PROTEÓMICA CLÍNICA

PROTEÓMICA
CLÍNICA

José Manuel González de Buitrago

Laura Ferreira Redondo

Comité de Publicaciones de la
Sociedad Española de Bioquímica Clínica
y Patología Molecular
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Octubre 2006
Monografías del Comité de Publicaciones
de la Sociedad Española de Bioquímica Clínica y Patología Molecular
Director de la Serie: J.M. González de Buitrago
Coordinador de la edición: F. Antoja Ribó

Comité de Publicaciones
Felipe Antoja Ribó
Francisco Cañizares Hernández
José M. Egea Caparrós
Román Galimany Solé
Miguel García Montes
Luis Gregorio Gómez-Cambronero López
José M. González de Buitrago
José M. Hernández Pérez
Jordi Huguet Ballester (presidente)
Joan B. Ortolà Devesa
Anna Padrós Fluvià
Eulàlia Urgell Rull
 ÍNDICE DE AUTORES

José Manuel González de Buitrago Laura Ferreira Redondo

Servicio de Bioquímica Clínica y Unidad Laboratorio de Proteómica Clínica
de Investigación Unidad de Investigación
Hospital Universitario de Salamanca Hospital Universitario de Salamanca
Departamento de Bioquímica y Biología
Molecular
Universidad de Salamanca

5
 Índice

Capítulo 1. Introducción a la proteómica ............................................ 13

Introducción .............................................................................. 13
Orígenes de la proteómica .......................................................... 14
Organización del Proteoma Humano (HUPO).................................. 14
Proteómica clínica...................................................................... 15
Marcadores biológicos........................................................... 15
Medidas de utilidad de los biomarcadores................................. 16
Áreas de estudio de la proteómica ................................................ 17 7
Proteínas y enfermedad ............................................................... 17
Síntesis, estructura y función de las proteínas ................................... 18
Síntesis ................................................................................ 18
Corte y empalme alternativo y edición del mRNA ........................ 20
Modificaciones posteriores a la traducción................................. 21
Estructura ............................................................................. 21
Funciones ............................................................................ 23
Tecnologías proteómicas ............................................................. 24
Estrategias proteómicas............................................................... 24
Referencias ............................................................................... 25
Libros de Bioquímica de consulta sobre proteínas ........................ 26

Capítulo 2. Tratamiento de las muestras para los estudios proteómicos ..... 27

Introducción .............................................................................. 27
Muestras de tejidos .................................................................... 27
Rotura de las células .............................................................. 28
Desactivación o eliminación de las sustancias que interfieren ......... 28
Precipitación proteica............................................................. 29
Otros métodos para eliminar los contaminantes ........................... 29
Solubilización de las proteínas................................................. 29
Fraccionamiento subcelular...................................................... 30
 Métodos para eliminar las proteínas más abundantes en los homo-
geneizados tisulares............................................................... 31
Cuantificación de las proteínas ................................................ 31
Muestras de plasma/suero sanguínero........................................... 31
Obtención de la muestra......................................................... 31
Eliminación/enriquecimiento.................................................... 32
Pre-fraccionamiento................................................................ 34
Muestras de orina ...................................................................... 35
Muestras de líquido cefalorraquídeo.............................................. 35
Enriquecimientos previos.............................................................. 36
Proteínas hidrófobas y básicas poco abundantes ......................... 36
Análisis de fosfoproteínas........................................................ 36
Análisis de glucoproteínas....................................................... 37
Referencias ............................................................................... 37

Capítulo 3. Elctroforesis bidimensional................................................ 41

Introducción .............................................................................. 41
Conceptos generales sobre electroforesis........................................ 41
Electroforesis en acetato de celulosa ......................................... 42
Electroforesis en gel ............................................................... 42
8
Electroforesis bidimensional.......................................................... 43
Separación en la primera dimensión.............................................. 44
Visión general sobre el enfoque isoeléctrico................................ 44
Tiras IPG ............................................................................. 45
Rehidratación de las tiras y aplicación de la muestra.................... 46
Desarrollo del enfoque isoeléctrico............................................ 46
Equilibrado de las tiras de IPG ..................................................... 47
Separación en la segunda dimensión ............................................ 47
Detección y cuantificación de las proteínas ..................................... 48
Electroforesis bidimensional en gel diferencial (DIGE 2D) ................... 49
Técnicas de análisis de imagen .................................................... 49
Corte de las manchas................................................................. 50
Referencias ............................................................................... 51

Capítulo 4. Separaciones multidimensionales....................................... 53

Introducción .............................................................................. 53
Técnicas cromatográficas ............................................................ 53
Cromatografía de intercambio iónico ........................................ 55
Cromatografía de exclusión de tamaño ..................................... 55
Cromatografía de afinidad...................................................... 56
Cromatografía líquida de alta resolución ........................................ 56
 Bombas............................................................................... 56
Fase normal y fase reversa ...................................................... 56
Detectores............................................................................ 57
Electroforesis capilar................................................................... 57
Separaciones multidimensionales .................................................. 57
Separaciones bidimensionales...................................................... 59
Cromatografía bidimensional con dos columnas en serie............... 59
Cromatografía bidimensional con columnas que se cambian ......... 60
Cromatografía líquida-electroforesis capilar ................................ 61
Enfoque isoeléctrico y cromatografía ......................................... 61
Separaciones tridimensionales ...................................................... 62
Sistemas comerciales .................................................................. 62
Referencias ............................................................................... 63

Capítulo 5. Estectrometría de masas................................................... 65

Introducción .............................................................................. 65
Aplicación de la espectrometría de masas para el estudio de las pro-
teínas.................................................................................. 65
Espectrómetros de masas............................................................. 66
Técnicas para volatilizar e ionizar proteínas o péptidos para espectro-
9
metría de masas.................................................................... 68
Técnica de ionización ESI ....................................................... 68
Técnica de ionización MALDI .................................................. 68
Tipos de analizadores de masas para los estudios proteómicos .......... 69
Analizadores de trampa iónica ................................................ 70
Analizadores de tiempo de vuelo ............................................. 71
Analizadores cuadrupolo ........................................................ 71
Analizador de resonancia de ión ciclotrón con transformada de Fu-
rier (FTICR) ........................................................................... 71
Espectrómetros de masas en tandem (MS/MS) ................................ 72
Detectores ................................................................................ 73
Combinación fuente de iones-analizador de masas .......................... 73
Identificación de las proteínas ...................................................... 73
Huellas de masa ................................................................... 74
Secuenciación ...................................................................... 74
Caracterización de las modificaciones posteriores a la traducción por
espectrometría de masas ........................................................ 76
Referencias ............................................................................... 76

Capítulo 6. Micromatrices proteicas................................................... 79

Introducción .............................................................................. 79
 Tipos de micromatrices proteicas................................................... 79
Métodos de unión...................................................................... 82
Ligandos de captura................................................................... 83
Detección................................................................................. 83
Métodos sin marcaje ............................................................. 83
Métodos con sondas marcadas ............................................... 84
Fluorescencia................................................................. 84
Detección cromogénica ................................................... 85
Quimioluminiscencia ....................................................... 85
Radiactividad ................................................................ 85
SELDI-TOF MS ........................................................................... 85
Matriz proteica ..................................................................... 85
Analizador de masa .............................................................. 86
Programas de análisis del patrón proteómico .............................. 87
Automatización ......................................................................... 87
Referencias ............................................................................... 88

Capítulo 7. Proteómica del plasma y proteómica de las células sanguí-

neas........................................................................................ 89
Introducción .............................................................................. 89
10
Proteínas plasmáticas.................................................................. 90
Separación por electroforesis................................................... 91
Determinación de proteínas específicas ..................................... 92
Significado clínico de las proteínas más abundantes .................... 92
Enzimas en plasma/suero ....................................................... 94
Marcadores tumorales............................................................ 94
Caracterización del proteoma plasmático....................................... 94
Estrategias para el descubrimiento de marcadores biológicos de en-
fermedad en el plasma/suero sanguíneo ................................... 98
Búsqueda de marcadores de cáncer mediante la técnica SELDI-TOF
MS..................................................................................... 99
Cáncer de ovario .................................................................. 99
Cáncer de mama .................................................................. 100
Cáncer de próstata................................................................ 100
Cáncer colorrectal ................................................................. 100
Conclusiones ........................................................................ 101
Caracterización de marcadores biológicos de cáncer mediante otras
técnicas proteómicas.............................................................. 101
Autoanticuerpos circulantes en los pacientes con cáncer .................... 102
Micromatrices de antígenos para la detección de autoanticuerpos ...... 102
Células sanguíneas .................................................................... 103
 Eritrocitos ............................................................................. 104
Plaquetas ............................................................................. 104
Leucocitos ............................................................................ 105
Leucemia y linfoma ................................................................ 106
Referencias ............................................................................... 107

Capítulo 8. Proteómica de la orina .................................................... 113

Introducción .............................................................................. 113
Fisiología y patología renal de las proteínas ................................... 113
Medida de proteínas en la orina .................................................. 114
Proteoma normal de la orina ........................................................ 115
Proteoma de la orina en las enfermedades renales ........................... 117
Enfermedades glomerulorrenales............................................... 117
Rechazo del injerto renal ........................................................ 118
Cánceres urológicos .............................................................. 118
Urolitiasis ............................................................................. 120
Proteoma de la orina en otras enfermedades no renales .................... 120
Referencias ............................................................................... 121

Capítulo 9. Proteómica de otros líquidos biológicos, proteómica tisular y

11
proteómica subcelular ................................................................. 125
Líquido cefalorraquídeo............................................................... 125
Proteínas del líquido cefalorraquídeo......................................... 125
Proteoma normal ................................................................... 126
Proteoma en enfermedades neurodegenerativas .......................... 126
Plasma seminal.......................................................................... 127
Líquido amniótico....................................................................... 128
Proteoma normal ................................................................... 128
Proteoma en la rotura prematura de membranas y en las infeccio-
nes intra-amnióticas................................................................ 128
Proteoma en el síndrome de Down ........................................... 129
Líquido de lavado broncoalveolar ................................................. 129
Proteoma normal ................................................................... 129
Proteoma de enfermedades pulmonares con fibrosis intersticial ....... 130
Proteoma del cerebro ................................................................. 130
Proteómica y enfermedad de Alzheimer ..................................... 131
Proteómica y enfermedad de Parkinson...................................... 131
Mecanismos moleculares de la neurotoxicidad............................ 132
Proteoma del hígado .................................................................. 132
Proteoma cardíaco..................................................................... 133
Proteomas subcelulares ............................................................... 134
 Núcleo................................................................................ 134
Mitocondrias ........................................................................ 135
Lisosomas ............................................................................ 135
Peroxisomas ......................................................................... 136
Exosomas ............................................................................ 136
Retículo endoplásmico y aparato de Golgi................................. 136
Referencias ............................................................................... 137

Títulos publicados ............................................................................. 145

12
 Capítulo 1

Introducción a la proteómica

Introducción

Desde hace mucho tiempo, el análisis de proteínas en los líquidos biológicos,

principalmente el suero, ha sido una parte integrante de la bioquímica clínica.
Primero fue la cuantificación de las proteínas totales, posteriormente la separa-
ción electroforética de las proteínas y más tarde la cuantificación de proteínas
específicas. Desde hace unos pocos años, la proteómica permite el análisis
simultáneo de cientos de proteínas y su identificación, así como el análisis de sus
modificaciones estructurales. El progreso de la proteómica se ha debido a los 13
avances que se han producido en diversas áreas de las ciencias biomédicas,
entre ellos los de los métodos analíticos que emplean espectrometría de masas,
la disponibilidad de la secuencia genómica completa de varios organismos, la
construcción de micromatrices proteicas/peptídicas, los métodos de computa-
ción y la tecnología de ordenadores. En el momento actual, la proteómica se
encuentra principalmente en una fase de investigación y desarrollo, pero pensa-
mos que en unos pocos años, la proteómica ocupará un lugar importante en los
laboratorios de Bioquímica Clínica.
El término proteoma lo utilizó por primera vez Marc Wilkins en 1995 para descri-
bir el complemento proteico total de un organismo, de acuerdo con la idea de
detectar y determinar todas las proteínas producidas por el DNA de un organismo
en lugar de secuenciar sus genes [1]. Poco después comenzó a emplearse el
término proteómica para señalar el estudio del protemoma [2]. Con una definición
más reciente, el proteoma es el conjunto de todas las proteínas presentes en una
célula, organismo o medio biológico en un momento determinado. Esto incluye no
solo las proteínas traducidas directamente a partir del material genético, sino tam-
bién todas las proteínas modificadas por el corte y empalme alternativo de los
transcritos primarios, el procesamiento posterior a la traducción o la combinación
de ambos. El proteoma no es un parámetro estático, como el genoma, sino un
conjunto dinámico que refleja tanto el programa genético intrínseco de las células
como el impacto de su entorno inmediato. Comparado con el genoma, el proteo-
 ma proporciona una visión más realista de una situación biológica y, por lo tanto,
se espera que sea más útil que el análisis genético para evaluar, por ejemplo, la
presencia de una enfermedad, su progresión y su respuesta al tratamiento.

Orígenes de la proteómica

Los primeros estudios de proteínas a los que de alguna forma se les puede deno-
minar como proteómica comenzaron en 1975 con la introducción de los geles
bidimensionales por O´Farrel [3], Klose [4] y Scheele [5] que los utilizaron para
cartografiar las proteínas de E. coli, el ratón y el cobaya, respectivamente. Aunque
se pudieron separar y visualizar muchas proteínas, no pudieron identificarse. A
pesar de esas limitaciones, poco después se propuso un análisis a gran escala de
todas las proteínas humanas. El objetivo de este proyecto denominado Índice de
Proteínas Humanas [6] era utilizar la electroforesis bidimensional de proteínas y
otros métodos para catalogar todas las proteínas humanas. Sin embargo, este
proyecto no tuvo continuidad y se abandonó fundamentalmente por falta de finan-
ciación. Un problema importante en esa época eran las técnicas de secuenciación
de proteínas que requerían una cantidad muy grande de la proteína purificada. La
puesta a punto de métodos de microsecuenciación basados en la técnica de Ed-
14
man permitieron crear la primera base de datos bidimensional [7]. A principio de
los años 1990 se diseñaron métodos para ionizar péptidos y llevar los iones pep-
tídicos resultantes a los espectrómetros de masas. De esta forma se produjo un
avance espectacular al poder utilizarse la espectrometría de masas para la identi-
ficación de las proteínas.

Organización del Proteoma Humano (HUPO)

En 2001, se creó la HUPO (Human Proteome Organization, Organización del

Proteoma Humano; www.hupo.org) con el fin de acelerar el desarrollo del campo
de la proteómica y estimular y organizar las colaboraciones internacionales en
investigación y educación [8]. Las misiones de la HUPO son:

1. Consolidar las organizaciones nacionales y regionales del proteoma en una

organización a nivel mundial.
2. Comprometerse en actividades científicas y educativas para estimular la difu-
sión de las tecnologías proteómicas y difundir el conocimiento del proteoma
humano y de los organismos modelo.
3. Colaborar en la coordinación de iniciativas públicas relacionadas con el
proteoma.
La HUPO ha creado diversas iniciativas centradas en los proteomas del plasma
sanguíneo, el hígado y el cerebro. En contraste con el proyecto del Genoma Hu-
mano que, en general, utiliza la tecnología básica para secuenciar los genes, la
Organización del Proteoma Humano pretende aplicar diferentes tecnologías nue-
vas, muchas de las cuales se encuentran en proceso de perfeccionamiento y es-
tandarización.

Proteómica clínica

La proteómica clínica es la aplicación de las técnicas y estrategias de la proteómi-

ca al campo de la Medicina. Uno de los objetivos de la proteómica clínica es el
descubrimiento de marcadores biológicos (biomarcadores).

Marcadores biológicos

El término biomarcador fue introducido en 1989 en el Medical Subject Heading

(MeSH) como: «parámetro biológico medible y cuantificable (ej., concentración
enzimática específica, concentración hormonal específica, distribución fenotípica
específica de un gen en una población, presencia de una sustancia biológica) que
15
sirve como índice de las variaciones fisiológicas o de salud, como el riesgo de
una enfermedad, los trastornos psiquiátricos, la exposición ambiental y sus efectos,
el diagnóstico de una enfermedad, un proceso metabólico, la drogadicción, el
embarazo, el desarrollo de una línea celular, un estudio epidemiológico, etc.». En
el año 2001, un grupo de trabajo de los National Institutes of Health (NIH) (Institu-
tos Nacionales de la Salud) estandarizó la definición de biomarcador como: «una
característica que se mide y evalúa objetivamente como indicador de procesos
biológicos normales, procesos patogénicos o respuestas farmacológicas a una
intervención terapéutica» [9].
Los marcadores biológicos son pruebas, medidas biométricas que transmiten la
información sobre el estado biológico de la persona que se analiza [10]. Estas
medidas pueden ser una lectura cuantitativa de una sustancia específica, estudios
sofisticados de imagen o, en los paradigmas genómico y proteómico, la medida
de muchos analitos combinada en modelos matemáticos [10]. El valor fundamen-
tal de los biomarcadores es su capacidad para diferenciar dos o más estados
biológicos. Esta capacidad de segregar es lo que diferencia a los biomarcadores
de las medidas sencillas. Una medida se convierte en biomarcador cuando los
estudios clínicos demuestran que las concentraciones por encima de unos umbrales
definidos predice la presencia de la enfermedad.
Así pues, en el sentido más simple, el objetivo del descubrimiento de marcadores
biológicos proteicos es identificar una proteína o un grupo de proteínas que dife-
 rencien a los pacientes con una determinada enfermedad de las personas sanas.
Un marcador biológico ideal es aquel que se encuentra en un espécimen biológi-
co que puede obtenerse de forma no invasiva.
El descubrimiento de biomarcadores está centrado principalmente en la explora-
ción proteómica de la sangre, que es una muestra de fácil acceso que contiene
una enorme cantidad de información. Sin embargo, la sangre (plasma o suero) es
el proteoma humano más complejo ya que, además de contener las proteínas
específicas de la sangre, contiene también proteínas liberadas de los tejidos del
cuerpo.

Medidas de utilidad de los biomarcadores

Cada biomarcador, igual que cualquier prueba clínica, posee unas características
determinadas de eficacia. Las medidas fundamentales de eficacia de todas las
pruebas clínicas son la sensibilidad y la especificidad. La sensibilidad refleja la
capacidad para identificar una enfermedad cuando está presente y la especifici-
dad refleja la capacidad para descartar la enfermedad cuando no está presente.
Tanto la sensibilidad como la especificidad varían en función del punto de corte
específico que se elija para dar la prueba como positiva o negativa. Para selec-
cionar el punto de corte que proporciona los valores más adecuados de sensibili-
16
dad y especificidad se utilizan las curvas ROC.
La sensibilidad y especificidad son propiedades del biomarcador. Si están bien
establecidos, estos valores son ciertos con independencia de la población que se
analiza. Sin embargo, lo que más interesa en la toma de decisiones clínicas no es
la sensibilidad y la especificidad, sino otras dos características que son el valor
predictivo de una prueba positiva (VPP) y el valor predictivo de una prueba negati-
va (VPN). A diferencia de la sensibilidad y la especificidad, los valores predictivos
dependen mucho de la población que se analiza.
El valor predictivo de una prueba positiva (VPP) indica la probabilidad de que la
persona tenga la enfermedad, mientras que el valor pedictivo de una prueba
negativa (VPN) señala la probabilidad de que la persona no tenga la enfermedad.
VPP y VPN varían dependiendo de la prevalencia de la enfermedad en la pobla-
ción que se analiza. Así, una prueba con una sensibilidad del 90% y una especi-
ficidad del 85% proporciona un VPP del 86% cuando la prevalencia es del 50%,
pero sólo da un valor VPP del 6% cuando la prevalencia es del 1%.
Cuando se estudia una enfermedad cuya prevalencia es baja, incluso una prueba
muy específica da lugar a muchos falsos positivos debido al gran número de per-
sonas sanas de la colectividad. En cambio, cuando la prevalencia es alta lo que
se obtiene es un número alto de falsos negativos. Así, pues, cuanto menor es la
prevalencia menor es el VPP y mayor el VPN y, al contrario, cuando la prevalencia
es alta.
Para eliminar la dificultad que surge al interpretar los valores predictivos como
consecuencia de su dependencia de la prevalencia se utilizan los cocientes de
probabilidad (likelihhod ratios). El cociente de probabilidad es el cociente entre la
probabilidad de un determinado valor de la prueba en presencia y ausencia de la
enfermedad. Los cocientes de probabilidad expresan cuantas veces es más pro-
bable que se encuentre un resultado de una prueba en las personas con la enfer-
medad que en las que no la tienen.
Los cocientes de probabilidad para las pruebas positivas y las pruebas negativas
pueden definirse en términos de sensibilidad y especificidad, uno asociado con un
resultado positivo de la prueba y el otro con un resultado negativo de la prueba.
LR+ = s/1–e y LR– = 1–s/e.

Áreas de estudio de la proteómica

Desde un punto de vista práctico, el campo de la proteómica puede dividirse en

tres áreas:

a) Proteómica estructural
Caracteriza las estructuras proteicas individuales y define sus contribuciones a
17
los grandes complejos con el objetivo de obtener una descripción completa de
todas las interacciones entre las moléculas [11]. Esta información puede ayudar
a situar cada una de las piezas de la arquitectura global de una célula y expli-
car cómo la expresión de determinadas proteínas proporciona a las células sus
características.

b) Proteómica de expresión
Estudio cuantitativo de la expresión proteica entre muestras que se diferencian en
alguna variable [12]. Puede compararse entre las muestras la expresión proteica
del proteoma completo o de subproteomas. Con estos estudios pueden identificar-
se proteínas específicas de una enfermedad.

c) Proteómica funcional
Elucida el papel de proteínas específicas en condiciones fisiológicas normales y
anormales.

Proteínas y enfermedad

Las proteínas son las principales moléculas funcionales de las células y participan
prácticamente en todas sus funciones y en el control de todos los procesos celula-
 res. Asimismo, la expresión de los genes y la concentración de las proteínas celu-
lares se modifican en las enfermedades por lo que se pueden utilizar para evaluar
estos estados. También, es posible el análisis proteómico para valorar situaciones
como el momento del ciclo celular, la diferenciación, la función de la célula y las
respuestas a las agresiones que sufren las células, ya sean de forma aguda o de
forma crónica.
Las modificaciones de las proteínas inducidas por una enfermedad afectan sustan-
cialmente a la función, lo cual, a su vez, puede afectar a otras proteínas. Se pro-
duce un proceso dinámico de la expresión y modificaciones de las proteínas que
es el que trata de identificar y caracterizar la proteómica.
En general, las enfermedades no producen alteraciones de una única proteína,
sino de muchas proteínas celulares y, especialmente, los procesos agudos pro-
ducen variaciones de las modificaciones de las proteínas posteriores a la tra-
ducción. Los procesos crónicos, además de estas alteraciones de las modifica-
ciones de las proteínas posteriores a la traducción, producen también cambios
de la expresión de los genes y, como consecuencia, variaciones de las concen-
traciones de proteínas celulares. Por este motivo, es de gran utilidad el estudio
del proteoma.

18
Síntesis, estructura y función de las proteínas

Las proteínas son macromoléculas formadas por moléculas de bajo peso molecu-
lar: los aminoácidos. Las proteínas son la expresión de la información genética.
Con unos 25000 genes en el genoma humano y teniendo en cuenta que cada
gen puede dar lugar a muchas proteínas debido al corte y empalme alternativo y
a las modificaciones posteriores a la traducción, el número de proteínas diferentes
del ser humano puede considerarse al menos unas 10 veces mayor.
Las proteínas constituyen más del 50% del peso seco de las células y su abundan-
cia y diversidad son reflejo de la posición central que ocupan en prácticamente
todos los aspectos de la estructura y función de las células. La extraordinaria diver-
sidad de la actividad celular se debe a la enorme versatilidad de las proteínas,
cada una de ellas diseñada específicamente para la función que va a desempe-
ñar. Esta información se encuentra en los genes.

Síntesis

El proceso de síntesis de proteínas recibe el nombre de traducción. La información

almacenada en la molécula de ácido desoxirribonucleico (DNA) se transcribe a
una molécula de RNA mensajero (mRNA). Tras su procesado en el núcleo, la
molécula de mRNA se exporta al citoplasma a través de los poros de la membra-
na nuclear. En el citoplasma, el mRNA se une a los ribosomas donde se produce
la traducción, esto es, la formación de la molécula de proteína de acuerdo con la
información que transporta el mRNA.
La secuencia de aminoácidos de una proteína viene determinada por la secuencia
de nucleótidos del gen. Esta colinealidad entre la molécula de DNA y la molécula
de proteína se establece por medio del código genético. Los cuatro nucleótidos
distintos del DNA (A, G, C, T) se disponen en grupos de tres (tripletes) que reciben
el nombre de codones. La combinación de cuatro nucleótidos distintos en grupos
de tres da lugar a 64 codones diferentes. Cada codón especifica un aminoácido,
excepto tres codones (UAA, UAG y UGA) que no especifican ningún aminoácido
y que son codones de parada. Se dice que el código genético es parcialmente
degenerado debido a que la mayoría de los aminoácidos están codificados por
varios codones (Figura 1.1).

Figura 1.1. Código genético

19
 Los aminoácidos que van a incorporarse a la cadena polipeptídica que se está
formando se activan por su unión a un RNA de transferencia (tRNA) específico,
formando un aminoacil-tRNA. Durante la síntesis de proteínas, los aminoacil-tRNA
reconocen los codones mediante apareamiento de bases utilizando sus anticodo-
nes.
Los ribosomas son los lugares en los que se produce la síntesis de proteínas y están
formados por dos subunidades denominadas grande y pequeña. El proceso de
traducción tiene lugar en tres fases: iniciación, elongación y terminación. En la
iniciación se une el ribosoma a una zona específica del mRNA y se une también
el metionil-tRNA iniciador con el codón de iniciación AUG formándose el comple-
jo de iniciación 80S. Durante la fase de elongación se van leyendo los codones e
incorporándose los aminoácidos correspondientes. Cuando el ribosoma llega a un
codón de terminación se libera la cadena polipeptídica y se separa el mRNA y el
ribosoma.

Corte y empalme alternativo y edición del mRNA

Una de las primeras observaciones que se hicieron tras conocerse la secuencia del
genoma humano fue que el número de genes, que parece ser de unos 25000, es
mucho menor del que se había supuesto inicialmente de unos 100000. Sin em-
20
bargo, el número de proteínas parece ser bastante mayor. Esta disociación se
explica por los procesos que experimenta el mRNA recién sintetizado.
En los eucariotas, los genes están formados por fragmentos que se expresan (exo-
nes) interrumpidos por fragmentos que no se expresan (intrones). Tras el descubri-
miento en 1977 de los exones e intrones, Walter Gilbert propuso que podrían
cortarse y empalmarse diferentes combinaciones de exones a lo que llamó corte y
empalme alternativo, para dar diferentes isoformas de mRNA de un gen [13].
Parece ser que el 40-60% de los genes humanos experimentan procesos de corte
y empalme alternativo [14].
El corte y empalme alternativo puede afectar al mRNA de diferentes formas. Pue-
den incluirse exones enteros, alterarse las posiciones de los lugares 5´ o 3´ de los
lugares de corte y empalme o retenerse intrones que de otra forma estarían some-
tidos a escisión. El corte y empalme alternativo también puede influenciar el nivel
de la expresión proteica. Asimismo, la proteína puede truncarse por la introduc-
ción de un codón de parada.
Otra forma de generar un mayor número de proteínas es por la edición del
mRNA. Se trata de un proceso que modifica uno o varios nucleótidos de un
tránscrito de RNA por desaminación de una base, bien A → I (adenina a inosi-
na) o C → U (citosina a uracilo). Estas modificaciones alteran las posibilidades
codificadoras de un tránscrito ya que I se aparea con G (no con U como lo
hace A) y U se aparea con A (no con G como lo hace C). La edición del mRNA
aumenta la diversidad proteica alterando los aminoácidos codificados, introdu-
ciendo codones de parada prematuros o cambiando los lugares de corte y em-
palme de un tránscrito.

Modificaciones posteriores a la traducción

La mayoría de los polipéptidos que se sintetizan experimentan uno o más tipos de

modificaciones covalentes. Estas alteraciones que pueden tener lugar al mismo
tiempo que se produce la síntesis o posteriormente son reacciones que modifican
las cadenas laterales de residuos de aminoácidos específicos o rompen enlaces
específicos. De forma general, las modificaciones posteriores a la traducción (MPT)
preparan a las proteínas para su función y/o para el plegamiento a su conforma-
ción con actividad biológica.
Las MPT pueden clasificarse en tres categorías en base a los procesos siguientes:
rotura (procesamientos de prepéptidos y propéptidos, eliminación de la metionina
iniciadora, procesamiento C-terminal), enlace (unión de grupos químicos, desde
los sencillos como acetilo, metilo, fosforilo o hidroxilo, hasta entidades más com-
plejas como glucanos o lípidos) y entrecruzamientos (enlaces disulfuro, tioéter y
tioéster). Muchas MPT complejas surgen por rotura y enlace, como la unión del
glucosilfosfatidilinositol, el corte de inteína y el procesamiento «hedgehog». Ac-
21
tualmente, se conocen más de trescientas modificaciones diferentes y se siguen
descubriendo cada año algunas más.
Mientras que algunas MPT son absolutamente necesarias para la función de de-
terminadas proteínas, como las que forman o unen un cofactor, otras MPT pueden
considerarse como opcionales cuando dirigen una proteína hacia una localización
celular o regulan las interacciones proteína-proteína y célula-célula y el estado de
activación. Está claro que el estado de actividad de una proteína depende de su
estado de modificación. Incluso cuando la expresión de un gen es la misma en
dos situaciones, el estado de fosforilación puede determinar la activación o desac-
tivación de una determinada proteína.

Estructura

Las proteínas están formadas por aminoácidos unidos por medio de un enlace
peptídico entre el grupo amino de un aminoácido y el grupo carboxilo de otro. En
la Tabla 1.1 se da una lista de los aminoácidos proteicos con sus abreviaturas de
tres letras y de una letra. Las proteínas son moléculas muy complejas y para su
estudio los bioquímicos consideran cuatro niveles de organización estructural (Figu-
ra 1.2). La estructura primaria es la secuencia u orden de los aminoácidos en la
cadena y está especificada por la información genética. La estructura secundaria
es el plegamiento localizado de la cadena polipeptídica debido a los enlaces de
 Figura 1.2. Los cuatro niveles de estructura proteica

22 hidrógeno. Las dos principales estructuras secundarias son la hélice α y la lámina

plegada β. Algunos aminoácidos de las proteínas, como la prolina, la isoleucina,
el triptófano y la asparagina interrumpen las estructuras de hélice α. La mayor
parte de las proteínas globulares contienen combinaciones de estructuras secunda-
rias de hélice α y lámina plegada β. Estos patrones se denominan estructuras
supersecundarias. Algunas proteínas tienen hasta un 70% de estructura secundaria
y otras no tienen ninguna.

Tabla 1.1. Abreviaturas de los aminoácidos

A Ala Alanina M Met Meteonina
C Cys Cisteína N Asn Asparagina
D Asp Ácido aspártico P Pro Prolina
E Glu Ácodp glutámico Q Gln Glutamina
F Phe Fenilalanina R Arg Arginina
G Gly Glicina S Ser Serina
H His Histidina T Thr Treonina
I Ile Isoleucina V Val Valina
K Lys Lisina W Trp Triptófano
L Leu Leucina Y Tyr Tirosina
La estructura terciaria es la forma tridimensional que adquiere la cadena polipeptídica
en el espacio. El plegamiento proteico es un proceso que se produce como conse-
cuencia de las interacciones entre las cadenas laterales de los aminoácidos y hace
que una molécula desorganizada recién sintetizada adquiera una estructura muy or-
ganizada. La estructura terciaria se estabiliza por interacciones electrostáticas, fuerzas
débiles de Van der Waals, enlaces de hidrógeno, interacciones hidrófobas y, en
algunas proteínas, enlaces disulfuro. Los aminoácidos se sitúan de acuerdo con la
polaridad de sus cadenas laterales, de forma que los apolares suelen colocarse en el
interior de la molécula, lejos del contacto con el ambiente acuoso, mientras que los
polares se sitúan en la superficie de la molécula en contacto con el ambiente acuoso.
La estructura cuaternaria corresponde a las asociaciones de dos o más cadenas
polipeptídicas o subunidades. Estas pueden ser idénticas o diferentes.

Funciones

Las proteínas se encuentran implicadas en prácticamente todos los procesos celula-

res, por lo que sus funciones son muy variadas. Las principales son: catalíticas,
estructurales, movimiento, defensa, regulación y transporte.
Con diferencia, el grupo más grande de proteínas son las enzimas que actúan
como catalizadores de las reacciones que tienen lugar en las células. Muchas
23
proteínas actúan como elementos estructurales que definen y mantienen diferentes
estructuras celulares y orgánicas. Aunque se trata de una función aparentemente
pasiva es de gran importancia ya que, en general, las proteínas estructurales pro-
porcionan resistencia y protección a las células y tejidos. El colágeno, la proteína
más abundante del organismo, es el componente principal del tejido conjuntivo,
que une los tejidos. Otra proteína estructural es la elastina que se encuentra en
varios tejidos del organismo, como los vasos sanguíneos y la piel. Determinadas
proteínas proporcionan a la célula capacidad de movimiento. Algunas de las
formas por medio de las cuales se ejecuta el movimiento son la división celular, la
contracción muscular y el movimiento de las células. Entre las proteínas que parti-
cipan en el movimiento se encuentran la tubulina y la actina. Un grupo importante
de proteínas presente en los seres vivos son las inmunoglobulinas o anticuerpos,
que forman parte del sistema de defensa de los organismos superiores para hacer
frente a la invasión por sustancias extrañas. Diversas proteínas regulan la capaci-
dad de otras para llevar a cabo sus funciones fisiológicas. Entre las proteínas
reguladoras están las hormonas y los factores de transcripción. Finalmente, en la
naturaleza se encuentra un grupo de proteínas encargadas del transporte de de-
terminadas moléculas de un lugar a otro del organismo. Como ejemplos, la hemo-
globina de los eritrocitos encargada de transportar el oxígeno desde los pulmones
hasta las células y la transferrina y la ceruloplasmina que son proteínas séricas que
transportan, respectivamente, hierro y cobre.
 Tecnologías proteómicas

Los estudios proteómicos utilizan dos tipos de planteamientos tecnológicos. Por un

lado, la combinación de una técnica de separación de proteínas, con un método
de identificación de las proteínas separadas y por el otro las micromatrices protei-
cas.
Hasta ahora la técnica predominante de separación de proteínas para los estudios
proteómicos es la electroforesis bidimensional en gel de poliacrilamida (2D-PAGE)
que separa las proteínas de acuerdo con su punto isoeléctrico (pI) y su tamaño. Las
proteínas separadas se hidrolizan con tripsina y se identifican por espectrometría
de masas, bien a través de sus huellas de masas (fingerprint) o bien por medio de
la secuenciación de los péptidos e identificación de las proteínas correspondientes
en bases de datos. En los últimos años se están aplicando cada vez más las técni-
cas de separación denominadas multidimensionales que combinan diversas técni-
cas cromatográficas o cromatografía y electroforesis capilar. Estas técnicas de
separación pueden aplicarse para separar directamente las proteínas de la mues-
tra o pueden aplicarse para la separación de los péptidos que son el resultado de
la hidrólisis con tripsina de las proteínas de la muestra. La principal ventaja de
estas técnicas multidimensionales es que pueden acoplarse directamente en línea
con los espectrómetros de masas.
24
La otra tecnología que se utiliza en los estudios proteómicos son las micromatrices
proteicas. En ellas se inmovilizan moléculas que van a actuar como captoras de
las proteínas que quieren detectarse. La incubación de la micromatriz con las
muestras produce la unión que posteriormente se pone de manifiesto utilizando
métodos sin marcaje o empleando sondas marcadas.

Estrategias proteómicas

Los estudios proteómicos se han dividido en dos clases que se denominan «de
arriba-abajo» y «de abajo-arriba» de acuerdo con la estrategia empleada [15]. En
los planteamientos de arriba-abajo se intenta separar el mayor número posible de
proteínas intactas utilizando técnicas como la electroforesis bidimensional en gel o
los sistemas multidimensionales. Una vez separadas las proteínas se hidrolizan por
tratamiento con tripsina y se analizan los péptidos resultantes por espectrometría
de masas para tratar de identificar las proteínas empleando bases de datos pro-
teicas.
En el otro lado, los planteamientos de abajo-arriba, que también reciben el
nombre de proteómica de escopetazo (shotgun), separación multidimensional
MS/MS o tecnología multidimensional de identificación de proteínas (multidi-
mensional protein identification technology o MudPIT), comienzan con el trata-
miento de la muestra con tripsina para hidrolizar todas las proteínas. Los pépti-
dos resultantes se separan por cromatografía multidimensional y se secuencian
por espectrometría de masas tandem (MS/MS). Los péptidos secuenciados se
emplean para realizar búsquedas en bases de datos e identificar las proteínas
de la muestra original.
Ambos enfoques proteómicos tienen ventajas e inconvenientes. La ventaja principal
de los de arriba-abajo son que proporcionan información sobre las cantidades de
las proteínas y su estructura. La principal ventaja de los de abajo-arriba es la ma-
yor resolución de las separaciones cromatográficas de los péptidos comparado
con las proteínas.

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26
 Capítulo 2

Tratamiento de las muestras

para los estudios proteómicos

Introducción

La preparación de la muestra antes de comenzar su análisis es uno de los puntos

críticos en los estudios proteómicos. Esta preparación debe ser lo más simple posible
para aumentar la reproducibilidad. Asimismo, debe procurarse que durante la pre-
paración de la muestra las proteínas sufran las menores modificaciones posibles. El
protocolo de preparación óptimo debe determinarse de forma empírica debido a la
gran diversidad de tipos de muestras que se emplean en los estudios proteómicos.
Un paso fundamental en muchos estudios proteómicos es el fraccionamiento previo
de la muestra, debido principalmente a que el intervalo de concentraciones de las 27
proteínas es muy grande en la mayoría de los medios biológicos. Así, en el suero
o plasma sanguíneo es de hasta 12 órdenes de magnitud, mientras que en los
tejidos o cultivos celulares suele ser menor, llegando como mucho a 8 órdenes de
magnitud. La eliminación selectiva de las proteínas más abundantes permite visua-
lizar y detectar mejor las proteínas menos abundantes. Otra de las razones para el
fraccionamiento previo de las muestras es la gran diferencia de propiedades de
las proteínas, como la masa, el punto isoeléctrico, el grado de hidrofobicidad y
las modificaciones posteriores a la traducción.
En este Capítulo se presentan las ideas generales sobre la preparación de las
muestras para los estudios proteómicos teniendo en cuenta las diferentes peculiari-
dades de cada tipo de muestra.

Muestras de tejidos

Los tres pasos principales en la preparación de las muestras de tejidos son la rotu-
ra de las células, la inactivación o eliminación de las sustancias que interfieren y la
solubilización de las proteínas [1]. En muchas ocasiones interesa analizar el pro-
teoma de algún orgánulo, como el núcleo, las mitocondrias o el complejo de
Golgi. En estos casos hay que hacer un fraccionamiento subcelular de la muestra,
que se realiza principalmente por centrifugación diferencial.
 Rotura de las células

La elección del método de rotura de las células depende de la procedencia de la

muestra, que puede ser una suspensión celular, un tejido sólido u otro tipo de
material biológico. La rotura de las células puede realizarse por lisis osmótica,
ciclos de congelación-descongelación, lisis con detergentes, lisis enzimática de la
pared celular, sonicación, pulverización con o sin nitrógeno líquido, presiones
elevadas, homogeneización con bolas de vidrio y una trituradora, cavitación con
nitrógeno u homogeneización con cuchillas rotadoras. Estos métodos pueden
emplearse de forma individual o combinados.

Desactivación o eliminación de las sustancias que interfieren

Las proteasas de los tejidos deben ser desactivadas para evitar la degradación
proteica y la pérdida de proteínas de peso molecular elevado. Las proteasas pue-
den inhibirse utilizando en la rotura de las células desnaturalizantes fuertes como
urea 8M, ácido tricloroacético al 10% o dodecil sulfato sódico al 2%. También
debe realizarse la preparación de la muestra a bajas temperaturas en las que son
menos activas las proteasas. Esta estrategia suele proporcionar una protección
suficiente frente a la proteolisis. Sin embargo, debe tenerse en cuenta que es bas-
28
tante difícil desactivar todas las proteasas. Algunas proteasas pueden retener su
actividad incluso en estas condiciones y en estos casos hay que utilizar inhibidores
específicos de las proteasas. Los inhibidores individuales de las proteasas sólo son
activos frente a clases específicas de proteasas, por lo que suelen emplearse di-
versas combinaciones de inhibidores. En la Tabla 2.1 se da una relación de los
principales inhibidores de las proteasas y las enzimas que inhiben.

Tabla 2.1. Inhibidores de las proteasas.

Inhibidor Enzimas que inhibe
PMSF (Fluoruro de fenilmetilsulfonilo) Serina proteasas, algunas cisteína proteasas
AEBSF (Fluoruro de aminoetil bencilsulfonilo) Serina proteasas, algunas cisteína proteasas
EDTA o EGTA Meataloproteasas
Peptidos inhibidores de proteasas
Leupeptina Serina y cisteína proteasas
Pepstatina Aspartil proteasas
Aprotinina Serina proteasas
Bestatina Aminopeptidasas
TLCK (Tosil lisina clorometil cetona) y TPCK (Tosil Serina y cisteína proteasas
fenilalanina clorometil cetona)
Benzamida Serina proteasas
Los iones salinos pueden interferir con la separación electroforética y deben elimi-
narse cuando su concentración sea excesivamente elevada (> 100 mM). La elimi-
nación de las sales puede conseguirse mediante diálisis, precipitación de las
proteínas y con sistemas de filtración como el Amicon.

Precipitación proteica

La precipitación proteica es un paso opcional en la preparación de la muestra

para la electroforesis bidimensional. Como se ha señalado la precipitación segui-
da de la resuspensión normalmente se emplea para separar de forma selectiva las
proteínas de la muestra de las especies contaminantes como las sales, los deter-
gentes, los ácidos nucleicos, los lípidos, etc. que podrían interferir con la 2D–
PAGE. Sin embargo, debe tenerse cuidado cuando se emplee un paso de preci-
tación por las posibles pérdidas.
Los principales métodos de precipitación utilizan el sulfato amónico, el ácido triclo-
roacético, la acetona, la combinación de ácido tricloroacético y acetona y el
acetato amónico en metanol seguido de la extracción con fenol.
Se han comercializado equipos de reactivos de precipitación para preparar las
muestras para 2D-PAGE. Entre ellos se encuentra el 2D Clean-Up kit (Amersham
Biosciences). Este equipo utiliza una combinación de precipitante y co-precipitante
29
para precipitar de forma cuantitativa las proteínas de la muestra al tiempo que se
dejan en la disolución las sustancias interferentes. Las proteínas se compactan por
centrifugación y el precipitado se lava para eliminar aún más los contaminantes no
proteicos. La muestra se centrifuga de nuevo y se resuspenden las proteínas.

Otros métodos para eliminar los contaminantes

Los polisacáridos, especialmente los que tienen cargas, y los ácidos nucleicos
pueden interaccionar con los anfolitos portadores y las proteínas y dar lugar a
patrones 2D «rayados». Además, estas macromoléculas también pueden incremen-
tar la viscosidad de las disoluciones y obstruir los poros de los geles de poliacrila-
mida. Los polisacáridos pueden eliminarse con la precipitación con ácido triclo-
roacético, sulfato amónico o acetona y los ácidos nucleicos tratando la muestra
con una mezcla de DNasa/RNasa sin proteasas.

Solubilización de las proteínas

Tras la rotura de las células y/o la eliminación de los compuestos que interfieren,
los polipéptidos individuales deben desnaturalizarse y reducirse para romper las
interacciones intramoleculares e intermoleculares y hacerlos solubles al tiempo que
se mantienen las propiedades de carga propias.
 La solubilización suele conseguirse empleando agentes desnaturalizantes, deter-
gentes y agentes reductores. A continuación se señalan algunas de estas sustan-
cias que se emplean en los estudios proteómicos.

1. Agentes desnaturalizantes. Normalmente se utiliza la urea a concentraciones

elevadas (8M), aunque se ha visto que la tiourea en combinación con la urea
mejora la solubilización, especialmente con proteínas de membrana [2].
2. Detergentes no iónicos o iónicos dobles. Siempre se incluyen en la solución de
la muestra para asegurar una completa solubilización de la misma y evitar
agregaciones a través de interacciones hidrófobas. El Triton X-100 o el NP40
suelen utilizarse como detergente iónico y CHAPS (ácido 3-[(3-
cloroamidopropil)diemtilamonio]-1-propanesulfónico) como detergente iónico
doble.
3. Agentes reductores. Rompen los enlaces disulfuro presentes en las proteínas y
las mantienen en su estado plenamente reducido. Suele utilizarse el ditiotreitol
(DTT) con un intervalo de concentración de 20 a 100 mM, aunque también
pueden emplearse el ditioeritrol (DTE), el 2-mercaptoetanol o el TBP.

Fraccionamiento subcelular
30
El fraccionamiento subcelular es un paso esencial en las técnicas proteómicas, de
especial importancia para el análisis de los orgánulos intracelulares y de los com-
plejos multiproteicos.
La centrifugación es el método más eficaz para el aislamiento de los orgánulos
subcelulares [3,4]. La pureza de los orgánulos aislados es esencial para el análisis
completo de los proteomas de los orgánulos. Los núcleos se obtienen por una
centrifugación a baja velocidad (600g) junto con residuos celulares, células intac-
tas y algunos componentes subcelulares más grandes. Los núcleos pueden purifi-
carse a partir del sedimento. El sobrenadante post-nuclear contiene el citosol y el
resto de los orgánulos en suspensión. Estos pueden separarse por centrifugación
en gradiente de densidad. Aunque las densidades relativas de las fracciones
dependen de las diferencias de composición de los componentes subcelulares, el
grado de separación obtenido depende también de la naturaleza del medio de
gradiente utilizado. La sacarosa es el medio más empleado, aunque también se
ha usado el Ficoll. También se han utilizado para estudiar los orgánulos otras
técnicas como la electroforesis libre de flujo o las técnicas inmunológicas.
Métodos para eliminar las proteínas más abundantes en los
homogeneizados tisulares

Debido al enmascaramiento que producen las proteínas más abundantes sobre las
menos abundantes, el análisis proteómico eficaz requiere la separación de las
proteínas abundantes para llevar a las menos abundantes al intervalo detectable.
Esto mejora la resolución cuando se analiza una fracción individual, proporciona
mapas 2D menos atestados de manchas, simplifica el análisis y la interpretación y
aumenta la probabilidad de descubrir proteínas nuevas de interés diagnóstico o
terapéutico.
La extracción secuencial de las proteínas de las células o los tejidos, de acuerdo
con su solubilidad es una posibilidad de enriquecer determinadas clases de pro-
teínas y simplificar el patrón de electroforesis bidimensional para el posterior análi-
sis de imagen e identificación proteica por espectrometría de masas. También se
ha empleado la cromatografía de afinidad para enriquecer las proteínas poco
abundantes.

Cuantificación de las proteínas

La electroforesis de las muestras proteicas requiere la cuantificación exacta de la

31
muestra para garantizar que se carga la cantidad adecuada de proteína. Ade-
más, la cuantificación exacta facilita la comparación entre muestras semejantes al
permitir cargar cantidades idénticas de proteína. Los métodos espectrofotométricos
más utilizados son el de Lowry y el de Bradford.

Muestras de plasma/suero sanguínero

Obtención de la muestra

Existen pocos estudios con relación a las condiciones de obtención del plas-
ma/suero para los estudios proteómicos. El Proyecto del Proteoma Plasmático
Humano de la HUPO estableció en 2002 un Comité de Especímenes para tratar
los temas del manejo de las muestras. Se ha publicado un informe con los resulta-
dos preliminares [5]. En él se señala la dificultad para definir una única lista de
estándares pre-analíticos para las muestras y su procesamiento, debido al amplio
espectro de técnicas analíticas que se utilizan en los estudios proteómicos. No
obstante, en el informe se indican algunos puntos observados, que son: (1) para
determinados estudios peptidómicos es preferible el plasma pobre en plaquetas al
suero; (2) las muestras deben repartirse el alícuotas y almacenarse preferiblemente
en nitrógeno líquido; (3) se recomienda la adición de inhibidores de las proteasas,
 pero deben incorporarse pronto y de forma juiciosa, ya que algunos forman aduc-
tos proteicos inespecíficos y otros interfieren con los estudios peptídicos; (4) el
seguimiento diligente de las variables pre-analíticas y (5) se recomienda el uso de
materiales de referencia para el control de la calidad.
West-Nielsen et al [6] han evaluado el proceso de manipulación de las muestras
de suero para los estudios proteómicos. Sus resultados indican que son factores
importantes el tiempo y la temperatura de coagulación de la sangre. El suero se
afecta cuando se deja que coagule durante más de 3 horas a temperatura am-
biente o más de 24 horas a 4.ºC. Asimismo, el almacenamiento del suero es
perjudicial si excede de 4 horas a temperatura ambiente o 24 horas a 4.ºC. No
obtienen datos que indiquen que sea preferible almacenarlo a –80.ºC que a –
20.ºC, ya que sus experimentos duraron sólo 7-14 días. También, han observado
que los ciclos de descongelación/congelación tienen poco efecto sobre la
estabilidad del suero.

Eliminación/enriquecimiento

El plasma sanguíneo presenta una variación muy grande de la concentración de

cada una de las proteínas que contiene. Así, la albúmina es 109 veces más
abundante que la troponina I. Un pequeño número de proteínas, incluyendo la
32
albúmina, las inmunoglobulinas, la transferrina, las haptoglobinas, la α1-
antitripsina y la α1-glucoproteína, constituyen hasta el 80% de todas las proteínas
del plasma sanguíneo [7]. Las 22 proteínas más abundantes (en concentraciones
de mg/mL) constituyen más del 99% de la masa de las proteínas plasmáticas
totales. El 1% restante, presumiblemente la población con interés biológico está
compuesta por miles de tipos de proteínas muy poco abundantes. Los órdenes
de magnitud de 10 o superiores limitan la capacidad de la espectrometría de
masas para detectar de forma eficaz las especies menos abundantes. Por lo
tanto, la eliminación de las proteínas muy abundantes es un paso crítico en la
obtención de un perfil proteómico plasmático, al expandir el intervalo de concen-
traciones que pueden detectarse.
La mayoría de los intentos de separar/eliminar las proteínas más abundantes del
plasma se han centrado en la albúmina, la proteína más abundante del plasma
con un 45-55% de todas las proteínas de éste y las inmunoglobulinas, que repre-
sentan aproximadamente el 15% de todas las proteínas del plasma. La elimina-
ción/reducción de estas dos proteínas abundantes suprimirá aproximadamente el
70% de todas las proteínas del plasma, lo que hace más fácil analizar las proteí-
nas menos abundantes.
Se han presentado varios métodos para eliminar/reducir las proteínas más abun-
dantes del plasma sanguíneo para los estudios proteómicos [8]; los principales son
los que utilizan colorantes como el azul de Cibacron [9] y los que emplean anti-
cuerpos, como el sistema múltiple de eliminación de afinidad (multiple affinity
removal system, MARS) [10] y los equipos con microcuentas de IgY [11].
Las técnicas basadas en colorantes al mismo tiempo que unen la mayoría de la
albúmina, también unen un gran número de proteínas inespecíficas, dando lugar a
pérdidas. Esta unión inespecífica probablemente incluye tanto proteínas que se
ligan al colorante como proteínas menores que se pegan a la albúmina. El azul de
Cibacron y otros colorantes se unen a las proteínas con dominios de unión nu-
cleados, así como a través de interacciones hidrófobas. Además, los amortiguado-
res que suelen utilizarse con estos colorantes no disocian las proteínas minoritarias
que están acomplejadas con la albúmina [12].
Las proteínas A o G se emplean para eliminar las inmunoglobulinas al unirse a la
región Fc de las mismas [13,14]. Estas proteínas pueden no unir todos los subgru-
pos de inmunoglobulinas dejando, de esta forma, parte de estas proteínas tan
heterogéneas.
Varios dispositivos y métodos de separación de proteínas que emplean reactivos
de captura de afinidad son capaces de unir y eliminar dianas específicas. Entre
estas técnicas, la captura por inmunoafinidad que utiliza anticuerpos es la estrate-
gia clásica, eficaz y más fiable que evita el efecto enmascarador de las proteínas
muy abundantes sobre las proteínas poco abundantes y permite una identificación
más completa de las proteínas poco abundantes. Se ha presentado un sistema con
33
microcuentas IgY que contiene anticuerpos frente a las 12 proteínas más abundan-
tes del plasma (albúmina, IgG, transferrina, α1-antitripsina, IgA, IgM, α2-
macroglobulina, haptoglobina, apo AI, apo AIII, α1-glucoproteína ácida y fibrinó-
geno) [11].
Recientemente, Agilent Technologies ha presentado un sistema de eliminación
múltiple de afinidad que une y retiene 6 proteínas muy abundantes (albúmina,
IgG, IgA, transferrina, α1-antitripsina y haptoglobina) en un paso. Asimismo, Se-
ppro ha presentado una columna de HPLC para separar las doce proteínas plas-
máticas más abundantes. Un estudio reciente de estos dos sistemas indica que las
proteínas muy abundantes actúan como transportadoras que interaccionan con
algunas especies poco abundantes de bajo peso molecular, de forma que las
estrategias de depleción inevitablemente eliminan algunas moléculas [15]. Ade-
más, demuestran que el análisis no sólo de la fracción que eluye, sino también de
la que queda unida a la columna, es una estrategia complementaria para obtener
un perfil más completo del proteoma plasmático [15].
Ettore et al [16] han presentado un nuevo método de depleción de proteínas ba-
sado en la incubación de las muestras de suero con fragmentos de anticuerpos
recombinantes procedentes de fagos, capaces de unirse a la proteína A de estafi-
lococos y que llevan un péptido C-terminal capaz de unirse a estreptavidina. Los
complejos antígeno-anticuerpo resultantes pueden separarse por la captura simul-
tánea sobre resina de proteína A y/o estreptavidina. La metodología presentada
 es modular, ya que pueden unirse varios anticuerpos recombinantes en un único
experimento de depleción. Además, los anticuerpos no tienen que acoplarse cova-
lentemente a un soporte sólido facilitando su almacenamiento.
El Gradiflow BF4000 es un sistema de separación electroforética de proteínas que
emplea membranas. Utiliza la carga y el tamaño inherente de las proteínas para
fraccionar las muestras a través de una membrana sin carga. Así pues, el Gradi-
flow procesa y purifica soluciones proteicas de acuerdo con diferencias de movili-
dad, pI y tamaño. Corthals et al [17] adaptaron el Gradiflow para el prefraccio-
namiento del suero humano y el enriquecimiento de las fracciones proteicas. Más
recientemente se ha realizado un estudio utilizando el Gradiflow, que forma parte
del Proyecto del Proteoma Plasmático (PPP) organizado por la HUPO, en el que se
trataba de eliminar la albúmina separando las muestras de plasma o suero en
cuatro fracciones proteicas: la primera con proteínas con un pI mayor que la al-
búmina, la segunda con proteínas con un pI< 5.25 pero con peso molecular (PM)
>125 kDa, la tercera con proteínas con un pI<5.25 pero con un PM menor que el
de la albúmina y la cuarta era la fracción enriquecida con la albúmina [18].

Pre-fraccionamiento

Se han propuesto diversos sistemas para realizar pre-fraccionamientos del plasma

34
de forma que se estudien mejor las proteínas con unas características determina-
das. El sistema MCE (multichannel electrolyte; electrolito multicanal) fracciona las
muestras proteicas complejas de acuerdo con el pH en varias cámaras de electro-
dos separadas por membranas isoeléctricas que pueden ajustarse con intervalos
de pH específicos [19]. Este sistema no se ha aplicado aún de forma importante
al plasma humano ya que requiere un volumen elevado de muestra. El ZOOM IEF
Fractionator (Invitrogen) es un sistema de enfoque isoeléctrico con varias cámaras
separadas que se ha aplicado al fraccionamiento del suero [20]. La electroforesis
de flujo libre (free flow electrophoresis, FFE) es un procedimiento continuo que
actúa en ausencia de una fase estacionaria o soporte sólido. La FFE separa partí-
culas cargadas con tamaños que van desde las dimensiones moleculares a las
celulares de acuerdo con su movilidad electroforética o el pI donde el amortigua-
dor que fluye libremente de forma vertical mantiene un gradiente de pH a través
de una única cámara de enfoque.
También se han empleado las membranas como método de eliminación de deter-
minadas proteínas. Por ejemplo, pueden separarse las proteínas de bajo peso
molecular (BPM) de las proteínas de alto peso molecular (APM). En estos sistemas
suele emplearse la ultrafiltración centrífuga [21]. Tanaka et al [22] han descrito un
planteamiento nuevo para descubrir las proteínas que se encuentran en las meno-
res concentraciones en el plasma. Utilizan un sistema de membranas de fibra
hueca y un sistema 3D-LC antes de la espectrometría de masas. El sistema de
membranas es totalmente automático y puede separar y concentrar las proteínas
de BPM del suero en 1 hora.

Muestras de orina

La orina normal tiene una concentración de proteínas muy diluida, con un alto
contenido de sales y otras sustancias de bajo peso molecular que interfieren con
los análisis proteómicos. La preparación de la muestra es por lo tanto un paso
crucial en los estudios proteómicos en orina, principalmente en aquellos estudios
que utilizan electroforesis bidimensional en gel de poliacrilamida para ais-
lar/concentrar las proteínas de la orina y para eliminar las sales que interfieren.
Pueden utilizarse varios protocolos para aislar/concentrar las proteínas de la ori-
na. Los que se utilizan con más frecuencia son la precipitación, la liofilización, la
ultracentrifugación y la filtración por centrifugación. La diálisis de las proteínas de
la orina y la concentración por liofilización mejora de forma significativa la repro-
ducibilidad y la resolución y probablemente refleja todas las proteínas de la orina
en los geles 2D [23].
Se ha publicado recientemente una evaluación sistemática de los métodos de
preparación de la muestra para los estudios proteómicos de la orina humana
35
utilizando geles bidimensionales [24], en donde se han analizado dos variables
principales: la cantidad (recuperación de proteína) y la calidad (patrones de man-
chas 2D o perfiles proteómicos). Las conclusiones alcanzadas son que no hay un
único protocolo perfecto que pueda utilizarse para examinar el proteoma completo
de la orina ya que cada método tiene ventajas y desventajas con relación a los
demás. Es necesaria la combinación de varios métodos de preparación de la
muestra para obtener la mayor cantidad de información cuantitativa y cualitativa.
Otro tema que hay que considerar en los estudios de proteómica de la orina es el
tiempo durante el que se recoge la muestra. Los especimenes de orina que se
utilizan en los laboratorios clínicos básicamente son de tres tipos: primera hora de
la mañana, aleatorio y de un tiempo determinado. Ha habido mucha discusión
sobre cual es la muestra más adecuada para estudiar las proteínas de la orina. En
la mayoría de los estudios de proteómica revisados, las muestras empleadas fue-
ron de primera hora de la mañana o aleatorias.

Muestras de líquido cefalorraquídeo

El líquido cefalorraquídeo (LCR) contiene una concentración de proteínas baja

(200-700 µg/mL) y una concentración salina elevada (>150 nmol/L). Así pues,
es necesario enriquecer las proteínas y eliminar las sales antes de la 2D-PAGE. Se
 han empleado cuatro métodos diferentes de desalinización: ultrafiltración, diálisis,
precipitación de proteínas y columnas Bio-Spin. De todos estos métodos, las co-
lumnas Bio-Spin son las que proporcionan mejor recuperación proteica y resolu-
ción en el gel [25]. Estas columnas contienen un gel de poliacrilamida con un
tamaño de corte de 6 kDa. Tras la centrifugación, las sales y otras impurezas con
un tamaño menor de 6 kDa quedan unidas a la columna, mientras que los pépti-
dos y las proteínas mayores de 6 kDa eluyen de la columna.
Para estudiar las proteínas poco abundantes del LCR debe fraccionarse previamen-
te. Se han utilizado las interacciones de afinidad entre la albúmina y el Cibacron
Blue y la proteína G y las inmunoglobulinas para eliminar la albúmina y las IgG,
respectivamente [26]. Los equipos comerciales de eliminación de albúmina dise-
ñados específicamente para el suero necesitan modificarse de forma específica y
optimizarse para que puedan ser utilizados para el LCR. Se ha empleado también
el enfoque isoeléctrico en fase líquida [27] y la extracción en fase sólida [28]
para fraccionar previamente el LCR.

Enriquecimientos previos

Con frecuencia y para realizar determinados tipos de estudios es conveniente

36
enriquecer algún tipo de fracción proteica. A continuación se indican algunos de
estos enriquecimientos.

Proteínas hidrófobas y básicas poco abundantes

Las proteínas hidrófobas normalmente se pierden durante la preparación de la

muestra, durante la entrada de las proteínas en los geles IPG o durante el enfoque
cuando las proteínas alcanzan sus puntos isoeléctricos. Se han conseguido mejo-
ras en la solubilización de las proteínas para la primera dimensión utilizando
agentes reductores más eficaces [29] y potentes caotropos y surfactantes [29,30].
Además, los procedimientos de extracción secuencial que incorporan estos agen-
tes para solubilizar y las técnicas cromatográficas hidrófobas han permitido la
separación y detección de proteínas hidrófobas en lisados celulares [31].

Análisis de fosfoproteínas

Para enriquecer las fosfoproteínas mediante inmunoprecipitación a partir de lisados

celulares complejos pueden emplearse anticuerpos específicos frente a aminoáci-
dos fosforilados [32]. Una alternativa nueva y muy prometedora a los anticuerpos
fosfoespecíficos es un sistema de purificación comercial de fosfoproteínas que
utiliza un paso de fosfoafinidad para aislar las fosfoproteínas intactas.
El aislamiento/enriquecimiento de péptidos fosforilados a partir de digeridos pro-
teicos es un paso crucial para la secuenciación e identificación de péptidos de los
lugares de fosforilación por MS. Puede hacerse por cromatografía de afinidad de
metales iónicos inmovilizados [33].
La derivatización química del grupo modificador potencialmente permite la unión
de un marcaje para la purificación de afinidad. Se han presentado varios métodos
que utilizan la modificación química de los fosfatos como estrategia para enrique-
cer los fosfopéptidos a partir de mezclas complejas [34].

Análisis de glucoproteínas

Para el enriquecimiento de glucoproteínas y glucopéptidos se emplean lectinas,

que son proteínas que unen hidratos de carbono con estructuras específicas. Las
principales lectinas empleadas son la concanavalina A y la aglutinina de germen
de trigo. Además de las ventajas de reducir la complejidad de las muestras, la
especificidad de las diferentes lectinas por distintos azúcares puede indicar las
características importantes de las cadenas de hidratos de carbono de las glucopro-
teínas.
Bunkenborg et al [35] han presentado un procedimiento para cartografiar los
lugares de N-glicosilación en mezclas complejas reduciendo su complejidad y
37
enriqueciendo las glucoproteínas. Las proteínas glucosiladas se seleccionaron por
un paso cromatográfico inicial con lectina y se hidrolizaron con endoproteinasa
Lys-C. Los péptidos glucosilados se seleccionaron posteriormente de la mezcla
hidrolizada por un segundo paso cromatográfico con lectina. Con este procedi-
miento identificaron 86 lugares de N-glicosilación en 71 proteínas del suero hu-
mano.

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40
 Capítulo 3

Elctroforesis bidimensional

Introducción

La electroforesis bidimensional es una técnica analítica con una gran capacidad

de separación, que permite analizar mezclas proteicas complejas de células,
tejidos y líquidos biológicos. Esta técnica separa las proteínas de acuerdo con dos
propiedades independientes en dos pasos separados. En este Capítulo se presen-
tan las principales características de la electroforesis bidimensional en su aplica-
ción a los estudios proteómicos.
41

Conceptos generales sobre electroforesis

Se denomina electroforesis al transporte de partículas cargadas en un campo

eléctrico. Es una técnica analítica que separa las partículas cargadas de acuerdo
con su velocidad de migración. La movilidad electroforética de una molécula
depende directamente de su carga e inversamente del coeficiente de rozamiento
que, a su vez, depende directamente del tamaño y la forma de la molécula y la
viscosidad del medio. La migración de las partículas depende del pH del medio
en que se encuentren, ya que su carga neta depende del pH.
El amortiguador que se utiliza en las separaciones electroforéticas ejerce dos fun-
ciones: por un lado lleva la carga eléctrica y, por otro, determina la carga neta de
las moléculas que se separan y, por ende, la dirección de la migración electroforé-
tica. La fuerza iónica del amortiguador determina la anchura de la nube iónica
que rodea a las moléculas cargadas. Cuanto mayor es la fuerza iónica, más
estrechas son las bandas de separación. Sin embargo, mucha fuerza iónica pro-
duce un calentamiento mayor y tal vez la desnaturalización de las sustancias que
van a separarse, por lo que hay que llegar a una solución de compromiso.
La electroforesis en un medio líquido recibe el nombre de electroforesis libre, mien-
tras que la que se realiza empleando un soporte sólido, recibe el nombre de elec-
troforesis de zona. En el medio electroforético, los soportes inertes producen sepa-
 raciones más nítidas pues evitan las corrientes de convección debidas al calenta-
miento durante la electroforesis libre. Los principales soportes para la electroforesis
son el papel, las membranas de acetato de celulosa y los geles de agar, agarosa,
almidón y poliacrilamida.
Uno de los problemas de la electroforesis de zona es el flujo electroendosmótico,
que se debe a la presencia de grupos cargados sobre la superficie del medio de
separación. Por ejemplo, la agarosa tiene grupos sulfato y la superficie de las
paredes de vidrio que se utiliza en la electroforesis capilar contiene grupos silanol
(Si-OH). Los iones positivos del amortiguador forman nubes de carga alrededor de
las cargas negativas inmóviles de los soportes. Cuando se aplica la corriente
eléctrica, mientras las cargas negativas permanecen fijas, las cargas positivas,
muy hidratadas, se mueven hacia el polo opuesto, lo que produce el movimiento
del disolvente. Las macromoléculas, como las proteínas, que se mueven en la
dirección contraria deben hacer frente a este flujo de iones positivos hidratados.
Cuando la carga neta de la macromolécula es pequeña pueden quedar inmóviles
e incluso ir hacia el polo opuesto.

Electroforesis en acetato de celulosa

Las membranas de acetato de celulosa se utilizan mucho en los laboratorios clíni-

42
cos por su fácil manipulación y la rapidez de sus separaciones electroforéticas. Su
aplicación principal es separar las proteínas del suero, el llamado «proteinogra-
ma». La electroforesis en acetato de celulosa separa las proteínas del suero en
cinco fracciones, que son la albúmina y las globulinas α1, α2, β y γ.

Electroforesis en gel

Los geles de agarosa, almidón y poliacrilamida no son sólo soportes que evitan la
difusión, ya que al modificar la concentración de los componentes que forman el
gel, pueden conseguirse diferentes porosidades y la separación, además de por
diferencias de carga, se produce también por diferencias de tamaño.
Los geles de poliacrilamida se forman polimerizando el monómero acrilamida y el
co-monómero de entrecruzamiento bisacrilamida. Variando las concentraciones del
monómero y el co-monómero de entrecruzamiento se consiguen geles de poliacri-
lamida con poros de tamaño amplio, cuya amplitud puede ajustarse para optimi-
zar la separación de los componentes de la muestra. Los geles de poliacrimalida
pueden prepararse con un contenido de acrilamida entre el 3 y el 30%.
Figura 3.1. electroforesis bidimensional

43

Electroforesis bidimensional

La electroforesis bidimensional es aquella que se realiza en dos dimensiones.

Normalmente, se utiliza el enfoque isoeléctrico (IEF) en la primera dimensión y la
electroforesis en gel de acrilamida con dodecil sulfato sódico (SDS-PAGE) en la
segunda dimensión. Por medio del IEF las proteínas se separan según su punto
isoeléctrico y con la SDS-PAGE se separan de acuerdo con su masa molecular.
De esta forma, tras la electroforesis bidimensional en gel de poliacrilamida (2D–
PAGE) tenemos un mapa proteico en el que las coordenadas de cada proteína
corresponden a su punto isoeléctrico y su masa molecular (Figura 3.1). Depen-
diendo del tamaño del gel y del gradiente de pH utilizado, la 2D-PAGE puede
 resolver más de 5000 proteínas simultáneamente (∼ 2000 proteínas rutinaria-
mente) y puede detectar < 1 ng de proteína por mancha. Otra de las grandes
ventajas de la 2D-PAGE es que muestra las proteínas intactas, de forma que
pueden detectarse las modificaciones posteriores a la traducción, que suelen
aparecer como «trenes» de manchas diferenciadas en el eje horizontal y/o
vertical en el gel 2D. Además, la separación mediante 2D-PAGE permite aislar
las proteínas en cantidades de miligramos para poder realizar estudios estructu-
rales. Görg y colaboradores han descrito la técnica bidimensional que se utiliza
actualmente [1-3].

Separación en la primera dimensión

Visión general sobre el enfoque isoeléctrico

La separación en la primera dimensión se realiza, como ya se ha señalado, me-

diante enfoque isoeléctrico (IEF). Éste es un método electroforético que separa las
proteínas de acuerdo con sus puntos isoeléctricos (pI). Las proteínas son moléculas
anfóteras; esto es, dependiendo del pH del medio tienen carga positiva, negativa
o cero. La carga neta de una proteína es la suma de todas las cargas positivas y
44
negativas de las cadenas laterales de sus aminoácidos y de los extremos amino y
carboxilo (Figura 3.2). El punto isoeléctrico (pI) es el pH específico al que la carga
neta de la proteína es cero (Figura 3.2). Las proteínas tienen carga positiva a
valores de pH por debajo de su pI y carga negativa a valores de pH por encima
del su pI.
En la técnica de IEF es fundamental el gradiente de pH. En un gradiente de pH y
bajo la influencia de un campo eléctrico, una proteína se moverá hasta la posición
del gradiente donde su carga neta sea cero. Una proteína con una carga neta
positiva migrará hacia el cátodo reduciéndose progresivamente su carga positiva
al moverse a través del gradiente de pH hasta que alcanza su pI. Una proteína
con carga neta negativa migrará hacia el ánodo, reduciéndose de forma progre-
siva su carga negativa hasta que alcanza la carga neta cero. Este es el efecto de
enfoque que concentra las proteínas a sus pI y que permite separar las proteínas
de acuerdo con diferencias de carga muy pequeñas.
El IEF que se realiza en condiciones desnaturalizantes proporciona la mayor reso-
lución y los resultados más definidos. La desnaturalización y solubilización comple-
ta se consiguen con una mezcla de urea, detergente y reductores (Capítulo 2), lo
cual garantiza que cada proteína se encuentra presente en una única conforma-
ción y sin agregación haciendo, por lo tanto, mínimas las interacciones intermole-
culares.
Figura 3.2. Representación de la carga neta de una proteína frente al pH de su
entorno. El punto de intersección de la curva en el eje x representa el punto
isoeléctrico de la proteína

45

Tiras IPG

Los primeros sistemas de anfolitos para crear los gradientes de pH generaban

gradientes que variaban a lo largo de la electroforesis al aplicar la corriente eléc-
trica, lo que originaba separaciones poco nítidas. Además, en la práctica, los
gradientes de pH generados por los anfolitos raramente se extendían más allá de
pH 7.5, lo que daba lugar a la pérdida de las proteínas básicas. Las dificultades
anteriores se superaron en gran medida con el uso de gradientes de pH inmovili-
zados (IPG) en el gel, que no se modifican a lo largo del proceso electroforético al
aplicar la corriente eléctrica [4]. Este tipo de soportes proporciona mejores sepa-
raciones.
Las tiras IPG se basan en el uso de reactivos bifuncionales de inmovilina, que son
un conjunto de 10 derivados de acrilamida químicamente bien definidos con la
estructura general CH2=CH-CO-NH-R, donde R contiene un grupo carboxilo o un
grupo amino. Estos forman un conjunto de amortiguadores con diferentes valores
de pH entre 1 y 13. Como el extremo reactivo copolimeriza con la matriz de
acrilamida, se generan gradientes de pH muy estables, lo cual permite verdaderos
enfoques isoeléctricos de estado estacionario con una mayor reproducibilidad.
 Otras ventajas de las tiras IPG son una mayor resolución debido a la capacidad
de generar gradientes de pH muy estrechos (∆pI=0.001), una separación repro-
ducible de las proteínas básicas y una mayor capacidad de carga.
Las tiras IPG pueden hacerse entre pH 2.5 y 12 con intervalos de pH lineales y
no lineales amplios (ej., 3-12), medios (ej., 4-7), estrechos (ej., 4.5-5.5) o ultra-
estrechos (ej., 4.9-5.3) y con diferentes longitudes, principalmente 7, 18 y 24
cm. Aunque las tiras IPG pueden fabricarse en el laboratorio mezclando dos
soluciones de inmovilinas con un mezclador de gradiente sobre una tira de plás-
tico, suelen adquirirse preparadas de forma deshidratada a suministradores
comerciales.

Rehidratación de las tiras y aplicación de la muestra

Antes de utilizarse las tiras IPG se deben rehidratar hasta su grosor original con
una solución que contiene agentes desnaturalizantes (urea, tiourea), detergentes no
iónicos o iónicos dobles (Tritón X-100, NP-40, CHAPS), agentes reductores (nor-
malmente DTT al 0.4%) y amortiguador IPG. Las cantidades de cada componente
pueden variar dentro de unos intervalos y depende del tipo de muestra que se
pretende analizar. De esta forma puede incrementarse la tolerancia a las sales de
la muestra o mejorar la solubilización de la misma. El tiempo de rehidratación
46
recomendado suele ser de 10 horas como mínimo. La muestra puede estar ya
incluida en la solución de rehidratación, con lo cual se elimina la formación de
precipitados en el punto de aplicación de la muestra, que puede ocurrir cuando la
muestra se «carga en copas» tras una rehidratación previa de la tira. Sin embargo,
hay ocasiones en las que es preferible cargar la muestra posteriormente a la rehi-
dratación, como por ejemplo cuando existe riesgo de proteolisis o de modificacio-
nes de las proteínas.
La cantidad de proteína que puede cargarse en una tira de gel IPG para una
resolución óptima, el máximo número de manchas y el mínimo de rayo-
nes/suciedad de fondo depende de los parámetros como el gradiente de pH, la
distancia de separación y la complejidad proteica de la muestra. Con fines analí-
ticos suelen cargarse unos 100-200 µg de proteína en una tira IPG de gradiente
de pH de 18 cm.

Desarrollo del enfoque isoeléctrico

Las tiras suelen desarrollarse a un amperaje de 50 µA por tira y 150 V para evitar
el calentamiento, ya que al comienzo la conductividad es elevada debido a las
sales. Al irse produciendo la separación, los iones salinos migran hacia los elec-
trodos, lo que hace que descienda la conductividad y que puedan aplicarse volta-
jes más elevados.
Los tiempos óptimos de enfoque deben establecerse de forma empírica para cada
combinación de muestra proteica, carga de proteína, intervalo de pH y longitud
de la tira IPG. Debe mantenerse la temperatura constante a unos 20.ºC. En la
actualidad, los equipos comerciales como el IPGphor (Amersham Biosciences) o el
Protean IEF System (Bio-Rad), contienen un soporte para la tira en el que se puede
rehidratar, cargar con las proteínas y realizar el enfoque isoeléctrico sin mover el
soporte.
Cuando no pueda realizarse la segunda dimensión inmediatamente tras el IEF, las
tiras de IPG deben congelarse y almacenarse a –70.ºC entre dos láminas de
plástico.

Equilibrado de las tiras de IPG

Antes de la separación en la segunda dimensión, es esencial que se equilibren las

tiras IPG para que las proteínas separadas interaccionen totalmente con el SDS.
Debido a que las proteínas enfocadas se unen con más fuerza a los grupos car-
gados fijos de la matriz del gel IPG que a los geles de anfolitos son necesarios
tiempos relativamente largos de equilibrado.
Se incuban las tiras IPG durante 10-15 minutos en el amortiguador descrito por
47
Gorg [1] (Tris-HCl 50 mmM, pH 8.8, SDS 2%, DTT 1%, urea 6 M y glicerol al
30%). Posteriormente se tienen las tiras otros 10-15 minutos en la misma solución
con yodoacetamida al 2% en lugar de DTT. La urea, junto con el glicerol, reduce
el efecto de la electroendósmosis y mejora la transferencia de las proteínas de la
primera a la segunda dimensión. El Tris mantiene el gel de la tira en el intervalo de
pH adecuado para la electroforesis, el SDS desnaturaliza las proteínas y forma
complejos de proteínas cargadas negativamente, el DTT preserva las proteínas en
un estado plenamente reducido y la yodoacetamida alquila grupos tiol de las
proteínas, evitando la reoxidación durante la electroforesis.
Tras el equilibrado, las tiras IPG se aplican sobre la superficie de los geles SDS-
PAGE horizontales o verticales de la segunda dimensión. La pérdida de proteínas
durante el paso de equilibrado y la posterior transferencia de la primera a la se-
gunda dimensión se debe a que algunas proteínas se quedan en la tira IPG por-
que se absorben en la matriz del gel, a los tiempos insuficientes de equilibrado y a
los efectos de lavado.

Separación en la segunda dimensión

La segunda dimensión se corre en gel de acrilamida con dodecilsulfato sódico

(SDS) y puede hacerse en sistemas horizontales o verticales. Los poros del gel de
 la segunda dimensión separan las proteínas de acuerdo con su tamaño, ya que el
dodecilsulfato sódico recubre de cargas negativas todas las proteínas de forma
proporcional a su masa. El efecto neto es que las proteínas migran como elipsoi-
des con un cociente carga negativa/masa uniforme y una movilidad relacionada
de forma logaritmica con la masa. Pueden emplearse geles homogéneos o con
gradiente. Éstos últimos tienen dos ventajas: permiten analizar proteínas con un
amplio intervalo de pesos moleculares y la disminución del tamaño de poro a lo
largo del gradiente estrecha las manchas. El amortiguador más habitual para la
segunda dimensión de la 2D-PAGE es el sistema de Tris-glicina de Laemmli [5].
Este amortiguador separa las proteínas a pH alto, lo cual proporciona la ventaja
de una agregación proteica mínima y una separación limpia, incluso con cargas
de proteínas relativamente grandes. También pueden utilizarse otros amortiguado-
res, como por ejemplo, el sistema Tris-tricina de Schägger y von Jagow [6] que
mejora la resolución de los polipéptidos con valores de masa molecular por deba-
jo de 10 kDa.
La electroforesis puede realizarse con voltaje o amperaje constante. La electrofore-
sis se detiene cuando el frente del colorante sale por la parte inferior del gel. Los
geles deben correrse a una temperatura por debajo de 25.ºC para evitar los
problemas que origina el calentamiento. Tras la electroforesis, los geles se sacan
de los casetes para su tinción.
48

Detección y cuantificación de las proteínas

Después de la electroforesis bidimensional, las proteínas separadas deben visuali-

zarse, ya sea con métodos de tinción universales o específicos [7]. Las propieda-
des más importantes de los métodos de visualización de proteínas son una alta
sensibilidad (un límite de detección bajo), un intervalo dinámico lineal alto (para
una buena cuantificación), reproducibilidad y compatibilidad con los procedimien-
tos de identificación proteica post-electroforéticos, como la espectrometría de ma-
sas. Entre los métodos universales de detección de proteínas en geles bidimensio-
nales están la tinción con colorantes aniónicos como el azul Coomasie, la tinción
negativa con cationes metálicos, como el zinc, la tinción con nitrato de plata, la
tinción o marcaje fluorescente y los isótopos radiactivos y la posterior detección
por autorradiografía.
La detección de las proteínas empleando marcaje fluorescente, como el SYPRO
Ruby [8] es muy popular, ya que ofrece un amplio intervalo dinámico lineal, la
detección de cantidades de nanogramos de proteína, y tiempos finales de tinción,
todo lo cual da lugar a una mayor reproducibilidad. Igualmente, pueden emplear-
se ésteres de succimidilo de los colorantes fluorescentes de cianuro (Cy) para
marcar las α-aminas de los péptidos y los grupos ε-amino de los residuos de lisina
de las proteínas antes de la 2D-PAGE en la técnica que se descibe en el apartado
siguiente.

Electroforesis bidimensional en gel diferencial (DIGE 2D)

Un cuello de botella serio en la evaluación de los geles 2D es la delineación de

los límites de las manchas proteicas en la imagen del gel y el emparejamiento
de las manchas en una serie de geles de forma que puedan realizarse compa-
raciones cuantitativas. La DIGE 2D es una estrategia analítica diseñada para
minimizar este problema, haciendo más fáciles y exactas las comparaciones
entre las muestras [9,10]. En la DIGE 2D se utilizan colorantes fluorescentes con
diferentes tamaños y cargas (derivados de Cy3 y Cy5) para marcar de forma
covalente las proteínas de dos muestras que van a compararse. Se mezclan las
muestras con las proteínas marcadas y luego se separan en un gel 2D. La señal
fluorescente de los colorantes Cy3 y Cy5 puede separarse y puede determinarse
el cociente de marcaje de cada muestra, lo que permite las comparaciones
cuantitativas entre las muestras con cada mancha. Como las muestras se separan
en un único gel, se evitan las diferencias debidas a las variaciones técnicas y se
elimina el proceso de «emparejamiento del gel». Puede añadirse a la mezcla un
49
estándar interno formado por una combinación de cantidades iguales de cada
muestra en la serie de comparación, marcado con un tercer compuesto fluores-
cente como Cy2.

Técnicas de análisis de imagen

Uno de los principales objetivos de los estudios proteómicos es identificar la expre-

sión diferencial entre las muestras control y experimental desarrolladas en los geles
2D. Deben analizarse las manchas que han desaparecido, aparecido o cuya
abundancia ha cambiado. Una vez obtenidas estas características, las proteínas
que interesen pueden identificarse utilizando la espectrometría de masas.
Para analizar la expresión diferencial se emplean programas de ordenador de
análisis de imagen [11,12]. Los programas de análisis de imagen de geles 2D se
han elaborado desde la introducción de esta técnica electroforética a mediados
de los años 1970 [13-15]. Posteriormente, a partir de los años 1990 se han
producido grandes avances en estos programas. En el momento actual los pro-
gramas más empleados son DeCyder 2D Analysis (Amersham Biosciences), Ima-
geMaster 2D Elite (Amersham Biosciences) y PDQuest 2D Analysis (Bio-Rad Labora-
tories. La principal base de datos de 2D-PAGE es SWISS-2DPAGE de ExPasy
(Expert Protein Analysis System) del Swiss Institute of Bioinformatics (SIB)
 Las imágenes deben capturarse y darles un formato digital para el análisis de
imagen. Las imágenes pueden captarse y trasladarse al ordenador utilizando los
diversos sistemas disponibles para esta finalidad. Los principales sistemas de cap-
tura son los escáneres, los densitómetros láser, las cámaras con dispositivos de
carga acoplada (cámaras CCD) y los captores de imágenes fluorescentes o fosfo-
rescentes. Las imágenes capturadas se someten posteriormente a análisis por orde-
nador.
Los programas de análisis de imagen son muy potentes y suelen seguir un proceso
en varias fases. En una primera fase hay un procesado previo de las imágenes
captadas del gel. En este proceso se realizan una serie de correcciones de la falta
de homogeneidad sistemática del gel producida por el proceso electroforético
para obtener la información más exacta posible. Principalmente se realizan co-
rrecciones espaciales y de la intensidad. En la segunda fase se produce la seg-
mentación de las manchas y la cuantificación. La detección de las manchas impli-
ca la resolución individual de cada mancha, lo cual proporciona un listado de
centros, intensidades y propiedades geométricas de las manchas. Debido a que
las manchas varían de tamaño e intensidad a veces existen dificultades para dife-
renciarlas de artefactos como ruido y arrastre y además pueden superponerse
varias manchas. La sistemática es detectar los centros del mayor número posible
de manchas, segmentar el gel en regiones en las que cada una contenga una de
50
estas manchas y modelar cada región mediante un modelo de manchas paramé-
trico. Tras detectar la mancha, se extrae la información característica sobre cada
una de ellas para cuantificar la expresión de la proteína y para facilitar el proceso
de emparejamiento de manchas.
El paso siguiente es el emparejamiento inicial que se realiza de forma manual
entre las referencias y la muestra. Una vez hecho esto, se deja que el programa
informático realice el emparejamiento automático del resto de las manchas. Poste-
riormente, se identifica la expresión diferencial y se presentan los datos e interpre-
tan. Todos los programas de análisis de geles 2D proporcionan gráficos, como
histogramas y diagramas de barras para representar de forma cuantitativa las
intensidades de las manchas y facilitar la comparación (Figura 3.3). Finalmente, se
pasan a las bases de datos de electroforesis bidimensional.

Corte de las manchas

Los programas de análisis de imagen obtienen información cuantitativa y cualitati-

va de las proteínas de una muestra y almacenan la información. Las manchas que
interesen pueden cortarse por medio de sistemas manuales o automáticos. Los
sistemas automáticos para cortar las manchas de los geles obtienen éstas de
acuerdo con las coordenadas de los programas de análisis de imagen y las
Figura 3.3. Software de análisis de geles bidimensionales «Image Master
Platinum» (Ge Healthcare)

51

depositan en placas de microtitulación donde son procesadas. Aquí, las proteínas

se modifican de forma química (reducen y alquilan) y se hidrolizan para preparar-
las para la espectrometría de masas.

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 Capítulo 4

Separaciones multidimensionales

Introducción

La electroforesis bidimensional en gel de poliacrilamida es el método de referencia en

los estudios proteómicos. Sin embargo, a pesar de ser una técnica muy utilizada
también tiene inconvenientes por lo que se han diseñando estrategias en fase líquida
que permitan el análisis de muestras proteómicas complejas mediante la combinación
de varios métodos de cromatografía líquida (LC) y de electroforesis capilar (CE) aco-
plados con el análisis por MS o MS/MS. Las separaciones pueden hacerse sobre las
proteínas intactas o sobre hidrolizados enzimáticos proteicos, de acuerdo con los dos 53
planteamientos proteómicos principales de arriba-abajo y de abajo-arriba.
Los sistemas multidimensionales de separación en columna pueden acoplarse de
varias formas. El efluente del primer sistema de separación puede transportarse al
sistema siguiente de forma manual (fuera de línea), automáticamente con ayuda de
un robot, o mediante la conexión de un tubo o una válvula que transporta directa-
mente una corriente de líquido al sistema siguiente (en línea).
En este Capítulo primero se presentan unas ideas generales sobre cromatografía y
electroforesis capilar y posteriormente se señalan las principales características de
los sistemas bidimensionales y tridimensionales en su aplicación a los estudios
proteómicos.

Técnicas cromatográficas

La cromatografía es una técnica física de separación que se fundamenta en la

distribución diferente de las sustancias en dos fases: una móvil y otra estacionaria.
Durante el proceso cromatográfico de separación, la fase móvil transporta el es-
pécimen a lo largo de la columna que contiene la fase estacionaria. A medida
que la fase móvil fluye por la estacionaria, los solutos se distribuyen entre ambas
fases. Los que son más afines a la fase móvil viajan más rápido que los que lo son
menos (Figura 4.1).
 Figura 4.1. Separación de moléculas mediante cromatografía en columna.
Imagen tomada de Alberts y colaboradores. Biología Molecular de la célula

54

Figura 4.2. Tipos de cromatografía. Imagen tomada de Alberts y colaboradores.

Biología Molecular de la célula
Las separaciones cromatográficas pueden clasificarse de acuerdo con el estado
físico de las fases móvil y estacionaria y según los mecanismos físicos de separa-
ción. En función del estado físico de las fases móvil y estacionaria, la cromatogra-
fía puede ser gas-líquido (fase móvil gaseosa y fase estacionaria líquida) y líquido-
líquido. De acuerdo con el mecanismo de separación la cromatografía puede ser
de adsorción, de reparto, de intercambio iónico, de exclusión de tamaño y de
afinidad. A menudo, en algunos métodos cromatográficos de separación coexisten
dos o más tipos de mecanismos.
Los principales tipos de cromatografía que se emplean en los estudios proteómicos
son la cromatografía de intercambio iónico, la cromatografía de exclusión de
tamaño y la cromatografía de afinidad (Figura 4.2).

Cromatografía de intercambio iónico

La cromatografía de intercambio iónico (ion exchange chromatography, IEX) sepa-

ra las sustancias con base a las interacciones electrostáticas que se producen entre
los grupos ionizables de los compuestos que quieren separarse y los grupos car-
gados unidos a un soporte. Los intercambiadores iónicos son sustancias insolubles
que contienen grupos cargados con iones móviles de signo contrario que neutrali-
zan los grupos fijos. Estos iones móviles o contraiones pueden intercambiarse de
55
forma reversible con otros iones de la misma carga.
Los cambiadores pueden ser catiónicos, si intercambian iones del medio con car-
ga positiva, o aniónicos, si intercambian iones negativos. Los grupos cargados de
la matriz insoluble determinan el tipo y la fuerza del cambiador. Los grupos fenóli-
cos, carboxílicos y sulfónicos se utilizan como intercambiadores catiónicos, mien-
tras que los grupos amino, alifáticos y aromáticos, se utilizan como aniónicos. Los
grupos sulfónicos y amino cuaternarios son cambiadores fuertes, mientras que los
otros grupos son cambiadores débiles.

Cromatografía de exclusión de tamaño

La cromatografía de exclusión de tamaño (size exclusion chromatography, SEC),

antes llamada filtración en geles, es una técnica que separa las moléculas en
función de su tamaño y de su forma. La fase estacionaria es un gel, un polímero
anhidro muy hidrófilo, que se hincha cuando se sumerge en agua o en soluciones
electrolíticas. La elución o salida de las sustancias de la columna es independiente
del eluyente o fase móvil utilizada, de su pH y su fuerza iónica y, como se ha
indicado, sólo es función de la forma y del tamaño de las sustancias y de los
poros del gel. Los principales geles que se utilizan en la cromatografía de exclu-
sión son el dextrano (Sephadex, Sephacryl), la agarosa (Sheparosa, Bio-Gel) y la
poliacrilamida (Bio-Gel).
 Cromatografía de afinidad

La cromatografía de afinidad utiliza para separar las sustancias interacciones

biológicas muy específicas como enzima-sustrato, antígeno-anticuerpo y hormona-
receptor. La técnica requiere que el compuesto que quiere separarse se una rever-
siblemente a un ligando específico que se ancla a una matriz insoluble. Así, la
fase estacionaria se prepara inmovilizando el ligando sobre el soporte sólido, bien
directamente o empleando un brazo espaciador.
La separación o elución de la sustancia que ha quedado retenida en la columna
por afinidad se consigue alterando las condiciones experimentales, por variación
del pH o de la fuerza iónica o pasando un ligando distinto al anclado en la co-
lumna por el que la sustancia tenga mayor afinidad.

Cromatografía líquida de alta resolución

Hasta hace unos años, la cromatografía en columna se realizaba utilizando el flujo

gravitatorio como fuerza impulsora de la fase móvil, lo que producía tiempos de
separación largos. La construcción de sistemas impulsores de la fase móvil con
mucha presión y la obtención de rellenos de columnas cuya actuación es muy
56
eficaz han permitido tiempos cortos de separación y una gran selectividad. La
cromatografía que emplea estos métodos se denomina cromatografía líquida de
alta resolución (HPLC).

Bombas

Los sistemas de bombeo para impulsar la fase móvil son uno de los componentes
más críticos de los cromatógrafos HPLC. La bomba de los cromatógrafos líquidos
puede actuar de modo isocrático o de modo gradiente. En el primero, la compo-
sición de la fase móvil permanece constante durante todo el proceso, mientras que
en el segundo, va cambiando durante la cromatografía.

Fase normal y fase reversa

Las fases líquidas estacionarias son generalmente polares, mientras que las fases móvi-
les son apolares. En este sentido, los líquidos estacionarios más usados son el agua y
el etilenglicol y las fases móviles más típicas, el hexano, el metanol y las mezclas he-
xano/isopropanol. Esta combinación de una fase estacionaria polar y una móvil apo-
lar se llama cromatografía líquida «en fase normal» (normal phase, NP). Cuando la
fase estacionaria es apolar, como un hidrocarburo, y se utilizan como fase móvil siste-
mas acuosos, la cromatografía se denomina «en fase reversa» (reverse phase, RP).
Detectores

Los principales detectores que se utilizan en HPLC son los espectroscópicos y los
electroquímicos. Los detectores espectroscópicos más utilizados se basan en medi-
das en el UV/visible y de fluorescencia.
La HPLC ha tenido un gran impacto sobre la separación de péptidos y proteínas.
Los instrumentos dedicados a la separación de proteínas han dado lugar a la
técnica denominada fast protein liquid chromatography (FPLC, cromatografía líqui-
da rápida de proteínas). Este tipo de cromatografía puede emplear todos los me-
canismos de separación cromatográficos.

Electroforesis capilar

La electroforesis capilar (CE) es una técnica en la que la electroforesis de zona se

realiza en capilares de 75 µm de diámetro interno y 25 cm de longitud. El tubo
capilar se conecta a un detector en un extremo y a una fuente de corriente a través
de recipientes con un amortiguador. Las principales ventajas que aportan los diá-
metros tan pequeños de los capilares son que se logra una mayor disipación del
calor, un menor volumen de la muestra y una anchura menor de las zonas de
57
separación. La gran disipación de calor permite aplicar grandes voltajes, de unos
5000 V, que mejoran la eficacia de la separación y reducen el tiempo de ésta.
Hay varias formas de electroforesis capilar. La más simple es la de zona (Capillary
zone electrophoresis, CZE; electroforesis capilar de zona). Los principales detecto-
res que se utilizan en la electroforesis capilar son los de ultravioleta/visible, de
fluorescencia, de conductividad y los amperométricos. La detección se realiza en
la columna, antes de que los solutos hayan salido del capilar y se produzca el
ensanchamiento de las bandas.

Separaciones multidimensionales

Una separación multidimensional implica el acoplamiento de dos o más mecanis-

mos de separación en un único análisis. En una separación multidimensional la
muestra se separa primero por un método y luego los componentes separados se
vuelven a separar por al menos otro método adicional independiente. Cada me-
canismo de separación descansa en una propiedad física independiente del anali-
to. Las propiedades físicas independientes corresponden a «dimensiones» y pue-
den ser tamaño, carga, hidrofobicidad o afinidad a un sustrato determinado. La
utilización de varias dimensiones independientes aumenta significativamente el
poder de resolución de una separación. Aunque no hay una limitación inherente al
 número de métodos de separación independientes que pueden acoplarse, las
restricciones prácticas han limitado la mayoría de las separaciones multidimensio-
nales presentadas hasta la fecha a dos dimensiones. En un caso ideal, la capaci-
dad total de picos de un sistema de separación bidimensional (2D) es aproxima-
damente igual al producto de las capacidades de picos de ambas dimensiones.
Hipotéticamente, si dos técnicas con una capacidad de picos de 100 cada una,
se combinan, el sistema 2D resultante podría tener una capacidad de picos teóri-
ca máxima de 10.000.
Las separaciones bidimensionales pueden diferenciarse en aquellas que lo son en
el espacio y las que lo son en el tiempo. La electroforesis bidimensional en gel es
una técnica típica en el espacio. En las técnicas que son 2D en el tiempo, primero
se lleva a cabo una separación 1D, con frecuencia en una columna de cromato-
grafía líquida y luego a continuación se someten las fracciones individuales de
esta primera separación monodimensional a una segunda separación 1D. Entre
las técnicas que son 2D en el tiempo debe realizarse otra distinción entre las sepa-
raciones fuera de línea y en línea. En los métodos fuera de línea, se recogen frac-
ciones de la primera dimensión que luego se separan en la segunda dimensión.
Las técnicas en línea emplean válvulas de desvío u otra instrumentación que permi-
tan transferir las fracciones de la primera dimensión directamente a la segunda
dimensión, normalmente mientras continúa simultáneamente la separación en la
58
primera dimensión.
Los métodos fuera de línea y en línea tienen ventajas y desventajas. En general, se
prefieren los métodos en línea ya que son mucho más rápidos al producirse las
separaciones en la segunda dimensión al mismo tiempo que las de la primera.
Deben tenerse en cuenta determinadas consideraciones teóricas en todas las sepa-
raciones multidimensionales con independencia de si la técnica es 2D en el espa-
cio o en el tiempo, fuera de línea o en línea. Giddings ha establecido dos de
estos requerimientos fundamentales para las separaciones multidimensionales idea-
les [1,2]. En primer lugar, los mecanismos de separación deben ser ortogonales,
lo que significa que la propiedad química o física por la que se separan los anali-
tos debe ser diferente para cada dimensión. Por ejemplo, la cromatografía líquida
en fase reversa que separa de acuerdo con la hidrofobicidad es ortogonal con la
cromatografía de intercambio iónico que separa de acuerdo con interacciones
culómbicas. Cuando un sistema es verdaderamente ortogonal, la distribución de
los componentes (picos) en una dimensión no debería correlacionarse con la dis-
tribución de los componentes en la otra dimensión. El segundo criterio de
Giddings establece que la resolución que no se consigue en la primera dimensión
de la separación puede perderse en cualquier dimensión posterior.
Separaciones bidimensionales

Se han realizado diversas combinaciones de cromatografía y electroforesis para

separar las proteínas o los péptidos en los estudios proteómicos. La cromatografía
puede emplearse en diversos modos de separación: fase normal (NP), fase reversa
(RP), exclusión de tamaño (SEC), intercambio iónico (IEX) y afinidad.
Cuando los sistemas bidimensionales se conectan con espectrómetros de masas, la
elección de la separación de la primera dimensión debe complementarse con la
cromatografía en fase reversa en la segunda dimensión debido a que en este caso
las muestras eluídas de la columna de fase reversa se encuentran en la forma más
deseable para su inyección en el espectrómetro de masas. En este tipo de análisis,
los candidatos más adecuados para la primera separación cromatográfica son la
cromatografía de exclusión de tamaño y la cromatografía de intercambio iónico.

Cromatografía bidimensional con dos columnas en serie

El método más simple de realizar una separación cromatográfica bidimensional es

acoplar dos columnas en serie, que empleen cada una de ellas un mecanismo de
separación diferente. Esto no puede realizarse empleando una elución isocrática
ya que las sustancias separadas en la primera dimensión podrían volver a juntarse
59
en la segunda dimensión y además es muy poco probable que la misma fase
móvil pueda separar en ambas columnas con mecanismos de separación diferen-
tes. Para resolver este problema ambas dimensiones deben operar en un modo
gradiente controlado. Así, las fracciones de la primera columna se eluyen a la
segunda columna utilizando un gradiente de pasos de fuerza eluyente creciente
con respecto a la primera columna. Tras eluir una fracción de la primera columna
se aplica un gradiente continuo adecuado para la segunda dimensión para sepa-
rar y eluir los componentes de la fracción. Luego se realiza otro paso de gradiente
de la primera dimensión y se repite el proceso.
El grupo de Yates ha puesto a punto una tecnología multidimensional en línea de
identificación de proteínas denominada MudPIT donde los materiales para las
cromatografías SCX y RP están empaquetados, en lugar de en dos columnas dife-
rentes en serie, secuencialmente en una única columna microcapilar [3]. El sistema
MudPIT se acopla directamente en línea con el espectrómetro de masas. Se han
empleado procedimientos semejantes fuera de línea para la separación de pépti-
dos procedentes de hidrolizados proteicos de un filtrado de plasma humano [4],
péptidos plasmáticos [5], orina humana [6] y proteínas plasmáticas humanas de
bajo peso molecular [7].
 Cromatografía bidimensional con columnas que se cambian

En los sistemas en línea se emplean válvulas para conectar la primera columna con
la segunda. Esta conexión puede dar lugar a tres tipos de problemas [8]:

1. Incompatibilidad del disolvente entre las fases móviles del primer y segundo
sistema.
2. Ensanchamiento excesivo de las bandas entre las columnas durante el paso
por las válvulas, los bucles o el detector.
3. Necesidad de una separación mucho más rápida en la segunda dimensión.

El disolvente de transferencia de la primera columna debe permitir concentrar los

analitos sobre la segunda columna y debe ser miscible con el disolvente utilizado en
la segunda separación. Asimismo, la segunda columna debe tener capacidad de
concentración de la muestra.
Aunque se han diseñado muchas disposiciones instrumentales, hay un patrón bási-
co que incluye un inyector, dos bombas isocráticas o de gradiente, una columna
para la primera dimensión y otra para la segunda, una o varias válvulas de cam-
bio controladas por ordenador y un sistema de detección adecuado.
La mayoría de los mecanismos de separación cromatográficos pueden combinarse
60
siempre que sean compatibles sus fases móviles. La conexión de sistemas de NP y
RP es especialmente difícil debido a que las fases móviles son inmiscibles. Se han
empleado diversas combinaciones de cromatografía líquida como intercambio
iónico-fase reversa (IEX/RP), exclusión de tamaño-fase reversa (SE/RP), fase rever-
sa-exclusión de tamaño (RP/SE), intercambio iónico-exclusión de tamaño (IEX/SE) y
fase normal-fase reversa (NP/RP).
Shen et al [9] utilizaron la combinación de nano-RPLC de alta eficacia con croma-
tografía de intercambio catiónico fuerte junto con MS tandem para caracterizar el
proteoma plasmático humano. Con relación a la abundancia de las proteínas
alcanzaron un intervalo dinámico mayor de 8 órdenes de magnitud. Utilizando un
total de 365 µg de plasma humano, identificaron entre 800 y 1682 proteínas,
dependiendo del criterio para su identificación.
En un sistema fuera de línea que utiliza la cromatografía de intercambio catiónico
fuerte (SCX) en la primera dimensión, los pasos de incremento de la concentración
salina y las fracciones que deben recogerse han de decidirse en función de diver-
sos factores como la complejidad de la mezcla de péptidos, el tamaño de la
muestra, el tiempo de gradiente, el tiempo disponible, el modo de espectrometría
de masas y los fines del análisis proteómico. Otro aspecto de la cromatografía de
intercambio iónico que debe decidirse es el tipo de amortiguador, la concentra-
ción y el pH. Las concentraciones salinas altas proporcionan picos agudos, tiem-
pos de elución cortos y un gran número de péptidos que eluyen juntos, mientras
que las concentraciones salinas bajas dan lugar a picos anchos, tiempos de elu-
ción largos y un número reducido de péptidos que eluyen juntos [10].

Cromatografía líquida-electroforesis capilar

Las mejores separaciones bidimensionales se consiguen cuando se acoplan

mecanismos se separación muy diferentes. Así pues, la combinación de croma-
tografía y electroforesis es muy adecuada. La electroforesis capilar es un método
de separación relativamente rápido comparado con la cromatografía líquida, lo
que hace muy adecuada a la CE como segunda dimensión. Aunque la LC y la
CE son técnicas de separación complementarias sus diferencias complican su
acoplamiento. Los volúmenes de elución de la LC convencional son mucho ma-
yores que los volúmenes de muestra de los capilares de la CE, por lo que o bien
deben utilizarse columnas cromatográficas capilares o emplear sólo una fracción
del eluyente cromatográfico [11]. También puede utilizarse una combinación de
los dos aparatos sin conexión en línea. Las dos formas de LC que más se han
acoplado con la CE son la cromatografía en fase reversa y la cromatografía de
exclusión de tamaño.
Isaaq et al [12] han utilizado un sistema fuera de línea RPLC/CZE para separar
mezclas complejas de digeridos con tripsina. Las fracciones que eluyen de la
61
columna HPLC se recogen cada 30 segundos, se concentran a vacío y se anali-
zan por electroforesis capilar de zona con identificación por fluorescencia. En
lugar de utilizar detección UV o de fluorescencia, Janini et al [13] han combinado
las separaciones RPLC-CZE con ESI-MS/MS para identificar las proteínas. Se
eliminaron de una muestra de suero las proteínas más abundantes y se digirió con
tripsina. Se separaron los péptidos por RPLC y se recogieron 96 fracciones. Estas
fracciones fuera de línea se sometieron a separaciones secuenciales por electrofo-
resis capilar de zona con identificación por ESI-MS/MS.

Enfoque isoeléctrico y cromatografía

Se ha utilizado un dispositivo de enfoque isoeléctrico (IEF) en fase líquida con

anfolitos libres para fraccionar una muestra de suero digerida con tripsina [14]. La
célula de enfoque está dividida en 20 cámaras por medio de membranas per-
meables. Tras el enfoque, la muestra de péptidos se separó en 20 fracciones en
las diferentes cámaras que se recogieron en tubos separados. Cada fracción se
analizó por µRPLC-MS/MS. También pueden separarse las proteínas por IEF,
luego digerirse con tripsina y posteriormente separarse por cromatografía en fase
reversa e identificarse los péptidos por ESI-MS/MS [15].
 Separaciones tridimensionales

Se han realizado diversas combinaciones de cromatografía y electroforesis que

recogen tres tipos de separación. Se ha combinado IEF/SCX/RP con una estrate-
gia MudPIT para analizar el proteoma del suero, detectándose 2071 péptidos
que dieron lugar a la identificación de 1143 proteínas [16]. Otras combinaciones
tridimensionales han sido RP/SCX/RP con una estrategia MudPIT, SEC/RP/CZE,
SEC/SCX/RP y afinidad/SCX/RP [17].

Sistemas comerciales

Beckmann Coulter ha comercializado el sistema PF2D que separa las proteínas en la

primera dimensión utilizando enfoque cromatográfico seguido en línea por cromato-
grafía en fase reversa en la segunda dimensión, separando de esta forma las proteí-
nas intactas de acuerdo con su pI e hidrofobicidad. Sheng et al [18] han utilizado el
PF2D para identificar 153 proteínas no redundantes del suero humano. El PF2D
mostró una capacidad elevada de carga sin distorsión de banda, y detectó proteínas
poco abundantes (intervalo > 100 pg), resolviendo proteínas hidrófobas de membra-
na con una alta reproducibilidad. También se han señalado otras ventajas como la
62
visualización de las bandas proteicas y la compatibilidad con varios sistemas de MS.
Así pues, el PF2D parece representar una nueva plataforma para el fraccionamiento o
separación del plasma u otros componentes celulares, como las proteínas de mem-
brana. Algunos inconvenientes del PF2D son el «desplazamiento de posición» que es
un hueco entre el pH del amortiguador de elución y el pI de las proteínas en las
fracciones del gradiente de pH, lo que puede ser problemático cuando se quiere
medir la expresión diferencial entre los especimenes control y enfermo, donde la
normalización de cada banda es crucial para la cuantificación [19].
Gyros (www.gyros.com) ha comercializado el MALDI SP1 CD Microlaboratory. La
base es un sistema de microfluidos de elevada capacidad que integra en un com-
pact disk (CD) la hidrólisis de la proteína y la separación de los péptidos con la
espectrometría de masas MALDI [20]. La fuerza centrífuga mueve el líquido a
través de múltiples microestructuras, cada una de las cuales contiene una columna
cromatográfica de fase reversa de 10 nL. El CD permite la preparación paralela
de 96 muestras con volúmenes que van desde uno a varios microlitros. Los pépti-
dos de los hidrolizados se concentran, desalan y posteriormente se eluyen de las
columnas directamente a áreas MALDI (200x400 µm) sobre el CD utilizando un
disolvente que contiene la matriz MALDI. Tras la cristalización, el CD se inserta en
el aparato MALDI para obtener a huella de masa de los péptidos y la identifica-
ción en las bases de datos. Se han presentado algunos trabajos que utilizan este
sistema [20,21].
Gyros también comercializa el MALDI IMAC1. En este sistema las columnas son
de cromatografía de afinidad con iones inmovilizados (immobilized ion affinity
chromatography, IMAC) y se utilizan para e enriquecimiento de péptidos fosforila-
dos en los estudios proteómicos de modificaciones posteriores a la traducción
(fosforilaciones) [22,23].

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 Capítulo 5

Estectrometría de masas

Introducción

La espectrometría de masas es una técnica muy utilizada desde hace años para la
identificación de moléculas. Se trata de una técnica analítica cualitativa y cuantita-
tiva de gran capacidad que además permite elucidar las estructuras y las propie-
dades químicas de las moléculas. Su límite de detección se acerca a 10-12 gra-
mos, que equivalen a 10-15 moles de un compuesto con una masa molecular de
1000 Da. Estas cifran señalan que es posible la identificación de compuestos que
se encuentren en concentraciones de hasta 1 parte por billón (1012) en muestras 65
químicas complejas.
En este Capítulo se presentan las principales características de la espectrometría
de masas, fundamentalmente en lo relacionado con su aplicación a los estudios
proteómicos. En los últimos años se han publicado varias revisiones sobre este
tema en la literatura anglosajona [1-4].

Aplicación de la espectrometría de masas para el estudio de las proteínas

Hasta la década de 1990 las proteínas se habían resistido a su análisis por es-
pectrometría de masas debido fundamentalmente a la dificultad de generar iones
a partir de estas moléculas grandes no volátiles. A finales de los años 1980 se
presentaron dos métodos que permitían la ionización de las proteínas. Estos eran
la ionización por pulverización eléctrica (electrospray ionization, ESI) [5] y la de-
sabsorción/ionización por láser con ayuda de una matriz (matriz-assisted laser
desorption/ionization, MALDI) [6]. Por estos descubrimientos Fenn y Karas recibie-
ron el Premio Nobel de Química de 2002.
La espectrometría de masas se ha utilizado mucho en el campo de la química
orgánica para el análisis de la estructura de moléculas complejas. Sin embargo, la
complejidad de las proteínas hace que su análisis por medio de la espectrometría
de masas sea más difícil. Inicialmente, esta técnica se ha aplicado al análisis de
 proteínas aisladas previamente y estudiadas fundamentalmente desde un punto de
vista único o de unas pocas proteínas. Sin embargo, los objetivos de la proteómi-
ca son el análisis de grandes grupos de proteínas que se expresan en las células.
Esto último está siendo posible por los grandes avances que se han producido en
los últimos años, tanto de la instrumentación, como de los programas informáticos
de análisis de datos.

Espectrómetros de masas

Los análisis de espectrometría de masas se llevan a cabo en los aparatos denomi-

nados espectrómetros de masas. Se trata de instrumentos en los que se mide la
masa de las moléculas que previamente se han transformado en iones. En un es-
pectro de masas se representan las relaciones masa/carga (m/z) de todas las
especies iónicas producidas a partir de la molécula. Cuando los iones tienen
carga 1, la relación m/z es igual a la masa molecular de la especie iónica expre-
sada en dalton.
Los espectrómetros de masas se emplean en proteómica, bien para medir simple-
mente la masa molecular de un polipéptido o para determinar otras características
estructurales, como la secuencia de aminoácidos o el lugar de unión o tipo de
66
modificación posterior a la traducción. En el primer caso se emplean espectróme-
tros de masas de una etapa, que actúan esencialmente como balanzas para pesar
las moléculas, mientras que en el segundo caso tras la determinación inicial de la
masa, se seleccionan iones específicos que se someten a una fragmentación me-
diante colisión. En este tipo de experimentos que se denominan de espectrometría
de masas tandem (MS/MS) pueden determinarse características estructurales deta-
lladas a partir del análisis de las masas de los fragmentos resultantes.
Las muestras que se analizan en el espectrómetro de masas deben estar en fase
gaseosa. Por ello, un requisito fundamental en esta técnica es un sistema de vapo-
rización. La muestra que puede encontrarse en estado sólido, líquido o gaseoso se
introduce en el analizador por medio de un inyector. Existen diversas posibilidades
de combinación de sistema de inyección y sistema de vaporización.
Como ya se ha señalado, los iones en la fase gaseosa se separan en el analiza-
dor según su relación masa/carga. Una vez separados se llevan al detector,
donde el flujo de iones se transforma en una corriente eléctrica, que es proporcio-
nal a la cantidad. Detectadas todas las especies iónicas se representa su relación
masa/carga frente a la cantidad relativa, lo cual recibe el nombre de espectro de
masas. En la Figura 5.1 se muestra el espectro de masas de una molécula sencilla
como el CO2. Las especies iónicas generadas son C+, O+, CO+ y CO2+.
Se denomina ión molecular al ión no fragmentado de la molécula original. Al ión
con la mayor abundancia en el espectro de masas se le asigna un valor relativo
Figura 5.1. Espectro de masas del CO2

del 100% y se denomina pico base. Como puede predecirse la fragmentación de

enlaces específicos a partir de su naturaleza química, es posible reconstruir la
estructura de una molécula a partir de su espectro de masas. Con estos datos es
posible obtener el peso molecular y la estructura del compuesto.
67
Los principales componentes de un espectrómetro de masas son:

• Fuente de los iones, donde tiene lugar la ionización.

• Analizador de masa, donde se mide m/z.
• Detector, donde se registra la cantidad de los iones correspondientes a un
determinado cociente m/z.
• Analizador de datos

En cualquiera de los analizadores de masas la separación de los iones requiere que

no choquen con otras moléculas durante su interacción con los campos eléctricos o
magnéticos. Esto hace necesario un vacío entre 10-3 y 10-9 torr, dependiendo del
analizador de masas. Además, este vacío se mantiene normalmente a temperatura
elevada (150-250.ºC) para impedir que las moléculas gaseosas o los compuestos
orgánicos se adsorban sobre las superficies interiores de la cámara de vacío.
Las dos características clave de un espectrómetro de masas son su exactitud de
masa y su poder de resolución. El poder de resolución indica la capacidad para
separar dos iones de masa cercana y se define por la diferencia del cociente
masa/masa. La exactitud de masa puede expresarse en términos absolutos como
la diferencia entre los valores observado y calculado o en términos relativos expre-
sada en ppm.
 Técnicas para volatilizar e ionizar proteínas o péptidos para
espectrometría de masas

Existen dos clases principales de técnicas para la volatilización e ionización de las

proteínas, que son la ionización por pulverización eléctrica, conocida como ESI
que es la abreviatura de la denominación en ingles electrospray ionization, y la
desabsorción/ionización por láser con ayuda de una matriz, que se abrevia con
las siglas MALDI (matrix-assisted desorption/ionization).

Técnica de ionización ESI

La ESI es una técnica que al mismo tiempo que extrae las sustancias de la disolu-
ción, las ioniza. A presión atmosférica permite la rápida transferencia de las sus-
tancias desde la fase líquida en la que se encuentran a una fase gaseosa. Se
pulveriza una disolución con las proteínas en forma de gotitas desde un capilar de
vidrio bajo el influjo de un campo eléctrico fuerte. Las gotitas captan cargas positi-
vas al salir del capilar. La evaporación del disolvente deja moléculas con muchas
cargas. Una molécula proteica de unos 20 kDa capta entre 10 y 30 cargas posi-
tivas. El espectro de masas de esta proteína muestra todas las especies cargadas
en forma de un conjunto de picos agudos cuyos valores consecutivos m/z se
68
diferencian por la carga y la masa de un único protón. En la Figura 5.2a se mues-
tra el espectro de masas de la proteína citocromo c. Téngase en cuenta que los
valores m/z menores significan un número mayor de cargas por molécula. Las
cargas múltiples permiten el análisis de moléculas muy grandes que tienen un
intervalo m/z relativamente pequeño. Otra ventaja de las cargas múltiples es que
puede obtenerse un peso molecular más exacto a partir del análisis de la distribu-
ción de picos con varias cargas. La técnica ESI es fácil de acoplar a la mayoría
de los métodos de separación de sustancias en fase líquida como la cromatogra-
fía y la electroforesis.

Técnica de ionización MALDI

En la técnica MALDI de evaporación/ionización, la muestra se solidifica dentro de

una matriz sólida que absorbe energía en un intervalo ultravioleta específico y
disipa la energía absorbida en forma de calor. Una vez que se encuentra la mues-
tra dentro de la matriz, se emplea un pulso láser para excitar la matriz química,
creando un microplasma que transfiere la energía a las moléculas proteicas de la
muestra, ionizándolas y expulsándolas a la fase gaseosa. Entre los productos se
encuentran moléculas que han captado un solo protón. Estas especies cargadas
positivamente pueden seleccionarse por el espectrómetro de masas para el análisis
de masas. De esta forma, se expulsan al tiempo las sustancias a la fase gaseosa
en la que se cargan. Un campo eléctrico de gran potencia situado entre la placa
MALDI y la entrada al tubo de espectrometría de masas hace que las sustancias
cargadas alcancen rápidamente la entrada a diferentes velocidades de acuerdo
con la relación m/z. Como la técnica MALDI sólo produce la adición de un único
protón, el espectro de masas sólo presenta un único pico correspondiente a ese
ión. En la Figura 5.2b se muestra el espectro de masas de la proteína citocromo c.

Figura 5.2. Espectros de masas del citocromo c generados utilizando ESI y

MALDI. Con ESI se observan muchos picos debidos a los diferentes estados de
carga que surgen de los diversos grados de protonación. Con MALDI sólo se
observa un pico ya que la ionización con esta técnica sólo produce la adición de
un único protón. Observar las diferentes escalas para m/z. Tomado de Glish &
Vachet. Nat Rev Drug Discov 2003; 2:140-50

69

Tipos de analizadores de masas para los estudios proteómicos

Tras la ionización, la muestra alcanza el analizador de masas, que separa los

iones de acuerdo con su cociente m/z. El movimiento del ión en el analizador de
masas puede manipularse mediante campos eléctricos o magnéticos para dirigir
los iones hacia un detector, que registra el número de iones de cada valor indivi-
dual m/z. En la investigación proteómica actualmente se emplean cuatro tipos de
analizadores de masas: de trampa iónica, de tiempo de vuelo, de cuadrupolo y
de resonancia ión ciclotrón con transformada de Furier. Cada uno de ellos difiere
considerablemente en sensibilidad, resolución, exactitud de masa y posibilidad de
fragmentar los iones peptídicos. Esto último da lugar a un espectro de masas con
un contenido de información muy alto (espectros MS/MS) [2]. La combinación de
fuente de iones, analizador de masa y detector normalmente viene determinada
por la aplicación. En la Figura 5.3 se presentan los dos tipos de métodos de
 ionización, así como algunos de los analizadores de masa que se emplean en los
estudios proteómicos y las combinaciones de ellos para la espectrometría de ma-
sas tandem.

Figura 5.3. En la parte superior se presentan las dos clases principales de

técnicas de ionización de las proteínas. A la izquierda la técnica de pulverización
eléctrica (ESI) y a la derecha la técnica MALDI. En la parte inferior se presentan
algunos analizadores de masa: a) Tiempo de vuelo (TOF); b) TOF-TOF; c) Triple
cuadrupolo o trampa iónica lineal; d) cuadrupolo-tiempo de vuelo; e) trampa
iónica; f) ion ciclotrón con transformada de Fourier. Tomado de Aebersold &
Mann. Nature 2003; 422:198-207

70

Analizadores de trampa iónica

En los analizadores de trampa iónica, en primer lugar se capturan los iones en el

centro del dispositivo durante un determinado intervalo de tiempo y luego se some-
ten al análisis de masas o con un sistema doble de masas. Estos analizadores son
duros, sensibles, relativamente baratos y muy utilizados, de forma que con ellos se
han obtenido la mayoría de los datos sobre proteómica que se han publicado. La
principal desventaja es que su exactitud de las determinaciones de la masa es
relativamente baja, lo que en parte se debe al número limitado de iones que pue-
den acumularse. El desarrollo de analizadores de trampa iónica lineal con mayo-
res capacidades de atrapamiento de iones ha expandido el rango dinámico y la
sensibilidad global de la técnica.
Analizadores de tiempo de vuelo

Los analizadores de tiempo de vuelo (TOF) separan los iones de acuerdo con su
velocidad. Teóricamente, todos los iones se forman al mismo tiempo y en el mismo
lugar en la fuente de iones. Posteriormente, son acelerados por un potencial fijo (1-
20 kV) en el tubo de conducción. Como todos los iones con la misma carga ob-
tienen la misma energía cinética tras la aceleración, los iones con menor m/z
alcanzan velocidades mayores que los que tienen mayor m/z. Así, las velocida-
des de los iones están inversamente relacionadas con la raíz cuadrada de m/z.
Tras acelerarse, los iones viajan a través de una distancia fija (normalmente 0.5-2
metros) antes de llegar al detector. De esta manera puede determinarse m/z me-
diante la medida del tiempo que tarda el ión en alcanzar el detector. La técnica
TOF tiene un poder de resolución de masa mayor de 12000 Da y exactitudes de
masa de 10 partes por millón (ppm).

Analizadores cuadrupolo

Un espectrómetro de masas cuadrupolo está formado por cuatro barras paralelas

que conducen la corriente eléctrica con una disposición cuadrangular. Las cuatro
barras forman un canal largo a través del cual pasa el haz de iones. El haz de
71
iones que penetra en el cuadrupolo contiene una mezcla de iones con diversos
valores m/z, pero sólo los iones con un intervalo m/z muy estrecho se transportan
a través del dispositivo para alcanzar el detector. Las barras del cuadrupolo tienen
aplicadas de forma superpuesta una radiofrecuencia y un voltaje. La magnitud
correcta de la radiofrecuencia y el voltaje aplicado a las barras permite a los
iones con un determinado valor m/z mantener trayectorias estables de la fuente al
detector, mientras que los iones con otros valores de m/z son incapaces de man-
tener trayectorias estables. Los analizadores cuadrupolo suelen tener una resolución
de varios miles, aunque los avances técnicos han permitido aparatos con resolu-
ciones superiores a 10000.

Analizador de resonancia de ión ciclotrón con transformada de Furier

(FTICR)

Los analizadores FTICR operan atrapando a los iones en una célula con un campo
magnético estático. Bajo la influencia del campo, los iones describen un movimien-
to ciclotrónico circular en la célula alrededor del eje z del campo magnético. El
valor m/z puede determinarse midiendo la frecuencia del movimiento de los iones.
Este tipo de analizador es el más potente de los que se dispone en la actualidad
en términos de resolución de masas y exactitud de masas.
 Espectrómetros de masas en tandem (MS/MS)

La espectrometría de masas tandem o MS/MS se realiza colocando dos espec-

trómetros de masas secuencialmente con una «célula de colisión» situada entre los
dos aparatos (Figura 5.4). El primer espectrómetro de masas (MS1) se utiliza para
seleccionar los iones con un determinado m/z a los que se denomina «ión precur-
sor». Éstos se dirigen al interior de la célula de colisión, donde chocan con molé-
culas de gas que los fragmentan en iones más pequeños que reciben el nombre
de «iones producto» y su espectro de masas se determina en el segundo espectró-
metro de masas (MS2).

Figura 5.4. Espectrometría de masas tandem o MS/MS. Tomado de Glisch &

Vachet. Nat Rev Drug Discov 2003; 2:140-50

72

La clave de la alta selectividad de la MS/MS es que caracteriza a un compuesto

por dos propiedades físicas, la masa iónica del ión precursor y la masa iónica de
los iones producto.
Entre los espectrómetros tandem se encuentran el de triple cuadrupolo, en el que el
primer cuadrupolo (Q1) actúa como el MS1 y el tercer cuadrupolo (Q3) como el
MS2. Entre estos dos cuadrupolos hay otro cuadrupolo (Q2) que actúa como la
célula de colisión. Otro sistema es el TOF/TOF que combina dos espectrómetros
de masas TOF. Este sistema se emplea mucho en los estudios proteómicos. Los
instrumentos híbridos combinan dos tipos de espectrómetros de masas. El más
popular es la combinación cuadrupolo/TOF, muy utilizada también en los estudios
proteómicos. Los espectrómetros de masas de trampa también pueden utilizarse
como espectrómetros de masas tandem. Se emplean mucho para la secuenciación
de péptidos.
Detectores

Con la excepción del FTICR, casi todos los espectrómetros de masas utilizan para
la detección de los iones multiplicadores electrónicos, que emplean placas multi-
plicadoras o dínodos. Todos se fundamentan en el principio de la multiplicación
de electrones, de forma que tras el choque del ión sobre el primer dínodo se am-
plía el número de electrones hasta generarse entre 104 y 108.

Combinación fuente de iones-analizador de masas

Tal y como se ha señalado antes, la combinación de la fuente de iones con el

analizador de masas está determinada por la aplicación. La ESI se acopla fre-
cuentemente con las trampas iónicas y los espectrómetros de masas tandem híbri-
dos como la combinación cuadrupolo-tiempo de vuelo (Q/TOF). Con este tipo de
analizador de masas no sólo puede determinarse la masa de un péptido determi-
nado, sino también su secuencia. Los iones con valores m/z específicos pueden
seleccionarse en la «trampa» para la fragmentación inducida por la colisión del
ión con un gas inerte.
La MALDI normalmente se acopla con analizadores TOF. El principal inconvenien-
73
te de los analizadores TOF es que no pueden realizar un verdadero MS/MS. Sin
embargo, se han diseñado recientemente aparatos TOF/TOF para solucionar este
problema. Los instrumentos TOF/TOF incorporan una célula de colisión entre dos
secciones TOF. Se seleccionan los iones de un cociente m/z en la primera sec-
ción TOF, se fragmentan en la célula de colisión y los fragmentos se separan en la
segunda sección TOF. Los instrumentos híbridos Q/TOF utilizan una disposición
semejante. Aquí la célula de colisión se coloca entre el filtro de masas cuadrupolo
y un analizador TOF. Los aparatos Q/TOF pueden emplearse con fuentes de
iones ESI y MALDI.
Los analizadores FTICR son muy versátiles y pueden combinarse con ambas fuentes
de iones MALDI y ESI. Recientemente, se ha combinado una trampa iónica con
FTICR. La trampa iónica se emplea para recoger los iones y luego aislarlos y frag-
mentarlos para su inyección en la célula FTICR donde se determinan las masas con
mucha exactitud. Esta disposición combina la alta capacidad de iones y los tiem-
pos altos de barrido de las trampas iónicas con las ventajas de la FTICR.

Identificación de las proteínas

Existen varias estrategias para identificar las proteínas a partir de los datos de
espectrometría de masas. Las principales son la técnica de «huellas de masa» y la
 segunda la secuenciación. La técnica de «huellas de masa» (mass fingerprinting)
utiliza fundamentalmente MALDI-TOF MS [7] y la secuenciación de péptidos es-
pectrometría de masas tandem [8]. La espectrometría de masas tandem normal-
mente se realiza en un espectrómetro de masas de triple cuadrupolo, un cuadrupo-
lo de trampa iónica o un híbrido cuadrupolo-TOF, frecuentemente con cromato-
grafía líquida en línea.

Huellas de masa

Las masas de los péptidos pueden calcularse para cada entrada de una base de
datos de secuencias proteicas (o de la traducción de una base de datos de se-
cuencias de nucleótidos) utilizando la especificidad de rotura de la proteasa que
se emplea en el análisis, generalmente la tripsina. Así pues, se determinan las
masas experimentales mediante MALDI-TOF tras la digestión proteolítica de la
proteína aislada, normalmente separada por 2D-PAGE. Se comparan las masas
observadas con el conjunto de masas peptídicas calculadas y se genera una
puntuación basada en el número de masas que coinciden con las calculadas.
Como se ha señalado, la tripsina es la enzima favorita para las huellas de masa.
Es relativamente barata, muy eficaz y genera péptidos con un tamaño medio de
unos 8-10 aminoácidos, muy adecuados para el análisis por MS. Los programas
74
de búsqueda accesibles en Internet para las huellas de masa que más se emplean
son Mascot [9], MS-Fit [10] y ProFound [11]. En principio, deben obtenerse los
mismos resultados con todos los programas cuando se emplean los mismos pará-
metros. Una descripción más detallada del análisis de las huellas de masa en los
estudios proteómicos puede encontrarse en el trabajo de Thiede et al [12].

Secuenciación

La secuenciación de péptidos mediante MS utiliza dos espectrómetros de masas

conectados en serie. Tras la ionización mediante ESI, la mezcla de péptidos car-
gados penetra en el primer espectrómetro de masas, que puede ser un analizador
de trampa iónica o un analizador de cuadrupolo, donde se separan de acuerdo
con sus cocientes m/z para crear una lista de los picos peptídicos más intensos. El
aparato se ajusta de forma que sólo una especie específica m/z se dirija a una
celda de colisión, donde sufre colisiones con moléculas de un gas inerte como el
argón. Los enlaces más lábiles de los péptidos generalmente son los enlaces ami-
da del esqueleto, lo que conduce a la fragmentación del esqueleto peptídico entre
los aminoácidos. Los fragmentos se separan en el segundo espectrómetro de ma-
sas, que suele ser un dispositivo TOF, de acuerdo con su cociente m/z. Los espec-
tros de masas tandem contienen una serie de iones fragmentos secuenciales [13].
Las señales de los iones fragmentos reflejan la secuencia de aminoácidos leída
Figura 5.5. Obtención de la secuencia de una proteína por espectrometría de
masas en tándem. Imagen tomada de Lehninger, Principios de Bioquímica

desde el extremo N-terminal o C-terminal (Figura 5.5). Las diferencias de peso

molecular entre los fragmentos sucesivos, que se diferencian en la masa de un
aminoácido, identifica la secuencia del péptido.
Para la fragmentación de los péptidos lineales protonados, la nomenclatura acep-
tada utiliza a,b,c para indicar los tipos comunes de iones producto que contienen
el N Terminal y x,y,z para aquellos iones que contienen el C Terminal [14]. La 75
diferencia de masa entre dos iones producto consecutivos del mismo tipo de letra
representa la masa del residuo de aminoácido intercalado. La información de los
fragmentos internos que no contienen ningún extremo también puede ayudar a
establecer o confirmar la composición del péptido.
Existen varios programas para comparar los espectros MS/MS con las bases de
datos de secuencias. En el momento actual, los dos algoritmos de búsqueda en
bases de datos más utilizados son SEQUEST (http://fields.scripps.edu/sequest)
[15] y MASCOT (http://www.matrixscience.com) [9]. No se ha revelado con
detalle la «función de puntuación» de MASCOT y, de esta forma, se considera
una «caja negra» para los usuarios. En cambio, el algoritmo de operación de
SEQUEST si se ha descrito [16].
El análisis de los datos de MS por parte de SEQUEST comienza con la reducción
de la complejidad del espectro tandem. Sólo se considera un cierto número de los
iones más abundantes y el resto se descarta. También se elimina del espectro el
ión precursor no fragmentado para evitar su identificación errónea como un frag-
mento. A continuación, se seleccionan secuencias de una base de datos. En pri-
mer lugar se crea una lista de péptidos que tienen masas iguales o cercanas a la
masa del ión precursor. Luego, se genera un espectro virtual MS/MS para cada
uno de los candidatos y se compara con el espectro observado. Como resultado
de esta comparación se produce una puntuación de correlación cruzada. Otra
puntuación, Delta CN, refleja la diferencia de correlación del segundo con rela-
 ción al primero. Cuanto mayor sea esta puntuación, más probable es que el pri-
mer emparejamiento sea el correcto. SEQUEST también puede detectar modifica-
ciones posteriores a la traducción. En este caso se observa el aumento de masa
de los aminoácidos.
Sin embargo, tal y como fue diseñado SEQUEST no asimilaba las puntuaciones
peptídicas compuestas en una puntuación proteica global como lo hace MAS-
COT. Esas funciones se han desarrollado recientemente y están englobadas en
dos programas: PeptideProphet [17], que permite clasificar a los péptidos identifi-
cados de acuerdo con una probabilidad estadística y ProteinProphet [18] que
asimila estas puntuaciones de los péptidos en una puntuación de probabilidad
global para la proteína. Puede consultarse el trabajo de Johson et al [19] en el
que se revisa la identificación de proteínas por espectrometría de masas.

Caracterización de las modificaciones posteriores a la traducción por

espectrometría de masas

Una proteína que ha sufrido una modificación posterior a la traducción exhibe un

aumento o descenso de masa con relación al peso molecular calculado a partir de
la secuencia de aminoácidos. La fosforilación de un residuo de tirosina conduce a
76
un aumento de la masa de 80 Da, que podría, en principio, detectarse por una
determinación de masa muy exacta mediante la espectrometría de masas de la
proteína intacta. Normalmente, las proteínas modificadas se caracterizan por
digestión enzimática y posterior cartografiado de masas. En el caso de que la
masa del péptido modificado no sea suficiente para determinar la naturaleza de la
modificación y su localización, los péptidos respectivos se analizan por espectro-
metría de masas tandem. Este procedimiento es con mucha frecuencia el último
paso experimental en la caracterización de una proteína o péptido modificado.
Muchos de los procedimientos que se emplean en la actualidad para identificar y
caracterizar las proteínas con modificaciones posteriores a la traducción suelen
emplear alguna forma de enriquecimiento específico de las moléculas que van a
identificarse antes de caracterizarlas por MS. Este paso de enriquecimiento puede
realizarse a nivel de la proteína, así como a nivel de los péptidos. En el Capítulo
2 se han presentado algunas formas de enriquecimiento.

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 Capítulo 6

Micromatrices proteicas

Introducción

Los estudios proteómicos pueden también realizarse empleando una tecnología

totalmente diferente a la expuesta hasta aquí. Se trata de las micromatrices (mi-
croarrays) proteicas. Una micromatriz está formada por moléculas biológicas in-
movilizadas sobre una superficie plana, generalmente un porta de vidrio de mi-
croscopio al que se ha tratado, una microplaca u otro soporte. Las moléculas
biológicas inmovilizadas, que reciben el nombre de sondas, normalmente son 79
oligonucleótidos, productos de PCR, proteínas, péptidos, hidratos de carbono u
otras moléculas pequeñas. De forma ideal, las sondas deben retener la actividad,
permanecer estables y no separarse del soporte durante los pasos experimentales.
Las micromatrices se hacen reaccionar con las muestras (extractos celulares, suero,
productos de PCR) para que se produzcan los reconocimientos moleculares y,
posteriormente, se detecta esta unión. En este Capítulo se presentan las caracterís-
ticas principales de las micromatrices proteicas.

Tipos de micromatrices proteicas

Las micromatrices proteicas se fabrican como se ha señalado colocando sobre la

superficie una serie de puntos, que corresponden cada uno de ellos a una molécu-
la biológica. En las Figura 6.1 y 6.2 se muestra un robot para la aplicación de las
moléculas biológicas sobre las micromatrices y un esquema del proceso de elabo-
ración de las mismas, respectivamente. Las micromatrices biológicas pueden ser
de tres tipos:

1. Micromatrices funcionales
2. Micromatrices de detección (o matrices analíticas)
3. Micromatrices de fase inversa
 Las micromatrices funcionales pueden utilizarse para analizar las propiedades bio-
químicas como la actividad enzimática y la especificidad de sustrato [1]. Las inte-
racciones enzima-sustrato pueden determinarse colocando posibles sustratos sobre la
micromatriz, incubándolas con la enzima y luego cuantificando la actividad enzimá-
tica de cada punto. Para determinar las interacciones proteína-proteína, se inmovili-
zan péptidos o proteínas sobre la micromatriz y esta se incuba con posibles compa-
ñeros de unión. Se detecta la interacción con marcajes fluorescentes. Otras
interacciones que pueden estudiarse son proteína-proteína, hormona-receptor o car-
tografiar epítopos.
En las micromatrices proteicas de detección se inmovilizan sobre el soporte diver-
sos reactivos de afinidad (antígenos o anticuerpos) que se utilizan para determinar
la abundancia de proteínas en una matriz compleja como el suero [2] (Figura
6.3). Las micromatrices analíticas pueden emplearse para determinar anticuerpos,
en el diagnóstico de la alergia o las enfermedades autoinmunitarias o para contro-
lar la expresión proteica a gran escala. En una tercera categoría de micromatrices

Figura 6.1. Robot para la aplicación de los ligandos de captura de las

micromatrices

80
proteicas, que normalmente reciben el nombre de micromatrices en fase inversa
[3], los tejidos, los lisados celulares o las muestras de suero se colocan sobre la
superficie de la micromatriz y se analizan con un anticuerpo por analito para una
lectura múltiple.

Figura 6.2. Proceso de fabricación de una micromatriz proteica

81

Figura 6.3. Diferentes clases de matrices proteicas

 Métodos de unión

Se han empleado diversos métodos para unir la proteína a la matriz, entre ellos la
adsorción pasiva de anticuerpos a membranas, los vidrios recubiertos de poli-L-
lisina, los hidrogeles, la unión covalente a vidrios recubiertos de aminas reactivas y
la unión de anticuerpos biotinilados a vidrios recubiertos de estreptavidina.
Aún no se ha determinado cual es la mejor elección de la superficie y depende de
la aplicación o del método de detección utilizado [4]. Los factores que hay que
tener en cuenta al evaluar las superficies son la reproducibilidad y la consistencia
tanto del fondo como de las señales, los niveles de las señales con relación a los
niveles de fondo y la capacidad de las superficies para mantener los anticuerpos
en unas formas reactivas plegadas adecuadamente.
La forma más simple de unir una proteína es la adsorción superficial. Esta estrate-
gia empleada durante mucho tiempo en los ELISA y las transferencias Western se
basa en la adsorción de las macromoléculas por medio de fuerzas electrostáticas
a superficies cargadas (portas recubiertos de poli-lisina) o por interacciones hidró-
fobas (membranas de nitrocelulosa o fluoruro de polivinildeno). Los portas recubier-
tos de nitrocelulosa muestran una capacidad de unión excelente y larga estabili-
dad de las sondas impresas. Sin embargo, la unión inespecífica a la nitrocelulosa
puede representar un problema significativo. A pesar de su simplicidad, el método
82
de adsorción tiene algunos inconvenientes, como son la separación de las proteí-
nas unidas con las condiciones severas de lavado, el fondo elevado debido a la
adsorción-desadsorción proteica inespecífica y a que las proteínas adsorbidas
sobre las superficies hidrófobas tienden a desnaturalizarse.
Una estrategia más fuerte es la unión covalente de proteínas y péptidos sobre la
superficie de una microplaca. El mecanismo covalente de enganche necesita la
presencia de grupos reactivos sobre el soporte, normalmente grupos electrófilos
como los epóxidos, los aldehídos y los ésteres/isotiocianatos de succimidilo ca-
paces de reaccionar con grupos nucleófilos (amino, tiol, hidroxilo) sobre las molé-
culas de ligando.
Una vía alternativa para inmovilizar las proteínas es utilizar una matriz que embe-
be la proteína en un entorno estructurado. Este mecanismo no implica el entrecru-
zamiento de las moléculas de captura con la superficie sino que se basa en el
atrapamiento físico de las proteínas en geles como la poliacrilamida o la agarosa.
Con independencia del sistema de unión, la inmovilización se produce con una
orientación aleatoria o inespecífica. Además de los métodos inespecíficos, las
moléculas sonda pueden marcarse e inmovilizarse por una interacción específica
no covalente entre la marca y las moléculas de captura inmovilizadas. Utilizando
estrategias de afinidad, la inmovilización tiene lugar de un modo orientado, uni-
forme y específico. La desventaja de esta estrategia es que las proteínas deben
biotinilarse o marcarse.
A pesar de la falta de una superficie ideal universal o de una estrategia de inmovi-
lización, los resultados publicados indican que está claro que los métodos existen-
tes son más que adecuados para muchas aplicaciones [5].

Ligandos de captura

La selección y producción de los agentes de captura son los puntos más críticos de
las macromatrices de detección de proteínas [6]. Existe una gran variedad de
ligandos de captura para su uso en las micromatrices proteicas. La clase principal
es la de anticuerpos, debido a su alta estabilidad, especificidad y afinidad para
las moléculas diana. Se han empleado micromatrices de autoantígenos para la
detección específica de autoanticuerpos y micromatrices de antígenos en estudios
de alergia.
Los péptidos sintéticos tienen características interesantes como ligandos de captu-
ra: pueden mimetizar las actividades biológicas de las proteínas, son fáciles de
sintetizar y manipular y son normalmente muy estables y baratos. Desgraciadamen-
te a veces carecen de una alta afinidad frente a las proteínas diana.

83
Detección

La detección puede hacerse utilizando métodos sin marcaje y métodos con sondas
marcadas [Espina, 2004]. Entre los métodos sin marcaje se encuentran la espec-
trometría de masas (MS), la resonancia de plasmón superficial (SPR), la microsco-
pia de fuerza atómica (AFM), los sistemas de «microvoladizos» (microcantilevers)
electromecánicos y el análisis con microbalanza de cristal de cuarzo (QCM). Entre
los métodos con sondas marcadas están la detección por fluorescencia, quimiolu-
miniscencia, electroquimioluminiscencia y radiactividad.

Métodos sin marcaje

Las micromatrices proteicas basadas en la espectrometría de masas con el método

de desabsorción/ionización por láser con ayuda de una matriz (SELDI TOF MS)
utilizan una superficie selectiva para inmovilizar las proteínas que interesan de una
solución proteica compleja. La ionización posterior de las moléculas retenidas y su
vuelo hacia el detector permiten su clasificación de acuerdo con su cociente ma-
sa/carga. En un apartado posterior de este Capítulo se describe con mayor dete-
nimiento esta técnica.
Los detectores de resonancia de plasmón superficial son biosensores ópticos que
detectan interacciones entre las moléculas. En la espectroscopia SPR convencional,
 el ligando de captura se inmoviliza sobre una película metálica delgada de oro o
plata. A continuación se añade la diana. La cantidad de molécula diana captura-
da sobre la superficie viene dada por la variación del ángulo de reflexión de la
luz incidente.
La microscopía de fuerza atómica revela la variación de la altura de una proteína
tras la unión con su molécula afín. Los «microvoladizos» para la detección biológi-
ca son tiras de silicio unidas en un extremo, con una molécula de captura unida a
la superficie. Cuando se une un analito al «microvoladizo» se mide su combado
como consecuencia de la tensión por la deflexión de un rayo óptico o por la va-
riación de resistencia eléctrica en una delgada lámina piezoeléctrica sobre el
«microvoladizo». También puede medirse la variación de su frecuencia mecánica
resonante. La microbalanza de cristal de cuarzo es un sistema sensible de medida
de la masa a nivel de nanogramos que puede utilizarse para controlar aconteci-
mientos biológicos como las interacciones moleculares en tiempo real.

Métodos con sondas marcadas

Los métodos de detección con sondas marcadas derivan de los protocolos de

inmunoanálisis. Pueden ser directos, indirectos o sandwich. Los métodos directos
son aquellos en los que la mezcla de proteínas está inmovilizada y la detección se
84
realiza utilizando moléculas marcadas de unión como los anticuerpos. En los mé-
todos indirectos se utilizan anticuerpos inmovilizados como ligandos de captura y
se detectan con proteínas marcadas. Finalmente, los métodos sandwich son aque-
llos en los que un primer anticuerpo inmovilizado actúa como agente de captura
para la proteína analizada que se revela por el reconocimiento con un anticuerpo
secundario marcado. En cada caso, la localización espacial del reactivo específi-
co de captura sobre la micromatriz define la identidad del analito medido en esa
localización.
Los métodos de detección con sondas marcadas dependen de estrategias de
marcaje de fluorescencia, cromogénicas, quimioluminiscentes, electroquimiolumi-
niscentes o de radiactividad.

Fluorescencia
Se han empleado diversos compuestos fluorescentes como marcaje en los métodos
con micromatrices y en la actualidad son el método preferido de detección [8]. Se
utilizan mucho para la detección de proteínas los colorantes Cy3 y Cy5.
Una estrategia muy utilizada es la amplificación de círculo rodante (rolling circle
amplification, RCA) que mejora la sensibilidad de la detección de fluorescencia
para detectar antígenos por debajo de una concentración femtomolar [9]. El sis-
tema RCA utiliza un anticuerpo «reportero» conjugado con un oligonucleótido. El
anticuerpo reportero se une al analito de la muestra capturado sobre la superficie
sólida de la micromatriz. Un DNA circular hibrida con una secuencia complemen-
taria del oligonucleótido. El complejo resultante se lava para eliminar el exceso de
reactivos y se amplifica el DNA marcador mediante la DNA polimerasa. El pro-
ducto amplificado se marca in situ por hibridación con oligonucleótidos marcados
con fluorescencia.

Detección cromogénica
Los cromógenos son sustratos de una reacción enzimática que genera un producto
coloreado insoluble. Las enzimas más empleadas para las reacciones cromogéni-
cas en micromatrices son la fosfatasa alcalina y la peroxidasa de rábano picante.
Estas enzimas actúan sobre sustratos químicos incoloros generando productos
coloreados.

Quimioluminiscencia
La quimioluminiscencia, que es la luminiscencia generada por una reacción quími-
ca, normalmente se emplea en micromatrices para la detección de proteínas reco-
nocidas por anticuerpos secundarios marcados con fosfatasa alcalina o peroxida-
sa de rábano picante.

Radiactividad
85
El marcaje radiactivo se realiza principalmebte con isótopos como el 32P o el 3H
incorporados a las proteínas o por sondas de triyodotironina-125I. La detección de
la señal se visualiza por autorradiografía y se cuantifica con un densitómetro.

SELDI-TOF MS

El sistema SELDI-TOF MS (Surface enhanced laser-desorption/ionization time-of-

fligth mass spectrometry, Espectrometría de masas de tiempo de vuelo con desab-
sorción/ionización potenciada por laser) fue introducido por Hutchens y Yip en
1993 [10]. El sistema emplea un «chip» proteico para retener las proteínas sobre
una superficie cromatográfica en fase sólida. Posteriormente se produce la desab-
sorción e ionización de las proteínas y su detección por espectrometría de masas
con TOF. La tecnología SELDI-TOF MS consta de tres componentes: la matriz pro-
teica, el analizador de masa y los programas informáticos de análisis de datos
[11].

Matriz proteica

El corazón de la tecnología SELDI-TOF MS es la matriz proteica (protein chip

array) [12]. La matriz proteica es una placa de 80x10 mm que contiene entre 8 y
 16 «manchas» formadas por una superficie cromatográfica específica. Cada su-
perficie está diseñada para seleccionar proteínas a partir de extractos crudos de
acuerdo con propiedades proteicas generales o específicas. Cada mancha con-
tiene una superficie tratada de forma química (aniónica, catiónica, hidrófoba,
hidrófila, etc.) o de forma bioquímica (anticuerpo, receptor, DNA, enzima, etc.).
De forma característica, las superficies tratadas con un agente bioquímico, como
un anticuerpo u otro tipo de reactivo de afinidad, están diseñadas para interac-
cionar de forma específica con una única proteína diana, mientras que las superfi-
cies tratadas de forma química retienen clases completas de proteínas. Una de las
características singulares de la SELDI-TOF MS que la ha hecho una herramienta
popular en el análisis de líquidos biológicos complejos como el suero es su capa-
cidad para analizar muestras «en bruto» con un formato de matriz, lo cual facilita
el poder analizar un gran número de muestras en poco tiempo.
Para trabajar se colocan unos pocos microlitros de la muestra sobre la superficie
del «chip» con unas condiciones específicas de unión que determinan las proteínas
que serán retenidas por la superficie. La especificidad proteica se consigue con la
aplicación de una serie de lavados con un disolvente o amortiguador adecuado
diseñado para que eluyan las proteínas no unidas y las sustancias que interfieren,
como las sales, los detergentes, los lípidos, etc., al tiempo que quedan retenidas
las proteínas de interés. Tras dejar que se seque la matriz, se añade una disolu-
86
ción de una molécula que absorbe energía y la matriz se inserta en el lector para
medir los pesos moleculares de las proteínas unidas.

Analizador de masa

El analizador de masa más común para obtener los patrones proteómicos es un

TOF MS relativamente simple equipado con un láser de nitrógeno de pulsos UV.
Este instrumento se conoce por el nombre comercial de ProteinChip Biomarker
System-II (PBS-II) MS. Tras la activación del láser, se irradian las muestras y se
produce la desabsorción/ionización que libera los iones gaseosos de la matriz.
Estos iones gaseosos entran en la región MS-TOF del aparato, que mide la rela-
ción m/z de cada proteína, de acuerdo con su velocidad a través de la cámara
iónica. El procesamiento de la señal se realiza mediante un convertidor analógi-
co/digital. Las proteínas detectadas se representan como una serie de picos. La
señal generada por muestras con muchas proteínas es un trazado que muestra la
abundancia relativa frente a los pesos moleculares de las proteínas detectadas. Se
han diseñado programas de ordenador para identificar las diferencias de abun-
dancia de proteínas entre dos muestras.
El sistema MALDI-TOF posee una sensibilidad relativamente elevada pero una
resolución y exactitud de masas bajas. El valor de los resultados de este sistema
descansa en la capacidad de obtener espectros de un número significativo de
muestras en un periodo de tiempo relativamente corto con poca preparación de la
muestra. El análisis de un gran número de muestras de forma ideal revelará un
patrón de señales de proteínas que son únicas o que se sobreexpresan en un
conjunto de muestras cuando se comparan con un conjunto de muestras diferentes.

Programas de análisis del patrón proteómico

El resultado neto del análisis de una mezcla proteómica compleja mediante MS

SELDI-TOF es un perfil de baja resolución de las especies proteicas o peptídicas
que estaban unidas a la superficie de la matriz y que posteriormente fueron ioni-
zadas. El desarrollo y combinación de algoritmos bioinformáticos sofisticados para
el análisis de los datos SELDI-TOF MS es lo que ha conducido a la aplicación
potencial de esta tecnología como un avance en el diagnóstico del cáncer y otras
enfermedades. Hay varios tipos diferentes de algoritmos bioinformáticos, como los
árboles de clasificación, las redes neurales, los algoritmos genéticos y los algorit-
mos de bosque alatorios. Aunque funcionan de forma diferente, todos ellos com-
parten un objetivo común que es construir un clasificador y descubrir las intensida-
des de pico que con mayor probabilidad sean responsables de segregar clases
de muestras.
Un avance de esta tecnología ha sido la utilización de un MS híbrido cuadrupolo
87
TOF (QqTOF) de alta resolución equipado con una fuente de iones SELDI para
obtener patrones proteómicos del suero. Se ha realizado un estudio de cáncer de
ovario con este sistema y el convencional [13], obteniéndose mejores resultados.

Automatización

En los últimos años se han introducido algunos sistemas para automatizar los análi-
sis con micromatrices. Ciphergen (www.ciphergen.com) ha fabricado una plata-
forma que utiliza la tecnología SELDI para identificar biomarcadores. El Protein-
Chip System Series 4000, que integra instrumentación, programas informáticos y
matrices, puede funcionar de cuatro modos que son descubrimiento, purificación,
identificación y análisis de biomarcadores.
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 Capítulo 7

Proteómica del plasma y

proteómica de las células sanguíneas

Introducción

La medida de las proteínas del plasma se emplea desde hace mucho tiempo como
parámetro de utilidad para el diagnóstico y seguimiento de muchas enfermedades.
Desde hace unos pocos años la introducción de métodos potentes de separación
como la electroforesis bidimensional en gel o las separaciones multidimensionales,
junto con la identificación de las proteínas por medio de espectrometría de masas
han permitido la transición del análisis de proteínas desde las determinaciones una
a una al análisis simultáneo de mezclas muy complejas. 89
El plasma humano es un espécimen clínico primario fundamental en el diagnóstico
de enfermedades y el control terapéutico. El plasma es un gran depósito de pro-
teínas que contiene miles de proteínas diferentes, entre las que se encuentran las
proteínas sanguíneas clásicas y otras muchas proteínas secretadas, vertidas o
perdidas de células y tejidos de todo el cuerpo. Una vez identificados los biomar-
cadores proteicos en un órgano o tejido se puede analizar el plasma sanguíneo
para buscar esos marcadores biológicos en la circulación.
Dado que el plasma/suero sanguíneo puede contener alguna combinación resi-
dual y potencialmente detectable de todos los sub-proteomas diferenciados del
organismo, los análisis del plasma pueden proporcionar información sobre estos
tejidos y, además, pueden proporcionar información con relación a casi cualquier
estado de enfermedad. En concreto, el plasma humano es potencialmente la mues-
tra más informativa que puede recogerse de una persona y que describe su estado
actual de salud. Aunque el plasma sanguíneo parece ser ideal para el análisis
proteómico con aplicaciones clínicas casi ilimitadas, la investigación proteómica
del plasma humano es más complicada que otras aplicaciones proteómicas como
los estudios celulares y microbianos. En este Capítulo se describe el estado actual
de la proteómica del plasma sanguíneo. Como señalan Liotta et al [1] quizás
llegue un tiempo en el que una pequeña muestra de sangre revelará una imagen
de los estados fisiológicos y patológicos de cada uno de los tejidos del organis-
mo. Asimismo, se incluye la descripción de los estudios que se están realizando
 sobre el proteoma de las diferentes células sanguíneas y su aplicación a las en-
fermedades hematológicas.

Proteínas plasmáticas

El plasma sanguíneo de un adulto contiene entre 60 y 80 mg/mL de proteínas,

con un número muy elevado de especies diferentes. La concentración de cada tipo
de proteína es muy variable, con proteínas como la albúmina con una concentra-
ción de entre 35-50 mg/mL hasta proteínas como la interleuquina 6 con una
concentración de alrededor de 2 x 10-12 mg/mL (2 pg/mL). En el plasma sanguí-
neo circulan proteínas intactas, así como otras parcialmente degradadas o frag-
mentos proteicos. Además, se encuentran presentes polimorfismos genéticos y
numerosas formas con modificaciones posteriores a la traducción, añadiendo
complejidad a la diversidad de las proteínas del plasma.
Las proteínas del plasma sanguíneo pueden ser específicas de éste si ejercen en él
su función, o inespecíficas, si se encuentran en él para ser transportadas o por
haber irrumpido como consecuencia de pérdidas de algún órgano o tejido daña-
do. Cada categoría de proteínas está a distintos niveles de concentración en el
plasma. Las proteínas específicas del plasma suelen encontrarse en concentracio-
90
nes altas. Entre estas proteínas están la albúmina, las inmunoglobulinas, las hapto-
globinas y la transferrina, por nombrar algunas. Las 22 proteínas más abundantes
representan aproximadamente el 99% del contenido proteico del plasma. Estas
proteínas están muy bien caracterizadas y muchas de ellas se han empleado como
indicadores diagnósticos de varios estados y/o enfermedades. Así, por ejemplo,
la proteína C reactiva se utiliza en las respuestas de fase aguda y la ferritina y la
transferrina como indicadores de déficit de hierro y anemia.
La segunda clase de proteínas, constituida por aquellas que no tienen una función
definida en el plasma, es la más grande y es la diana de los estudios proteómi-
cos. Son las proteínas que se encuentran en el plasma como consecuencia de su
salida de algún órgano o tejido.
La concentración de las proteínas plasmáticas en un momento dado es el resultado de
tres procesos: síntesis, volumen de líquido en que se distribuyen y degradación. La
mayoría de las proteínas del plasma se sintetizan en el hígado, aunque algunas de
ellas se forman en otros lugares, como las inmunoglobulinas que se forman en los
linfocitos B. Las proteínas plasmáticas están presentes tanto en el espacio vascular
como en el extravascular, en los que se distribuyen de acuerdo con sus masas molecu-
lares. Con relación a la desaparición de las proteínas plasmáticas hay que considerar
juntas las pérdidas externas y la degradación. El catabolismo de las proteínas plasmá-
ticas se produce en mayor o menor medida en todas las células del organismo, que
las captan y degradan en su interior, aprovechando los aminoácidos producidos.
La concentración total de proteínas plasmáticas se mide mediante métodos quími-
cos. El método más utilizado para la medida de las proteínas plasmáticas en los
laboratorios clínicos es el del biuret, en el que se forma un quelato coloreado entre
el ión Cu2+ y los átomos de oxígeno del carbonilo y de nitrógeno de la amida del
enlace peptídico.
La alteración de la concentración de las proteínas plasmáticas puede deberse a
modificaciones de la síntesis, de la degradación o de los cambios del volumen de
distribución. En diversos estados patológicos, estos procesos pueden superponerse
e, incluso, ir en direcciones opuestas. En la práctica, la determinación de la con-
centración total de proteínas plasmáticas es una medida que sólo refleja los cam-
bios de las proteínas más abundantes, como la albúmina y las inmunoglobulinas, y
tiene un valor relativo. Las principales situaciones en las que se encuentran eleva-
das las proteínas totales son las hipergammaglobulinemias y los estados hipovolé-
micos. Las proteínas totales del plasma sanguíneo se encuentran disminuidas en las
deficiencias nutritivas; las situaciones con descenso de la síntesis, como las hepa-
topatías graves y la agammaglobulinemia; los procesos en los que se pierden,
como los trastornos renales, los gastrointestinales o las dermopatías graves y las
situaciones con un aumento del catabolismo como la fiebre, la inflamación, las
enfermedades crónicas y el cáncer.
91
Separación por electroforesis

Las proteínas plasmáticas pueden separarse por electroforesis en varias fracciones

o grupos. Uno de los soportes más empleados para la separación electroforética
son las tiras de acetato de celulosa. En este soporte las principales fracciones en
orden decreciente de movilidad son: albúmina y α1, α2, β y γ globulinas. Cada
una de estas fracciones está formada por muchas proteínas. La albúmina es la
proteína más abundante del plasma sanguíneo. La fracción de α1 globulinas está
compuesta principalmente por la α1-glucoproteína ácida, la α1-antitripsina y las α-
lipoproteínas. La fracción de α2-globulinas está formada por la α2-macroglobulina,
la ceruloplasmina y la haptoglobina. La fracción de β-globulinas está formada por
las β-lipoproteínas, la transferrina, le hemopexina y el complemento C3. Las γ-
globulinas o inmunoglobulinas son producidas por las células plasmáticas y sus
precursores los linfocitos B.
Determinados patrones electroforéticos de las proteínas del suero son característi-
cos de determinadas enfermedades, como el síndrome nefrótico, el síndrome in-
flamatorio crónico o agudo, la hipogammaglobulinemia e hipergammaglobuline-
mia, la deficiencia de α1-antitripsina y las paraproteinemias.
La mayor parte de las proteínas que constituyen las fracciones α1 y α2 aumenta en
los procesos en los que hay una lesión tisular activa, lo que se denomina reacción
de fase aguda. No obstante, los incrementos de α1 y α2 globulinas son hallazgos
 poco específicos en la mayor parte de los casos. Se observan incrementos en los
estados de agresión o inflamatorios, consecuencia de infecciones, traumatismos,
postoperatorios, necrosis tisulares y enfermedades autoinmunitarias. Las β-glo-
bulinas aumentan en los procesos que cursan con hiperlipoproteinemias. También,
en la deficiencia de hierro o las concentraciones elevadas de estrógenos se obser-
va una elevación de la banda β correspondiente a la transferrina. La fusión o un
puente entre las bandas β y γ sugiere un aumento de IgA, tal y como se observa
en la cirrosis, las infecciones del tracto respiratorio o la piel y la artritis reumatoide.
Los aumentos difusos de la banda de γ-globulinas señalan aumentos policlonales
de las inmunoglobulinas asociados con una reacción inmunitaria, una enfermedad
inflamatoria crónica, una enfermedad hepática o una neoplasia diseminada. En
las gammapatías monoclonales se observa una banda estrecha en la región de las
γ-globulinas.

Determinación de proteínas específicas

Algunas proteínas plasmáticas pueden medirse de forma específica. La cuantifica-

ción de las proteínas plasmáticas específicas se realiza mediante métodos inmu-
noquímicos (nefelometría, turbidimetría) e inmunoanálisis con reactivos marcados
(enzimoinmunoanálisis, fluoroinmunoanálisis, radioinmunoanálisis, luminoinmunoa-
92
nálisis). Las principales proteínas plasmáticas que se cuantifican de forma específi-
ca son albúmina, proteína de unión de retinol, α1-glucoproteína ácida, α1-
antitripsina, proteína C reactiva, α2-macrogloblina, ceruloplasmina, haptoglobina,
transferrina, β2-microglobulina, inmunoglobulinas y proteínas del complemento.

Significado clínico de las proteínas más abundantes

La albúmina sólo aumenta en la deshidratación aguda y como consecuencia de

ello el hallazgo de valores elevados tiene poca utilidad clínica. El descenso de la
concentración de albúmina puede deberse a un descenso de su síntesis, un au-
mento de su catabolismo o una combinación de ambos. El descenso de la síntesis
de albúmina puede ser primario o genético como en la analbuminemia, o adquiri-
do, como en los procesos inflamatorios. La albúmina puede perderse por la orina
como en el síndrome nefrótico o por el tracto gastrointestinal como en la enteropa-
tía grave. La albúmina se ha utilizado como indicador del estado proteico general;
no obstante, su fiabilidad como indicador del estado nutritivo no es grande debido
a su larga vida media (19 días) y a la disminución de su síntesis en la mayoría de
los procesos inflamatorios.
La proteína de unión de retinol (RBP) es un reactante de fase aguda negativo, esto
es, desciende en estos procesos. Dada su corta vida media en el plasma (12
horas) es un marcador útil para el seguimiento del estado nutritivo a corto plazo.
La concentración sérica de RBP también es un indicador sensible de las variacio-
nes tempranas de la función glomerular.
La α1-glucoproteína ácida (AGA), también denominada orosomucoide, es útil para
el control precoz de las respuestas de fase aguda, en las que aumenta con un
pico a los 3-5 días. Desciende en el síndrome nefrótico, donde se pierde por la
orina debido a su pequeño tamaño.
La α1-antitripsina (AAT) es una de las proteínas que aumentan en las respuestas de fase
aguda. La síntesis de AAT se estimula por los estrógenos, por lo que se observan au-
mentos al final del embarazo y en la terapia con estrógenos. La deficiencia hereditaria
grave de la AAT se asocia con enfermedades hepáticas en los niños y enfermedades
pulmonares crónicas en los adultos. Se han descrito aproximadamente 75 variantes
hereditarias de AAT, de las que sólo unas pocas (nula, Z, S y P) se asocian con con-
centraciones séricas lo suficientemente bajas para producir enfermedades, especial-
mente en homocigotos o en determinadas combinaciones heterocigóticas.
La proteína C reactiva (PCR) es la proteína de fase aguda arquetipo y desempeña
un papel importante en la defensa temprana de determinadas infecciones. Su
concentración puede aumentar hasta 1000 veces. Su análisis secuencial es útil
para el control del tratamiento.
La α2-macroglobulina (A2M) es un inhibidor plasmático de proteinasas. Aumenta
en el síndrome nefrótico y disminuye en las respuestas de fase aguda. La cerulo-
93
plasmina (Cp) es una α2-globulina que contiene aproximadamente el 95% del
cobre del suero y su principal función son las reacciones redox del plasma, donde
puede actuar como oxidante o antioxidante. Suele medirse como prueba de de-
tección sistemática de la enfermedad de Wilson. La haptoglobina (Hp) es una α2-
glucoproteína que une hemoglobina de forma irreversible. Su principal utilidad es
la detección sistemática y el seguimiento de los trastornos hemolíticos.
La β2-microglobulina es una proteína de bajo peso molecular que constituye la
cadena β de los HLA de clase I. Aumenta en la insuficiencia renal, la inflamación
y las neoplasias. La transferrina es la proteína plasmática principal de transporte
de hierro (Fe3+). La evaluación de la concentración plasmática de transferrina es útil
para el diagnóstico diferencial de la anemia hipocrómica microcítica y para el
seguimiento del tratamiento. En la deficiencia de hierro, aumenta la transferrina y
se encuentra menos saturada con hierro.
Las proteínas del complemento C3 y C4 aumentan, principalmente C3, en las
respuestas de fase aguda. C3 aumenta también en la obstrucción biliar y en la
glomeruloesclerosis focal. C3 y C4 disminuyen en la inmunodeficiencia adquirida.
Los incrementos de las inmunoglobulinas pueden ser policlonales o monoclonales.
Los aumentos policlonales se producen especialmente en las inflamaciones cróni-
cas (cirrosis hepática, hepatitis crónica, poliartritis crónica, etc), mientras que los
aumentos monoclonales son característicos del mieloma. Las γ-globulinas disminu-
yen por defectos de su síntesis o por pérdidas importantes.
 Enzimas en plasma/suero

La medida de la actividad de diversas enzimas en el plasma/suero se emplea

desde hace mucho tiempo para el diagnóstico y seguimiento de un gran número
de estados patológicos. Así, la creatina quinasa (CK) y su isoenzima MB se em-
plean para el diagnóstico del infarto agudo de miocardio, las aminotransferasas
(AST, ALT) para el diagnóstico y seguimiento de las hepatitis agudas, la fosfatasa
alcalina (AP) para las enfermedades óseas y hepáticas, la amilasa para el diag-
nóstico y seguimiento de la pancreatitis aguda, la gammaglutamil transferasa
(GGT) para las enfermedades hepáticas y la lactato deshidrogenasa (LDH) para
diversas enfermedades cardíacas, hepáticas y hematológicas.

Marcadores tumorales

Los marcadores tumorales pueden definirse en un sentido amplio como aquellas

moléculas biológicas que se miden de forma cuantitativa en los tejidos o en los
líquidos corporales y que pueden tener utilidad clínica en los pacientes con cán-
cer. Los marcadores tumorales se emplean para la detección sistemática (scree-
ning), el diagnóstico, la estadificación, el pronóstico y el seguimiento de la res-
puesta al tratamiento o la detección de la recurrencia del tumor. El marcador
94
tumoral ideal debería ser muy específico de un único tipo de tumor y no estar
relacionado con otro estado patológico. Sin embargo, este tipo de marcadores
tan específicos son raros. La mayoría de los marcadores tumorales que se emplean
en la actualidad son proteínas que se expresan en las células durante el desarrollo
embrionario y en las células cancerosas. Estos marcadores suelen ser relativamente
específicos de las células tumorales, aunque no del tipo de cáncer. Así, pues, en
la actualidad, debido a la falta de sensibilidad y especificidad, ningún marcador
único se reconoce como verdadero marcador tumoral.
Entre los marcadores tumorales que se emplean hoy en día se encuentran el antí-
geno prostático específico (PSA) para el cáncer de próstata, el antígeno carci-
noembrionario (CEA) para el cáncer colorrectal, la α-fetoproteína (AFP) para el
carcinoma hepatocelular, el antígeno del cáncer CA15-3 para el cáncer de ma-
ma, el antígeno del cáncer CA19-9 para el cáncer gastrointestinal y el antígeno
del cáncer CA125 para el cáncer de ovario.

Caracterización del proteoma plasmático

La electroforesis bidimensional en gel establecida hace 30 años se aplicó pronto

para separar las proteínas plasmáticas [2]. La utilización de la espectrometría de
masas para identificar las proteínas obtenidas partir de las manchas de los geles
2D revolucionó el campo de la proteómica [3] (Figura 7.1). También, el empleo
de técnicas multidimensionales de separación ha contribuido a los estudios del
proteoma plasmático.

Figura 7.1. 2-DE de plasma humano. Imagen tomada del Swiss-2DE PAGE
(http://www.expasy.org/ch2d/)

95

Adkins et al [4] realizaron la primera aplicación proteómica de la técnica denomi-

nada «de escopetazo» al plasma/suero humano identificando 490 proteínas. Tras
hidrolizar con tripsina el suero, al que habían quitado las inmunoglobulinas, em-
plearon cromatografía líquida de intercambio catiónico fuerte fuera de línea y
luego una separación en fase reversa acoplada con un análisis MS/MS. Más
tarde, utilizando otra estrategia proteómica, como es la electroforesis bidimensio-
 nal junto con la espectrometría de masas y otras separaciones cromatográficas
(cromatografía de intercambio iónico y de exclusión de tamaño), se han detectado
3700 manchas e identificado 325 proteínas [5].
Tirumalai et al [6] han caracterizado el proteoma sérico humano de bajo peso
molecular (BPM), que es la fracción proteica/peptídica a la que se han quitado
las proteínas de alto peso molecular, como la albúmina, las inmunoglobulinas, la
transferrina y las lipoproteínas. Esta fracción de BPM está formada por varias
clases de proteínas con importancia fisiológica como las citoquinas, las quimio-
quinas, las hormonas peptídicas y los fragmentos proteolíticos de proteínas más
grandes. Utilizaron la ultrafiltración centrífuga del suero para eliminar las proteínas
grandes con el consiguiente enriquecimiento de las proteínas/péptidos de BPM.
Debido a que la albúmina une y transporta moléculas pequeñas y péptidos, reali-
zaron la ultracentrifugación diferencial en condiciones de disolvente que afectan la
rotura de las interacciones proteína-proteína. La muestra sérica del proteoma de
BPM se digirió con tripsina, se fraccionó por cromatografía de intercambio iónico
fuerte y se analizó por cromatografía líquida microcapilar en fase reversa acopla-
da en línea con espectrometría de masas tandem con ionización por electropulve-
rización. Identificaron finalmente 341 proteínas séricas.
En 2004, se compiló una lista no redundante de 1175 proteínas plasmáticas
detectadas de 4 orígenes diferentes, tres ya publicados previamente y una bús-
96
queda en la literatura [7]. Curiosamente, de esta lista de 1175 proteínas, sólo
195 (17%) se habían observado en al menos dos de los estudios previos con sólo
46 (4%) identificadas en los cuatro. Esto representaba un solapamiento sorpren-
dentemente bajo que se atribuyó a tres fuentes principales: diferentes métodos de
separación y detección, diferentes muestras de suero/plasma e identificaciones
erróneas dentro de cada uno de los estudios.
El fraccionamiento del plasma humano en 12960 fracciones por medio de técni-
cas de cromatografía multidimensional permitió identificar 502 proteínas [8]. La
identificación de un número relativamente pequeño de proteínas en el plas-
ma/suero sanguíneo humano indica la dificultad debida a la complejidad de la
muestra y al intervalo tan grande de concentraciones de sus componentes. Recien-
temente, la combinación de la depleción paso a paso de las IgG y la albúmina
mediante cromatografía de afinidad y la separación por cromatografía líquida
capilar de ultra-alta eficacia acopladas con espectrometría de masas tandem de
trampa iónica ha permitido identificar 2392 proteínas de una muestra de plasma
con un nivel de confianza superior al 94% y 2198 proteínas más con un nivel de
confianza del 80% [9]. Las abundancias relativas de las proteínas identificadas se
expande por un intervalo de concentración de más de ocho órdenes de magnitud
(<30 pg/mL hasta ~30 mg/mL) facilitado por el nivel de sensibilidad analítica de
atomol de los métodos de análisis. Más del 80% de las proteínas observadas
presentan interacciones con IgG y/o albúmina.
Recientemente, se ha presentado un estudio que emplea un procedimiento versátil de
separación multidimensional no desnaturalizante con tecnología de microplaca [10].
En la primera dimensión se separa la muestra en 96 fracciones por cromatografía de
exclusión de tamaño. En la segunda dimensión las fracciones de la primera dimen-
sión se transfieren mediante un dispositivo de manejo de líquidos a 96 columnas
cromatográficas paralelas de intercambio aniónico. De esta forma, las proteínas se
conservan en sus estados nativos y se distribuyen en 2400 fracciones líquidas. Estas
se someten a una cuantificación e identificación de las proteínas. Para cuantificar se
emplean métodos espectrofotométricos e inmunológicos y medidas de actividad
enzimática. La identificación de las proteínas se llevó a cabo por MALDI-TOF MS y
LC-ESI-MS/MS. Los autores identificaron con este sistema 742 proteínas.
Como se ha señalado, una de las iniciativas de la Organización del Proteoma
Humano (HUPO) es el Proyecto del Proteoma Plasmático (PPP) cuyos objetivos
específicos a largo plazo son:

(a) Un análisis completo de los constituyentes proteícos del plasma humano y el

suero humano.
(b) La identificación de las fuentes de variación entre las personas con el tiempo
debido a aspectos fisiológicos (edad, sexo, ciclo menstrual, ejercicio, estrés),
patológicos (diversas enfermedades, cohortes especiales) y tratamientos (medi-
97
caciones habituales).
(c) Determinar la cuantía de la variación entre las personas en las poblaciones y
entre poblaciones debido a factores genéticos, nutritivos y de otro tipo.

La HUPO ha lanzado una fase piloto para: (1) evaluar las ventajas y limitaciones de
muchas vías de depleción, fraccionamiento y tecnología MS; (2) comparar los espe-
címenes humanos de referencia de suero y plasma anticoagulado con EDTA, hepa-
rina y citrato, y (3) crear una base pública de conocimientos. Enviaron datos 35
laboratorios participantes de 13 países y se identificaron 3020 proteínas con dos o
más péptidos [11].
En la Segunda Conferencia Anual de la HUPO celebrada en marzo de 2006, los
investigadores trataron los retos que quedaban al PPP de la HUPO una vez con-
cluida la fase piloto [12]. De acuerdo con Gil Omenn, co-director del PPP, el
proyecto continuará con varios grupos de trabajo. Éstos probablemente se centra-
rán en seis misiones:

1. Desarrollar un consenso sobre los procedimientos operativos estándar.

2. Identificar o preparar estándares de referencia de péptidos, proteínas y plas-
ma.
3. Priorizar proteínas plasmáticas para la producción o consecución de anticuer-
pos por la HUPO Antibody Initiative (HAI).
 4. Reclutar varios laboratorios principales que tengan experiencia con tecnologías
avanzadas para analizar muestras de plasma y compartir los resultados.
5. Interaccionar con las iniciativas de la proteómica de enfermedades o de órganos.
6. Mantener un esfuerzo bioinformático para integrar los hallazgos del PPP, otras
iniciativas de HUPO y varios trabajos publicados.

Estrategias para el descubrimiento de marcadores biológicos de

enfermedad en el plasma/suero sanguíneo

La mayoría de los estudios proteómicos que utilizan el plasma humano no se diri-

gen hacia las proteínas con una abundancia entre alta y moderada, sino que
intentan centrarse en posibles biomarcadores capaces de diferenciar los distintos
estados de enfermedad o predecir su aparición. En general, se supone que estos
biomarcadores de interés no se originan a partir de las secreciones plasmáticas
clásicas, sino de la salida, secreción o degradación de proteínas del tejido, el
tipo celular o la ruta celular afectados. Pero una vez que las proteínas han salido
al plasma, aquí se diluyen en los 6 litros de éste, dando lugar a concentraciones
bajas. Esta idea es la que impulsa la necesidad de ampliar el intervalo dinámico
de detección, sin descartarse la posibilidad de encontrar biomarcadores en las
98
variantes o las modificaciones posteriores a la traducción de las proteínas plasmá-
ticas clásicas de gran abundancia. Teniendo en cuenta que la mayoría de los
posibles biomarcadores candidatos se van a encontrar en estas regiones de con-
centraciones tan bajas ¿qué se puede hacer?
Una estrategia utilizada en algunos estudios ha sido emplear un tejido o líquido
para identificar primero posibles candidatos y luego buscarlos en el plasma/suero.
Un ejemplo lo proporcionan Liao et al [13], que han empleado LC-MS/MS, y
Drynda et al [14], que ha utilizado 2D-PAGE, para examinar el líquido sinovial e
identificar marcadores proteicos de artritis reumatoide y luego han verificado estos
marcadores en muestras de suero y plasma, respectivamente.
Para detectar los posibles biomarcadores que se encuentran en concentraciones
muy pequeñas, los análisis proteómicos en plasma pueden abordarse de dos
formas diferentes. La primera es mejorar la propia tecnología (separación, espec-
trometría de masas) para permitir la detección e identificación dentro de un interva-
lo dinámico mayor de abundancias proteicas relativas. La segunda es mejorar de
forma eficaz la muestra del plasma enriqueciendo las proteínas de potencial inte-
rés, disminuyendo así el intervalo dinámico necesario para detectar más proteínas
candidatas.
Búsqueda de marcadores de cáncer mediante la técnica SELDI-TOF MS

El cáncer es una enfermedad del DNA que se origina en los genes mutados y que
conduce a una expresión proteica aberrante. De esta forma, se espera que los
estudios proteómicos del cáncer sean capaces de identificar marcadores biológi-
cos de la enfermedad que puedan emplearse tanto para el diagnóstico precoz
como para el seguimiento de la eficacia del tratamiento. Asimismo, pueden dise-
ñarse tratamientos a la medida de acuerdo con las expresiones proteicas.
Las micromatrices proteicas se han utilizado mucho para la detección precoz del
cáncer [15]. La tecnología SELDI-TOF MS utilizando muestras de suero se ha apli-
cado a los estudios del cáncer de ovario [16-18], mama [19-23], cabeza y cue-
llo [24], gastrointestinal [25], páncreas [26] y próstata [27].

Cáncer de ovario

En 2002, Petricoin et al [16] presentaron el primer estudio proteómico con la

técnica SELDI-TOF MS en pacientes con cáncer de ovario. Se analizó un conjunto
de «espectros» preliminares de entrenamiento procedentes del análisis del suero de
50 mujeres no afectadas y 50 pacientes con cáncer de ovario mediante un algo-
ritmo iterativo de búsqueda que identificó un patrón proteómico que discriminaba
99
totalmente el cáncer de su ausencia. El patrón descubierto se empleó posteriormen-
te para clasificar un conjunto independiente de 116 muestras de suero enmasca-
radas: 50 de mujeres con cáncer de ovario y 66 de mujeres no afectadas o con
enfermedades no malignas. El patrón discriminador identificó correctamente los 50
cánceres de ovario en el conjunto enmascarado. De los 66 casos de enfermedad
no maligna, 63 fueron reconocidos como no cánceres.
El estudio inicial de Petricoin ha sido criticado al no poder reproducirse los resul-
tados [28,29]. Las críticas con relación a la reproducibilidad de los perfiles
proteicos y la identidad de los biomarcadores propuestos han enfatizado la
importancia de la validación y reproducibilidad en los grupos con muchas mues-
tras y en diferentes laboratorios, junto con la necesidad de identificar al biomar-
cador [28-32].
En un estudio multicéntrico con validación cruzada entre 503 individuos de los
centros participantes se han identificado tres biomarcadores [17]. Estos tres bio-
marcadores eran la apo A1 (descenso en el cáncer), una forma truncada de la
transtiretina (descenso) y un fragmento fraccionado de la cadena pesada H4 del
inhibidor de la α-tripsina (aumento). La sensibilidad de un modelo multivariado que
combinaba estos tres marcadores fue superior a la del CA-125. Las masas de las
proteínas correspondientes a dos de los tres biomarcadores se volvieron a detectar
en un estudio independiente que utilizó distintas matrices, tratándose de las mismas
proteínas [18].
 Los biomarcadores séricos de cáncer de ovario observados son todos ellos proteínas
séricas conocidas, que es poco probable se originen en el tumor, aunque las modi-
ficaciones específicas podrían conferir especificidad tumoral a estas proteínas.

Cáncer de mama

También se ha aplicado la técnica SELDI-TOF MS al estudio del cáncer de mama.

Se ha encontrado un patrón de sólo tres biomarcadores séricos que diferenciaban
a las pacientes de los controles: dos (8.1 kDa y 8.9 kDa) con mayor expresión y
uno (4.3 kDa) con menor expresión en las pacientes [19]. La sensibilidad y especi-
ficidad eran del 93% y el 91%, respectivamente. Una nueva población sólo con-
firmó el aumento de expresión de los picos de 8.1 kDa y 8.9 kDa [20]. Otro
grupo empleando el mismo análisis para sus pacientes con cáncer de mama no
pudo confirmar la diferencia de expresión a 8.1 kDa [22]. Se han observado
diferencias en las pacientes con cáncer que tienen la mutación BCRA-1 y las que
no la tienen (cáncer esporádico). Una de ellas era la sobreexpresión de un pico a
8.1 kDa [23]. Como se desconoce la identidad del pico, no está claro si la pro-
teína está relacionada con el gen BCRA.

Cáncer de próstata
100

Se han señalado niveles altos de funcionamiento (sensibilidad y especificidad de

70-90%) de los patrones proteicos séricos que diferenciaban el cáncer de próstata
y la enfermedad benigna [27]. Uno de los biomarcadores identificado en este
estudio se confirmó con otra población [33]. Posteriormente, se identificó como
una isoforma de la apolipoproteína A-II. Se ha realizado un estudio que indica la
detección reproducible de picos de control de calidad y la clasificación correcta
de 14 muestras con cáncer y 14 controles en seis lugares diferentes, basado en
picos discriminantes [34].

Cáncer colorrectal

Se han detectado por SELDI-TOF MS dos patrones proteicos discriminadores en

suero con una sensibilidad y especificidad de alrededor del 90% [35,36], que
también clasificaban correctamente los cánceres en fase temprana. En una pobla-
ción independiente se han encontrado dos masas discriminadoras [37]. Reciente-
mente, se ha detectado en dos estudios independientes el aumento de las α-defen-
sinas 1, 2 y 3 en cáncer colorrectal [38,39]. En ambos estudios los resultados en
el tejido estaban correlacionados con la concentración en suero. Desgraciadamen-
te, la concentración de α-defensinas también aumenta en suero en procesos como
las infecciones.
Conclusiones

Aunque la tecnología SELFI-TOF MS de patrones proteicos se está aplicando mu-

cho a los estudios del cáncer, hay todavía un gran número de objeciones. Entre
ellas, la de que no hay pruebas concluyentes sobre la fuente de la información
diagnostica, esto es, los picos clasificatorios, de los perfiles séricos [15]. Una de
las posibilidades es que los picos distintivos sean de proteínas específicas del
tumor. Otra segunda hipótesis es que los picos que permiten la discriminación no
se originen en el tumor [40]. Estos picos diferenciadores se originarían de proteí-
nas que son un epifenómeno del cáncer y son producidas por otros órganos en
respuesta a la presencia del cáncer. También podrían estar relacionadas con el
estado del paciente canceroso, como la infección, la desnutrición o la enfermedad
generalizada. Hasta el momento no hay pruebas suficientes para determinar cual
de estas dos hipótesis describe la realidad con mayor exactitud.

Caracterización de marcadores biológicos de cáncer mediante otras

técnicas proteómicas

Yu et al [41] han empleado la electroforesis diferencial en gel (DIGE) para separar

101
las proteínas y su caracterización posterior utilizando espectrometría de masas
tandem. Inicialmente eliminaron las proteínas más abundantes (albúmina, inmuno-
globulinas, transferrina, haptoglobina, antitripsina) utilizando una columna de
cromatografía de inmunoafinidad. Encontraron 56 manchas aumentadas en los
pacientes con cáncer de páncreas y 43 disminuidas. Identificaron 24 proteínas
aumentadas y 17 disminuidas en los pacientes con cáncer. Los análisis por transfe-
rencia Western confirmaron los incrementos de varias de estas proteínas en las
muestras de suero de los cánceres pancreáticos.
Miller et al [42] han utilizado micromatrices de anticuerpos para obtener perfiles
proteicos de suero con objeto de identificar potenciales biomarcadores de cáncer
de próstata. Empleando 184 anticuerpos han identificado cinco proteínas (Factor
de von Willebrand, IgM, α1-antiquimotripsina, villina e IgG) con concentraciones
diferentes entre las muestras con cáncer de próstata y los controles. De igual mane-
ra, Sánchez-Carbayo et al [43] han empleado micromatrices de anticuerpos para
obtener posibles biomarcadores en suero de cáncer de vejiga. Utilizaron microma-
trices con 254 anticuerpos y los perfiles obtenidos clasificaron correctamente un
93.7% de los pacientes. Una segunda micromatriz con 144 anticuerpos mostró
que los perfiles proteicos proporcionaron una información predictiva estratificando
a los pacientes de acuerdo con su supervivencia.
 Autoanticuerpos circulantes en los pacientes con cáncer

Existen pruebas de una respuesta inmunitaria humoral contra antígenos tumorales

en algunos pacientes con cáncer que podría utilizarse en pruebas séricas de pro-
gresión de la enfermedad [44-47]. En estos estudios las proteínas aisladas del
tejido tumoral o de las líneas celulares se separan por 2D PAGE y luego se trans-
fieren a membranas y se realiza una inmunotransferencia frente a los sueros de los
pacientes. Las inmunoglobulinas presentes en los sueros que tienen reactividad
frente a las proteínas del tumor pueden detectarse en estas transferencias bidimen-
sionales y la proteína antigénica puede identificarse por espectrometría de masas
tras alinear la transferencia con un gel teñido. Se han estudiado de esta forma los
sueros de los pacientes con cáncer de pulmón [44,48], carcinoma hepatocelular
[45,49], carcinoma de células renales [46,50], neuroblastoma [51], cáncer de
próstata [52] y cáncer de mama [53] y en cada caso se encontraron autoanti-
cuerpos específicos frente a un número limitado de proteínas tumorales. Aunque no
se sabe bien por qué algunas proteínas del tumor se hacen antigénicas en un
subconjunto de pacientes, los anticuerpos antitumorales suelen corresponder a
proteínas del tumor sobreexpresadas, deslocalizadas o mutadas. Hay también
pruebas de que un aumento de las citoquinas contribuye a la aparición de autoan-
ticuerpos en algunos pacientes.
102

Micromatrices de antígenos para la detección de autoanticuerpos

Se han utilizado micromatrices de antígenos para la detección de autoanticuerpos

en las enfermedades autoinmunitarias. Joos et al [54] fueron los primeros en crear
un inmunoanálisis con un formato de micromatriz que permitía el análisis simultá-
neo de 18 autoanticuerpos. Las matrices se incubaban con los sueros de los pa-
cientes y los autoanticuerpos unidos se detectaban con un anticuerpo secundario
marcado con peroxidasa y medidas por quimioluminiscencia utilizando como
sustrato luminol. El grupo de Robinson [55] construyó una micromatriz con 196
biomoléculas diferentes que representan los principales autoantígenos frente a los
que se dirigen los autoanticuerpos de los pacientes con enfermedades autoinmuni-
tarias reumáticas. Para detectar la unión de los autoanticuerpos a los autoantíge-
nos específicos sobre las micromatrices, éstas se incubaron con un anticuerpo
secundario anti-humano conjugado con el fluorocromo Cy-3. Los autores indicaban
que sus micromatrices de antígenos eran entre cuatro y ocho veces más sensibles
que los ELISA convencionales. Concluyeron que las micromatrices de antígenos
representan una herramienta muy potente para estudiar la especificidad y la pato-
genia de la respuesta de autoanticuerpos y para identificar y definir autoantígenos
relevantes en las enfermedades autoinmunitarias humanas. El mismo grupo ha
publicado recientemente otra aplicación de las micromatrices de antígenos para
obtener perfiles de autoanticuerpos en la artritis reumatoide [56]. La micromatriz
de antígenos sinoviales contenía 225 péptidos y proteínas que representan au-
toantígenos candidatos de la artritis reumatoide. Los resultados indicaban que las
micromatrices de antígenos demostraban que las respuestas de los linfocitos B
autorreactivos dirigidos frente a epítopos citrulinados estaban presentes en un
subconjunto de pacientes con artritis reumatoide con características predictoras de
aparición de una artritis reumatoide grave. Por el contrario, la respuesta autoinmu-
nitaria de los epítopos nativos contenidos en las matrices sinoviales, incluyendo
varios péptidos de gp39 y colágeno tipo II del cartílago humano estaba asociada
con características predictoras de una artritis reumatoide menos grave. Concluye-
ron que el análisis proteómico de las reactividades de autoanticuerpos proporcio-
na información diagnóstica y permite la estratificación de los pacientes con artritis
reumatoide precoz en subconjuntos con relevancia clínica.
Otro estudio de un grupo de Shangai (China) utilizó micromatrices con 15 autoan-
tígenos para la detección de autoanticuerpos en las enfermedades autoinmunita-
rias reumáticas [57]. Los antígenos se imprimieron sobre pocillos de poliestireno.
Como segundo anticuerpo utilizaron IgG anti-humana marcada con peroxidasa y
un sustrato quimioluminiscente. Los autores señalaban que este sistema proporciona
resultados semejantes a los de los métodos convencionales, de forma que pueden
103
utilizarse las micromatrices como herramientas para el diagnóstico de un gran
número de enfermedades autoinmunitarias a bajo coste. También indicaban que la
utilización de micromatrices combinada con los análisis de inteligencia artificial
pueden proporcionar mejoras en el rendimiento coste-eficacia y exactitud para el
diagnóstico molecular de las enfermedades autoinmunitarias.

Células sanguíneas

Todas las células sanguíneas surgen de un progenitor común, la célula madre

hematopoyética pluripotente. Un progenitor mieloide común da lugar a granuloci-
tos y monocitos. Los granulocitos están formados por neutrófilos, eosinófilos y basó-
filos. Los neutrófilos y los monocitos (macrófagos) son los elementos clave del siste-
ma de defensa innato. Los eosinófilos, los basófilos y los mastocitos responden a
los alérgenos y a las infecciones por parásitos. Las estirpes linfoides formadas por
los linfocitos B, T y citolíticos (natural killer) proceden de un progenitor linfoide
común.
En los últimos años se han realizado diversos estudios proteómicos de las células
sanguíneas con objeto de conocer mejor su funcionamiento en condiciones norma-
les y en la enfermedad. Recientemente, se ha publicado una revisión detallada
sobre los estudios proteómicos de las célula sanguíneas [58].
 Eritrocitos

Low et al [59] presentaron un estudio proteómico de membranas de eritrocitos

utilizando separación mediante 2D-PAGE e identificación por MALDI-TOF MS.
Identificaron 102 manchas proteicas que correspondían a 59 polipéptidos diferen-
tes, siendo las 43 manchas restantes isoformas. Posteriormente, Kakhniashvili et al
[60] analizaron las membranas eritrocitarias y el citoplasma por espectrometría de
masas de trampa iónica MS/MS en línea con cromatografía líquida. Identificaron
unas 100 proteínas de membrana, incluyendo varias proteínas de la membrana
del citoesqueleto, como la espectrina, la anquirina y proteínas de las bandas 3,
4.1, 4.2, 4.9 y 7.2b. El estudio de la fracción citoplásmica de los eritrocitos
permitió identificar muchas proteínas como las cadenas de hemoglobina α, β y γ.
Mas recientemente, Pasini et al [61] han obtenido el proteoma del eritrocito huma-
no más completo e informativo utilizando diversas técnicas de separación de pro-
teínas junto con la identificación con MS cuadrupolo-TOF y transformada de
Fourier. Han identificado un total de 340 proteínas de membrana y 252 proteínas
solubles. También recientemente, Kakhniashvili et al [62] han analizado el proteo-
ma del eritrocito en la drepanocitosis utilizando la técnica DIGE. Han observado
49 manchas proteicas cuyo contenido variaba, en 38 casos aumentando y en 11
casos disminuyendo.
104

Plaquetas

Las plaquetas son fragmentos citoplásmicos procedentes de los megacariocitos. Su

función principal es formar los trombos sobre las lesiones vasculares y contribuir al
proceso de curación. Las plaquetas no tienen núcleo pero si proteínas y mRNA.
Este mRNA remanente las hace capaces de sintetizar algunas proteínas y poseen
el aparato para modificar las proteínas después de la traducción. El primer análisis
proteómico del citosol de las plaquetas se realizó empleando 2D-PAGE con un
intervalo amplio de pI (3-10) seguido de MALDI-TOF MS [63]. Se identificaron
186 proteínas. Un estudio posterior detectó 2300 manchas proteicas [64], identi-
ficándose 123 productos génicos diferentes, correspondientes a proteínas con
funciones muy diferentes como transducción de señal, proteína quinasas, proteína
fosfatasas, proteínas de unión de calcio, proteínas de unión de GTP y complejos
proteicos. En otro estudio, García et al [65] analizaron de forma separada la
región de pI 4-5 y la región de pI 5-11 del proteoma de las plaquetas humanas e
identificaron 311 productos génicos.
La expresión proteómica de las plaquetas es muy dinámica, dependiendo de su
estado de activación. García et al [66] detectaron 62 proteínas que se expresa-
ban de forma diferente en plaquetas activadas e inactivadas, bien apareciendo o
desapareciendo, aumentando o disminuyendo entre los dos estados. Martents et al
[67] han empleado nuevas tecnologías de separación como la denominada CO-
FRADIC (combined fraccional diagonal chromatography, cromatografía diagonal
fraccionada y combinada) junto con identificación por MS/MS. Han encontrado
641 proteínas de las plaquetas, entre ellas 404 nuevas.

Leucocitos

Se han publicado varios trabajos sobre las aplicaciones de la proteómica de las

células inflamatorias como los neutrófilos, los monocitos, los macrófagos, los eosi-
nófilos y los linfocitos. Los neutrófilos son la clase principal de glóbulos blancos de
la sangre periférica donde desempeñan una función crucial en la eliminación de
los patógenos extracelulares por fagocitosis siendo el componente principal de la
respuesta inmunitaria innata. Con el empleo de 2D-PAGE y MS se ha observado
que la activación de los neutrófilos con forbol 12-miristato, factor de necrosis tumo-
ral α o interferón γ induce la tirosilación de varias proteínas endógenas como la
lactoferrina, la catalasa, la vimentina, la filamina A, la mieloperoxidasa, la ATP
sintetasa, la anexina A, la citoqueratina 10 o la gliceraldehído 3-fosfato deshidro-
genasa [68].
Los macrófagos no sólo son células fagocitarias importantes en la defensa sino
también células presentadoras de antígeno. Seong et al [69] han analizado el
105
efecto de la agresión oxidativa generada en los lugares de la inflamación y la
lesión sobre el perfil proteómico de los monocitos. Han visto que se sobreexpresan
28 proteínas principalmente implicadas en el metabolismo energético, la traduc-
ción y la mediación del plegamiento proteico. Dupont et al [70] han elaborado
mapas de referencia 2D-PAGE del proteoma del macrófago humano para elucidar
la disfunción de los macrófagos en las enfermedades inflamatorias, inmunológicas
e infecciosas.
La activación de los eosinófilos desempeña un papel importante durante las res-
puestas alérgicas e inflamatorias. Levi-Sachaffer et al [71] han realizado estudios
proteómicos para descifrar los mecanismos de la activación eosinófila. Han obser-
vado diferentes manchas proteicas que aumentan o disminuyen. El paso siguiente
es identificar las proteínas relevantes por espectrometría de masas.
Los linfocitos B se diferencian en células plasmáticas y segregan anticuerpos, lo
que corresponde a la respuesta inmunitaria humoral, mientras que los linfocitos T
juegan un papel determinante en la respuesta inmunitaria celular. Empleando la
proteómica clásica se ha establecido una base de datos proteómicos de los linfo-
citos T colaboradores [72]. Se detectaron unas 1500 manchas proteicas y se
identificaron 91 proteínas. Asimismo, Rantajoki et al [73] han estudiado las proteí-
nas que se expresan de forma diferente en las células Th1 y Th2.
 Leucemia y linfoma

La leucemia y el linfoma son dos grupos importantes de enfermedades hematológi-

cas que han sido estudiadas desde una perspectiva proteómica. Harris et al [74]
han demostrado que el tratamiento de células de leucemia promielocítica aguda
con ácido todo-trans retinoico reestructuraba la regulación de las rutas supresoras
posteriores a la transcripción. Señalaron 59 proteínas que se expresaban de forma
diferente; entre ellas factores de iniciación y elongación, ribonucleoproteínas nu-
cleares heterogéneas y RNP nucleares pequeñas.
La leucemia linfocítica crónica puede dividirse en dos grupos distintos de acuerdo
con que haya sucedido o no una hipermutación somática en la región variable del
locus de la cadena pesada de las inmunoglobulinas o alternativamente si las célu-
las expresan concentraciones mayores de la proteína CD38. Se ha estudiado
recientemente la proteómica de los dos tipos de leucemia linfocítica crónica [75] y
se han identificado diferencias significativas de los patrones de expresión proteica
entre los casos con y sin mutación somática. Sin embargo, no se han encontrado
diferencias entre las muestras de los pacientes CD38 positivos y CD38 negativos.
Cui et al [76,77] han estudiado diversos pacientes con leucemia aguda diagnos-
ticados de acuerdo con la clasificación Franco-Americana-Británica utilizando 2D-
PAGE y MALDI-TOF MS y ESI MS/MS. Identificaron diferentes perfiles proteicos
106
de acuerdo con el tipo de leucemia aguda. Encontraron un grupo de proteínas
muy expresadas en subgrupos de leucemia mieloide crónica [76]. Además, pudie-
ron reconocer otro grupo de proteínas que diferenciaban la leucemia linfoblástica
aguda de los leucocitos normales, así como los subtipos de leucemia mieloblástica
aguda [77].
Balkhi et al [78] empleando células de médula ósea han estudiado la leucemia
mieloide aguda mediante 2D-PAGE y MALDI-TOF MS y MS tandem. Han encon-
trado diferencias significativas en el proteoma y las modificaciones posteriores a la
traducción de péptidos entre los grupos citogenéticos.
Los estudios proteómicos pueden proporcionar un conocimiento completo de los
fenotipos de las neoplasias linfoides. Joubert-Caron y Caron [79] han publicado
una revisión muy detallada sobre la proteómica de los linfomas. El trabajo presen-
ta muchos aspectos diferentes del análisis proteómico de las células hematopoyéti-
cas cancerosas, así como de los efectos de diversos fármacos sobre esas células.
Además, los autores describen las estrategias que pueden utilizarse para estudiar
el proteoma de los linfomas, haciendo especial hincapié en el efecto de los trata-
mientos farmacológicos sobre el proteoma de las células linfoides y proponiendo
una clasificación funcional.
Un trabajo reciente de Fujii et al [80] ha construido una base de datos bidimen-
sional de líneas celulares de neoplasias linfoides con 309 proteínas que corres-
ponden a 389 manchas proteicas en el gel. Las líneas celulares se clasificaron en
cuatro grupos: linfoma de Hodgkin, neoplasia de células B, neoplasias de células
T y neoplasias de células citolíticas. Encontraron 28 proteínas con diferencias
superiores al doble entre los distintos grupos.

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mutated or unmutated IgV(H) teomics 2006; 6:4856-76.
 Capítulo 8

Proteómica de la orina

Introducción

La orina humana es un líquido biológico fácil de obtener que contiene importantes

marcadores biológicos. Se ha utilizado para estudiar la fisiología renal y las en-
fermedades renales. La orina normal contiene hasta 150 mg/24h de proteínas.
Estas proteínas se originan tanto de la ultrafiltración del plasma como del propio
tracto urinario. Las enfermedades que afectan de forma adversa la función del
riñón producen una pérdida excesiva de proteínas en la orina. Se define la protei-
nuria como una excreción excesiva de proteínas en la orina. Se ha definido la 113
orina como una biopsia líquida del riñón y del tracto urogenital y proporciona
mucha información sobre estos órganos. De esta forma, muchas variaciones de las
funciones del riñón y del tracto urogenital pueden detectarse en el proteoma de la
orina. Además, como filtrado de la sangre, la orina contiene componentes protei-
cos que son semejantes a los de la sangre. Por lo tanto, las variaciones patológi-
cas de los órganos humanos, que pueden encontrarse en el suero, también pue-
den reflejarse y detectarse en el proteoma de la orina. En este Capítulo se
presentan los principales estudios proteómicos realizados con la orina.

Fisiología y patología renal de las proteínas

Las proteínas de menos de 40 kDa pasan fácilmente a través de la barrera del

filtrado glomerular y se reabsorben. Debido a su baja concentración en plasma, sólo
se encuentran en la orina cantidades pequeñas de estas proteínas. Cuando una
enfermedad altera la barrera de filtración glomerular pasa una mayor cantidad de
las proteínas plasmáticas al ultrafiltrado y se produce una proteinuria glomerular. Esta
se presenta en las enfermedades glomerulares primarias, como la glomerulonefritis
aguda y crónica y la nefropatía por IgA, o en los trastornos que producen un daño
glomerular, como las enfermedades sistémicas (diabetes mellitus, lupus eritematoso
sistémico y amiloidosis), las enfermedades infecciosas y los fármacos.
 Los túbulos renales proximales reabsorben las proteínas menores de 40 kDa del
filtrado glomerular y también degradan algunas. La alteración de la reabsorción
por el túbulo proximal de las proteínas que se filtran normalmente por los gloméru-
los origina proteinuria tubular que se caracteriza por la excreción de proteínas de
pequeño peso molecular y generalmente no supera los 2g/24h. Aunque muchos
componentes contribuyen a la proteinuria tubular, un componente principal es la
β2-microglobulina. La proteinuria globular aparece en la nefritis intersticial, la ne-
crosis tubular aguda y la acidosis tubular renal.

Medida de proteínas en la orina

La determinación cuantitativa de las proteínas totales de la orina normalmente se

realiza en orinas recogidas durante un tiempo determinado. Generalmente, suele
emplearse orina de 24 horas. Hay numerosos métodos para medir las proteínas
de la orina, entre ellos, el de Lowry, la turbidimetría tras añadir ácido tricloroacéti-
co o ácido sulfosalicílico o el tratamiento con un colorante como el azul brillante
de Coomasie o el molibdato rojo de pirogalol.
La separación electroforética de las proteínas de la orina presenta un patrón globu-
lar que generalmente es difuso. La albúmina es la proteína dominante. Normal-
114
mente hay sólo mínimas cantidades de α1 y α2 globulinas. Las β– globulinas y γ-
globulinas son insignificantes o están ausentes. En contraste con el suero, la elec-
troforesis de la orina no contiene β-lipoproteínas o β-globulina.
La proteinuria asociada con un aumento de la permeabilidad glomerular presenta
un patrón electroforético dominado por la albúmina con cantidades moderadas de
β-globulinas, algo de α1-globulinas, trazas de α2-globulinas y trazas de γ-
globulinas.
En general, las proteinuria refleja albuminuria. La albúmina puede medirse fácil-
mente por inmunoanálisis cuantitativos. Se define como microalbuminuria un au-
mento de la eliminación urinaria de albúmina por encima del intervalo de referen-
cia para las personas sanas no diabéticas, pero que es una concentración que no
puede detectarse con las tiras reactivas para proteínas.
La presencia en la orina de cadenas ligeras de inmunoglobulinas, que se denomi-
nan proteínas de Bence Jones, es una indicación importante de la presencia de
mieloma y, en aproximadamente el 20% de los casos, puede producirse en au-
sencia de una banda de paraproteína en el suero. La forma más adecuada de
detectar la proteína de Bence Jones es la electroforesis de la orina complementada
con una inmunofijación.
La mioglobina es una pequeña hemoproteína que normalmente se cataboliza por
endocitosis y proteolisis en el túbulo proximal tras la filtración glomerular. Normal-
mente, sólo aparece en la orina entre el 0.01% y el 5% de la proteína filtrada. En
la rabdomiolisis se liberan al plasma grandes cantidades de mioglobina, saturan-
do el mecanismo de reabsorción tubular, lo que ocasiona la aparición de grandes
cantidades de mioglobina en la orina. La mioglobina de la orina se mide por
inmunoanálisis.
La cistatina C es una proteína de bajo peso molecular (12.8 kDa) que sintetizan
todas las células nucleadas y que actúa como inhibidor de las cisteína proteasas.
Su pequeño tamaño y su punto isoeléctrico elevado (pI=9.2) hacen que se filtre
libremente por el glomérulo. Se ha utilizado la determinación de cistatina C en
orina como marcador de la tasa de filtración glomerular. La cistatina C se determi-
na por inmunoanálisis.

Proteoma normal de la orina

Los primeros estudios en la orina normal se realizaron en 1979, aunque en esta

época todavía no se había acuñado el término proteómica. En ese año se presen-
tó una separación bidimensional de las proteínas de la orina [1]. Tres años des-
pués, el mismo laboratorio presentó otro estudio con un mapa electroforético bidi-
mensional las proteínas más importantes de la orina [2]. Los principales problemas
en esta época eran la baja reproducibilidad de la 2D-PAGE utilizada debido a la
115
inestabilidad de los gradientes de pH.
En 1995, se presentó un mapa de referencia de las proteínas de la orina [3]. Las
proteínas se identificaron por coelectroforesis, inmunotransferencia y cromatografía
de afinidad con los correspondientes anticuerpos. El año siguiente se publicó una
imagen en gel 2D de las proteínas normales utilizando precipitación con colorantes
para aislar las proteínas, pero no se identificaba ninguna proteína [4]. Heine et al
[5] utilizando HPLC-ESI-MS identificaron 34 de los péptidos y fragmentos proteicos.
Años después, Spahr et al [6] mediante LC-MS/MS identificaron 124 proteínas en
la orina normal sin fraccionar. Thongboonkerd et al [7] aplicaron la precipitación
con acetona para las proteínas ácidas e hidrófilas y la ultracentrifugación para las
proteínas básica, hidrófobas y de membrana en la orina normal. Las proteínas de la
orina obtenidas por estos dos métodos se separaron posteriormente por 2D-PAGE y
se identificaron por MS. Finalmente se anotaron 47 proteínas de la orina.
Más recientemente, se ha presentado un mapa proteómico de la orina normal en
geles bidimensionales (Figura 8.1) [8]. Las muestras de orina se dializaron para
eliminar las moléculas que interfieren. La gran variación intraindividual e interindi-
vidual de los perfiles proteicos hicieron difícil establecer un mapa proteómico
normal. Para resolver este problema se mezcló la orina de 20 varones y 20 muje-
res sanos y se establecieron los mapas proteicos que fueron casi idénticos, excep-
to por algunas manchas probablemente de proteínas dependientes del sexo. Se
anotaron 113 proteínas diferentes.
 Figura 8.1. Comparación de geles de las proteínas urinarias de mujer (A) y
hombre (B) separadas por 2-DE. Las proteínas específicas de cada sexo están
indicadas con círculos. Imagen tomada de Oh et al., 2004

Se ha diseñado una estrategia de fraccionamiento proteico para enriquecer las

116 proteínas de masa molecular inferior a 30 kDa en una fracción distinta de las
proteínas grandes [9]. A la fracción con las proteínas con masas moleculares
superiores a 30 kDa se la realizó una cromatografía de sustracción por inmunoafi-
nidad para eliminar la mayoría de las proteínas más abundantes (albúmina e IgG),
obteniéndose una mejor diferenciación de las manchas. El análisis de unas 1400
manchas diferentes condujo a la identificación del 30% de las proteínas. Como se
esperaba de los altos niveles de modificaciones posteriores a la traducción de la
mayoría de las proteínas de la orina y la presencia de productos proteolíticos, las
420 manchas identificadas quedaron reducidas a 150 anotaciones proteicas.
Zerefos et al [10] han obtenido el proteoma de la orina humana mediante electro-
foresis preparativa combinada con 2D-PAGE. Han identificado 778 manchas
proteicas correspondientes a 141 productos génicos diferentes. Entre las proteínas
identificadas a partir de la electroforesis preparativa se encontraban muchas poco
abundantes como las proteínas implicadas en la transducción de señal. También
se ha empleado la técnica SELDI-TOF MS para obtener un perfil de las proteínas
urinarias [11].
Como conclusión de este apartado, se han empleado básicamente dos enfoques
para establecer el proteoma de la orina normal. Por un lado, la 2D-PAGE con
identificación por MS de las proteínas separadas y por el otro, la SELDI-TOF MS.
La construcción de un mapa proteómico de la orina normal en geles 2D es funda-
mental para obtener un molde con el que comparar las orinas en la enfermedad.
Proteoma de la orina en las enfermedades renales

Se ha obtenido el proteoma de la orina en varias enfermedades renales, compa-

rándolo con el proteoma normal de la orina. Las principales enfermedades estu-
diadas han sido las enfermedades glomerulares, el rechazo del injerto renal en los
trasplantes, los cánceres urológicos y la urolitiasis. A continuación se presentan los
principales resultados obtenidos en estos estudios.

Enfermedades glomerulorrenales

Los datos preliminares de un estudio electroforético en gel que buscaba marcadores

biológicos en la orina en varias enfermedades glomerulares (nefropatía diabética,
glomeruloesclerosis segmentaria focal, nefritis lúpica) señalaron 25 proteínas que se
expresaban de forma diferencial entre los grupos [12]. En un estudio reciente de
nefropatía diabética se identificó un patrón proteico de la orina en adolescentes con
diabetes tipo 1 y nefropatía diabética precoz [13]. El estudio se realizó utilizando
electroforesis capilar de alta resolución acoplada con espectrometría de masas.
La nefropatía por inmunoglobulinas A (NIgA) es una de las enfermedades glomeru-
lares más comunes. Haubitz et al [14] utilizaron la electroforesis capilar acoplada
en línea con espectrometría de masas para analizar los patrones protei-
117
cos/peptídicos de los pacientes con NIgA. Los resultados se compararon con los
hallazgos de los pacientes con nefropatía membranosa (NM) y las personas nor-
males. Los pacientes con NIgA, incluso los que tenían una eliminación de proteí-
nas dentro del intervalo normal, presentaban un patrón polipeptídico en orina que
difería de forma significativa del de las personas normales y los pacientes con
NM, lo cual indicaba un patrón «NIgA» específico de la eliminación de polipépti-
dos. El tratamiento de los pacientes estaba asociado con variaciones del patrón,
posiblemente indicando un efecto terapéutico.
En otro estudio, se han analizado las variaciones de la expresión de las proteínas de
la orina en los pacientes con NIgA utilizando electroforesis bidimensional en gel y se
ha comparado sus perfiles de expresión con los de las personas normales [15]. Las
proteínas de la orina se identificaron mediante MALDI-TOF MS. Se detectaron apro-
ximadamente 216 manchas proteicas que se expresaban de forma diferencial en la
NIgA. Entre estas, 82 manchas estaban sobre-expresadas y 134 estaban infra-
expresadas en comparación con las personas normales. Finalmente, se identificaron
en la NIgA un total de 84 manchas que se expresaban de forma diferente, lo cual
representaba 59 proteínas diferentes. Se necesitan estudios posteriores para caracte-
rizar la relación entre estas proteínas en la patogénesis de la NIgA.
 Rechazo del injerto renal

El rechazo agudo del injerto renal es uno de los problemas principales del tras-
plante renal. En la actualidad, el diagnóstico del rechazo agudo se realiza me-
diante biopsia renal. Un marcador biológico no invasor de rechazo permitiría no
sólo el diagnóstico precoz, sino también un control frecuente del tratamiento inmu-
nodepresor. Se han intentado varias estrategias, como las medidas de mRNA en
los linfocitos de la orina, la citometría de flujo de la orina y las medidas de linfoci-
tos alorreactivos en sangre periférica, pero ninguna ha alcanzado una aplicación
clínica. En los últimos años se ha aplicado la proteómica para buscar marcadores
biológicos de rechazo agudo del injerto.
En un estudio inicial, Clarke et al [16] han utilizado la técnica SELDI-TOF MS para
evaluar el proteoma de la orina en los trasplantes rechazados. Encontraron varios
picos, pero no los pudieron identificar. Posteriormente, O´Riordan et al [17], utilizando
también SELDI-TOF MS, identificaron tres picos con masas de 4.7, 25.6 y 19.0 kDa
que diferenciaban a los pacientes con rechazo agudo de los pacientes estables.
En otro estudio inicial, Schaub et al [18], utilizando SELDI-TOF MS, encontraron
tres grupos de picos prominentes en los pacientes con episodios de rechazo agu-
do. En la mayoría de los pacientes la presencia o ausencia de estos grupos de
picos estaba correlacionada con la evolución clínico-patológica. Estas proteínas se
118
identificaron posteriormente por espectrometría de masas como derivadas de for-
mas fraccionadas de la β2-microglobulina no producidas por la tripsina [19]. Los
experimentos in vitro han revelado que las roturas de la β2-microglobulina intacta
requieren un pH de la orina de menos de 6 y la presencia de proteasas aspárti-
cas. Los pacientes con rechazos agudos tenían menores pH de la orina y mayores
cantidades de proteasas aspárticas que los pacientes trasplantados estables y las
personas normales. Estos factores conducen en última instancia a mayores canti-
dades de β2-microglobulina fraccionada en la orina.
En un trabajo reciente, Reichelt et al [20] han utilizado la técnica SELDI-TOF MS
para estudiar el rechazo del injerto renal. Identificaron varios picos proteicos en la
orina que diferenciaba el rechazo de su ausencia. Con dos biomarcadores a
25.71 kDa y 28.13 kDa obtuvieron una sensibilidad diagnóstica del 90% y 93%
y una especificidad del 80% y 85%, respectivamente.

Cánceres urológicos

No existen actualmente marcadores tumorales circulantes de uso rutinario para el

cáncer renal, que con frecuencia se detecta casualmente y que suele encontrarse
avanzado en el momento de la presentación teniendo la mitad de los pacientes
diseminación tumoral local o distante. En los cánceres urológicos, la orina repre-
senta un líquido especialmente útil en el que observar los marcadores tumorales
debido a que puede contener mayores concentraciones de los productos liberados
directamente por el tumor y además se obtiene de forma no invasiva. Se han
estudiado utilizando métodos proteómicos en orina los canceres urológicos, inclu-
yendo el cáncer de vejiga y el carcinoma de células renales (CCR).
En los primeros estudios proteómicos, Rasmussen et al [21], utilizando 2D-PAGE e
identificación de las proteínas separadas mediante espectrometría de masas e
inmunotransferencia, identificaron 124 polipéptidos (con algunas variantes repeti-
das) en la orina de los pacientes con carcinoma de células escamosas de la veji-
ga (CCE). Sin embargo, las proteínas identificadas estaban limitadas a los grupos
más abundantes. Entre las proteínas identificadas, la psoriasina sólo se observó en
la orina de los pacientes con CCE. La psoriasina, que es la proteína más abun-
dante de los queratinocitos humanos, es por lo tanto un marcador biológico po-
tencial del cáncer de vejiga CCE.
Se ha utilizado la SELDI-TOF MS para estudiar las muestras de orina de los pacien-
tes con carcinoma de células de transición (CCT) de la vejiga [22]. Las variacio-
nes proteicas múltiples se detectaron de forma reproducible en el grupo CCT,
incluyendo cinco marcadores biológicos potenciales nuevos de CCT y siete grupos
de proteínas. Uno de los marcadores biológicos de 2.4 kDa también se detectó
en las células cancerosas de la vejiga y fue identificado como defensina.
Saito et al [23] han estudiado a un grupo de pacientes con cáncer de vejiga y se
119
han centrado en las proteínas de la matriz extracelular y las metaloproteinasas de
la matriz. La orina se trató con lechos de afinidad de gelatina y se realizó un
análisis del proteoma de las proteínas unidas a los lechos mediante 2D-PAGE. Se
identificaron en los pacientes cancerosos y no en los normales las metaloproteína-
sas de la matriz 2 y 9 y la fibronectina y sus fragmentos. No sólo las cantidades
totales de estas proteínas, sino también los patrones de su distribución sobre los
geles, se emparejaban con la extensión de la invasión diagnosticada por examen
histopatológico.
Rogers et al [24] han utilizado SELDI-TOF MS y un análisis de redes neurales para
detectar el cáncer renal e identificar proteínas de uso potencial como marcadores.
Se utilizaron muestras de orina de pacientes a los que se realizó nefrectomía por
un carcinoma de células renales y de personas normales para entrenar a los mode-
los de redes neurales basado en la presencia/ausencia de picos o valores de
intensidad de picos, dando una sensibilidad y especificidad de 98.3-100%.
Recientemente, Theodorescu et al [25] han utilizado la electroforesis capilar aco-
plada con la espectrometría de masas para obtener patrones polipeptídicos de
muestras de orina de pacientes con carcinoma del urotelio y personas sanas.
Identificaron un patrón diagnóstico de carcinoma de urotelio de 22 masas poli-
peptídicas. Se identificó un polipéptido prominente del patrón diagnóstico de
carcionoma urotelial como el fibrinopéptido A, un conocido marcador de cáncer
de ovario y cáncer gástrico.
 El cáncer de próstata también se ha analizado en los estudios del proteoma de la
orina. En sus estudios iniciales sobre las proteínas de la orina humana utilizando
electroforesis bidimensional Edwards et al [2] identificaron un marcador candidato
de cáncer de próstata que denominaron antígeno de cáncer prostático (PCA-1).
No se produjeron estudios confirmatorios posteriores de esta proteína. Más recien-
temente, se ha realizado un análisis proteómico de la orina tras masaje prostático
de pacientes con cáncer de próstata utilizando 2D-PAGE e identificación por
MALDI-TOF MS [26]. Se identificó la calgranulina B/MRP-14 en varios pacientes
con cáncer de próstata y no en los controles. Se necesita más investigación para
señalar a esta proteína como un posible marcador nuevo de cáncer prostático.

Urolitiasis

Se ha realizado un estudio de un grupo de pacientes con urolitiasis y la compara-

ción con las personas normales en orina utilizando SELDI-TOF MS [27]. Los perfiles
proteicos obtenidos han revelado una relación entre las intensidades de los picos
de 67 y 24 kDa diferente entre los dos grupos. El cociente p64:p24 era menor
de 1 en todas las muestras control, mientras que la mayoría de las muestras del
grupo de estudio presentaba cocientes mayores de 1. Los autores indicaban que
la SELDI-TOF MS de la orina representa un método nuevo prometedor para identi-
120
ficar de forma rápida a los pacientes con urolitiasis.

Proteoma de la orina en otras enfermedades no renales

El proteoma de la orina también se ha analizado en enfermedades no renales.

Tantipainboonwong et al [28] han examinado métodos de preparación de orinas
normales y con cáncer de pulmón para el estudio de las proteínas urinarias. Se
identificaron algunas proteínas que se expresan de forma diferencial. Aunque los
resultados de HPLC y SDS-PAGE revelaron pocas diferencias de los patrones pro-
teicos entre las orinas normales y las de cáncer de pulmón, la 2D-PAGE propor-
cionó resultados con información más útil sobre diferentes patrones proteicos entre
las personas normales y las que tenían cáncer de pulmón. Las proteínas que se
expresaban de forma diferencial fueron la glucoproteína CD59, la transtiretina, la
proteína activadora GP2 y la cadena ligera libre IgG.
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123
 Capítulo 9

Proteómica de otros líquidos biológicos,

proteómica tisular y proteómica subcelular

Los estudios proteómicos se han aplicado también al estudio de otros líquidos

biológicos distintos al plasma/suero y la orina, como el líquido cefalorraquídeo, el
plasma seminal, el líquido amniótico y el líquido de lavado broncoalveolar. Asi-
mismo, se han realizado estudios de los proteomas de diversos tejidos y de diver-
sos orgánulos subcelulares con fines diagnósticos y de seguimiento. En este Capítu-
lo presentamos algunos de estos estudios.

Líquido cefalorraquídeo 125

El líquido cefalorraquídeo (LCR) se produce en el plexo coroideo de los ventrículos

cerebrales y circula por el sistema ventricular y por el exterior del cerebro y la
médula espinal en el espacio subaracnoideo. El LCR recoge sustancias segrega-
das por muchas regiones cerebrales y productos de desecho del metabolismo
cerebral. La homeostasis del LCR depende directamente de la barrera epitelial
hematoencefálica situada en los plexos coroideos e indirectamente de la barrera
hematoencefálica endotelial a través del compartimento intersticial del cerebro. El
LCR es especialmente importante para el descubrimiento de biomarcadores de
enfermedad ya que refleja las proteínas del cerebro en condiciones de salud, así
como en varias enfermedades neurodegenerativas.

Proteínas del líquido cefalorraquídeo

La concentración normal de proteínas del LCR es de 15-45 mg/dL. Mas del

80% del contenido de proteínas del LCR se origina a partir del plasma sanguí-
neo por ultrafiltración y pinocitosis; el resto procede de la síntesis intratecal.
Debido a que el LCR es un ultrafiltrado del plasma, predominan las proteínas de
bajo peso molecular como la prealbúmina, la albúmina y la transferrina. El aná-
lisis de las proteínas totales y de proteínas específicas del LCR se emplea princi-
palmente para detectar el aumento de la permeabilidad de la barrera hema-
 toencefálica a las proteínas del plasma o el aumento de la síntesis intratecal de
inmunoglobulinas.

Proteoma normal

Los primeros estudios del proteoma del LCR se realizaron empleando electroforesis
bidimensional en gel y espectrometría de masas para identificar las proteínas
separadas [1,2]. Con estas técnicas se identificaron unas 30 proteínas, las más
abundantes del LCR. Posteriormente, se ha analizado el proteoma del líquido
cefalorraquídeo utilizando electroforesis capilar [3] y enfoque isoeléctrico capilar
[4]. Wettherhall et al [3] acoplaron la electroforesis capilar (EC) a un espectróme-
tro de masas de resonancia de ión ciclotrón con transformada de Fourier. Primero
realizaron una digestión con tripsina de las proteínas y tras separarlas por EC
identificaron unas 30 proteínas con la espectrometría de masas.
Posteriormente, Ramstrom et al [5] comunicaron la combinación de cromatografía
líquida capilar con espectrometría de masas con transformada de Fourier para
analizar el proteoma del LCR. Identificaron 39 proteínas con sólo 32 µL de LCR.
Hu et al [6] han estudiado las variaciones intra-individuales e inter-individuales del
proteoma del LCR. Noben et al [7] han empleado sistemas multidimensionales de
separación de péptidos con posterior identificación por espectrometría de masas
126
para estudiar el LCR, identificando 148 proteínas, 60 de las cuales por vez prime-
ra en LCR por espectrometría de masas. Existe un mapa de referencia de las pro-
teínas del LCR al que se puede acceder en Internet en http://www.expasy.ch.

Proteoma en enfermedades neurodegenerativas

Diversas enfermedades neurodegenerativas han sido objeto de estudios proteómi-

cos en el LCR para descubrir biomarcadores para el diagnóstico o el seguimiento
[8]. Se han realizado diversos estudios proteómicos en LCR en la enfermedad de
Alzheimer. Davidsson et al [9] utilizaron 2D-PAGE, tinción con SYPRO Ruby e
identificación por espectrometría de masas. Encontraron que estaba alterada de
forma significativa en los pacientes con Alzheimer la concentración de seis proteí-
nas y sus isoformas, incluyendo proapolipoproteína, apo E, β2-microglobulina,
proteína de unión de retinol, transtiretina y ubiquitina. Las proteínas más alteradas
eran las lipoproteínas, especialmente la proapolipoproteína. Este mismo grupo ha
ampliado el estudio posteriormente [10].
Abdi et al [11] han utilizado un método proteómico cualtitativo múltiple (iTRAQ,
isobaric Tagging for Relative and Absolute protein Quantification; Marcaje isobári-
co para la cualtificación relativa y absoluta de proteínas), junto con cromatografía
multidimensional y espectrometría de masas MS/MS para medir los cambios
relativos del proteoma del LCR de pacientes con enfermedad de Alzheimer, enfer-
medad de Parkinson y demencia con cuerpos de Lewy comparado con el de
controles sanos. Los hallazgos proteómicos muestran cambios cuantitativos en estas
enfermedades comparados con los controles. Varios paneles de marcadores úni-
cos fueron capaces de diferenciar estas enfermedades entre ellas y con los contro-
les con una alta sensibilidad a un 95% de especificidad.
Ranganathan et al [12] han empleado la técnica SELDI-TOF MS para analizar el
LCR de pacientes con esclerosis lateral amiotrófica (ELA). Encontraron que descen-
dían la transferrina y la cistatina C y aumentaba el fragmento C-terminal de la
proteína 7B2. Pasinetti et al [13] han utilizado también SELDI-TOF MS para anali-
zar el proteoma del LCR en la ELA. Han encontrado tres especies proteicas dismi-
nuidas en los pacientes con ELA. Este modelo identificó correctamente a los pa-
cientes con ELA con una exactitud del 95%, una sensibilidad del 91% y una
especificidad del 97%.
La esclerosis múltiple (EM) es una enfermedad inflamatoria autoinmunitaria del
sistema nervioso central en la que se destruye la vaina de mielina. Hammak et al
[14] han encontrado cuatro proteínas en el LCR de los pacientes con esclerosis
múltiple que no se encuentran en el LCR de las personas sanas. Se desconoce si
están relacionadas con la causa y la patogenia de la EM. Más recientemente,
Noben et al [7] también han estudiado el proteoma del LCR en la esclerosis múlti-
ple encontrando diferencias con las personas normales.
127

Plasma seminal

El plasma seminal es el componente líquido del semen y proporciona un entorno

seguro a los espermatozoides. El plasma seminal es una mezcla de secreciones de
varias glándulas accesorias del varón como la próstata, las vesículas seminales, el
epidídimo y las glándulas de Cowper. La concentración de proteínas del plasma
seminal humano se encuentra comprendida entre 35 y 55 mg/mL.
En los últimos años se han realizado diversos estudios proteómicos utilizando la
electroforesis bidimensional en gel combinada con la identificación de las proteí-
nas por espectrometría de masas de las manchas proteicas cuya abundancia varía
en diferentes situaciones clínicas relacionadas con la infertilidad [15,16]. También
se ha estudiado por 2D-PAGE el componente celular del eyaculado humano, esto
es, los espermatozoides [17] y un estudio ha comunicado diferencias en 20 man-
chas proteicas en un paciente infértil [18]. Un estudio del plasma seminal humano
empleando electroforesis en gel 2D y 1D y MALDI-TOF MS y LC-MS/MS ha co-
municado la identificación de 61 proteínas [19]. Recientemente, Pilch y Mann
[20] han identificado 923 proteínas en el plasma seminal humano utilizando
electroforesis 1D, digestión enzimática y cromatografía líquida y la identificación
de los péptidos mediante espectrometría de masas de trampa iónica lineal-
 transformada de Fourier. Asimismo, Martinez-Heredia et al [21] han detectado
mediante 2D-PAGE unas 1000 manchas proteicas en el espermatozoide humano.
La posterior extracción de los geles de 145 manchas y el análisis por MALDI-TOF
MS ha permitido identificar 89 proteínas diferentes. La función de estas proteínas
era la producción de energía (23%), la transcripción, síntesis, transporte, plegado
y recambio de las proteínas (8%), el citoesqueleto, los flagelos y el movimiento
celular (10%), el reconocimiento celular (7%), el metabolismo (6%) y funciones
desconocidas (11%). No se había descrito previamente la expresión en esperma-
tozoides humanos de un 23% de las proteínas identificadas.

Líquido amniótico

El líquido amniótico (LA) es esencial para el desarrollo del feto durante el embara-
zo. Su producción varía a lo largo de éste y está relacionada directamente con la
integridad funcional de los compartimentos fetal, de la placenta y amniótico. Al
comienzo del embarazo, el LA es principalmente agua procedente de la madre,
pero tras la 12 semana, la orina fetal constituye casi la totalidad del líquido. Es
conocido que el líquido amniótico (LA) contiene muchas proteínas cuya expresión
refleja la constitución genotípica del feto y regula las interacciones fisiológicas feto-
128
maternas. La concentración de proteínas del LA es de 2-17 mg/mL al comienzo
del embarazo y de 2-7 mg/mL al final.

Proteoma normal

El primer mapa proteico bidimensional del líquido amniótico fue publicado por
Liberatori et al [22] en 1997. Posteriormente, se han realizado otros estudios. Más
recientemente, Tsangaris et al [23] han obtenido una base de datos proteica 2D
del sobrenadante del LA humano normal. La identificación proteica se realizó por
MALDI-TOF. Se han identificado 136 productos génicos diferentes. La mayoría de
las proteínas identificadas eran proteínas reguladoras, enzimas, proteínas secreta-
das, transportadoras e inmunoglobulinas. Michel et al [24] han comparado el
plasma sanguíneo con el LA y han encontrado que 26 proteínas estaban exclusi-
vamente en el LA y no en el plasma sanguíneo. Diez de ellas pertenecen a la
placenta o son específicas del embarazo.

Proteoma en la rotura prematura de membranas y en las infecciones intra-

amnióticas

Se han realizado estudios en el LA para detectar la ruptura de membranas y para

el diagnóstico de infección intra-amniótica. La ruptura prematura de membranas
(RPM) es responsable de muchos partos prematuros. La RPM está también asocia-
da con un aumento del riesgo de infecciones fetales y maternas. Es obligado un
diagnóstico precoz para disminuir estas complicaciones.
Vuadens et al [25] han realizado estudios proteómicos en el líquido amniótico
buscando marcadores de RPM. Identificaron dos proteínas, la agrina y el perleca-
no, no presentes en el plasma sanguíneo. Ambas son proteoglucanos de gran
tamaño de heparán sulfato. No se conoce su función y su posible utilidad como
marcadores de RPM. Ruetschi et al [26] han empleado SELDI-TOF MS para detec-
tar en el LA marcadores de inflamación intra-amniótica. Encontraron que se sobre-
expresaban de forma significativa en el LA de los casos con inflamación intra-
amniótica 17 proteínas. Cinco de estas proteínas fueron identificadas como pro-
teínas neutrófilas 1-3 y calgranulina A y B.
Gravett et al [27] han realizado un estudio proteómico en busca de marcadores de
infección intra-amniótica. Emplearon SELDI-TOF MS encontrando dos picos peptídicos
que se expresaban de forma diferente en esta situación patológica; fueron identifica-
dos como calgranulina B y una proteína de unión al factor de tipo insulinoide, que
sugieren podrían utilizarse para la detección precoz de infección intra-amniótica.

Proteoma en el síndrome de Down

129
Tsangaris et al [28] han estudiado el sobrenadante del LA de embarazos con fetos
con síndrome de Down y fetos normales a la 17 semana de gestación mediante
electroforesis bidimensional. Encontraron diferencias cuantitativas de la expresión
de varias proteínas.

Líquido de lavado broncoalveolar

Las vías aéreas y, especialmente, los alvéolos están recubiertas con una capa fina
de líquido que es una fuente importante de células y componentes solubles del
pulmón, que desempeñan funciones importantes protegiendo al pulmón de agre-
siones indebidas y conservando su capacidad de intercambio de gases. Varios
estudios recientes en BALF sugieren que la 2D-PAGE puede ser útil para investigar
las variaciones de la expresión proteica en los pacientes con diversas enfermeda-
des pulmonares.

Proteoma normal

Varios grupos han estudiado el proteoma del BALF. Magi et al [29] y Sabounchi-
Schutt et al [30] han sido los principales investigadores en obtener el proteoma
normal del BALF. Se han visualizado mediante tinción con plata más de 1200
 manchas proteicas, identificándose un gran número de proteínas. Una compara-
ción entre los proteomas del plasma y del BALF revela que determinadas proteínas
se caracterizan por una mayor concentración en el BALF que en el plasma, lo que
sugiere que se producen de forma específica en las vías aéreas. Estas proteínas
son, por lo tanto, buenos candidatos como biomarcadores específicos del pulmón.

Proteoma de enfermedades pulmonares con fibrosis intersticial

Se ha estudiado el proteoma diferencial en enfermedades como la sarcoidosis, la

neumonía bacteriana, la fibrosis pulmonar idiopática, el lupus eritematoso, la
granulomatosis de Wegener, la neumonitis por hipersensibilidad, la neumonía
eosinófila crónica, la proteinosis alveolar, la asbestosis, la neumonía lipoide y la
fibrosis quística [31]. De todas ellas, las más estudiadas han sido la sarcoidosis y
la fibrosis pulmonar idiopática.

Proteoma del cerebro

El cerebro es uno de los tejidos más complejos de los organismos superiores, que
se diferencia de los demás órganos debido a sus muchos tipos celulares diferentes,
130
su estructura a nivel celular y tisular y su capacidad restringida de regeneración.
Desde el comienzo de las investigaciones proteómicas se ha estudiado el cerebro.
Los primeros análisis se realizaron utilizando 2D-PAGE e identificación de las
proteínas por MALDI-TOF y más recientemente se han empleado sistemas de sepa-
ración multidimensional [32].
Entre las iniciativas de la Organización del Proteoma Humano (HUPO) se encuen-
tra el Human Brain Proteome Project (HBPP; www.hbpp.org), Proyecto del Proteo-
ma del Cerebro Humano, con los objetivos siguientes:

1. Analizar el proteoma del cerebro del ser humano y del ratón en situaciones
normales y en distintas enfermedades cerebrales y el envejecimiento. Entre las
enfermedades prioritarias están las enfermedades de Alzheimer y Parkinson.
2. Realizar estudios de proteómica cuantitativa y analizar la expresión proteica
de diferentes áreas cerebrales y de líquidos cerebrales, tanto en condiciones
normales de salud como en diferentes enfermedades.
3. Avanzar en el conocimiento de las enfermedades neurológicas y del envejeci-
miento para impulsar nuevos métodos diagnósticos y nuevos tratamientos.
4. Intercambiar conocimientos y datos con otros proyectos de la HUPO e iniciati-
vas nacionales/internacionales en el campo de la neuroproteómica.
5. Realizar investigación neuroproteómica y proporcionar los resultados a la
comunidad científica y la sociedad.
Uno de los objetivos del HBPP es la generación de un mapa proteico del cerebro.
Se han obtenido ya proteomas de diversos orgánulos y fracciones subcelulares del
cerebro humano, como las mitocondrias, los microsomas y la fracción citosólica.
Recientemente se han comunicado diversos trabajos dentro del HBPP. Park et al [33]
han utilizado métodos se separación multidimensionales (fraccionamiento bioquímico
de acuerdo con la solubilidad, 1D y RP-LC), antes del análisis MS/MS, para aumen-
tar el intervalo y número total de proteínas identificadas en el lóbulo temporal del
cerebro humano. Han identificado 1533 proteínas, que han clasificado de acuerdo
con su distribución en los componentes celulares. Mueller et al [34] han colocado en
el contexto biológico las proteínas identificadas en el HBPP. Estas proteínas se han
agrupado en diferentes clases: Proteínas del citoesqueleto, enzimas del metabolismo
intermediario, proteínas de señalización, proteínas antioxidantes, proteínas de ubi-
quitinación y relacionadas con el proteasoma, proteínas de unión al RNA y que
participan en la transcripción, corte y empalme y elongacion, proteínas de choque
térmico y chaperonas, proteínas neuronales y proteínas de la glia. Reidegeld et al
[35] y Hamacher et al [36] han resumido los logros obtenidos hasta ahora en el
HBPP.

Proteómica y enfermedad de Alzheimer

131
La enfermedad de Alzheimer (EA) es la causa más común de demencia en la vejez
y se caracteriza por la deposición del péptido β-amiloide. Son muchos los estudios
proteómicos que se han centrado en la EA. Entre otros estudios se ha analizado la
expresión proteica, la alteración del metabolismo energético, la alteración de la
expresión antioxidante, la alteración de la función sináptica, la alteración neuro-
transmisora y receptora, la regulación de la apoptosis y la anti-apoptosis y las
funciones de las proteínas chaperonas [37].
Los estudios proteómicos en la EA han aportado datos importantes sobre esta
enfermedad y en un futuro cercano proporcionarán muchos más que permitirán
entender mejor esta enfermedad neurodegenerativa que afecta a un porcentaje
importante de la población.

Proteómica y enfermedad de Parkinson

La enfermedad de Parkinson (EP) es la segunda enfermedad neurodegenerativa

tras la enfermedad de Alzheimer. Se ha estudiado la expresión proteica de la
sustancia negra en pacientes con EP y controles, observándose que variaba la
expresión de 9 proteínas. Además de la idea ya consolidada de la implicación de
la agresión oxidativa en la patogenia de la EP, que sugiere la sobre-expresión de
proteínas mitocondriales y proteínas de eliminación de las especies reactivas de
oxígeno, parece existir un mecanismo de potenciación de las señales aferentes
 hacia la sustancia negra tras la degeneración de las neuronas dopaminérgicas
[38].

Mecanismos moleculares de la neurotoxicidad

Otra de las aplicaciones de la proteómica del cerebro se ha dirigido al estudio de

los mecanismos moleculares de los neurotóxicos [39]. Muchos de los compuestos
que producen toxicidad en el cerebro actúan a nivel de las proteínas. Asimismo, en
muchas ocasiones una de las consecuencias indirectas de la exposición a un neuro-
tóxico es la afectación de la expresión proteica. Tanto las acciones directas como
las indirectas de los compuestos con toxicidad cerebral pueden ser alteraciones de
algunas modificaciones proteicas posteriores a la traducción como fosforilaciones o
glucosilaciones que hacen que la proteína actúe de forma adecuada.
Otra posibilidad de las sustancias neurotóxicas es la generación de una tensión
oxidativa que de lugar a un daño secundario de las proteínas con la consecuente
pérdida de su función. Finalmente, el tóxico puede alterar la expresión de los
genes y como consecuencia de ello alterarse la concentración de determinadas
proteínas y las funciones que desempeñan.

132
Proteoma del hígado

El hígado es el órgano más grande del cuerpo y probablemente el segundo tras el

cerebro en complejidad. Es el lugar fundamental del metabolismo de la mayoría
de las sustancias. Otras funciones del hígado son la de síntesis de un gran número
de proteínas y la de desintoxicación. Desde hace varios años se están realizando
estudios proteómicos en hígado. Kim et al [40] realizaron un análisis proteómico
del tejido hepático normal utilizando 2D-PAGE y MALDI-TOF MS, identificando un
gran número de proteínas. Más recientemente, Ying et al [41] han publicado un
conjunto de datos del proteoma hepático fetal utilizando el fraccionamiento subce-
lular y técnicas de separación multidimensionales, llegando a identificar 2495
proteínas diferentes.
El Proyecto del Proteoma del Hígado Humano (Human Liver Proteome Project,
HLPP) (www.hlpp.org) es una de las iniciativas de la Organización del Proteoma
Humano (HUPO). Sus objetivos son:

1. Generar una estrategia integradora que conduzca a un atlas completo de las

proteínas del hígado.
2. Expandir el proteoma hepático a su fisioma y su patoma para acelerar de
forma importante el diagnóstico y tratamiento de las enfermedades hepáticas.
3. Generar procedimientos operativos estándar para otras iniciativas HUPO.
De acuerdo con el plan global, el HLPP puede dividirse en dos fases: 1) fase piloto
(2002-2005) y 2) fase de acción (2006-2010). Dentro de la fase piloto, los cuatro
laboratorios chinos que recibieron muestras de tejido hepático, eligieron 12 estrate-
gias para los análisis de perfiles de exposición. Con el primer conjunto de datos
recogidos en los cuatro laboratorios de referencia se realizó un primer análisis. Se
identificaron 4975 proteínas y 2383 grupos con 9245 proteínas de los cuatro
grupos utilizando proteómica con gel y proteómica de «escopetazo». Asimismo, se
analizaron las categorías funcionales del perfil de expresión proteica [42].
El cáncer de hígado es uno de los cánceres que se producen con mayor frecuencia.
Normalmente, se origina a partir de una enfermedad hepática inflamatoria crónica
debida a una infección por los virus B y C y a la exposición a sustancias canceríge-
nas como la aflatoxina. Se han publicado diversos estudios proteómicos en tejido
relacionados con el carcinoma hepatocelular utilizando tanto la 2D-PAGE con identi-
ficación de las proteínas por espectrometría de masas MALDI-TOF, así como las
técnicas DIGE y SELDI-TOF. Entre los trabajos publicados se encuentran los de Lim et
al [40], Kim et al [43], Yokohama et al [44], Blanc et al [45], Fang et al [46] y
Liang et al [47]. Estos estudios han tratado de obtener perfiles proteicos identificado-
res del cáncer y se han comparado los perfiles proteicos de acuerdo con el virus que
originó el hapatocarcinoma. Los resultados parecen indicar que los mecanismos de
hepatocarcinogénesis pueden ser diferentes para cada uno de los virus.
133
Un tema común de los análisis del tejido tumoral es el descenso de las enzimas de
la oxidación de los ácidos grasos [48]. El enlace aparente entre este hecho y la
progresión de la lesión hepática y la fibrosis y el aumento del riesgo de aparición
de cáncer de hígado hace de estas rutas metabólicas celulares dianas atractivas
de potenciales fármacos anti-fibróticos.

Proteoma cardíaco

A lo largo de los primeros años 1990 se empleó la electroforesis bidimensional en

gel de poliacrilamida para obtener mapas de manchas proteicas de miocardio
[49-51]. Con los datos obtenidos se han establecido tres bases de datos de geles
2D a las que se puede acceder a través de Internet en las siguientes direcciones:
HSC-2DPAGE (www.doc.ic.ac.uk/vip/hsc-2dpage) [52], HP-2DPAGE
(www.mdc-berlin.de/~~emu/heart) [53] y HEART-2DPAGE (www.chemie.fu-
berlin.de/use/pleiss) [54]. Sin embargo, estas bases de datos no se actualizan
desde hace varios años. Recientemente, se ha analizado el proteoma del corazón
humano utilizando gradientes de pH inmovilizados de intervalo estrecho identifi-
cándose un número elevado de proteínas [55].
Entre las enfermedades cardiacas la más estudiada desde el punto de vista pro-
teómico es la miocardiopatía dilatada (MCD) una enfermedad grave de etiología
 desconocida que se caracteriza por el deterioro de la función sistólica, lo cual da
lugar a insuficiencia cardiaca. Los estudios proteómicos realizados han señalado
un descenso significativo de diversas proteínas que pueden clasificarse en tres
clases funcionales: proteínas del citoesqueleto y miofibrillares, proteínas asociadas
con las mitocondrias y proteínas asociadas con la respuesta a la agresión [56].
Gallego-Delgado et al [57] han estudiado el perfil proteico en la hipertrofia ventri-
cular izquierda inducida por la hipertensión. Su principal hallazgo ha sido identifi-
car proteínas que se expresan de forma diferente y el hecho de que tras la regre-
sión de la hipertrofia ventricular izquierda, el proteoma aún mantiene varias
proteínas expresadas características del corazón hipertrofiado. Estas proteínas que
no se recuperan desempeñan un papel esencial en la ruta de producción de ener-
gía, en la defensa frente a la agresión y también en la regulación de la hipertrofia.

Proteomas subcelulares

Las células eucariotas se encuentran divididas en diferentes compartimentos u

orgánulos delimitados por membranas. Los principales son el núcleo, las mitocon-
drias, los lisosomas, los peroxisomas, el retículo endoplásmico, el aparato de
Golgi y el citoplasma.
134
Los estudios proteómicos de orgánulos más allá de generar simples listas de pro-
teínas están conduciendo a descubrimientos importantes en biología celular y están
contribuyendo a reformar nuestros conocimientos de la célula y sus orgánulos [58].

Núcleo

El núcleo, rodeado por la membrana nuclear, contiene el material genético y es el

lugar de la expresión de los genes. Se ha analizado con un enfoque proteómico
tanto las proteínas del núcleo, como las del nucleolo y la membrana nuclear.
Jung et al [59] describieron el establecimiento de un mapa de referencia de elec-
troforesis bidimensional de las proteínas nucleares aisladas del hígado humano.
Contenían 1497 manchas. En un estudio inicial de identificación se logró identifi-
car 26 manchas que correspondían a 15 proteínas diferentes. En el año 2000 se
creó la NPD (Nuclear Protein Database; Base de datos de proteínas nucleares,
http//:npd.hgu.mrc.ac.uk) [60], que contiene información sobre más de 1300
proteínas que se supone o ya se conoce que se localizan en el núcleo celular.
Se ha estudiado la membrana nuclear identificándose 148 proteínas de las que
19 eran nuevas [61]. El complejo del poro nuclear es una subestructura de la
membrana nuclear que tiene una importancia fundamental en el control del tráfico
de moléculas entre el núcleo y el citoplasma. El complejo del poro nuclear se ha
analizado también extensamente mediante proteómica. El análisis proteómico del
espliceosoma ha conducido a la identificación de 292 proteínas, entre ellas varias
nuevas [62].
El nucleolo es el lugar de la síntesis de rRNA y donde se ensamblan las subunida-
des ribosómicas. El análisis proteómico ha identificado 271 productos génicos en
una preparación de nucleolos de células HeLa, de los cuales más del 30% no se
habían caracterizado previamente o eran desconocidos [63].

Mitocondrias

Las mitocondrias son uno de los orgánulos subcelulares más complejos, donde
tienen lugar muchas funciones celulares como la producción de energía, el meta-
bolismo de los ácidos grasos, la síntesis de pirimidinas, la homeostasis del calcio y
la señalización celular.
Se han realizado varios estudios proteómicos con mitocondrias procedentes de
células humanas [64]. Uno de los primeros análisis se realizó en mitocondrias
purificadas a partir de placenta humana utilizando electroforesis bidimensional en
gel e identificación por espectrometría de masas [65]. Sólo se identificaron 46
proteínas y muchas de ellas no eran de origen mitocondrial, lo cual sugería una
contaminación significativa del citoplasma y otros compartimentos. Un estudio
posterior con mitocondrias de una línea celular de neuroblastoma identificó 80
135
proteínas con poca contaminación [66]. Lescuyer et al [67] utilizaron 2D-PAGE y
huellas peptídicas de masa para analizar el proteoma mitocondrial de placenta
humana. Identificaron unas 140 proteínas, aunque aproximadamente el 25% de
ellas eran contaminantes.
Utilizando un fraccionamiento en gradiente de sacarosa y métodos de secuencia-
ción de proteínas mediante MS se identificaron 615 proteínas diferentes [68]. Un
estudio posterior mediante técnicas cromatográficas multidimensionales de mito-
condrias cardíacas amplió el número de proteínas a 685 [69].
Una proporción significativa de las proteínas identificadas participa en la fosforila-
ción oxidativa, la señalización, la síntesis de DNA, RNA y proteínas, el transporte
iónico y el metabolismo lipídico [68]. El proteoma mitocondrial puede consultarse
en Internet en MitoProteome (www.mitoproteome.org) [70] y MITOP
(www.mitop.de) [71] donde se encuentran tabuladas las proteínas mitocondriales
y se dan asignaciones funcionales y categorías.

Lisosomas

Los lisosomas son orgánulos en los que tiene lugar la degradación de proteínas,
oligosacáridos, glucolípidos, glucosaminoglucanos y otras macromoléculas. En
1998, Chataway et al [72] presentaron una base de datos de electroforesis bidi-
mensional de proteínas lisosómicas de placenta humana. Un poco después, Jour-
 net at al [73] analizaron el proteoma de lisosomas de monocitos y células de
cáncer de mama buscando nuevas hidrolasas. Utilizando 2D-PAGE, Wunderlich et
al [74] compararon los perfiles proteicos de los endosomas tempranos y tardíos y
encontraron que varias manchas proteicas estaban aumentadas en los endosomas
tardíos. Una de las proteínas que aumentaba denominada p14 actuaba como
proteína adaptadora esencial para el ensamblaje de un complejo crucial en la
transducción de señal [75]. El análisis proteómico de lisosomas purificados tam-
bién ha conducido a la identificación de proteínas del complejo γ-secretasa, pro-
porcionando datos para un mejor conocimiento de la enfermedad de Alzheimer
[76].

Peroxisomas

Los peroxisomas son orgánulos metabólicos presentes en casi todas las células
eucariotas que contienen enzimas implicadas en la respiración del peróxido de
hidrógeno y el metabolismo de lípidos. Se han realizado varios estudios proteómi-
cos que comparan el proteoma de células con y sin exposición a agentes de
proliferación peroxisómica [77]. Esta estrategia indirecta se utiliza debido a la
dificultad para aislar estos orgánulos. Kikuchi et al [78] han realizado un estudio
proteómico con peroxisomas aislados utilizando SDS-PAGE combinada con croma-
136
tografía líquida y espectrometría de masas. Identificaron 34 proteínas peroxisómi-
cas conocidas, además encontraron dos proteínas peroxisómicas nuevas muy
abundantes de función desconocida.

Exosomas

Los exosomas se generan por la invaginación de vesículas de membrana dentro

de orgánulos endocíticos. Se secretan por diversas células tras la fusión de los
cuerpos endocíticos multivesiculares tardíos con la membrana plasmática. Parecen
intervenir en la presentación del antígeno. Se han realizado diversos estudios
proteómicos de exosomas procedentes de células dendríticas y de linfocitos B
[79,80].

Retículo endoplásmico y aparato de Golgi

El retículo endoplásmico (RE) y el aparato de Golgi son responsables de la clasifi-

cación de las proteínas y proporcionan la localización para las modificaciones de
las proteínas posteriores a la traducción. Los primeros estudios proteómicos del
aparato de Golgi identificaron 73 [81], 45 [82] y 81 [83] proteínas. Después,
Wu et al [84] utilizando una tecnología multidimensional han identificado más de
400 proteínas del aparato de Golgi con un mínimo de 5 identificaciones peptídi-
cas independientes por proteína. Entre las proteínas identificadas 41 no tenían
función conocida. Recientemente, Takatalo et al [85] han utilizado LC capilar/ESI-
MS/MS para estudiar el proteoma del aparato de Golgi identificando nuevos
complejos proteicos.

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are ñocalized in the lysosomal 276:5152-65.
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Mol Biol Cell 2004; 15:2907-19. teins by direct organelle proteomic
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Corthals G, et al. Identification of 6:3502-8.

143
 TÍTULOS PUBLICADOS

TEORÍA DE VALORES DE REFERENCIA

Dirigida por J.M. Queraltó
Recopilación de todos los documentos de la Comisión Valores de Referencia.
Recomendaciones oficiales para la producción, utilización y transferabilidad de los
valores de referencia.
84 páginas (1993).

INTERFERENCIAS ANALÍTICAS
Dirigida por N. Gascón, F. Antoja y R. Galimany 145
Interferencias analíticas y efectos biológicos. Interferencias endógenas. Revisión
crítica de los diversos protocolos para el estudio de las interferencias analíticas.
Criterios para la interpretación de interferencias analíticas. Estudio multicéntrico de
las interferencias analíticas producidas por diversos medicamentos.
96 páginas (1993).

TERMINOLOGÍA BIOQUÍMICA-CLÍNICA: ENZIMAS

Preparada por M.J. Castiñeiras y X. Fuentes
Documento en Fase 3 de la Comisión de Terminología. Relación de la nomencla-
tura recomendada de las principales enzimas de interés bioquímico-clínico, basa-
da en la última versión de las Recomendaciones sobre Nomenclatura de las enzi-
mas de la Comisión Internacional de Enzimas de la Unión Internacional de
Bioquímica. Las entradas al vocabulario corresponden a los nombres triviales o de
trabajo. Se indica el nombre sistemático y el número de código correspondientes
así como otros nombres triviales (sinónimos) no recomendados.
84 páginas (1994).

SELECCIÓN Y EVALUACIÓN DE SISTEMAS ANALÍTICOS

Dirigida por M. Martínez
Guía, paso a paso, de los aspectos que se deben considerar al seleccionar y eva-
luar sistemas e instrumentación analítica. Incluye desde las especificaciones iniciales
 hasta el análisis de los costos en automatización. Dos capítulos exponen modelos de
evaluaciones completas y parciales. Incluye vocabulario, estudio de costes, estrate-
gias estadísticas para el tratamiento de datos y un modelo de evaluación.
120 páginas (1994).

LA CITOMETRÍA DE FLUJO EN EL LABORATORIO CLÍNICO

Dirigida por A. Orfao y J. M. González de Buitrago
La citometría de flujo es una de las técnicas de desarrollo más espectacular en los últi-
mos años, en los que ha pasado desde los laboratorios de investigación básica a los
laboratorios clínicos. Mediante citometría de flujo son posibles los análisis de antígenos
celulares, los estudios del ciclo celular, la determinación de la ploidia en cánceres y los
estudios de diversos parámetros celulares como la concentración de calcio intracelular,
el pH intracelular, la apoptosis y la incorporación de análogos de la timidina.
84 páginas (1995).

ISOENZIMAS Y FORMAS MÚLTIPLES DE LAS ENZIMAS EN BIOQUÍMICA

CLÍNICA
Dirigida por F. Canalias Reverter
La medición de las isoenzimas y de las formas múltiples de determinadas enzimas
es de gran utilidad clínica para el diagnóstico de muchas enfermedades y altera-
146
ciones metabólicas. En esta monografía se tratan ampliamente aspectos funciona-
les, metodológicos y semiológicos de algunas isoenzimas y formas múltiples de
enzimas tan conocidas como son la creatina quinasa, la fosfatasa alcalina, la L-
lactato deshidrogenasa o la α-amilasa y de otras menos utilizadas en la rutina del
laboratorio, pero de gran interés clínico, como son la fosfatasa ácida, la adenosi-
na desaminasa o la colinesterasa.
72 páginas (1996).

AVANCES EN HORMONOLOGÍA
Dirigida por M.A. Navarro Moreno
Se destacan algunos de los aspectos más sobresalientes que han ocurrido en el
estudio de la patología relacionada con el análisis hormonal en los últimos años.
Existen capítulos que abordan este estudio con técnicas de biología molecular (hipó-
fisis, tiroides); otros recopilan la regulación general de órganos y sistemas (ovario y
crecimiento) a la luz de la implicación que los factores de crecimiento ejercen en
esta regulación. Otros capítulos describen marcadores óseos y regulación hormonal
del hueso y de las hipercalcemias, centrándose los restantes en aspectos tan nove-
dosos como el abordaje del estudio de tumores ocasionales suprarrenales, estudio
de proteínas en diabetes, la DHA como agente terapéutico y el tema siempre deba-
tido del uso de los llamados métodos de tercera generación para la tirotropina.
136 páginas (1996).
RECOMENDACIONES EN ENZIMOLOGÍA CLÍNICA
Dirigida por F. Canalias y F.J. Gella
La presente monografía es una recopilación de todas las recomendaciones defini-
tivas de la Comisión de Enzimas de la SEQC. Se tratan exhaustivamente las enzi-
mas con mayor aplicación en el campo del Laboratorio Clínico. Los documentos se
han agrupado en función de su temática, prescindiendo del orden en que fueron
publicados. Debe tenerse en cuenta que se ha respetado totalmente el contenido
original de cada documento, aunque incumplan alguna recomendación posterior
de la SEQC en aspectos de nomenclatura.
128 páginas (1997).

ELEMENTOS TRAZA. ASPECTOS BIOQUÍMICOS, ANALÍTICOS Y

CLÍNICOS
Dirigida por J. A. Cocho, J. F. Escanero y J.M. González de Buitrago
A lo largo de 31 capítulos, distribuidos en dos partes, se hace un repaso a aspec-
tos generales como química, metabolismo, toxicología o análisis, en la primera, y
a cada uno de los elementos tóxicos y esenciales, en la segunda. Para cada ele-
mento, desde una perspectiva humana, se hace un repaso a su historia, ingesta,
implicaciones fisiológicas, metodología analítica, etc.
630 páginas (1998).
147

DIAGNÓSTICO MOLECULAR EN GENÉTICA MÉDICA

Dirigida por M. Lucas
El asesoramiento genético está fuertemente potenciado por los avances en genéti-
ca molecular que permiten detectar anomalías genéticas y su segregación entre los
miembros de una familia. Así, el diagnóstico molecular de una enfermedad ha
dado lugar a una variedad de nuevas situaciones en las que la buena práctica
necesita de una información científico/técnica precisa en su origen y en la utiliza-
ción de la misma. El Diagnóstico Molecular en Genética Médica ha sido tratado
en este libro desde la experiencia de especialistas enfrentados con la tarea del
diagnóstico a través de las depuradas técnicas de laboratorio de la Biología Mo-
lecular. Su lectura es recomendable a interesados en este apasionante campo de
las Ciencias de la Salud.
226 páginas (1998).

PROTOCOLOS ANALÍTICOS EN ATENCIÓN PRIMARIA

Traducción de los documentos elaborados por facultativos del Institut Català de la
Salut, consensuados en grupos de trabajo pluridisciplinarios. Se presentan los
protocolos analíticos como la forma de utilización más racional, coherente y efec-
tiva de los medios diagnósticos que proporcionan los laboratorios clínicos.
196 Páginas (1998).
 MODELOS DE DOCUMENTOS DE UN SISTEMA DE LA CALIDAD
Dirigida por A. Salas
Recopilación de algunos modelos o ejemplos prácticos de procedimientos que
forman parte de la documentación de un sistema de la calidad. Se presentan en
dos partes. En la primera parte se muestran seis documentos generales que afectan
a todas las secciones de un laboratorio clínico. En la segunda parte se agrupan
ocho procedimientos normalizados de trabajo, específicos de las distintas áreas
analíticas del laboratorio.
168 páginas (2000).

ESTRATEGIAS PARA ESTABLECER ESPECIFICACIONES GLOBALES DE LA

CALIDAD ANALÍTICA EN EL LABORATORIO CLÍNICO
Ponencias de la Conferencia Internacional de Estocolmo (1999) recogidas en un
número extraordinario de la revista The Scandinavian Journal of Clinical & Labora-
tory Investigation. Traducción realizada por la Comisión de la Calidad Analítica
de la SEQC.
En esta monografía se encuentra amplia información sobre las especificaciones de
la calidad analítica (imprecisión, error sistemático, error total) de las determinacio-
nes cuantitativas y cualitativas, así como de los factores pre y post-analíticos que
influyen sobre las especificaciones de la calidad. El trabajo refleja el modelo je-
148
rárquico que establece especificaciones ordenadas de mayor a menor trascen-
dencia clínica, aceptado por consenso internacional.
164 páginas (2000).

FILARIASIS. ETIOLOGÍA Y DIAGNÓSTICO DE LABORATORIO

Preparada por E. Boquet Jiménez y M. Boquet Figueras
Las filarias son unos parásitos hematozoarios propios de países tropicales que se
transmiten a través de artrópodos vectores. Debido a la facilidad de los viajes
intercontinentales, los laboratorios clínicos deben conocer la enfermedad y estar en
disposición de diagnosticarla. La monografía describe las características de las
principales filarias así como la metodología y los criterios de identificación necesa-
rios para determinar género y especie. Completa la exposición una interesante
iconografía que muestra los signos diferenciales de las principales microfilarias
sanguíneas.
42 páginas; 20 fotografías (2000).

ESTUDIO DE LA FUNCIÓN GONADAL Y DE LA FERTILIDAD EN EL

LABORATORIO CLÍNICO
Dirigida por J. Gaya y E. Berlanga
En esta monografía se tratan aspectos novedosos y de gran interés relacionados
con el estudio bioquímico de la función gonadal y de la fertilidad. Se abordan
tanto conceptos básicos (mecanismos de acción hormonal, bioquímica y caracte-
rísticas analíticas de las hormonas proteicas y esteroideas, fisiopatología de los
ejes hipotalamo-hiposfiso-gonadales) como de contenido más específico (fecunda-
ción asistida) y se plantean temas en los que la aportación del laboratorio se hace
indispensable tales como protocolos diagnósticos, exploraciones y pruebas funcio-
nales dinámicas o impacto de la automatización en las determinaciones de hor-
monas. Una monografía útil, por la constante evolución de las materias que trata,
tanto para el laboratorio general como para el laboratorio de hormonas.
216 páginas (2001).

EL PALUDISMO. ETIOLOGÍA, DIAGNÓSTICO DE LABORATORIO Y

PROFILAXIS
Preparada por E. Boquet Jiménez y M. Boquet Figueras
Se recoge una visión global del tema del paludismo. Su contenido está dividido
en varias partes, empezando por la descripción del agente etiológico, su ciclo
biológico y la transmisión al hombre con las manifestaciones clínicas y patológicas
que le produce.
Sigue una parte dedicada al diagnóstico de laboratorio en la que se describen los
principales métodos de investigación del parásito (coloraciones, serodiagnóstico,
etc.). En ella se exponen tablas con características diferenciales de los distintos
149
estadios de los parásitos, además de figuras y fotografías de dichos periodos.
Incluye también las pautas de quimioprofilaxis a tener en cuenta en las principales
zonas de distribución de la malaria, la descripción de los países con paludismo en-
démico y los antipalúdicos utilizados en el tratamiento de la parasitación. Adjunta una
relación de los Servicios de Sanidad Exterior del territorio español donde se puede
consultar sobre la quimioprofilaxis más adecuada al país que se pretende viajar.
La monografía concluye con una terminología que recoge los principales términos
relacionados con Plasmodium y Paludismo.
58 páginas (2001).

ESTUDIO DE LA FUNCIÓN CORTICOSUPRARRENAL EN EL LABORATORIO

CLÍNICO
Dirigida por M.J. Martínez de Osaba, N. Potau y E. Berlanga
Esta monografía se encuadra dentro del programa de formación continuada que
organiza anualmente la Comisión de Hormonas. Está estructurada en cuatro gran-
des apartados, bioquímica general, exploración del eje hipotalámico-hipofisario-
corticosuprarrenal, fisiopatología y protocolos diagnósticos y un capítulo dedicado
a hiperplasia suprarrenal congénita que incluye diagnóstico prenatal y genética
molecular. Pretende dar una visión de conjunto y hacer una actualización de los
temas más controvertidos de la patología de la corteza suprarrenal que continúa
siendo, a pesar de la gran variedad de magnitudes bioquímicas que se utilizan
 para su diagnóstico, uno de los campos de mayor dificultad diagnóstica tanto
para el clínico como para el laboratorio.
200 páginas (2002).

DIAGNÓSTICO MOLECULAR EN GENÉTICA MÉDICA (II)

Dirigida por Jesús Molano
Esta monografía es una continuación de la monografía que se publicó en el año
1998. Se exponen en ella aspectos bioquímicos, genéticos y clínicos de una serie
de enfermedades monogénicas que, por su prevalencia relativamente alta, son de
gran interés para los profesionales de la sanidad en general y para los especialis-
tas del laboratorio en particular. Cada capítulo ha sido desarrollado por especia-
listas escogidos entre los más expertos en cada uno de los temas.
138 páginas (2002).

ESTUDIO DE LA FUNCIÓN PANCREÁTICA ENDOCRINA EN EL

LABORATORIO CLÍNICO
Dirigida por Eugenio Berlanga y Roser Casamitjana
En esta monografía se ofrece una revisión de los aspectos más interesantes de la
función pancreática endocrina. Se abordan desde temas generales de bioquímica
básica y de valoración de los aspectos metodológicos relacionados con las hormo-
150
nas de síntesis pancreática, hasta aspectos más específicos relativos a la diabetes
mellitus (fisiopatología, autoinmunidad, control metabólico, criterios diagnósticos
actuales, complicaciones y diabetes tipo MODY) y al estudio de la hipoglucemia.
Contiene también una actualización de los sistemas de análisis en el lugar de aten-
ción del paciente aplicados a las diversas patologías pancreáticas.
168 páginas (2004).

DICCIONARIO DE TÉRMINOS DE GESTIÓN

Preparado por la Comisión de Gestión del Laboratorio Clínico
Dirigido por Margarita Fusté
Cada vez, mayor número de profesionales del laboratorio clínico asumen tareas de
gestión. En este diccionario se detallan los términos más comunes utilizados en la
gestión del laboratorio clínico. El objetivo es ofrecer una herramienta a los profesio-
nales involucrados para una mayor comprensión de los conceptos que tienen sus
raíces en distintas disciplinas, economía de la salud, gestión y política sanitaria.
155 páginas (2004).

PERSPECTIVAS ACTUALES EN AUTOINMUNIDAD

Dirigido por: José Manuel González-Buitrago
En los últimos años se han producido avances importantes en los estudios de las
enfermedades autoinmunitarias. Con esta monografía se pretende una puesta al
día sobre la etiopatogenia, el diagnóstico, la utilidad de los datos de laboratorio y
demás aspectos importantes de estas enfermedades. Se hace un énfasis especial
en los autoanticuerpos, sus métodos de determinación, su utilidad clínica y las
guías clínicas de su uso.
315 páginas (2004).

HOMOCISTEÍNA
Esta monografía el resultado de la 1.ª Jornada Nacional sobre Homocisteína que
se celebró en Segovia en el marco de las Jornadas del Comité Científico de la
Sociedad Española de Bioquímica Clínica y Patología Molecular, organizada por
el Grupo de Trabajo sobre Homocisteína.
Se revisan tanto los aspectos técnicos de la determinación de la homocisteína,
importantes en nuestra especialidad, como los aspectos clínicos. Desde la perspec-
tiva clínica se trató tanto la patología vascular en los distintos territorios, como otras
patologías, quizá menos prevalentes, pero no por eso menos interesantes. Otro
aspecto que se consideró muy de actualidad y también se presentó en la Jornada
fue los aspectos nutricionales y epidemiológicos de la homocisteína.
Finalmente, la monografía recoge los 24 pósters que se presentaron en la Jornada,
que ya se publicaron en el número 2004; 23 (3): 121-154 de la revista Química
Clínica.
151
164 páginas (2005).

VITAMINAS
Dirigido por: Ramón Deulofeu Piquet, M. Antonia Vilaseca y M. Cruz Pastor
La Comisión de Vitaminas Nutrición y Dietética, ha publicado la primera parte de
la Monografía de Vitaminas (volumen I) Hidrosolubles.
Hoy en día ha cambiado la perspectiva de estudio de las vitaminas, pues sabe-
mos que, en nuestro medio, tan importante es el déficit parcial como fue la caren-
cia absoluta en épocas anteriores. Los temas de nutrición son de gran actualidad
pues cada día tenemos más pruebas de que la calidad de la dieta está en rela-
ción directa a la salud. Esta monografía reúne las aportaciones de expertos de
diferentes áreas tanto de la universidad, como de los laboratorios clínicos e incluye
un prólogo del profesor Gregorio Varela-Mosquera, no olvida los aspectos meto-
dológicos y aporta información clínica y nutricional muy útil.
180 páginas (2005).

ESTUDIO DE LA FUNCIÓN SOMATOTROPA EN EL LABORATORIO

CLÍNICO
Dirigido por Laura Audí, María Luisa Granada y Eugenio Berlanga
En esta monografía, que ha elaborado la Comisión de Hormonas, se revisa uno
de los campos más controvertidos del laboratorio clínico tanto desde el punto de
 vista analítico como el de su interpretación clínica. Se actualizan aspectos rela-
cionados con la hormona del crecimiento (GH), los factores de crecimiento simi-
lares a la insulina (IFGs) y sus proteínas de transporte, abordando temas de
fisiología y patología, incluyendo anomalías génicas. Se describen y discuten los
protocolos más actuales utilizados para la exploración funcional del eje y los
métodos analíticos que habitualmente se emplean para el estudio de la función
somatotropa.
100 páginas (2005).

INTERFERENCIAS EN QUÍMICA CLÍNICA II

Dirigido por María del Patrocinio Chueca, Roser Güell e Isabel Rojo
Esta monografía es la segunda publicada por la Comisión de Interferencias y
Efectos de los Medicamentos en Química Clínica dando continuidad a la publica-
da a finales del año 1993, con el objetivo de seguir profundizando y ampliando
conocimientos en el campo de las interferencias analíticas en el laboratorio.
En ella se tratan temas actuales como son las interferencias en inmunoensayos, su
detección y eliminación; las interferencias producidas por macroenzimas; el efecto
matriz. Se revisan las interferencias en el análisis de orina con tiras reactivas. Se
muestra el estudio de las interferencias dependientes de la concentración del cons-
tituyente. Y se aporta un aspecto practico importante, al realizar un estudio de los
152
tipos de interferencias, dando a conocer el acceso a distintas bases de datos que
pueden ayudarnos en nuestra tarea diaria en el laboratorio clínico.
160 páginas (2005).

UNA GUÍA PRÁCTICA PARA LA ACREDITACIÓN DEL LABORATORIO

CLÍNICO
David Burnett
El objetivo de este libro es doble; en primer lugar, introducir el tema de los siste-
mas de la calidad y acreditación en los laboratorios clínicos, y en segundo lugar,
proporcionar una fuente de información práctica para ayudar a los laboratorios a
prepararse para la acreditación.
La traducción ha sido efectuada por miembros del Comité de Garantía de la Cali-
dad y Acreditación, bajo la dirección de Francisco Ramón y Ángel Salas.
328 páginas (2005).

ASPECTOS PRÁCTICOS Y ACTUALES DEL TRATAMIENTO CON LITIO

Dirigida por María Victoria Seijas Martínez-Echevarría
Es una monografía exhaustiva, actualizada y muy didáctica sobre el tratamiento
con litio en la que se detallan los mecanismos de acción, los niveles de evidencia
científica de las indicaciones, el uso terapéutico, la evaluación y el tratamiento de
la toxicidad y una interesantísima sección de interacciones farmacológicas.
También se exponen aspectos analíticos escasamente documentados en los textos
clínicos, tales como los métodos actuales de medición, tiempos de muestreo, con-
diciones preanalíticas e interpretación de resultados en función de las condiciones
del paciente.
Por todo ello, esta monografía es especialmente recomendada a los especialistas
del laboratorio, psiquiatras y médicos de atención primaria.
100 páginas (2006).

TÉCNICAS DE GENÉTICA MOLECULAR II

Dirigido por O. Díez
Las técnicas de genética molecular han experimentado una evolución espectacular
en los últimos años. Su presencia creciente en el ámbito del diagnóstico clínico
hace necesario el conocimiento de los conceptos teóricos y técnicos en los que se
basan. En esta monografía se desarrollan y amplían algunos temas iniciados en
una monografía anterior, publicada en 1995, y se exponen nuevas técnicas y
procedimientos de genética molecular, aplicados fundamentalmente al diagnóstico
de enfermedades de origen genético. Cada capítulo ha sido preparado por espe-
cialistas en las materias respectivas, que proporcionan información teórica sobre
los fundamentos metodológicos así como recomendaciones de tipo práctico.
160 páginas (2006).
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