Tema 4

ESPECTROMETRÍA DE MASAS.
TÉCNICAS ACOPLADAS: GC-MS Y
HPLC-MS

Vicente Ferreira
Mª Teresa Gómez
Química Analítica II
Curso 2014-15 1
 ANÁLISIS ORGÁNICO VERSUS INORGÁNICO

ORGÁNICO INORGÁNICO

•• Mayoritariamente
Mayoritariamenteconstituído
constituído •• Decenas
Decenasde deelementos
elementos
por
porC,
C,HHyyO.
O.Eventualmente
Eventualmente diferentes
diferentes
N,
N,S,
S,PPyyhalógenos
halógenos •• Número
Númerode decombinaciones
combinaciones
•• Millones
Millonesde
decombinaciones
combinaciones limitadas
limitadas
posibles
posibles •• Diversidad
Diversidadde
delas
las
•• Propiedades
Propiedades propiedades
propiedades
espectroscópicas
espectroscópicasatómicas
atómicas espectroscópicas
espectroscópicasde delos
los
poco
pocoremarcables
remarcables átomos.
átomos.
•• Propiedades
Propiedadesredox
redoxen
en •• Muchas
Muchasespecies
especiescon
conbuenas
buenas
disolución
disoluciónproblemáticas
problemáticas propiedades
propiedadesredox
redox
•• Importancia
Importanciadedelalamolécula
molécula •• Importancia
Importanciadel
delelemento
elemento
•• Macromoléculas
Macromoléculas •• Pocas
Pocasespecies
especiescomplejas
complejas
2
 ESPECTROMETRÍA
DE MASAS (MS)

ANÁLISIS ANÁLISIS
ORGÁNICO INORGÁNICO

ESPECTROMETRÍA DE ESPECTROMETRÍA DE
MASAS ORGÁNICA MASAS INORGÁNICA

3
• Introducción general
• Espectrometría de Masas Orgánica
• CG-MS
• HPLC-MS

4
 VISIÓN GENERAL AL MS

¿QUÉ ES MS?

Un
Un conjunto
conjunto de de técnicas
técnicas de
de detección
detección
que
que utilizan
utilizan IONES
IONES EN EN FASE
FASE GAS
GAS

•• Carácter
Carácteruniversal
universal
•• Elevada
Elevadaselectividad
selectividad
•• Carácter
Caráctercualitativo
cualitativoyycuantitativo
cuantitativo
•• Elevada
Elevadasensibilidad
sensibilidad
•• Información
Informaciónsobre
sobreisótopos
isótopos
•• Rapidez.
Rapidez.Monitorización
Monitorizaciónde deprocesos
procesosen
entiempo
tiemporeal
real

5
 VISIÓN GENERAL AL MS

FUNDAMENTO

Separación de iones gaseosos en función de su relación

masa/carga y su posterior detección

El fundamento de la separación consiste en la modificación de

las trayectorias de los distintos iones al atravesar campos
eléctricos y magnéticos (alto vacío)

ORGÁNICA INORGÁNICA

Iones moleculares Iones atómicos gaseosos

gaseosos Análisis elemental (no C,
H, N, O)

Metodología e instrumentación distinta 6

 VISIÓN GENERAL AL MS

INSTRUMENTACIÓN BÁSICA

Fuentes de Separación de Detector

iones iones según
m/c

ORGÁNICA INORGÁNICA

Elucidación de estructuras ICP-MS

SIMS
LIMS
Detector en Cromatografía GDMS
…….

7
 ESPECTROMETRÍA DE MASAS

ESTRATEGIAS ACTUALES DE MS ORGÁNICA

• Desarrollo de potentes Cromatografía y

técnicas de separación, y de Electroforesis
técnicas instrumentales de
separación
Análisis
• Uso de reactivos enzimáticos enzimático y
y proteicos para conseguir la técnicas de
selectividad propia del mundo inmunoensayo
bioquímico.
• Desarrollo de técnicas Espectroscopía de
Infrarrojo
instrumentales capaces de
Espectrometría de
dar información más Masas
específica de la molécula.

8
 ESPECTROMETRÍA DE MASAS

¿Cuándo emplear MS como detector en GC o HPLC?

• Cuando sea necesario aportar pruebas de la identidad de la

molécula (análisis confirmatorio)

• Cuando el análisis con cualquier otro detector más sencillo sea

complicado

NOTAS: Los detectores MS son más caros, difíciles de operar y de

mantener que cualquier otro detector HPLC, por lo que sólo los
emplearemos cuando sea estrictamente necesario

9
 VISIÓN GENERAL AL MS

UNIDADES EN MS

Masa atómica Media ponderada de las masas de

los isótopos de un elemento

Masa molecular de Suma de las masas atómicas

una molécula o ion

Masa entera de la molécula con el

Masa nominal de una isótopo más abundante de cada
molécula o ion uno de los átomos que lo forman

SEÑAL ANALÍTICA

El
Elespectro
espectrode
demasas
masasrepresenta
representalalaseñal
señaldel
deldetector
detector versus
versusla
larelación
relaciónm/z.
m/z.
Son picos cuyo área es proporcional a la abundancia del isótopo
Son picos cuyo área es proporcional a la abundancia del isótopo

10
ESPECTROMETRÍA DE MASAS

Espectro MS de un alcano

11
 ESPECTROMETRÍA DE MASAS

+
R
energía
R +
+
CH2

molécula ión-radical
fragmentos iónicos
fase gas-zona de alto vacío

Sistema de Analizador de
detector
ionización masas

Abundancia (%)
ESPECTRO DE MASAS
Ión tropilio
• información específica de
Ión-radical la molécula
• información estructural
Ión benceno • universal
• muy sensible
77 91 M m/z 12
 ESPECTROMETRÍA DE MASAS

Intensidad (%)
100
MS estándar:
moléculas pequeñas (PM<2000)
m/z
en fase gas
200

Técnicas de ionización suave (CI)

Técnicas de alta resolución 200’023 200’346

Técnicas de MS/MS

Técnicas para la ionización

200
de moléculas grandes
Técnicas para la ionización
de moléculas en efluentes líquidos 13
 ESPECTROMETRÍA DE MASAS

DIAGRAMA DE BLOQUES

Sistema
introducción FUENTE DE IONES ANALIZADOR(ES) DETECTOR
(sonda,
cromatógrafo)
IONES DE
ANALITO/FRAG SEPARACION DETECCION
MOLÉCULAS MENTOS
DE ANALITO IONICOS

ZONA DE ALTO VACIO

SISTEMA DE PROCESADO

14
 ESPECTROMETRÍA DE MASAS

SISTEMAS PARA GENERAR IONES

Especies que ya Impacto electrónico

De baja energía
están en fase gas Ionización química

Especies sólidas FAB

De alta energía líquidas SIMS
macromoleculares LD
MALDI

Especies presentes Electrospray

De media energía
en efluentes líquidos APCI

15
 ESPECTROMETRÍA DE MASAS

FUENTES DE IONES

Técnica y acrónimo Autores Fundamento y aplicación

Técnicas para moléculas en fase gas o contenidas en efluentes gaseosos
Impacto Electrónico (EI) DempsterBleakney Análisis orgánico
1929;Nier 1947 cualitativo y cuantitativo de
moléculas discretas.
Gases previamente Munson y Field, 1966 Análisis orgánico
ionizados (ionización cualitativo y cuantitativo;
química) (CI) Determinación precisa de
la masa molecular,
aumento de la selectividad
y sensibilidad (sólo en
modo negativo).

16
 ESPECTROMETRÍA DE MASAS

FUENTES DE IONES

Técnica y acrónimo Autores Fundamento y aplicación

Técnicas para especies sólidas o líquidas
Ionización por Bombardeo Barber, 1981 Análisis de superficies (SIMS);
con átomos o iones Análisis de compuestos polares de
Rápidos (SIMS; FAB) alto peso molecular (FAB)
La muestra sólida (SIMS) o disuelta
(FAB) es bombardeada por un haz
de iones (SIMS) o átomos o
moléculas neutras (FAB).
Desorción Láser (LD) o Hillenkamp, Análisis de superficies y de
ionización de desorción 1985 heterogeneidades (LD). Análisis de
láser asistida por matriz picomoles de proteínas de hasta
(MALDI) 300.000 Da (MALDI).
Plasma de Acoplamiento Olesik Análisis inorgánico
Inductivo (ICP)

17
 ESPECTROMETRÍA DE MASAS

FUENTES DE IONES

Técnica y acrónimo Autores Fundamento y aplicación

Técnicas para especies contenidas en efluentes líquidos
Termospray (TSP) Vestal, 1980 Acoplamiento con HPLC de
sustancias iónicas
Electrospray (ESI o ES) Fenn, 1984 y 1988 Acoplamiento con HPLC,
permitiendo análisis de
macromoléculas previamente
ionizadas
Ionización química a Huan et al, 1990 Genera iones en fase gas
Presión Atmosférica
(APCI)

18
 ESPECTROMETRÍA DE MASAS

IONIZACIÓN POR IMPACTO ELECTRÓNICO (EI)

• Un filamento de Tungsteno o Renio calentado emite

electrones

• Esos electrones son acelerados por campos eléctricos hasta

una cierta energía (típicamente 70eV)

• A esa energía, los electrones son capaces de “colisionar” con

las moléculas que se encuentren en su trayectoria, ΔV
transfiriéndoles energía e-

• Dicha energía se emplea en extraer un electrón de la

molécula, generando un catión radical con un exceso de e-
energía vibratoria
M
• Dicha energía vibratoria se reparte por todos los enlaces, 2e-
pudiendo generar la rotura de aquéllos más débiles o que
conduzcan a especies más estables
M+.
R+
N.
19
 ESPECTROMETRÍA DE MASAS

IONIZACIÓN POR IMPACTO ELECTRÓNICO (EI)

• La rotura de la molécula ionizada sigue un patrón

estadísticamente estable (en condiciones de vacío) en
cuanto al número y proporción de fragmentos
producidos

• En esas condiciones sólo los iones positivos son ΔV

estables e-

• Los fragmentos iónicos supervivientes, ordenados por

e-
su m/z (z es casi siempre 1) y normalizados al máximo
constituyen el espectro de masas de la molécula
M
2e-
• Ese espectro de masas es el que se almacena en
librerías de identificación de especies
M+.
• Dichos espectros sólo son accesibles para moléculas R+
volatilizables (hasta 2000 UMA)
N.
20
 FUENTE DE IMPACTO ELECTRÓNICO (EI)

analizador
filamento
+ vacio
+
e- + +
efluente GC
+
+ repeledor
+
e-
+ ánodo

21
 ESPECTROMETRÍA DE MASAS

ANALIZADORES DE MASAS

RESOLUCIÓN DE MASAS

1. Cada pico del espectro de masas tiene una anchura finita. Esto limita la
mínima diferencia de masas de dos picos próximos
2. Si están próximos, se pueden solapar y dar un único pico
3. RESOLUCIÓN: diferencias más pequeña entre dos picos Δm
Δm = diferencia de masas necesaria para que la altura del valle entre
dos picos adyacentes de la misma altura sea un 10 % de la misma
4. UN UNICO PICO: Δm es la anchura del pico a un 5% de la altura

Habitualmente
se expresa en
unidades mg / L

22
 ESPECTROMETRÍA DE MASAS

ANALIZADORES DE MASAS

PODER DE RESOLUCIÓN

Poder de resolución = m / Δm

- m = menor valor de m/c

- Δm= resolución
Debe indicarse en qué masa se hizo la medida

23
ESPECTROMETRÍA DE MASAS

ANALIZADORES DE MASAS

24
 ESPECTROMETRÍA DE MASAS

ANALIZADORES DE MASAS

• Su misión es separar los iones generados en la fuente en función

de su relación m/z

• Se pueden encontrar tres tipos básicos:

1) Los que para obtener un espectro requieren realizar una
programación de campos Eléctricos o Magnéticos en el tiempo
(escán)
• Quadrupolos
• Ion Traps
• Sectores Magnéticos
2) Los que para obtener un espectro sólo requieren un tiempo (no
hay cambio) Analizadores de Tiempo de Vuelo (TOF)

3) Los que son capaces de obtener todos los iones del espectro
simultáneamente (Ciclotrones)

25
ANALIZADORES DE MASAS

QUADRUPOLOS

1. Cuatro polos interconectados 2 a 2

2. Sometidos a una diferencia de potencial
fija (U) y otra alterna (V)
3. Según la combinación de campos U/V,
iones de cierto m/z podrán atravesar o no
el pasillo central

- -

26
 ANALIZADORES DE MASAS

CUADRUPOLOS

cos wt = 0 cos wt = -1 cos wt = 0

cos wt = 1

+ - + -
y
+ + - - + + +
- - + +
ro +
+ - + -

x
Φ = U - V cos wt
U=1000 V U=1000 V U=1000 V U=1000 V
V= +2000V V= +2000V V= +2000V V= +2000V
Φ= -1000V Φ= 1000 V Φ= -1000 V Φ= 1000 V

27
ANALIZADORES DE MASAS

CUADRUPOLOS

28
 ANALIZADORES DE MASAS
CUADRUPOLO
SCAN EN UN CUADRUPOLO

Iones procedentes
de la fuente en una Condiciones UV a tiempo 0
unidad de tiempo Multiplicador/
(ms) detector
+
+
+
i
Sólo los iones más pequeños consiguen cruzar el quadrupolo y alcanzar el detector

Condiciones UV a tiempo 1
Iones procedentes
de la fuente en la
+
segunda unidad de
tiempo (ms) +
+

Sólo los iones medianos consiguen cruzar el quadrupolo y alcanzar el detector

29
 ANALIZADORES DE MASAS
CUADRUPOLOS
SINGLE ION MONITORING (SIM)

SIM EN UN QUADRUPOLO
Iones procedentes de
la fuente en una Condiciones UV prefijadas
unidad de tiempo (ms) Multiplicador/
+ detector

++
i
Sólo los iones de un cierto tamaño consiguen cruzar
el quadrupolo y alcanzar el detector. Todos los
demás se descargan

En modo SIM TODOS los iones de un cierto m/z cruzan el quadrupolo sin
descargarse. Es el modo de máxima sensibilidad empleado para el
análisis cuantitativo. Típicamente recogemos dos o tres iones por molécula
de interés (para tener criterios de identidad adicionales)
30
 ANALIZADORES DE MASAS
CUADRUPOLOS

MS-MS EN UN TRIPLE CUADRUPOLO EN UN QUADRUPOLO

+ + + + + +
+
+
Iones El primer En el segundo El tercer analizador
generados en analizador analizador se realiza la Se obtiene un
la fuente deja pasar fragmenta el ión separación de los espectro de
sólo el de por colisión fragmentos masas del ión
interés (ion producidos padre
padre)

Este modo se conoce como “Selected Reaction Monitoring” y es el más

empleado en líquidos-masas. Con fines cuantitativos y para ganar
sensibilidad, el tercer analizador se hace trabajar en modo SIM recogiendo
sólo 1 o 2 iones.
31
 ANALIZADORES DE MASAS
CUADRUPOLOS

EVALUACIÓN DE CUADRUPOLOS

DATOS
DATOSRELEVANTES:
RELEVANTES:
•• Resolución:
Resolución: Baja.
Baja.11unidad
unidaddedemasa
masa
•• Rango
Rangode demasas:
masas: De
De50-2000
50-2000(con
(convariantes)
variantes)
•• Velocidad
Velocidaddedescan:
scan: 4000
4000-10000
-10000u/sec
u/sec
•• Requisitos
Requisitosdedepresión:
presión: 10
10-4-10
-4
-10-6tor
-6
tor
•• Modos
Modosde deoperación
operaciónposibles:
posibles: Scan;
Scan;SIM;
SIM;SRM
SRM
•• Espectros
Espectrosenenmodo
modoScan
Scanmuy
muyreproducibles
reproduciblesyybien
bienconocidos
conocidos

VERSIONES
VERSIONESYYAPLICACIONES:
APLICACIONES:
•• Simple.
Simple.Scan
Scanyy SIM.
SIM.Aplicaciones
Aplicacionesestándar
estándardedealta
altaproductividad.
productividad.
•• Triple:
Triple:Scan
ScanyySRM.
SRM. Métodos
Métodosde derutina
rutinaen
enensayos
ensayosclínicos
clínicospara
para
búsqueda de determinados analitos.
búsqueda de determinados analitos.
•• Con
Concapacidad
capacidadpara
paraMS
MSdedeiones
ionesnegativos
negativos

32
 ANALIZADORES DE MASAS

ION TRAP

Orificio de entrada de
electrones (del filamento)

Órbitas de los iones

atrapados en la
trampa

Electrodo de Electrodo de
anillo anillo

Salida de
electrones y de
Multiplicador iones

33
 ANALIZADORES DE MASAS

ION TRAP: operación estándar

e-

1 las moléculas 2 los electrones a 3 Se muestrea el

entran en el Ion Trap 70eV crean iones potencial de manera
que se quedan que los iones van
formando órbitas abandonando
estables secuencialmente el
trap cayendo al
detector
34
 ANALIZADORES DE MASAS

ION TRAP: MS - MS

1 las moléculas
entran en el Ion Trap

2 los electrones a
70eV crean iones,
pero sólo los de una
m/z seleccionada
son estabilizados
4 Se muestrea el
3 Mediante una onda de potencial de manera
radiofrecuencia, se que los iones hijos
transmite energía al ion van abandonando
para que se rompa en secuencialmente el
fragmentos, que se trap cayendo al
quedan dentro del trap detector

35
36
 ANALIZADORES DE MASAS
ION-TRAP

EVALUACIÓN ION - TRAPS

DATOS
DATOSRELEVANTES:
RELEVANTES:
•• Resolución:
Resolución:Baja.
Baja.11unidad
unidadde
demasa
masa
•• Rango
Rangode demasas:
masas:DeDe10-2000
10-2000(con
(convariantes)
variantes)
•• Velocidad
Velocidaddedescan:
scan:4000
4000u/sec
u/sec
•• Requisitos
Requisitosdedepresión:
presión:Bajos.
Bajos.10
10-3tor
-3
tor
•• Modos
Modosde deoperación
operaciónposibles:
posibles:MS;
MS;MS/MS
MS/MS
•• Espectros
Espectrostienden
tiendenaadeformarse
deformarsecon conmasas
masasgrandes
grandesde
deanalito
analito

VERSIONES
VERSIONESYYAPLICACIONES:
APLICACIONES:
•• Simple.
Simple.Operando
Operandoen enmodo
modocontínuo
contínuoScan
Scantiene
tieneuna
unasensibilidad
sensibilidadmejor
mejor
que un quadrupolo en SCAN
que un quadrupolo en SCAN
•• MS/MS
MS/MSconconoosin
sinexcitación
excitaciónresonante.
resonante.Indispensable
Indispensableen enaplicaciones
aplicaciones
que
querequieren
requierenconfirmación
confirmaciónestructural
estructuralyyalta
altaselectividad.
selectividad.Mucho
Muchomásmás
barato
baratoque
quetriple
triplequad.
quad.Estudios
Estudiosmetabólicos.
metabólicos.Química
Químicacombinatoria.
combinatoria.

37
 ANALIZADORES DE
ANALIZADORES DE MASAS
MASAS

ANALIZADORES DE TIEMPO DE VUELO (TOF)

• Fundamento: Aplicar una fuerza que acelere los iones en función de su

masa hacia el detector. Los iones más pequeños serán más acelerados y
lo alcanzarán antes
- 1) sometidos a un pulso de aceleración
- 2) introducidos en un “tubo de vuelo” de geometría calibrada
• El proceso es muy rápido ya que no conlleva barridos de potencial (1-5
ms)
• Los iones son muestreados periódicamente durante un tiempo definido
• Son separados en relación al tiempo que tardan en recorrer el tubo de
vuelo y que depende de m/c
• Se pueden detectar iones muy grandes, basta con esperar más tiempo

TUBO DE VUELO: 1 m tiempo de llegada al detector: 50 μs

RAPIDEZ
38
 ANALIZADORES DE
ANALIZADORES DE MASAS
MASAS

ANALIZADORES DE TIEMPO DE VUELO (TOF)

Iones y neutros procedentes de la fuente

Plato para
focalizar los + Plato detector
+ +
iones al
analizador
Campos para la
aceleración de los iones

DISEÑO LINEAL

39
 ANALIZADORES DE MASAS

ANALIZADORES DE TIEMPO DE VUELO (TOF)

REFLECTRON PARA MEDIDA DE MASAS EXACTAS

• La resolución del analizador depende

de la dispersión de los tiempos de vuelo
de los iones (de la misma m/c).
• Inicialmente están a distintas distancias
del detector, distintas velocidades y se
muestrean en distintos momentos.

Dispersión espacial, de energía, temporal

REFLECTRON: espejo iónico que refleja el paquete de iones hacia el detector.

Amortigua la dispersión de energías de iones del mismo m/c
• Los iones más rápidos penetran más en espejo y necesitan más tiempo para
salir del mismo
• Los más lentos coinciden con éstos al salir del reflectron y llegan todos juntos
al detector 40
 ANALIZADORES DE MASAS
(TOF)

MS EN ALTA RESOLUCIÓN

Fig. 1. Identification of dehydrobufotenine by HPLC-electrospray (ESI)-MS-

TOF in methanolic extracts fromMelanophryniscus species, corresponding
to the theoretical accurate mass of 203.118438, and its two isotopes
41
 ANALIZADORES DE MASAS
(TOF)

EVALUACIÓN TOFs

DATOS
DATOS RELEVANTES:
RELEVANTES:
•• Resolución:
Resolución: Puede
Puede serser tanto
tanto baja
baja como
como alta
alta según
según configuración
configuración
•• Rango
Rango de
de masas:
masas: ilimitado
ilimitado
•• Velocidad
Velocidad de
de scan:
scan: muy
muy rápida
rápida >> 10
106 u/sec.
6
u/sec. Fácil
Fácil alcanzar
alcanzar 100-500
100-500
scanes por segundo.
scanes por segundo.
•• Requisitos
Requisitos de
de vacío.
vacío. Altos:
Altos: 10
10-7 oo mayor
-7
mayor

VERSIONES
VERSIONESYYAPLICACIONES:
APLICACIONES:
•• Configuración
Configuraciónestándar
estándar(lineal).
(lineal).Debido
Debidoaasu
suvelocidad
velocidaddedescaneo
scaneoyy
rango
rangodedemasas
masases esimbatible
imbatibleen ensituaciones
situacionesenenlas
lasque
queseserequieren
requieren
espectros completos y/o el análisis de sustancias de alto
espectros completos y/o el análisis de sustancias de alto peso peso
molecular.
molecular.
•• Con
Conununreflectron
reflectron(un
(unespejo
espejoelectrostático)
electrostático)puede
puedetrabajar
trabajarenenalta
alta
resolución
resoluciónyydar
daralta
altaexactitud.
exactitud.Es Esmucho
muchomás
máscaro.
caro.
•• Como
Comodetector
detectorHPLC
HPLCse seprefiere
prefiereen
entandem
tandemconconunundoble
doblequad
quadpara
para
posibilitar
posibilitarMS/MS.
MS/MS.

42
 ESPECTROMETRÍA DE MASAS

DETECTORES

• Son multiplicadores de electrones.

• Multiplicadores de electrones continuos
• Multiplicadores de electrones discretos. (serie de dínodos).
Trabajan a alta y a baja sensibilidad

MULTIPLICADOR DE ELECTRONES CONTINUO

+
-
• Es un tubo de vidrio en forma de
corneta. Superficie recubierta de óxido de
Dínodo continuo
plomo
• Los iones son recogidos en la boca del
detector (potencial negativo elevado).
Gradiente de potenciales sucesivos
• El impacto del ion y los impactos
sucesivos generan electrones que se van
Corriente amplificada multiplicando. Amplificación de la señal
43
CG - MS

44
 CG-MS

inyector

Helio procesador

OPERACION ESTANDAR
• He como gas portador columna
fuente detector
• Columna capilar de al menos 20 m y bajo
sangrado
analizador
• Caudales de 1 ml/min horno
• Acoplamiento directo
• Impacto electrónico
Control horno Línea de transferencia Bombas
• Quadrupolo (95% casos), Ion Trap (si se
requiere MS/MS) o QTOF o triple quad de vacío
• Trabajo cuantitativo en modo SIM (sensibilidad
en torno al 1pg)

45
 CG-MS

CALIDAD Y FACILIDAD DEL ANÁLISIS GC-MS

Facilidad/calidad del aislamiento

Preferibles extractos limpios (libres Fáciles: poco polares y volátiles

de material no volátil) y simples Difíciles: polares y poco volátiles
Cuanto más se parezca a la matriz, más
difícil será la extracción

Facilidad/calidad de la separación GC
Preferible separación del
disolvente, retención adecuada (ni Fáciles: poco polares y medio-volátiles
mucha ni poca), pico simétrico y lo Difíciles: polares y muy o muy poco volátiles
más separado posible

Calidad de la selectividad MS
Preferible poca fragmentación Fáciles: grandes y con grupos conjugados
(mucha señal) con iones grandes y (posible MS/MS)
selectivos Difíciles: pequeños y sin grupos conjugados
46
 CG-MS

CALIDAD Y FACILIDAD DEL ANÁLISIS GC-MS

• Facilidad/calidad del aislamiento

• Facilidad/calidad de la separación GC
• Calidad de la selectividad MS

Formación de
Técnicas derivados:
GC-GC
1. Menos polares
Ionización 2. Más volátiles
química 3. Más estables
4. Más detectables

Técnicas MS/MS y HRMS

47
 O
acetaldehyde
H3C F F

+ N

H F
F F

HO NH

F F F
2,3,4,5,6-pentafluorobenzyl metilimina

F F
MEJORA:
2,3,4,5,6-pentafluorobenzyl hydroxylamine Extractabilidad
F DERIVATIZACION Propiedades cromatográficas
F
H
N
Volatilidad
Si (H3C)Si Propiedades
F
O
espectrométricas
O
trimethylsilyl trifluoroacetamide
O O Si(CH3)

+
OH
O O Si(CH3)
O OH
(H3C)Si
O

Si(CH3)

HO OH
48
OH
D-glucopyranose
 CG-MS

DERIVADOS TÍPICOS EN GC Y GC-MS

• – OSi(CH3)3 (TMS)
-OH
• - OCOCH3 (Acetilo)

• – COOCH3 (metil ester)

-COOH
• - COOSi(CH3)3 (TMS)

• R1R2CNOCH3 (metoxima)
R1R2CO
• R1R2CNNHPh (fenilhidrazona)

49
 CG-MS

IONIZACIÓN QUÍMICA POSITIVA

• Es una forma más suave de generar iones

• Se introduce en una fuente similar a la de impacto un gas (metano,
isobutano o amoniaco) a presión
• El proceso de impacto electrónico se realiza mayoritariamente sobre el
gas
• Al haber muchas moléculas, la fragmentación no es la típica de impacto,
sino que se forma un plasma enriquecido en una serie de iones
característicos del gas
• Son estos iones los que transfieren la carga al analito, generalmente por
procesos de transferencia de protón
• Los iones que se forman mayoritariamente son MH+ (iones
pseudomoleculares) así como aductos

50
 CG-MS

COMPARATIVA PCI - EI

Gas reactivo: isobutano

51
 CG-MS

IONIZACIÓN QUÍMICA CON METANO

IONES FORMADOS CH4+· + e- CH4+·, CH3+·, CH2+·, CH+·,...+ 2 e-

EN LA IONIZACION
DEL METANO CH4+· + CH4 CH5+ + CH4·
m/z 17
CH3+· + CH4 C2H5+ + H2
m/z 29
CH2+· + CH4 C2H3+ + H2 + H·
m/z 27
C2H3+ + CH4 C3H5+ + H2

m/z 41

M+CH5+ÆMH+ + CH4
M+C2H5+ÆMC2H5+
Espectro de Iones en la M+C3H5+ÆMC3H5+
Impacto Ionización
Electrónico Química Serie M+1; M+29; M+41 implican M
Algo de tendencia a fragmentación
52
 CG-MS

IONIZACIÓN QUÍMICA CON METANO

Espectro PCI del p-clorotolueno (izquierda) y

cloruro de bencilo (abajo) (M=126) con metano

MC2H5+

MH+
53
 CG-MS

COMPARATIVA ENTRE METANO, ISOBUTANO Y AMONIACO COMO GASES

54
 CG-MS

COMPARATIVA ENTRE METANO, ISOBUTANO Y AMONIACO COMO GASES

55
 CG-MS

IONIZACIÓN QUÍMICA DE IONES NEGATIVOS (NICI)

GENERALIDADES:
• Se generan, analizan y detectan iones negativos mediante el uso de
electrones térmicos
• Modo captura electrónica es la técnica más sensible conocida
• Se obtiene información del peso molecular
• Se obtiene poca información estructural
• Muy útil para análisis cuantitativo, de especies con alta afinidad electrónica

FORMACION DE e- TERMICOS
R es el gas reactivo
e-(200 eV) +{R1} Cp+ + C-p + 2 e- (térmicos) (metano, isobutano,
amoniaco)

CAPTURA DE ELECTRONES:

e-(térmicos) + {M} {M}-· Absorción de electrón

e-(térmicos) + {M} {M-X}- + {X} Disociación con absorción de electrón
e-(térmicos) + {M} {M-X}+ + {X}- + e- Formación de un par iónico
56
 CG-MS

IONIZACIÓN QUÍMICA DE IONES NEGATIVOS (NICI)

EJEMPLO

Señal obtenida para menos de 5 ppt (5ng/L) del derivado del

azufrado 2-furfuriltiol en vino.
57
HPLC - MS

58
 HPLC-MS

¿Qué dificultades tiene el acoplamiento HPLC-MS?

• Muchas especies analizadas por HPLC son no volátiles

• A menudo se emplean buffers salinos no volátiles

59
 HPLC-MS

PASO DE LÍQUIDO A ALTO VACÍO

60

Sistema cromatográfico Necesidad de evacuación

Columna gas capilar a 1 ml/min 166 l/s
Columna gas semicapilar a 10
1.660 l/s
ml/min
Columna gas empaquetada a 40
>6.000 l/s
ml/min
Líquido acuoso a 1 ml/min 206.577 l/s
Líquido acuoso a 0.1 ml/min 20.657 l/s

Capacidad típica de una bomba en un MS de sobremesa: 50-300 l/s

60
 HPLC-MS

HPLC-MS: SOLUCIONES

1ª generación
• Dividir el flujo a la salida de la columna de HPLC, introduciendo sólo una
fracción en el MS
• Aumentar la potencia de bombeo del espectrómetro incluyendo una
criobomba (hasta 50 microlitros/L de flujo de fase móvil)
• Empleando micro-HPLC y HPLC-capilar

2ª generación
• Eliminando el disolvente antes de la entrada al MS: Cinta transportadora y
Haz de partículas

3ª generación
• Introduciendo mayor capacidad de bombeo en la fuente de iones:
Termospray
• Realizando la ionización a presión atmosférica: APCI, Electrospray e
Ionspray
61
 HPLC-MS

TERMOSPRAY

• Efluente HPLC se hace circular por un capilar metálico calentado

para que se evapore en forma de spray
• Como fase móvil se emplean sales de amonio/acetato. Las micelas
tendrán una carga neta (distribución estadística)
• Al evaporarse el disolvente neutro, las micelas concentran cada vez
más carga
• Se puede producir la transferencia de carga a los analitos
• Un electrodo empuja por repulsión a los iones de interés al
analizador
• El número de iones generados es bajo y la ionización poco estable

62
 HPLC-MS

ELECTROSPRAY

• El efluente (ml/min) se hace circular por un capilar metálico sometido a

un gran campo eléctrico (6kV)
• El otro terminal del circuito está en la entrada del espectrómetro
• El campo eléctrico “succiona” electrones desde el efluente hasta la
entrada del espectrómetro
• Para cerrarse el circuito, los iones positivos del efluente son
proyectados en forma de jet, provocando la rápida nebulización en
micelas cargadas, que por fuerza de repulsión se reducen rápidamente
en tamaño
• La desolvatación permite trasladar al espectrómetro iones de alta
masa e incluso numerosas cargas
• Los iones pueden estar ya presentes en el efluente o formarse como
aductos

63
 HPLC-MS

ESQUEMA DEL ELECTROSPRAY

No hay procesos de
fragmentación:
los iones son los que había en la
fase móvil, y algunos aductos
Iones en fase gas

64
Las fuerzas de repulsión electrostática superan la tensión superficial
 HPLC-MS
ELECTROSPRAY
“PLUMA” DEL ELECTROSPRAY

Cono de Taylor
Pluma

65
 HPLC-MS

ELECTROSPRAY
DISEÑO ORTOGONAL

Con el diseño ortogonal se

consigue mejorar la
sensibilidad en más de un
orden de magnitud

66
 HPLC-MS

ELECTROSPRAY

MASA DE PROTEINAS

En función del pH la proteína se encontrará más o menos protonada, existiendo

una distribución estadística de cargas

Encontraremos un “cluster” de iones de m/z =(M+n)/n, donde n es el nº de

protones de ese ión particular

67
 HPLC-electrosprayMS
ANÁLISIS DE C8-
AHL (octil lactona
de la homoserina)
Comunicaciones
intercelulares de las
bacterias

M = 228

68
 HPLC-MS

SONDA APCI (Ionización Química a Presión atmosférica)

• El efluente, se nebuliza con ayuda de una alta corriente de N2 y se conduce

a una cámara de evaporación

• Una vez vaporizado, se encuentra con un filamento emisor de electrones

(descargas corona), que ionizan a las especies mayoritarias (N2 y H2O)

• Los iones de estas especies, provocan la ionización de algunas moléculas,

particularmente las bases de Lewis, por procesos de transferencia
protónica (ionización química)
N 2+ o + 2 H 2O → N 2 + H 3O + + OH o
H 3O + + RNH 2 (analito ) → H 2O + RNH 3+
• La técnica es sensible y selectiva, para especies básicas

69
 HPLC-MS

SONDA APCI)

70
 HPLC-MS
SONDA APCI
IONIZACIÓN EN APCI

71
 HPLC-MS
SONDA APCI)

APLICACIÓN APCI EN ANÁLISIS DE BENZODIACEPINAS

Aplicación APCI análisis

benzodiacepinas

72
 HPLC-MS
SONDA APCI)
APCI-MS DIRECTO EN AIRE

a) Diagram of APCI/Mini
10.5.
b) Typical mass spectrum
of mixture of benzene
(15 ppb), toluene (35
ppb), and ethylbenzene
(60 ppb).
c) Typical mass spectrum
of DMMP (65 ppb) and
DEET (260 ppb)
obtained using the
APCI/Mini 10.5.
d) Typical mass spectrum
using APCI/Mini 10.5
for benzene (125 ppb),
toluene (150 ppb), and
ethylbenzene (210 ppb)
in the presence of 0.1%
acetone and 500 ppb
nicotine in air.

73
dimethylmethylphosphonate (DMMP) and N,N-diethylmetatoluamide (DEET)
 HPLC-MS

¿ELECTROSPRAY O APCI?

74 • No existe un sistema que sirva para todo tipo de compuestos y se requiere

conocimiento químico de los analitos (aceptor de H+ en modo positivo –alcali-
, donor de H+ en modo negativo –ácido-).

• Electrospray:
– es más general y por tanto menos selectivo. Todas las sustancias iónicas
en el efluente generarán iones en el electrospray
– Sufre serios problemas de efecto matriz
– es preferible para compuestos polares o ionizados (p.ej. proteínas)
– tiene serias restricciones de líquido (máx. 0,1 ml/min, ideal 0,02 ml/min)

• APCI:
– preferible para compuestos neutros y no polares (p.ej. lípidos), sobre todo
para componentes de carácter básico (modo +) o ácido (modo -)
– sólo sirve para sustancias de tamaño mediano (Mmol1500) y
termoestables
– forma iones pseudomoleculares y aductos con disolvente
74
 HPLC-MS

¿ELECTROSPRAY O APCI?

75

Iónico

ELECTROSPRAY

Polaridad 
del analito SONDA APCI

GC‐MS
No polar
101 102 103 104 105
Peso molecular

75