DETERMINACIÓN DE PROTEÍNAS POR EL MÉTODO DE BRADFORD

“ reactivo Bradford sigma listo para usar”

Blanco: Este tubo no contiene proteína, se reemplaza la muestra por agua y se le agrega el
correspondiente volumen de reactivo. Se realiza para determinar la absorbancia del reactivo, este valor
se descuenta de la absorbancia del resto de los tubos.
Curva de calibración: Para su realización se utilizará la solución testigo de concentración conocida.
Con la medida de absorbancia de cada tubo y conociendo la cantidad de proteínas que contiene cada
uno de los tubos, es posible realizar una curva de calibración (gráfico A 595 vs g/ml de proteína). Es
necesario realizarla cada vez que se procesen las muestras. La concentración del TESTIGO es 100
g/ml.
Muestra incógnita: se procesa en simultáneo y en las mismas condiciones que la curva de
calibración. El tubo contiene la muestra y la misma cantidad de reactivos que los anteriores. Para
conocer la cantidad de proteínas de la muestra (g), se determina la absorbancia de la misma y se
interpola en la curva de calibración. Cada grupo procesa una sola Muestra incógnita (A o B).
Protocolo:

Curva de Calibración

Tubo Concentración H2O Proteína BSA Reactivo

(l) ( 10 mg/ml) de
C/T (g) Bradford
(ml)
Blanco 300 1

1 1 600 1

2 0,5 300 300 1

3 0,25 300 300 1

4 0,125 300 300 1

5 0,0625 300 300 1

6 0,03125 300 1

7 0,015625 300 1

8 0,0078125 300 1

9 0,0039062 300 1

descarte -------- 300

Muestras:

Tubo Dilución H2O Muestra Reactivo de

(l) C/T (l) Bradford
(ml)
Muestra 1 1 300 1

Muestra 1 0,5 300 300 1

Procedimiento cuantificación de proteínas

1. Chequear disponibilidad de BSA, sino preparar stock 10 mg/ml, siempre usando agua
destilada. Volumen final 1 ml. Reservar en Freezer.
2. Mientras ocurre lo anterior, se preparan las diluciones como se muestra en la tabla. En el
primer eppendorf se añaden 600 ul de muestra o proteína y se lleva a vortex, se trasvasan
300 ul al eppendorf 2, se añade agua para la dilución. Éste se lleva a vortex y se trasvasan
300 ul y así sucesivamente hasta el eppendorf 9. Descartando 300 ul final. Importante: el
agua a utilizar debe estar purificada!
3. Por último se añaden a todos los eppendorf 1 ml de reactivo de Bradford. Se lleva a vortex y
se espera de 2 minutos a 1 hora para medir absorbancia 595 nm.
4. Aclaración: usar cubetas de plástico comenzando por el blanco, luego por la curva de
calibración desde los epp. más diluidos hasta los más concentrados. Enjuagar la cubeta con
agua purificada y medir las muestras de la misma manera.
Procedimiento extracción proteínas intracelulares

1. El electrodo al finalizar el experimento electroquímico se almacena en PBS 1X, estéril.

Mínimo volumen posible, el mismo para todas las muestras y cuantificarlo.
2. El mismo se introduce en NaOH 0,2N durante 24 hs a T ambiente (usar la mínima
cantidad posible de NaOH y el mismo volumen para todas las muestras), luego de las 24
hs, se calienta durante 30 minutos a 90ªC. Con el objetivo de lisar bacterias y que todo
quede en solución y no en el electrodo. Al finalizar sacar el electrodo, centrifugar la
solución a 6000 g, 5 min a 4 ºC. Tomar el sobrenadante para los ensayos.
3. Si no se utiliza en el momento, guardar en frezeer y en todo momento en el que se trabaje
en mesada debe estar con hielo para evitar la desnaturalización.
4. Cuantificar las proteínas.
Procedimiento extracción proteínas extracelulares

5. El electrodo al finalizar el experimento electroquímico se almacena en PBS 1X, frío y

estéril. Mínimo volumen posible, el mismo para todas las muestras y cuantificarlo.
6. Llevar tubo a vortex (fuerte) por dos minutos.
7. Centrifugar la solución a 16000 g, 5 min a 4 ºC. Tomar el sobrenadante para los ensayos.
8. Si no se utiliza en el momento, guardar en frezeer y en todo momento en el que se trabaje
en mesada debe estar con hielo para evitar la desnaturalización.
9. Cuantificar las proteínas.
 DETERMINACIÓN DE PROTEÍNAS POR EL MÉTODO DE BRADFORD
“ reactivo Protein Assay Dye Reagent Concentrate- BIO-RAD”
Blanco: Este tubo no contiene proteína, se reemplaza la muestra por agua y se le agrega el
correspondiente volumen de reactivo. Se realiza para determinar la absorbancia del reactivo, este valor
se descuenta de la absorbancia del resto de los tubos.
Curva de calibración: Para su realización se utilizará la solución testigo de concentración conocida.
Con la medida de absorbancia de cada tubo y conociendo la cantidad de proteínas que contiene cada
uno de los tubos, es posible realizar una curva de calibración (gráfico A 595 vs g/ml de proteína). Es
necesario realizarla cada vez que se procesen las muestras. La concentración del TESTIGO es 100
g/ml.
Muestra incógnita: se procesa en simultáneo y en las mismas condiciones que la curva de
calibración. El tubo contiene la muestra y la misma cantidad de reactivos que los anteriores. Para
conocer la cantidad de proteínas de la muestra (g), se determina la absorbancia de la misma y se
interpola en la curva de calibración. Cada grupo procesa una sola Muestra incógnita (A o B).
Protocolo: Standard Procedure (20-150 ug de Proteína)

Curva de Calibración

Tubo Concentración H2O Proteína BSA Reactivo

(l) ( 2 mg/ml) de
C/T (l) Bradford
(ml)
Blanco 25 - 1,25

1 1.5 6.25 18.75 1,25

2 1.25 9.375 15.625 1,25

3 1.0 12.5 12.5 1,25

4 0.75 15.625 9.375 1,25

5 0.5 18.75 6.25 1,25

6 0.25 21.875 3.125 1,25

Muestras:

Tubo Dilución H2O Muestra Reactivo de

(l) C/T (l) Bradford
(ml)
Muestra 1 1 25 1,25
 Muestra 1 0,5 12.5 12.5 1,25

Preparación reactivo de Bio-rad concentrado ( HAY QUE DILUIR 1 EN 5)

1. Recordar que al diluir el reactivo, su fecha de caducidad es de 2 semanas aprox. Preservado

en la heladera. Por lo que conviene preparar la cantidad exacta a utilizar. Para la curva de
calibración se requieren 8,75 ml de reactivo diluido. El volumen final dependerá de la
cantidad de muestras.
2. Para preparar 15 ml volumen final de reactivo diluido, se toman 3 ml de reactivo bio-rad
concentrado, se añaden 12 ml de agua destilada. Se filtra con filtro Hartmann de 47 mm
diámetro. Se preserva de la luz y ya está listo para utilizar.

Procedimiento cuantificación de proteínas

3. Chequear disponibilidad de BSA, sino preparar stock 10 mg/ml, siempre usando agua
destilada. Volumen final 1 ml. Reservar en Freezer.
4. Prepara una dilución (1 en 5) de BSA concentrada, para trabajar con la curva de calibración.
El volumen de BSA que se necesita para la curva es de 65.625 ul. Se pueden preparar 100 ul,
por cualquier cosa. Entonces tomamos 20 ul de BSA ( 10 mg/ml) y 80 ul de agua destilada.
2 Mientras ocurre lo anterior, se preparan las diluciones como se muestra en la tabla.
3 Por último se añaden a todos los eppendorf 1,25 ml de reactivo de Bradford. Se lleva a
vortex y se espera de 5 minutos a 1 hora para medir absorbancia 595 nm.
4 Aclaración: usar cubetas de plástico comenzando por el blanco, luego por la curva de
calibración desde los epp. más diluidos hasta los más concentrados. Enjuagar la cubeta con
agua purificada y medir las muestras de la misma manera.

Curva de calibración debería quedar así:

  DO 595 Do
blanco 0,592  
250 0,884 0,292
500 1,138 0,546
750 1,418 0,826
1000 1,596 1,004
1500 1,899 1,307
Curva del fabricante:
 Protocolo: Microassay Procedure (1,2 a 10 ug/ml de Proteína)

Curva de Calibración

Tubo Concentración H2O Proteína BSA Reactivo de

(l) ( 0.1 mg/ml) Bradford (ul)
(l)
Blanco 800 - 200

1 10 720 80 200

2 8 736 64 200

3 6 752 48 200

4 4 768 32 200

5 2 784 16 200

6 1.25 790 10 200

Muestras:

Tubo Dilución H2O Muestra Reactivo de

(l) C/T (l) Bradford
(ml)
Muestra 1 1 800 1,25

Muestra 1 0,5 400 400 1,25

Preparación reactivo de Bio-rad concentrado ( SE UTILIZA CONCENTRADO)

Procedimiento cuantificación de proteínas
5. Chequear disponibilidad de BSA, sino preparar stock 10 mg/ml, siempre usando agua
destilada. Volumen final 1 ml. Reservar en Freezer.
6. Prepara una dilución (1 en 100) de BSA concentrada, para trabajar con la curva de
calibración. El volumen de BSA que se necesita para la curva es de 250 ul. Se pueden
preparar 1000 ul, para trabajar con pipeta. Entonces tomamos 10 ul de BSA ( 10 mg/ml) y
990 ul de agua destilada.
5 Mientras ocurre lo anterior, se preparan las diluciones como se muestra en la tabla.
6 Por último se añaden a todos los eppendorf 200 ul de reactivo de Bio-Rad concentrado. Se
lleva a vortex y se espera de 5 minutos a 1 hora para medir absorbancia 595 nm.
7 Aclaración: usar cubetas de plástico comenzando por el blanco, luego por la curva de
calibración desde los epp. más diluidos hasta los más concentrados. Enjuagar la cubeta con
agua purificada y medir las muestras de la misma manera.