Practica 6 Levaduras Recombinantes.1

PRACTICA 6
APLICACION DE INGENIERIA GENETICA. MODIFICACIÓN GENÉTICA

DE LEVADURAS VÍNICAS
I.- OBJETIVOS.
Obtener levaduras vínicas que produzcan durante la fermentación características
particulares en el vino.
II.- FUNDAMENTO.
Mejora genética de levaduras vínicas
Las características genéticas de una levadura vínica pueden ser modificadas según las
necesidades de la industria vitivinícola. Se han desarrollado diversas levaduras utilizando
técnicas clásicas como la inducción y selección de mutantes, y la hibridación y fusión de
protoplastos. Sin embargo, la aplicación de las técnicas de ADN recombinante se presenta
como un enfoque más sencillo y preciso.
Los pasos básicos para clonar un gen y transformar una levadura vínica (figura 1) son:
a) identificación del gen que le va a conferir una característica nueva a la
levadura y aislamiento del fragmento de DNA foráneo
b) identificación mediante el uso de enzimas de restricción del vector
(plásmido) que va a servir para introducir el nuevo gen en la levadura
c) transformación de la levadura, por introducción del vector con el gen
quimera
d) selección de las levaduras transformadas, aquellas que han incorporado el
plásmido con el nuevo gen; estos sistemas están basados mayoritariamente
en resistencias a antibióticos.
Siguiendo esta metodología es posible construir cepas que expresen actividades
metabólicas de interés o que ejerzan efectos beneficiosos en las características
organolépticas de los vinos.
Figura 1 Esquema de mejora genética de levaduras vínicas mediante el uso de técnicas de DNA
recombinante
Casos:
Levaduras killer.
Se han diseñado levaduras vínicas que, al contener los genes que codifican los
factores killer K1 y K2, presentan una ventaja ecológica evidente, ya que las levaduras
vínicas naturales sólo expresan el factor K1 y, por tanto, son resistentes únicamente a este
factor killer.
Aparte de la fermentación alcohólica, la fermentación maloláctica es un proceso
tecnológico de gran importancia en enología. Mediante su uso se logra desacidificar los
vinos tintos y algunos vinos blancos en regiones frías. Esta fermentación la llevan a cabo
bacterias ácido lácticas, sobre todo Oenococcus oenii, y rebaja la acidez de los vinos al
descarboxilar el ácido L-málico a ácido L-láctico. La reacción está catalizada por el
llamado enzima málico que ha sido purificado de varias bacterias ácido lácticas. Los
genes correspondientes han sido clonados a partir de Lactobacillus
delbrueckii, Lactococcus lactis y Oenococcus oenii. Para ello se ha construido una
levadura recombinante que porta un gen de la levadura Schizosaccharomyces pombe, que
codifica una malato permeasa y el gen de L. lactis que codifica el enzima málico. Esta
levadura es capaz de fermentar 4,5 g/L de malato en mostos artificiales en tan sólo cuatro
días. (Pretorius I.S., 2000)
Levaduras que mejoran la estabilidad proteica de vinos y cavas
Uno de los problemas que suele afectar a los vinos blancos y rosados, en la fermentación,
es la quiebra proteica, que es el enturbiamiento ocasional, que se produce por floculación
(reposo) de las proteínas naturales de la uva, debido a temperaturas altas o el tiempo de
almacenamiento, lo que puede ser vista por los consumidores como una alteración.
Actualmente, el único sistema realmente eficaz para evitar la quiebra proteica es la
eliminación de las proteínas inestables, por tratamiento con bentonita o por ultrafiltración.
La clarificación con bentonita afecta la calidad sensorial del vino, pues elimina gran parte
de las proteínas, pero el vino pierde estructura y untuosidad, y se afecta el aroma del vino,
ya que absorbe directamente aromas, o indirectamente las proteínas son fijadores de
aromas y al ser eliminadas arrastran con ellas parte de estos aromas. Además, las proteínas
son moléculas tensoactivas y son factores positivos para la espumabilidad y la
persistencia de la espuma de los vinos espumosos. La alternativa de la ultrafiltración
también afecta el aroma y la untuosidad del vino, y su implantación requiere inversión
cuantiosa.
Las manoproteínas del vino pueden proceder; de la uva, de las levaduras por autolisis y
de los productos de clarificación con naturaleza proteica.
Por tanto, la cepa de levadura, que determina la cantidad de proteínas liberadas durante
la producción enológica, es un factor determinante de la quiebra proteica. Además, las
levaduras liberan constituyentes celulares, como proteínas o polisacáridos, que también
contribuyen a la calidad del vino (Feuillat, M. 2003). Otras propiedades enológicas de las
manoproteínas son la protección frente a la inestabilidad tartárica, la retención de
compuestos del aroma, la reducción de la astringencia, aumento de la sensación dulce, y
aumento del cuerpo y redondez en boca, especialmente apreciados en vino tinto. Además,
las manoproteínas estimulan el crecimiento de bacterias lácticas, y consecuentemente la
fermentación maloláctica, y mejoran la calidad de la espuma de vinos espumosos.
Algunas proteínas de la pared celular de la levadura han demostrado capacidad de

estabilizar el vino frente a quiebra proteica. Se han clonado y sobreexpresaron en cepas
de laboratorio de S. cerevisiae los genes YOL155c and YDR055w, que codifican
respectivamente las proteínas Hpf1p y Hpf2p, y demostraron que esa proteína Hpf2
reduce la turbidez hasta un 40% cuando se añade al vino. Sin embargo, no existe ninguna
cepa vínica recombinante que secrete más manoproteínas durante la fermentación
alcohólica.
En resultados con cepas de laboratorio, se ha demostrado que la deleción de los genes

FKS1, GPI7, GAS1 ó KNR4, da lugar a un incremento en la liberación de manoproteínas
en medios de cultivo (Gonzáles y Gonzáles, 2006). El sobrenadante de las cepas que
carecen de todas las copias de los genes correspondientes es más rico en manoproteínas
que el de las cepas control, ya desde el inicio de la fase estacionarla. Cuando se añaden
exógenamente a un vino, los polisacáridos aislados de estos sobrenadantes permiten
mejorar la estabilidad proteica de los vinos acabados, de acuerdo con el contenido relativo
en manoproteínas de cada uno.
III.- PROCEDIMIENTO.
Observe los siguientes videos:
a. Importancia de levaduras en vino
https://www.youtube.com/watch?v=ZQFhhg6SYxQ
b. Tipos de levaduras.
https://www.youtube.com/watch?v=zCaK-aIK10g
c. Saccharomyces serevisiae
https://www.youtube.com/watch?v=OMezmqGcL9M
d. Levaduras Killer para elaborar vinos tranquilos y espumosos

https://www.youtube.com/watch?v=jzYTN02MgBM
e. Levadura para el vino de Rioja alavesa

https://www.youtube.com/watch?v=9TLgpa12fQg
IV.- CUESTIONARIO
1. Que función cumplen las levaduras en la producción de vinos.
2. Que son las levaduras killer
3. Porque se hacen muchos trabajos de ingeniería genética en S. cerevisiae
4. Que son los vinos de cava
5. Que son levaduras autóctonas o indígenas, y porque es importante su uso en
vinificación
6. Explique sobre los principales grupos de mutágenos químicos.
7. Explique sobre Radiación mutagénica y cuáles son los principales tipos.
8. Explique sobre selección de los mutantes y sus diversos métodos de selección.
9. Explique las diferencias entre mutagénesis al azar y mutagénesis dirigida.
10. Investigue sobre mutantes resistentes a la toxina killer K9.
V.- BIBLIOGRAFLA
• Feuillat, M. (2003). Yeast macromolecules: Origin, Composition and Enological
interest. Am J. Enol. Vitic. 54: 21 1 -213).
• González-Ramos, D. and González, R. 2006. Genetic determinants of the reléase
of mannoproteins of enological interest by Saccharomyces cerevislae. J. Agrie.
Food Chem. 54:941-1-9416.
• Pretorius I.S.: «Tailoring wine yeast for the new millennium: novel approaches to
the ancient art of winemaking», Yeast 2000; 16: 675-729.
• Varela et al., (2016) Volatile flavour profile of reduced alcohol wines fermented
with the non-conventional yeast species Metschnikowia pulcherrima and
Saccharomyces uvarum

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