos y peces. Estas infecciones microsporidianas de huéspedes acuáticos se consideran un peligro
potencial para la salud, así como un riesgo nanciero en la acuacultura.

Una de las enfermedades críticas que afectan el cultivo del camarón es la “enfermedad de algodón del camarón”
(CSD), y los agentes causantes asociados con esta enfermedad son los microsporidios que se encuentran en al menos
cinco géneros, incluidos Pleistophora, Thelohania, Perezia, Agmasoma y Ameson. Estos parásitos microsporidianos
infectan principalmente el músculo esquelético, haciendo que las regiones del cuerpo afectadas sean blancas u
opacas, lo que le da el nombre común a esta enfermedad. Los camarones ligeramente infectados pueden verse y
comportarse normalmente, pero las infecciones graves hacen que los camarones no sean comercializables o no sean
comestibles. En los camarones, el aspecto blanco opaco del músculo está relacionado principalmente con infecciones
microsporidianas. Sin embargo, otros agentes causales como los dino agelados, las bacterias o los virus también
pueden estar relacionados con esta enfermedad.

Este estudio se centró en el microsporidio asociado con CSD en camarones recolectados de Madagascar,
Mozambique y el Reino de Arabia Saudita. Investigamos sus características histopatológicas y determinamos su
clasi cación taxonómica por secuenciación de subunidades pequeñas de rADN (SSU de rADN). Estas secuencias se
usan ampliamente para dilucidar las relaciones evolutivas entre organismos, ya que son de origen antiguo y se
encuentran en todas las formas de vida conocidas.

Además, se desarrollaron métodos de diagnóstico especí cos para esta enfermedad basados en: 1. hibridación in situ
[ISH; un tipo de hibridación usando una cadena marcada complementaria de ADN, ARN o ácidos nucleicos
modi cados (es decir, sonda) para localizar una secuencia especí ca de ADN o ARN en una porción o sección de
tejido]; y 2. reacción en cadena de la polimerasa (PCR), un método ampliamente empleado en biología molecular para
hacer numerosas copias de un segmento de ADN especí co) dirigido a la secuencia de SSU de rADN.

Con guración del estudio

Un total de 298 muestras de camarones con signos clínicos de CSD fueron enviadas desde Madagascar, Mozambique
y Arabia Saudita Laboratorio de Patología Acuícola de la Universidad de Arizona durante un período de varios años.
La Tabla 1 resume la información relevante.

Han, CSD, Tabla 1

Órgano No. muestras
País y especies Estadío Grado PCR
objetivo positivas/totales
Madagascar (P.
Adult G3-G4 Músculo 3/3 NA
monodon)

Madagascar (P.
Juvenil G3-G4 Músculo/HP 6/30 NA
monodon)

Madagascar (P.
Sub-adulto NA Músculo/HP NA pos.
monodon)

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Órgano No. muestras

País y especies Estadío Grado PCR
objetivo positivas/totales
Madagascar (P.
Sub-adulto G3-G4 Músculo/HP 4/19 NA
monodon)

Madagascar (P. Músculo

Adulto G2-G3 3/5 NA
monodon) /HP/corazón

Madagascar (P.
Sub-adulto G1-G3 Músculo/HP 6/28 NA
monodon)

Madagascar (P.
Juvenil NA Músculo NA pos.
monodon)

Madagascar (P.
Juvenil G3-G4 Músculo/HP 35/35 NA
monodon)

Madagascar (P.
Juvenil NA Músculo/HP NA pos.
monodon)

G3-G4 Músculo
Mozambique (P.
Juvenil G3-G4 /HP/agallas/ 4/23 NA
monodon)
corazón/LO

G3-G4 Músculo
Mozambique (P.
PL G3-G4 /HP/agallas/ 2/50 NA
monodon)
corazón/LO

G3-G4 Músculo
Mozambique (P.
Adulto G3-G4 /HP/agallas/ 4/4 NA
monodon)
corazón/LO

G3-G4 Músculo
Saudi Arabia (P.
Adulto G4 /HP/agallas/ 3/3 NA
indicus)
corazón/LO

Saudi Arabia (P.

Adulto G2-G4 Músculo/HP 30/93 NA
indicus)

Saudi Arabia (P.

Adulto NA Músculo NA pos.
indicus)

Saudi Arabia (P.

Juvenil G2-G4 Músculo/HP 5/5 NA
indicus)

Tabla 1. Muestras de la enfermedad de algodón del camarón utilizadas en este estudio (modi cado de la tabla
original). Las muestras se analizaron mediante examen histopatológico (para presencia de microsporidios) y
ensayos de PCR. El sistema de grado G varía de G0 (negativo) a G4 (gravedad más alta). La columna de PCR
indica el órgano diana positivo para Perezia sp. (HP: hepatopáncreas; LO: órgano linfoide). PL: postlarvas; pos:
positivo; na: no disponible.

Resultados y discusión
Examen de histopatología
En camarones y otros crustáceos, Perezia spp. destruye los músculos y reemplaza gradualmente la musculatura por
masas de etapas de desarrollo de parásitos y esporas. En las últimas etapas de la infección, los parásitos pueden
invadir otros tejidos y órganos, como los cardiomiocitos, las células epiteliales y del tejido conectivo de las glándulas

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antenales, en el mismo camarón. En este estudio, varios tejidos del mismo camarón se vieron afectados por este
microsporidio. El examen de histopatología reveló numerosas esporas de microsporidios en muestras recolectadas de
Madagascar, Mozambique y Arabia Saudita. La infección afectó principalmente al hepatopáncreas y al músculo, en el
nivel de gravedad correspondiente a grados que van desde G1 a G4.

Se observaron esporas maduras entre las bras del músculo esquelético (Fig. 1A, B) y las etapas previas a las esporas
y las esporas del epitelio infectado de los túbulos del hepatopáncreas (Fig. 1C, D). En las infecciones graves, también
se observaron esporas dentro de las células epiteliales del lamento branquial (Fig. 1E, F), bras musculares
cardíacas (Fig. 1G) y células parenquimatosas del órgano linfoide (Fig. 1H). Las esporas que se extienden por todo el
organismo en las etapas avanzadas de la infección podrían haberse derivado de la infección muscular: los músculos
se deterioraron gradualmente y las esporas contaminaron los tejidos circundantes. Además, la mayoría de los casos
(90 por ciento) de CSD fueron acompañados por infecciones de la enfermedad de ensuciamiento de las branquias
causadas por Zoothamnium sp. o Epistylis sp., que indicó que los animales que sufren microsporidiosis
probablemente eran débiles y susceptibles a infecciones secundarias o infestaciones.

Fig. 1: Lesiones representativas características de la enfermedad

causada por el microsporidio encontrado en camarones peneidos de
Madagascar, Mozambique y Arabia Saudita. (A, B) Esporas maduras
acumuladas entre las bras musculares esqueléticas; (C, D)
preesporas ( echas) y etapas de esporas (puntas de echa) dentro de
las células epiteliales del túbulo del hepatopáncreas (el recuadro
muestra células desprendibles); (E, F) acumulaciones
intracitoplasmáticas de esporas maduras dentro de las células
epiteliales del lamento branquial; (G) esporas maduras dentro de las
bras musculares del corazón; (H) células parenquimatosas de

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túbulos de órganos linfoides. Tinción: (A, C, E, G, H) hematoxilina /

eosina- oxina de Mayer-Bennett; (B, D, F) Giemsa. Barras de escala =
30 µm.

Secuencia de SSU de rADN del nuevo microsporidio que causa CSD

Realizamos una PCR dirigida a las secuencias de SSU de rADN de los camarones que exhibían CSD, recolectados en
Madagascar, y se obtuvo un fragmento de 1,2 kbp y se secuenciaron. La secuencia de nucleótidos de SSU de rADN se
depositó en Genbank. Según los resultados de la prueba, la secuencia de nucleótidos tenía una identidad del 94 por
ciento con la secuencia de SSU de rADN de Pleistophora sp. infectando a Penaeus setiferus, y 93 por ciento de
identidad con la de un microesporido no identi cado de Metapenaeus joineri. En 2002, Pleistophorasp. de P.
setiferus fue re-identi cado como Perezia nelsoni mediante exámenes morfológicos. En base a la información de
secuencia, por lo tanto, ahora consideramos que el microsporidio recién identi cado pertenece al género Perezia, y
nos referiremos a él como Perezia sp. lo sucesivo. La CSD causada por Pereziasp. parece extenderse a varios países
productores de camarones, incluidos Madagascar, Mozambique, Arabia Saudita (el presente estudio), Estados Unidos
y Japón, pero no se ha estudiado lo su ciente.

En este estudio, los ADN genómicos extraídos de las muestras de Madagascar y Arabia Saudita se sometieron a PCR
con cebadores especí cos dirigidos a SSU de rADN. Las secuencias obtenidas fueron 100 por ciento idénticas para
ambas muestras. Casualmente, el virus del síndrome de la mancha blanca (WSSV) detectado en estos mismos 3
países (Madagascar, Mozambique y Arabia Saudita) también mostró patrones genómicos idénticos.

Perezia sp. – ISH especí co

La sonda reaccionó fuertemente tanto al músculo esquelético como al hepatopáncreas (Fig. 2A-C), y también a otros
órganos como las branquias, el corazón y los órganos linfoides (datos no mostrados), correspondientes a los
resultados de histopatología. La sonda diseñada a partir de la secuencia de SSU de rADNr de Perezia sp. parecía ser
especí co para camarones con síntomas de CSD de Madagascar, Mozambique y Arabia Saudita.

Al principio, identi camos erróneamente la infección de Perezia sp. como infección por EHP mediante examen
histopatológico normal. Sin embargo, esta sonda ISH no reaccionó a P. stylirostris infectado con E. hepatopenaei (Fig.
2D). No se observó reacción en ninguno de los tejidos preparados a partir de P. vannamei libre de patógenos.
Tampoco P. vannamei y P. monodon, así como los poliquetos infectados con un microsporidio similar a Agmasoma no
identi cado, no reaccionaron a las sondas ISH (datos no incluidos aquí).

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Fig. 2: Ensayo de hibridación in situ (ISH) con una sonda génica

marcada con digoxígeno especí ca para la detección del
microsporidio que causa la enfermedad de algodón del camarón. El
precipitado azul oscuro indica la presencia del parásito (A) dentro de
las células epiteliales del túbulo hepatopáncreas de Penaeus
indicus de Arabia Saudita, (B) entre las bras musculares esqueléticas
de P. monodon de Mozambique y (C) dentro de las células epiteliales
del túbulo hepatopáncreas de P. monodon de Madagascar. (D) Parte
del hepatopáncreas de P. stylirostris de Brunei infectada por
Enterocytozoon hepatopenaeique muestra resultados
representativos, enfatizando la especi cidad de la sonda como lo
demuestra la ausencia de precipitado azul oscuro. Mancha:
contratinción Bismark-Brown. Barras de escala = 30 μm.

Perezia sp. – PCR especí ca

Para nes de diagnóstico, diseñamos un par de cebadores de PCR dirigidos al ADN de Perezia sp.  y generamos un
amplicón de 443 pb (término de biología molecular para designar una pieza de ADN o ARN que es la fuente y/o
producto de los eventos de ampli cación o replicación), que se muestra en la Fig. 3. Esta reacción de PCR es
especí ca del microsporidio Perezia sp. que  causa CSD, y por lo tanto puede ser útil para monitorear este parásito.
Estos cebadores no reaccionaron al ADN microsporidiano de los camarones infectados con E. hepatopenaei (datos
no mostrados). Además, no hubo reacción cruzada al ADN genómico de los camarones (P. vannamei, P. monodon, P.
indicus, P. stylirostris y Macrobrachium rosenbergii), poliquetos, calamares y Artemia spp. (datos no mostrados).

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No analizamos las muestras de Mozambique por PCR, pero la sonda reaccionó intensamente a ISH depositando los
productos de reacción en las células objetivo en las muestras de Mozambique. En este estudio, describimos
microsporidios que infectan los músculos y el hepatopáncreas que causan CSD en camarones de Madagascar,
Mozambique y Arabia Saudita en la región del Mar Rojo-Océano Índico.

Fig. 3: Resultados de PCR especí cos de Perezia sp. Carriles 1-2:

Hepatopáncreas de Penaeus monodon de Madagascar; Carriles 3-6:
músculo de P. monodon de Madagascar; Carriles 7-8: músculo de P.
indicus de Arabia Saudita; Carril 9: Enterocytozoon
hepatopenaei (EHP); Carril 10: control libre de patógenos especí cos
(SPF); Carril 11: control negativo (NC).

Perspectivas
Las infecciones microsporidianas se con rmaron mediante análisis histopatológico y los parásitos se identi caron
como Perezia sp. Además, desarrollamos ensayos de ISH y PCR capaces de detectar este parásito. Estos métodos
pueden ayudar a los productores de camarones en el diagnóstico y manejo de la CSD causada por el microsporidio
Perezia sp.

Referencias disponibles de la primera autora.

Authors
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JEE EUN HAN, DVM, PH.D.

Laboratory of Aquatic Biomedicine, College of Veterinary Medicine

Kyungpook National University, Daegu 41566, Korea

[email protected] (mailto:[email protected])

SEUNG CHAN LEE

Laboratory of Aquatic Biomedicine, College of Veterinary Medicine

Kyungpook National University, Daegu 41566, Korea

SEUL CHAN PARK

Laboratory of Aquatic Biomedicine, College of Veterinary Medicine

Kyungpook National University, Daegu 41566, Korea

MARC LE GROUMELLEC, DVM, PH.D.

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