UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DEL BENI

“JOSÉ BALLIVIAN”
VICERRECTORADODE POSGRADO

PRACTICA
Trasplantes: Técnicas y resultados clínicos
MsC. Lizzetty Venegas Aponte
 TECNICAS DE TIPAJE DE TEJIDOS

INTRODUCCIÓN
Los avances en el conocimiento de los mecanismos que intervienen en el halo-
reconocimiento y en los elementos efectores de la respuesta inmunitaria, así como de
los mecanismos de inmunorregulación, han consolidado el trasplante renal y de tejido
(Medula ósea). En este contexto, el sistema principal de histocompatibilidad (MHC) y la
respuesta humoral han adquirido un peso muy importante en el pronóstico y
seguimiento del trasplante.
INMUNOBIOLOGÍA DEL TRASPLANTE Sistema principal de histocompatibilidad
Los antígenos del complejo mayor de histocompatibilidad (CMH), además de
presentar antígenos a los linfocitos T, son los encargados de identificar las células del
organismo y diferenciarlas de las extrañas, funcionando como una especie de
documento de identidad de cada célula. El elevado polimorfismo genético del complejo
mayor de histocompatibilidad CMH permite un gran número de combinaciones de
estas moléculas, y la probabilidad de que dos individuos tengan los mismos
determinantes antigénicos es extremadamente baja.
Los más relevantes codifican dos tipos de antígenos con distinta función biológica: los
de clase I (locus A, B y C) y los de clase II (locus DR, DP y DQ). Los antígenos de clase
I aparecen en casi todas las células nucleadas del organismo, en tanto que los de clase
II se limitan a las células encargadas de la presentación de antígenos como los
linfocitos B, macrófagos y células dendríticas, principalmente.
Las moléculas de clase I se especializan en presentar los péptidos procesados a los
linfocitos T CD8, mientras que las de clase II los presentan a los CD4.
La traducción de cada gen del sistema HLA da lugar a una proteína homogénea en la
que se intercalan algunas regiones muy variables y polimórficas que reciben el nombre
de epítopos y que se comportan como aloantígenos.
Cada epítopo o combinación de epítopos es específico de cada alelo, pero algunos
alelos de los distintos locus pueden compartir epítopos. Estos motivos compartidos
explican las relaciones que tienen entre sí determinadas especificidades y deben
tenerse en cuenta en la interpretación de los estudios de anticuerpos y en la selección
de donantes.
Reconocimiento antigénico y activación de la respuesta inmunitaria
Los casos de gemelos HLA idénticos, en los que las células del injerto son reconocidas
como propias, la puesta en contacto del paciente con el injerto activará el sistema
inmunitario, que reconocerá a las células extrañas y las destruirá.
La sensibilización previa específica del receptor contra las células del donante puede
dar lugar a una destrucción inmediata del injerto hablamos de un rechazo hiperagudo a
través de mecanismos humorales en los que interviene la activación del complemento.
Las primeras células del receptor que tienen contacto con el injerto son las células
presentadoras de antígenos que adquieren y procesan los aloantígenos del donante
ensamblándolos junto con moléculas del Complejo Mayor de Histocompatibilidad del
receptor en la superficie celular para su presentación a los linfocitos T del receptor, que
los reconoce mediante su receptor de células T.
La generación de una señal principal y secundaria correctas induce la síntesis por el
linfocito T de interleucina 2 (IL-2) y otras citocinas, así como la expresión del receptor
de la IL-2 (IL-2R) en su superficie, lo que permite la expansión clonal de los linfocitos
alorreactivos.
Herencia genética HLA

Los genes se heredan en bloques o en haplotipos de padres a hijos, de acuerdo con las
leyes mendelianas de la herencia, cada hijo hereda en bloque la combinación de genes
HLA materno y paterno. Cada célula del organismo posee un halotipo paterno y otro
materno excepto las celulas germinales.

Estos genes se expresan de forma codominante, por cada locus HLA, el hijo hereda un
alelo de la madre y otro del padre, por lo que ambos haplotipos de los padres se
expresan.

Cada rosario de colores es un haplotipo HLA que los padres pueden transmitir a los
hijos ya su vez les ha sido transmitido a ellos desde sus progenitores.
Región de clase I del MHC
Es la región más telomérica, aquí se ubican los genes de la clase I en los locus A,B,C
que codifican las moléculas clásicas HLA A, B, C, así como los genes que codifican a
las moléculas no clásicas HLA E,F,G,H,Y,J.
Región de la clase II del MHC
Los genes de la región de la clase II se localizan mas cerca del centrómero y se ubican
en tres principales locus DP,DQ,DR, que codifican las moléculas HLA DP,DR, DQ. En
esta región se encuentra también los genes que codifican a las moléculas no clásicas
TAP, LMP, DM. Las TAP transportan péptidos al RE y facilitan el anclaje a la clase I.
Los genes LMP2 y LMP7, codifican para subunidades proteínicas catalíticas que
convierten proteasomas estándares en inmunoproteosomas y generan péptidos mas
eficientes. Los genes DM codifican para una molécula tipo clase II que facilita la carga
de péptidos antigénicos hacia moléculas de MHC de la clase II.

COMPLEJO MAYOR DE HISTOCOMPATIBILIDAD

El

complejo mayor de histocompatibilidad (MHC, del inglés

majorhistocompatibilitycomplex) es una región genética formada por un conjunto de
genes polimórficos, alineados en una región grande y continua del genoma, encontrada
en todos los mamíferos, con modificaciones que varían de una especie a otra. En el
ratón se le conoce como sistema H-2 y en el humano como sistema de antígenos
leucocitarios humanos (HLA, del inglés human leukocyteantigens). El sistema HLA se
localiza en el brazo corto del cromosoma 6 que comprende un grupo de genes
relacionados desde el punto de vista funcional, expresados principalmente en las
células nucleadas. En el sistema HLA existen tres regiones: región de clase I que
codifica las moléculas de histocompatibilidad de clase 1, la región de clase II que
codifica las moléculas de histocompatibilidad de clase II y la región de clase III que
codifica moléculas de características estructurales y funcionales diferentes. Estos
antígenos de histocompatibilidad son polimórficos y se heredan comocaracteres
autosómicos codominantes. Un individuo hereda los antígenos de histocompatibilidad
de un cromosoma materno y de un cromosoma paterno en forma de haplotipo. Al inicio,
las moléculas de histocompatibilidad se estudian por su importancia en las reacciones
de rechazo de tejidos trasplantados entre los individuos de la misma especie, aunque la
función fisiológica de sus productos es la capacidad de unirse a los péptidos y
presentarlos a los linfocitos.

REGIÓN CLASE I Y II DEL MHC

Clase I: Los genes se ubican en los locus A,B y C que codifican las moléculas HLA A,
B, C, así como los genes que codifican a las moléculas HLA E,F,G,H,Y,J.
Clase II:Los genes se localizan en el centrómero y se ubican en 3 principales locus
(DP,DQ,DR) los cuales codifican las moléculas HLA DP,DR,DQ, en esta región también
se encuentran los genes que codifican las moléculas no clásicas(TAP,LMP,DM).
 NOMENCLATURA

Nomenclatura Indica

HLA la región HLA y el prefijo de un gen HLA

HLA-DRB1 un locus HLA particular, es decir, DRB1

HLA-DRB1 * 13 un grupo de alelos que codifican el antígeno DR13 o la homología de secuencia con otros alelos DRB1 * 13

HLA-DRB1 * 13: 01 un alelo HLA específico

HLA-DRB1 * 13: 01: 02 un alelo que difiere por una mutación sinónima de DRB1 * 13: 01: 01

HLA-DRB1 * 13: 01: 01: un alelo que contiene una mutación fuera de la región codificante de DRB1 * 13: 01: 01: 01
02

HLA-A * 24: 09N un alelo 'nulo': un alelo que no se expresa

HLA-A * 30: 14L un alelo que codifica una proteína con expresión en la superficie celular significativamente reducida o 'baja'

HLA-A * 24: 02: 01: un alelo que codifica una proteína con expresión en la superficie celular significativamente reducida o 'baja',
02L donde la mutación se encuentra fuera de la región codificante

HLA-B * 44: 02: 01: 02S un alelo que codifica una proteína que se expresa solo como una molécula 'secretada'

HLA-A * 32: 11Q un alelo que tiene una mutación que previamente se ha demostrado que tiene un efecto significativo en la
expresión de la superficie celular, pero cuando esto no se ha confirmado y su expresión sigue siendo
'cuestionable'

ESTUDIOS REQUERIDOS PARA EL TRASPLANTE

RECEPTOR
• Tipificación HLA
• Grupo sanguíneo
• PRA
• Detección de Acs anti-HLA post-trasplante
DONANTE
• Tipificación HLA
• Grupo sanguíneo
RECEPTOR/DONANTE
• Prueba cruzada (crossmatch XM)
Técnicas de tipificación HLA
El método más usado para la tipificación del HLA es la prueba de microlinfocitotoxicidad
o test NHI desarrollada en 1964 por el Dr. Paul Terasaki, en el cual los linfocitos viables
(T–B) de la persona en estudio son expuestos a un panel de antisueros debidamente
caracterizados en donde están incluidos los distintos tipos de HLA. Posteriormente se
agrega suero de conejo como fuente de complemento que es capaz de provocar daño
de la membrana celular de los linfocitos que han reaccionado con los antisueros y éstos
se identifican en microscopía fluorescente. Los resultados se expresan en magnitud de
reacción (1 = negativo, 2,4 = débilmente positivo y 6,8 = fuertemente positivo)
dependiendo del porcentaje de lisis celular y la asignación de la tipificación se basa en
la especificidad de los antisueros que producen reacciones positivas.
Detección de anticuerpos Anti–HLA (PRA)
El monitorear periódicamente la presencia de anticuerpos anti–HLA en los sueros de los
pacientes que se encuentran en lista de espera para trasplante es sin duda alguna uno
de los mayores logros clínicos en los laboratorios de histocompatibilidad. La información
que se obtiene sirve para conocer el grado de aloinmunización humoral y se expresa
como porcentaje de reactividad (%PRA), siendo el máximo 100%. De igual manera esta
prueba permite conocer la especificidad de los anticuerpos formados y esta información
nos correlaciona con precisión si existe o no incompatibilidad del receptor con el
potencial donador en estudio y la posibilidad de desarrollar algún tipo de rechazo.
Asimismo, es una herramienta útil para la selección de donadores en pacientes
altamente sensibilizados. En términos generales, mientras mayor es el porcentaje de
PRA más sensibilizado se encuentra el paciente y son menores las posibilidades de
tener una prueba cruzada negativa con un potencial donador.
Pruebas cruzadas linfocitarias

Esta prueba sirve para detectar anticuerpos anti–HLA preformados, en contra de las
células del donador, presentes en el suero del potencial receptor, con la finalidad de
evitar un rechazo hiperagudo o pérdida temprana del injerto. El resultado de una prueba
cruzada positiva contraindica la realización del trasplante.

La prueba cruzada es uno de los procedimientos más importantes y necesarios en el

trasplante de órganos, sobre todo en el renal. Se utiliza la prueba de
microlinfocitotoxicidad dependiente de complemento (descrita previamente) donde los
linfocitos del potencial donador sirven como blanco para el suero del receptor. En los
casos de una prueba cruzada positiva es importante descartar la presencia de
autoanticuerpos no–HLA, los cuales son irrelevantes para trasplantar y se traducen
como resultados falsos positivos. Estos anticuerpos son del tipo IgM y reaccionan a
baja temperatura. La manera más efectiva para confirmar un resultado positivo es tratar
el suero del receptor con un agente reductor como ditiotreitol (DTT). Los anticuerpos
IgM son inactivados por acción del DTT, de manera que si aún persiste un resultado
positivo éste puede atribuirse a la presencia de anticuerpos anti–HLA del tipo IgG y por
lo tanto es una contraindicación para trasplantar. 8 Este estudio generalmente constituye
una prueba de rutina en el informe del laboratorio de histocompatibilidad.

En la actualidad se han desarrollado también métodos más sensibles que la prueba

cruzada convencional. Éstas son las técnicas por citometría de flujo y la prueba cruzada
con globulina antihumana (AHG), las cuales permiten detectar niveles muy bajos de
anticuerpos circulantes, lo que facilita una mejor evaluación de la pareja
receptor/donador para el trasplante. Aunque la prueba por citometría de flujo es muy
sensible, su alto costo no permite todavía su uso rutinario, al menos en nuestro medio.

BANDEJAS DE TIPIFICACIÓN DE TEJIDOS TERASAKI HLA

Las bandejas de tipificación Terasaki HLA Clase I y Clase II, que contienen
antisueros o anticuerpos monoclonales conocidos, se utilizan para determinar la
presencia de antígenos HLA Clase I o Clase II en linfocitos T o B. Cada pocillo
contiene 1 microlitro (1 µl) de un antisuero específico y 5 microlitros (5 µl) de aceite
mineral pesado. Cada bandeja contiene un control positivo y negativo. Las bandejas
de tipificación de Clase II también incluyen un anticuerpo monoclonal anti-linfocito B
y anti-T.

Los linfocitos viables se incuban con anticuerpo de unión al complemento. Si los

linfocitos expresan un antígeno reconocido por un anticuerpo específico, la porción
Fab del anticuerpo se une al complejo antígeno-anticuerpo formador de antígeno.
Una vez formados estos complejos, se añade el complemento de conejo. El C1q y el
Ca ++ del complemento se unen a la porción FC del anticuerpo. Se requiere un
anticuerpo IgM para unir una molécula de C1q o se requieren dos anticuerpos IgG
para unir una molécula de C1q. La unión de C1q con complejos antígeno-anticuerpo
inicia la cascada del complemento que conduce a la lisis celular. En una reacción
negativa, los linfocitos están vivos. En una reacción positiva, los linfocitos están
muertos.

MUESTRAS

Se requieren linfocitos viables para la tipificación serológica: la sangre debe

recibirse y procesarse inmediatamente después de la obtención. El rendimiento de
linfocitos disminuye con el tiempo y las temperaturas extremas. La sangre debe
recolectarse en citrato dextrosa ácida (ACD) o heparina sódica, almacenarse
horizontalmente a temperatura ambiente (20 - 25ºC) y procesarse dentro de las 48
horas para obtener el máximo rendimiento de linfocitos T y B.

PROCEDIMIENTO:
A. Materiales

1. Bandeja (s) de mecanografía HLA Clase I o Clase II, 72 pocillos

2. Hojas de trabajo que identifican la especificidad de cada anticuerpo monoclonal.

3. Complemento listo para usar, que consiste en suero de conejo combinado

sin diluir de un grupo grande de al menos 15 conejos. El complemento
proporcionado no debe diluirse.

4. Microjeringas, volúmenes dispensados de 1 µl y 5 µl

5. Portaobjetos de cubierta o portaobjetos de vidrio Insta-Seal (OLI Cat. #

TIS250U)

6. Reactivos de tinción y fijación:

a. Para pruebas de exclusión de colorantes: Eosina Y (base de sodio) y

formaldehído.
b. Para pruebas de fluorescencia: FluoroQuench AO / EB (OLI Cat. # FQAE-
100/500 o FQZAE100)

B. Procedimiento
a. Descongele las bandejas a 20 - 25º C durante 15 minutos y úselas
dentro de los 30 minutos posteriores a la descongelación.
Precaución: No vuelva a congelar.

b. A cada pocillo, agregue 1 µl de una suspensión de 2 x 106 células / ml

de linfocitos T o B a la bandeja de Clase I o linfocitos B a la bandeja de
Clase II.
c. Mezcle las microgotitas con un mezclador electrostático o un cable.
d. Incube las bandejas a temperatura ambiente (20 - 25ºC) durante 30 minutos.

e. Dispense 5 µl del correspondiente complemento HLA-ABC o DR de

conejo (incluido) en cada pocillo de la bandeja de prueba. Mezclar
usando un mezclador electrostático o alambre.
f. Incube las bandejas a temperatura ambiente (20 - 25ºC) durante 1 hora.
g. Después de la incubación, teñir y fijar las células:
 (1) Para la prueba de exclusión de tinte, agregue a cada pocillo:

 5 µl de colorante de eosina, seguidos 2 minutos más tarde por 5

µl de formaldehído.

(2) Para la prueba de fluorescencia, agregue 5 µl de

FluoroQuench®.

h. Mezclar con un mezclador electrostático o alambre.

i. Cubra las bandejas con Terasaki Insta-Seal (OLI Cat. # TIS250U) o un

portaobjetos de vidrio. Deje reposar las bandejas a temperatura
ambiente (20 - 25ºC) durante 15 minutos para permitir que los linfocitos
se asienten. Las bandejas de exclusión de tinte se pueden almacenar a
2 - 5ºC hasta por 2 semanas. Las bandejas fluorescentes se pueden
almacenar a 2-5 ° C en la oscuridad hasta por 2 días.

RESULTADOS
A. Adquisición de datos

1. Hoja de trabajo específica del producto.

C. Análisis de los datos

1. Hoja de patrón de reacción específico del producto, Hoja de análisis específico

del producto

2. La muerte celular ocurrirá en cualquier pocillo de prueba donde el antígeno

de superficie celular HLA sea reconocido por su anticuerpo anti-HLA
coincidente.

3. Usando la exclusión de tinte, los linfocitos negativos (vivos) aparecen

pequeños, brillantes y refráctiles. Los linfocitos positivos (muertos)
aparecen oscuros y no refráctiles con el tinte de eosina.

4. Para las pruebas de fluorescencia, los linfocitos negativos (vivos)

aparecen en verde. Los linfocitos positivos (muertos) aparecen rojos.

LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO

 Las dificultades de aislamiento celular y la contaminación de la preparación
de linfocitos con glóbulos rojos, levadura, monocitos, plaquetas o granulocitos
pueden producir resultados erróneos. Además, pueden producirse resultados
erróneos cuando las concentraciones de células están por encima o por
debajo de los niveles aceptables.

 Muchos anticuerpos anti-HLA reaccionan de forma cruzada con epítopos

compartidos por muchos antígenos HLA diferentes (CREG).

 En las bandejas de tipificación de Clase II, el control de anti-linfocitos B

debe ser positivo para validar que la preparación celular está enriquecida
con linfocitos B. Si este control es menor que una puntuación de reacción de
6, la prueba no es válida.

 La contaminación bacteriana o el cambio en el pH de los antisueros pueden causar

reacciones negativas falsas.

 Debido a la complejidad de las pruebas de HLA, un técnico o especialista

certificado en HLA debe revisar e interpretar los datos y asignar la tipificación
de HLA.

 Esta prueba no debe usarse como la única base para tomar una decisión clínica.

VALORES ESPERADOS

Evaluación microscópica de pruebas

Las reacciones se puntúan estimando el porcentaje de muerte celular. Si el control
negativo contiene linfocitos muertos, el porcentaje de muerte celular en los pocillos
restantes debe ajustarse en consecuencia.

El estándar de lectura ASHI se muestra en la siguiente tabla:

 Puntaje Muertecelular Interpretación
1 0-10% Negativo
2 11-20% Dudosonegativo
4 21-50% Débilpositivo
6 51-80% Positivo
8 81-100% Fuertepositivo
0 No se puede leer

Las frecuencias fenotípicas para HLA Clase I y Clase II variarán entre diferentes
poblaciones (es decir, caucásicos, negros estadounidenses, orientales, etc.). 3

Interpretación de los resultados (para cada muestra):

Utilizando la hoja de trabajo adecuada, registre la viabilidad inicial del control de

suero normal y analice las reacciones del suero en las columnas correspondientes
junto con las especificidades de los anticuerpos.
BIBLIOGRAFÍA

1. De-Leo-Cervantes, C. (2005). Pruebas de Histocompatibilidad en el programa de

trasplante. SCIELO, 144-145.
2. RUBIO CAMPAL, F., ROMERO BURGUILLOS, R., & GARCIA ESPINOZA, B. (2016).
TECNICAS DE INMUNODIAGNOSTICO . ESPAÑA: PARANINFO.
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4. Manual de laboratorio de ASHI, tercera edición, ASHI, Lenexa, KS.

5. Parham P. Inmunología. 2ª edición. Ed. Médica Panamericana. Buenos Aires, Argentina.
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6. Área de Inmunología. Prácticas de Inmunología SanitariaAutor: Gonzalo Rubio
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7. Cruz-Taías P, Pérez-Fernández OM, Rojas-Villarraga A, Rodríguez-Rodríguez A,
Arango MT, Anaya JM. (2012). Shared HLA class llin sixautoimmune diseases in
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