MANUAL DE USO DE

MALDI-TOF
PROCEDIMIENTO OPERATIVO ESTÁNDAR

ANLIS "Dr. Carlos G. Malbrán"

INSTITUTO NACIONAL DE ENFERMEDADES INFECCIOSAS
DEPARTAMETO DE BACTERIOLOGÍA
SERVICIO BACTERIOLOGÍA ESPECIAL

CIUDAD AUTÓNOMA DE BUENOS AIRES

Enero 2022
 CITA RECOMENDADA:

Rocca Florencia; Prieto Mónica; Martínez, Claudia; Cipolla, Lucía; Armitano,

Rita; Martínez, Gisela; D’Angiolo, Gastón. Manual de uso de MALDI-TOF:
Procedimiento operativo estándar. Ciudad Autónoma de Buenos Aires:
ANLIS Dr.C.G.Malbrán, 2022.
Disponible en: http://sgc.anlis.gob.ar/handle/123456789/2421

“Este recurso es el resultado del financiamiento otorgado por el Estado Nacional, por lo
tanto queda sujeto al cumplimiento de la Ley Nº 26.899 y la política de gestión del
conocimiento de la ANLIS”.

Este obra está bajo una Licencia

CreativeCommonsAttribution 4.0 International (CC BY 4.0)

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 AUTORAS Y AUTORES:

FLORENCIA ROCCA
MÓNICA PRIETO
CLAUDIA MARTÍNEZ
LUCÍA CIPOLLA
RITA ARMITANO
GISELA MARTÍNEZ
GASTÓN D´ANGIOLO

Manual de uso de MALDI-TOF: Procedimiento operativo estándar

ANLIS "Dr. Carlos G. Malbrán"

INSTITUTO NACIONAL DE ENFERMEDADES INFECCIOSAS
DEPARTAMENTO DE BACTERIOLOGÍA
SERVICIO BACTERIOLOGÍA ESPECIAL

Ciudad Autónoma de Buenos Aires, enero 2022

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TABLA DE CONTENIDO O ÍNDICE 4

PROPÓSITO - ALCANCE 5

1-DEFINICIONES Y ABREVIATURAS 5

2-RESPONSABLES 6

3-FUNDAMENTOS TEÓRICOS 6

4-INSTRUCCIONES 6

5-CONSIDERACIONES ESPECIALES 23

6-BIBLIOGRAFÍA 23

7-ANEXOS 24

4
PROPÓSITO: Describir la metodología de MALDI-TOF (Matrix-Assisted Laser
Desorption/Ionization- Time of Flight) para la identificación de microorganismos

ALCANCE: aislamientos de microorganismos pertenecientes a grupos de riesgo 1 y 2 de los

distintos laboratorios que conforman el INEI

1.- DEFINICIONES Y ABREVIATURAS

GRUPO DE RIESGO I: Bajo riesgo individual y comunitario (requieren nivel de contención 1). Este
grupo incluye aquellos microorganismos que no causan enfermedades a
trabajadores de laboratorio y animales.

GRUPO DE RIESGO II: Moderado riesgo individual y riesgo comunitario limitado (requieren nivel de
contención 2). Este grupo incluye patógenos que pueden causar
enfermedades a humanos o animales, pero bajo circunstancias normales, no
producen riesgos serios a trabajadores de laboratorio, la comunidad, los
recursos naturales o el medioambiente. Las exposiciones de laboratorio rara
vez conducen a infecciones que producen enfermedades serias. Existen
tratamientos efectivos, medidas preventivas y el riesgo de dispersión en la
comunidad es bajo.

MALDI TOF: Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time-Of-Flight

HCCA: matriz, ácido 4-hidroxi α-cianocinámico

BTS: estándar bacteriano

TFA: ácido trifluoroacético

AN: acetonitrilo

SO: solvente orgánico

AF: ácido fórmico

EtOH: etanol

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 2.- RESPONSABLES

Operadores con entrenamiento certificado por profesional responsable designado. (Registro

entrenamiento MALDI TOF) Los mismos deben registrar su actividad en el formulario de registro del
usuario MALDITOF (ANEXO FI-BE-21.)

3.-FUNDAMENTOS TEÓRICOS ACERCA DE LA TECNOLOGÍA MALDI BIOTYPER 3.1

La espectrometría de masas mediante la tecnología MALDI-TOF MS (matrix assisted laser desorption

ionization-time of flight-mass spectrometry), ha demostrado ser una herramienta de identificación
bacteriana rápida, confiable y específica. Esta metodología permite la identificación de microorganismos
mediante el análisis de proteínas, principalmente ribosomales, a partir de colonias a través de la creación
de un espectro de masas, el cual es específico para cada especie.
Los espectrómetros de masas están formados por tres elementos básicos. En primer lugar, la "fuente de
iones", donde a partir de la muestra se forma un haz de iones en estado gaseoso. En segundo término, el
"separador de masas" o "tubo de vuelo", que separa los iones formados en función de su relación
"masa/carga" (m/z), y en tercera instancia el "detector" de los iones previamente separados.
La información final que nos proporciona esta técnica es la relación m/z de los distintos iones formados y
en qué cantidad relativa están presentes.

4.-INSTRUCCIONES

4.1.-MANTENIMIENTO DEL EQUIPO

Se realizan mantenimientos preventivos una vez al año, a cargo de ingenieros de la empresa Bruker
Daltonics. Se registra la actividad realizada en una carpeta donde se deja constancia de la certificación del
ingeniero de la empresa.
Se realizan mantenimientos correctivos cuando lo solicita el usuario, debido a fallas o mal funcionamiento
del equipo, a cargo de ingenieros de la empresa Bruker en forma presencial o vía remota y se evalúa el
procedimiento con el posterior desempeño del equipo.

4.2.-CONDICIONES DE SEGURIDAD
Durante el procesamiento de las muestras se debe trabajar en cabinas de seguridad biológica de clase II y
empleando elementos de protección personal.
Al largar una corrida en el equipo, no se requieren medidas de bioseguridad; pero sí se deberán cumplir
ciertas condiciones ambientales constantes de acuerdo a lo indicado en el Manual del equipo:
temperatura ambiente, humedad menor al 70% y limpieza del ambiente (libre de polvo y talco),
manteniendo ventanas cerradas. Respecto de la temperatura, de acuerdo con la experiencia de este
laboratorio, el rango óptimo de trabajo es de 18-22ºC con aire acondicionado.

4.3.- OPERACIONES PRELIMINARES

4.3.1.- Preparación del SO (ANEXO IT –BE-19)

6
4.3.2.-Preparación y almacenamiento de la matriz (ANEXO IT –BE-20)
4.3.3.- Preparación y almacenamiento del BTS (ANEXO IT –BE-18)
4.3.4.- Procedimiento de calibración

• Agregar 1 µl de BTS en uno o varios spots de la placa

• Dejar secar a temperatura ambiente
• Cubrir inmediatamente con 1 µl de matriz
• Dejar secar a temperatura ambiente
• Insertar la placa en el equipo. Existen dos formas de realizarlo:

1. Preferentemente, desde el programa Flex Control, seleccionando el botón IN/OUT

(Figura 1)

2. Con el botón verde del equipo “IN/OUT” (con el programa Flex Control maximizado)

Figura 1

• Una vez en modo OUT, se podrá abrir la tapa del equipo. Insertar la placa en el Maldi
Biotyper (Figura 2), cerrar tocando nuevamente la flecha (Figura 1)
• Aguardar que el equipo ingrese a modo “IN”

7
 Figura 2

• En la ventana del programa Flex Control verificar la generación de vacío en el equipo.

Seleccionar “STATUS” / “DETAILS” / “VACUUM” (Figura 3, 4)

Figura 3

8
 Figura 4

• Aguardar hasta que el punto “Source High” pase de FAIL (rojo), al OK (verde)

(Figuras 4 y 5)

Figura 5

• Luego cerrar solamente la pantalla “VACUUM” (cruz negra)

9
• Proceder a la calibración

Seleccionar el pocillo de BTS preparado en el día y presionar “CALIBRATE” (Figura 6)

A la derecha de la pantalla se visualizará el espectro y seleccionando la solapa
“CALIBRATION” se podrá verificar que al menos 7 de las ocho proteínas del BTS
pasaron la calibración

Figura 6

Aparecerá una nota indicando la calibración correcta (Figura 7)

Nota: Si no se lograra la calibración automática, puede corregirse mediante calibración

manual

10
 Figura 7

Calibración manual
• Seleccionar con el botón izquierdo del mouse, una proteína que no tenga tilde. Al

hacerlo aparecerá en la pantalla el pico correspondiente a esa proteína. Hacer “click” a

la izquierda del pico de esa proteína, en cualquier sector de la pantalla con el botón
izquierdo del mouse. Aparecerá una banda verde y si el error en ppm es menor a 300,
seleccionar “APPLY” (Figura 8)

Figura 8
11
 • Repetir este paso con todas las proteínas no tildadas
• Finalmente seleccionar “FILE” – “SAVE METHODS AS” – “SAVE” – “YES”
• Volver a calibrar, presionando “CALIBRATE”
• Aparecerá la nota de calibración correcta
• Minimizar el programa Flex control (no cerrar NUNCA este programa)

Si la calibración manual no puede ser llevada a cabo debido a que el error para cada
proteína es mayor a 300 ppm, se debe repetir el procedimiento con nueva alícuota de
BTS del mismo tubo

Si la calibración siguiera fuera de rango, se deberá reconstituir nuevo BTS

Si aún no pudiese realizarse una calibración correcta, preparar nuevo solvente orgánico
y luego BTS fresco.

Nota: Registrar el procedimiento realizado en la planilla de calibración (ANEXO FI-BE-

18).

Importante: Trabajar rápidamente cuando el tubo de BTS está destapado para evitar su
evaporación.
Se recomienda calibrar el equipo cada vez que se lleve a cabo un ensayo, o en dos
turnos (por la mañana y por la tarde) si el flujo de trabajo es continuo.

4.4.- PROCESAMIENTO DE MUESTRAS

4.4.1.- Criterios de aceptación / rechazo de muestras

Se deberá trabajar con cultivos frescos (18 – 24 horas de incubación). Algunos microorganismos de
crecimiento lento pueden necesitar mayores tiempos de incubación antes de ser testeados.
La metodología acepta cultivos en agar Columbia con sangre de carnero al 5%, agar tripticasa soya, agar
Mac Conkey, agar Chocolate, agar BHI.
No deben utilizarse cultivos refrigerados, debido a que esto puede alterar el espectro y su
reproducibilidad.
Microorganismos esporulados y otros como Levaduras, Micobacterias, Actinomycetales que poseen pared
12
celular gruesa, pueden no ser identificados por el método directo y requerir métodos de extracción para
su completa identificación.

4.4.2.- Métodos

Método de extendido directo

Materiales:

• Cabina de seguridad biológica

• Placa de 96 pocillos reutilizable

• Escarbadientes

• Tips de 10 µl

• Micropipetas: P10 (1-10 µl)

• Equipo Maldi Biotyper

• Cultivo fresco de microorganismos: realizar cultivos de 18 a 24 horas en los medios de

crecimiento apropiados para cada grupo de bacterias en particular

Reactivos:

• BTS
• Matriz

Procedimiento

• En la planilla de registro (ANEXO FI-BE-19), rotular la posición del BTS, que se utilizará
como control del ensayo, y de cada muestra en estudio, que deberá sembrarse por
duplicado
• En la cabina de seguridad biológica y empleando guantes de látex libres de talco, tomar

con un escarbadientes, una sola colonia aislada y realizar un extendido lo más fino
posible en un pocillo. Realizar el segundo spot sin volver a tocar la colonia
• Agregar 1 µl de BTS en un pocillo de la placa. Este paso debe realizarse luego de

inoculadas las muestras ya que es importante que el BTS no permanezca expuesto al

aire para evitar la oxidación de las proteínas
• Una vez secos los pocillos sembrados, cubrir con 1 µl de matriz, comenzando por el BTS

• Dejar secar a temperatura ambiente 5-10 minutos

• Introducir la placa en el equipo y proceder a la identificación

• El procedimiento a seguir para realizar el método de extendido directo, se puede observar

en la Figura 9.

13
 Figura 9

Importante: Durante el procedimiento de siembra, NO sacar la placa de su soporte plástico y no tocar su

superficie.

La metodología es muy sensible y una pequeña cantidad de material biológico suele ser suficiente; excesos
de material biológico pueden llevar a fallas en la clasificación.

Una vez cubiertas las muestras con matriz, la lectura puede ser realizada hasta 3 o 4 horas después de la
siembra. En ese caso, guardar la placa en su soporte y en ambiente fresco y seco, evitando variaciones de
temperatura y humedad.

Si es posible dejar esa placa dentro del equipo en estado de vacío, la corrida puede realizarse hasta 10 o
12 horas luego de la siembra.

Nota: En caso de no lograr una identificación confiable por el método directo, se sugiere realizar el
procedimiento agregando 1 µl de AF 70% al segundo pocillo de cada muestra y luego cubrir con la
matriz.

De no obtenerse los resultados deseados, ensayar la extracción con ácido fórmico.

Método de extracción con ácido fórmico

Materiales:

• Cabina de seguridad biológica

• Placa de 96 pocillos reutilizable
• Equipo Maldi Biotyper
• Vortex
• Escarbadientes
• Eppendorf de 1,5 ml
• Tips de 100 µl – 1000 µl
• Micropipetas P1000 (100 µl – 1000 µl)
• Microcentrífuga
• Cultivo fresco de microorganismos
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 Reactivos:

• Matriz
• Agua ultrapura
• EtOH 100%
• AF 70%
• AN 100%

Preparación:

• Para 1 ml de AF 70% agregar: 300 µl agua + 700 µl de ácido fórmico puro

• Registrar la preparación en la planilla correspondiente.

Procedimiento:

• Agregar 300 µl de agua en un tubo eppendorf

• Transferir varias colonias aisladas al tubo hasta lograr una turbidez cercana al 3 de Mc

Farland
• Pasar por vortex vigorosamente

• Agregar 900 µl de EtOH (de ser necesario detener el proceso, las muestras pueden ser

refrigeradas en este paso)

• Pasar por vortex vigorosamente

• Centrifugar a 13000 rpm durante 2 minutos

• Decantar el EtOH del sobrenadante por inversión

• Centrifugar a 13000 rpm durante 2 minutos

• Remover el exceso de líquido con pipeta. Dejar secar a temperatura ambiente hasta

evaporación total
• Agregar 50 µl de AF (si el pellet es pequeño, reducir el volumen de AF a 10 µl).

• Pasar por vortex vigorosamente

• Agregar 50 µl de AN (si el pellet es pequeño, reducir el volumen de AN a 10 µl).

• Pasar por vortex vigorosamente. De realizarse una modificación, el AF y el AN

deberán estar en volúmenes idénticos.
• Centrifugar a 13000 rpm durante 2 minutos

• Pipetear 1 µl del sobrenadante en un pocillo de la placa, evitando tocar el pellet. Dejar

secar
• Cubrir con 1 µl de matriz. Dejar secar a temperatura ambiente 5 - 10 minutos

• Introducir la placa en el equipo y proceder a la identificación

Nota: Se recomienda realizar este procedimiento en el día y emplear reactivos químicos de alta pureza para
asegurar la calidad de la extracción y del espectro.
15
4.5.- INTERPRETACION DE RESULTADOS

4.5.1.- Procedimiento de identificación

Manejo de hardware y software (Flex Control, Maldi Biotyper RTC, Maldi Biotyper 3.1)

En el programa Flex Control

- Insertar la placa en el equipo

- Verificar el vacío
- Proceder a la calibración
- Minimizar programa Flex Control (según descripto en el punto 5.2.4)

En el programa MALDI BIOTYPER RTC

- Crear un archivo nuevo para la corrida, seleccionando en “FILE” - “NEW

CLASSIFICATION” (Figura 10)
- En “PROJECT NAME”, escribir el nombre del archivo y luego seleccionar “NEW”
(Figura 11)

Figura 10

16
 Figura 11

- En la pantalla de New Project, seleccionar “OK” – “NEXT” (Figuras 12 y 13)

Figura 12

17
 Figura 13

- Una vez creado el proyecto, aparecerá la grilla de la placa para asociar las
muestras a las posiciones
- Marcar las posiciones a ensayar y, con el botón derecho del mouse, seleccionar
“ADD ANALYTES” (Figura 14)
- Identificar las muestras en la columna ID. Click en botón “FINISH” (Figura 15)

Figura 14

18
 Figura 15

De inmediato comenzarán a procesarse las muestras y mostrarse los resultados

(Figura 16)

Figura 16

- Para imprimir un informe, se deberá seleccionar “VIEW” - “RESULTS” (Figura 17)

19
 Figura 17 Figura 18
- Seleccionar las páginas a imprimir en “PRINT PREVIEW" para obtener la planilla
de resultados (figura 18)
- Para ver un proyecto anterior, seleccionar “FILE”- “OPEN CLASSIFICATION” y
elegir el proyecto deseado.

Nota: Todos los procedimientos en el equipo Maldi Biotyper deben realizarse SIN EL
USO DE GUANTES

Importante: el software Flex Control debe permanecer abierto, aun cuando no está en
uso.

4.5.2.- Revisión de espectros y valores de Score. Análisis de resultados

Se comparan los perfiles proteicos obtenidos de las muestras con la base de datos del equipo (BD 9997
organismos a principios del año 2022), y con las Bases de Datos in house.

En líneas generales, se utiliza el criterio de identificación descripto por el fabricante:

Score ≥ 2.000= identificación a nivel de especie
Score 1.700-1.999= identificación a nivel de género
Score < 1.700= no identificación

Se analizan los valores de score de los 10 primeros pocillos (TOP TEN), verificando una divergencia
mayor al 10% entre el resultado de la primera especie y la distinta siguiente.

20
Cuando se obtienen valores de score menores a 1.700, se deberá optimizar la preparación de la muestra,
ya sea, variando la cantidad de inóculo o utilizando protocolo de extracción distinto del método directo.

En caso de obtener varias especies con score mayor a 2.000 y sin 10% de divergencia entre dichos valores,
analizar los resultados, agregar pruebas bioquímicas diferenciales o evaluar derivar el aislamiento al
Laboratorio de Referencia para confirmar la identificación.

Nota: La verificación de la identificación por el laboratorio de referencia, se realiza empleando pruebas

bioquímicas convencionales manuales o automatizadas, secuenciación parcial del gen 16S ARNr y de
genes específicos adicionales según normas vigentes del MM18 A del CLSI para los distintos grupos
taxonómicos.

Se aceptarán valores de score más bajos para determinados grupos de microorganismos, previamente
validados por Laboratorios de Referencia, para una identificación confiable.
Se recomienda consultar el Manual de interpretación de resultados de MALDI-TOF: Alternativas para la
identificación de microorganismos.

La creación, validación y transferencia de Bases de Datos in house estará a cargo de los Laboratorios de
Referencia pertenecientes a la ANLIS “Dr. Carlos G. Malbrán” y al
Hospital de Clínicas José de San Martín.

4.5.3.- Limitaciones en la identificación

Se recomienda consultar el Manual de interpretación de resultados de MALDI-TOF: Alternativas para la

identificación de microorganismos.

• Shigella sp. No está incluido en la base de datos Maldi Biotyper 3.1 y es considerado
como parte de las especies de E. coli, en consecuencia, no arroja un patrón diferente.

• Streptococcus pneumoniae está estrechamente relacionado al grupo de Streptococcus

mitis y podrían producirse errores de identificación.

• Stenotrophomonas maltophilia: tres especies del género Pseudomonas (P. hibiscola,

P. geniculata y P. beteli), están estrechamente relacionadas con S. maltophilia y pueden
obtenerse identificaciones erróneas. La identificación de estos microorganismos debe

21
 considerarse como Stenotrophomonas grupo maltophilia.

• Complejo Acinetobacter baumannii-calcoaceticus (A.baumannii, A. calcoaceticus,

A. genospecies 3, A. genospecies 13), la diferenciación de especie puede ser difícil.

• No es posible una segura diferenciación dentro del complejo Enterobacter cloacae.

• Grupo Pseudomonas putida, la diferenciación es limitada al igual que en el Grupo

Pseudomonas fluorescens.

• Bordetella pertussis y B. bronchiseptica están estrechamente relacionadas y muestran

un patrón similar.

• Achromobacter xylosoxidans y A. ruhlandii presentan un patrón similar y no pueden ser

diferenciados.

• Complejo Burkholderia cepacia, la resolución se encuentra limitada.

• Bacteroides nordii y B. salyersiae están estrechamente relacionados y la diferenciación

es poco fiable.

• Género Listeria: sólo Listeria grayi puede ser diferenciada de las otras especies.

• Género Aeromonas: todas las especies presentan un patrón muy similar.

• Klebsiella oxytoca / Raoutella ornitholytica: sus patrones son muy similares.

• Los siguientes agentes potenciales de bioterrorismo no se encuentran en la base de datos

Biotyper 3.1:

Clostridium botulinum, Francisella tularensis, Salmonella typhi, Salmonella paratyphi,

22
 Shigella dysenteriae, Vibrio cholerae, Bacillus anthracis, Brucella melitensis, Burkholderia
mallei, Burkholderia pseudomallei, Yersinia pestis

4.6.- OPERACIONES POST ANALÍTICAS

4. 6.1.- Lavado de placas (ANEXO IT –BE-21)

4.6.2.- Descarte de las muestras

El material estudiado se coloca en bolsas rojas para ser descontaminado y posteriormente se realiza el
descarte final.

5.- CONSIDERACIONES ESPECIALES

Trabajar en cabina con guantes de protección cuando se utiliza TFA, ya que el mismo es corrosivo.
Durante el lavado de las placas de acero, evitar la inmersión de la placa dentro de las soluciones de EtOH
o TFA. Sólo se debe cubrir la superficie con los reactivos químicos.
Proteger la superficie de la placa de rayaduras, guardándola en el recipiente de almacenamiento provisto
por Bruker Daltonics.

6.- BIBLIOGRAFÍA

• Manual del usuario MALDI Biotyper 3.0. Bruker Daltonics. 2011.

• Manual de Bioseguridad en el Laboratorio. Organización Mundial de la Salud. Tercera

Edición. Ginebra 2005.

• Interpretive criteria for identification of Bacteria and Fungi by DNA Target Sequencing;
Approved Guideline. MM18-A. Vol 28 No. 12. Clinical and Laboratory Standards Institute
(CLSI).

• Rocca MF, Prieto M, Almuzara M, Barberis C, Vay C. Viñes MP (ed). Manual de

interpretación de resultados de MALDI-TOF: Alternativas para la identificación de
microorganismos. Buenos Aires: ANLIS; UBA, 2019. Disponible en:
http://sgc.anlis.gob.ar/handle/123456789/614

23
7.- ANEXOS

• Planilla de calibración. FI-BE-18

• Planilla de registros de muestras. FI-BE-19

• Planilla de registro de preparación de insumos para MALDI TOF. FI-BE-20

• Planilla Registro usuarios. MADITOF FI-BE-21

• Preparación del SO. IT –BE-19

• Preparación y almacenamiento de la matriz. IT –BE-20

• Preparación y almacenamiento del BTS. IT –BE-18

• Lavado de placas. IT –BE-21

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Planilla de calibración

FECHA /
BTS FECHA
HORA PLACA POCILLO OBSERVACIONES
LOTE HIDRATACIÓN
CALIBRACIÓN
Planilla de registro de muestras
Planilla de registro de preparación de insumos para MALDI TOF

FECHA / HORA VOLUMEN

REACTIVO LOTE ALICUOTAS OPERADOR OBSERVACIONES
PREPARACIÓN FINAL
 Código FI-BE-21
Registro Usuarios Versión 00
Malditof Fecha de revisión:
03/12/2019
Página 1 de 1

Marcar con una x lo que corresponda

Fecha Hora Servicio Agente
Corrida Subida a base de datos Análisis de datos

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Debe confirmarse su vigencia antes de hacer uso de esta versión, por si ha sido modificada.
 Instructivo para la preparación del Solvente Orgánico (SO)

El SO debe ser preparado bajo campana química (sin excepción), y utilizando

guantes de protección. Se utiliza para reconstituir el BTS y la matriz.

Condiciones de seguridad: el ácido trifluoroacético (TFA) debe ser manipulado

bajo estrictas normas de bioseguridad. Ver la ficha de seguridad vinculada a este
documento.

Materiales:
• Campana para trabajar con reactivos químicos
• Tubos eppendorf de 1,5 ml
• Tips de 10 µl, 100 µl y 1000 µl
• Micropipetas: P10 (0,5-10 µl); P100 (10-100 µl); P1000 (100-1000 µl)
• Recipientes de vidrio para almacenar el reactivo si se preparan volúmenes
mayores
• Guantes
• Guardapolvo
Reactivos:
• Acetonitrilo, AN 100% (HPLC / MS Grade)
• Acido trifluoroacético, TFA 100% (HPLC / MS Grade)
• Agua ultrapura (HPLC / MS Grade)
Preparación:
• Para 1 ml de SO agregar: 475 µl de agua ultrapura + 25 µl 100% TFA + 500 µl
de 100% AN
• Rotular con fecha de preparación
• Almacenar a temperatura ambiente
• Registrar la preparación en la planilla correspondiente (ver FI-BE20)

Nota: Nunca utilizar las botellas primarias para preparar muestras

El TFA es muy corrosivo
El AN es altamente inflamable

Tener en cuenta que el AN es muy volátil y su evaporación puede impactar

negativamente sobre la concentración del solvente. Siempre se debe agregar
primero agua en la botella y luego TFA y AN.
Instructivo para la preparación y almacenamiento de la matriz
(HCCA, acido hidroxicianocinamico)

Marca: Bruker Daltonik

Número de catálogo: 255344
Rendimiento aproximado: 250 determinaciones / tubo
Una vez recibido, almacenar a 4 °C o a temperaturas inferiores hasta su uso

Materiales:
• Campana para trabajar con reactivos químicos
• Tips de 1000 µl
• Micropipetas: P1000 (100-1000 µl)
• Recipiente para almacenar la matriz al resguardo de la luz
• Vórtex
• Guantes
• Guardapolvo

Reactivos:
• SO (solvente orgánico)
• HCCA liofilizada

Preparación:
• Reconstituir el tubo liofilizado con 250 µl de SO
• Usar vortex durante 1 minuto. Confirmar disolución total
• Rotular el tubo con fecha de preparación
• Registrar la preparación en la planilla correspondiente (Ver FI-BE20)

Almacenamiento:
• Una vez reconstituido, guardar en oscuridad a temperatura ambiente en envase
rotulado.
• Se recomienda usar dentro de la semana de reconstitución.

Nota: Pasar por vortex previo a su uso y revisar que no se hayan formado cristales
en el fondo del tubo.
De ser así, agregar 30 µl de AN y pasar por vortex o centrifugar a 13000 rpm
durante 2 minutos, utilizar el sobrenadante. Si los cristales no se disuelven, se
debe preparar nueva matriz.

Es importante trabajar rápidamente cuando la matriz está abierta por posible

evaporación.
Instructivo para la Preparación y almacenamiento del BTS

BTS es un extracto de proteínas ribosomales de Escherichia coli DH5α, que posee dos proteínas
adicionales (RNAsa y mioglobina), para cubrir el rango de lectura de 2 a 20 KDa.

Marca: Bruker Daltonik

Número de catálogo: 255343
Rendimiento aproximado: 40 determinaciones / tubo
Una vez recibido, almacenar a -18 °C o a temperaturas inferiores hasta su uso

Materiales:

Campana para trabajar con reactivos químicos

• Tips de 10 y de 100 µl
• Micropipetas: P10 (1-10 µl); P100 (10-100 µl)
• Microtubo de 0,2 µl o 0,5 µl
• Guantes
• Guardapolvo

Reactivos:
• SO (solvente orgánico)
• BTS liofilizado

Preparación:

• Reconstituir el vial liofilizado con 50 µl de SO

• Disolver pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo unas 20 veces; evitando la
formación de burbujas
• Dejar estabilizar a temperatura ambiente durante 5 -10 minutos
• Volver a mezclar con pipeta, 20 veces
• Fraccionar alícuotas de 5 µl en microtubos y rotular con fecha de reconstitución
• Registrar la preparación en la planilla correspondiente (Ver FI-BE20)

Almacenamiento:
• Una vez reconstituido, almacenar a -18 °C

Nota: Se recomienda su uso dentro de los 5 meses de la fecha de preparación. No volver a

guardar una vez descongelado.

Se recomienda preparar y refrigerar el BTS al menos 48 horas previas a su uso, ya que esto
mejora el rendimiento.
Instructivo para el Lavado de placas

La placa de acero reutilizable debe ser lavada para remover residuos de proteínas y
matriz, una vez que se utilizaron todos los pocillos. No es necesario lavarla
diariamente si no se utilizan todas las posiciones.

Condiciones de seguridad: el ácido trifluoroacético debe ser manipulado bajo

estrictas normas de bioseguridad. Ver la ficha de seguridad vinculada a este
documento.

Materiales:
• Recipiente para realizar lavados
• Tips de 1000 µl
• Micropipetas: P1000 (100-1000 µl)
• Papel tissue de buena calidad
• Guantes de látex
• Cabina de seguridad biológica

Reactivos:
• Etanol 70% (EtOH)
• Acido trifluoroacético 80% (TFA)
• Agua ultrapura

Para preparar 100 ml de EtOH 70%: 30 ml de agua ultrapura + 70 ml de EtOH 100%

Para preparar 1 ml de TFA 80%: 200 µl de agua ultrapura + 800 µl de TFA 100%

Procedimiento:
• Transferir la placa a un recipiente y cubrir su superficie con EtOH 70%. No
inundar la totalidad de la placa
• Dejar a temperatura ambiente durante 5 minutos
• Remover la placa y enjuagar con abundante agua ultrapura con una pipeta
• Limpiar con papel tissue embebido en EtOH 70%
• Enjuagar la placa con agua ultrapura y volver a limpiar con papel tissue seco
• Cubrir la placa con una capa de 100 µl de TFA 80% y limpiar intensamente
todas las posiciones de la placa con papel tissue
• Enjuagar la placa con agua ultrapura y limpiar hasta secarla con papel tissue
seco
• Dejar secar completamente, al menos 15 minutos a temperatura ambiente