UNIVERSIDAD NACIONAL FEDERICO VILLARREAL

FACULTAD DE CIENCIAS NATURALES Y MATEMTICA

ESCUELA PROFESIONAL DE BIOLOGA

Informe de Prcticas Pre Profesionales I

ESTANDARIZACIN DE LA TCNICA DE ENSAYO COMETA

EMPLEANDO GENOTOXICIDAD DE CICLOFOSFAMIDA EN
ERITROCITOS DE SANGRE PERIFRICA DE TILAPIA,
Oreochromis sp. EN CONDICIONES DE LABORATORIO

ALUMNA:

Marlene Gabriela Espinoza Goyas

TUTORA INTERNA:

Blga. Gloria Mara Sez Flores

TUTOR EXTERNO:

Mg. Carlos Scotto Espinoza

LUGAR DE PRCTICAS:

Laboratorio de Mejora Gentica y Reproduccin

Animal

Lima Per
2013

ESTANDARIZACIN DE LA TCNICA DE ENSAYO COMETA EMPLEANDO

GENOTOXICIDAD DE CICLOFOSFAMIDA EN ERITROCITOS DE SANGRE
PERIFRICA DE TILAPIA, Oreochromis sp. EN CONDICIONES DE
LABORATORIO
STANDARDIZED TEST TECHNIQUE USING COMET CYCLOPHOSPHAMIDE
GENOTOXICITY OF PERIPHERAL BLOOD ERYTHROCYTE TILAPIA,
Oreochromis sp UNDER LABORATORY CONDITIONS

RESUMEN
El ensayo de cometa, o electroforesis en gel de una sola clula, es un mtodo
genotoxicolgico sensible para la evaluacin de daos en el ADN en las clulas
individuales, lo que permite la cuantificacin de las roturas del ADN y sitios
lbiles alcalinos. Actualmente, varios grupos de investigacin internacionales
han publicado recomendaciones que describen los protocolos y criterios para el
ensayo cometa, cuyo objetivo es establecer altos estndares para obtener
datos vlidos, reproducibles y precisos. En el presente estudio, se tuvo como
objetivo estandarizar el ensayo cometa en condiciones de laboratorio con
ciclofosfamida a diferentes concentraciones y periodos de exposicin en
eritrocitos de Oreochromis sp., con el fin de ajustar el mtodo con materiales y
equipos con los que se cuentan en el laboratorio de Mejora gentica y
reproduccin animal. Para la tincin se utiliz una solucin de 0.25 % de Nitrato
de plata, 40 L/100mL de formaldehdo al 37% y agua destilada. Se observ
que el uso de las sustancias utilizadas en la metodologa fue ptimo para el
desarrollo de la tcnica. Se logr observar cometas, stos, fueron clasificados
visualmente empleando una escala arbitraria de cinco categoras segn la
formacin de ADN en la cola, asignando a cada cometa un valor.
Palabras clave: Ensayo cometa, estandarizacin, Oreochromis sp., tilapia,
ciclofosfamida.

ABSTRACT
The test of comet, or gel electrophoresis of a single cell, is a sensitive
genotoxicologico method for the assessment of DNA damage in individual cells,
which allows the quantification of DNA breaks in the labile alkali and sites.
Currently, several international research groups have published recommendations
describing the protocols and criteria for the comet assay, which aims to set high
standards for valid, reproducible and accurate. In the present study, we aimed to
standardize the comet assay laboratory conditions with cyclophosphamide at
different concentrations and exposure periods in erythrocytes of Oreochromis sp.,
In order to adjust the method and equipment with materials that are counted in
breeding laboratory and animal reproduction. For staining, a solution of 0.25%
silver nitrate, 40 L/100mL of 37% formaldehyde and distilled water. Observed that
the use of the substances used in the methodology was optimal for the
development of the technique. It was possible to observe comets; they were
classified visually using an arbitrary scale of five categories according to the
formation of DNA in the tail, assigning a value to each kite.
Key

words:

comet

assay,

standardization,

cyclophosphamide.

Oreochromis

sp.,

Tilapia,

NDICE
Pginas
I.

INTRODUCCIN

II.

MARCO TERICO

2.1 Genotoxicidad

2.2 Agentes alquilantes

2.3 Ciclofosfamida

2.4 Tilapia Oreochromis sp

2.5 Ensayo cometa

OBJETIVOS

11

3.1 Objetivo general

11

3.2 Objetivos especficos

11

MATERIALES Y MTODOS

11

4.1. Animales

11

4.2. Suntancia

12

4.3. Concentracin y Tiempo

12

4.4. Materiales

13

4.5. Mtodos

13

III.

IV.

5.5.1. Ensayo Cometa

13

4.5.1.1. Preparacin de la lmina

4

13

4.5.1.1.1. Primera capa de agarosa

14

4.5.1.1.2. Segunda capa de agarosa

14

4.5.1.1.3. Tercera capa de agarosa

15

4.5.1.2. Fase de Lisis

15

4.5.1.3. Fase de denaturacin

16

4.5.1.4. Fases de electroforesis

16

4.5.1.5. Fase de neutralizacin

17

4.5.1.6. Fijacin

17

4.5.1.7. Tincin

18

4.5.1.8. Observacin de cometas

19

V.

RESULTADOS

19

VI.

DISCUSIN

22

VII.

CONCLUSIONES

24

VIII.

REFERENCIA BIBLIOGRFICA

25

ANEXOS

29

I. INTRODUCCIN
El ensayo de cometa, o electroforesis en gel de una sola clula, es un mtodo
genotoxicolgico sensible para la evaluacin de daos en el ADN en las clulas
individuales, lo que permite la cuantificacin de las roturas del ADN y sitios lbiles
alcalinos. En comparacin con otras pruebas de genotoxicidad, las ventajas del
ensayo cometa son la deteccin de ligero dao en el ADN, el bajo nmero de
clulas

requerido,

de

bajo

costo,

precisin,

facilidad

de

aplicacin,

reproducibilidad, y corto perodo de tiempo para llevar a cabo el experimento.

(Belpaeme et al, 1998;. Tice et al, 2000;. Bcker et al, 2006).
Esta tcnica es el resultado de los estudios realizados por stling y Johanson, que
desarroll la metodologa de electroforesis de ADN en micro-gel, y aquellos por
Singh et al. (1988), que mejor la tcnica. Actualmente, varios grupos de
investigacin internacionales han publicado recomendaciones que describen los
protocolos y criterios para el ensayo cometa, cuyo objetivo es establecer altos
estndares para obtener datos vlidos, reproducibles y precisos. (Klaude et al,
1996;. Brendler-Schwaab et al, 2005;. Di -Paolo, 2006).
Los peces son considerados como buenos bioindicadores porque dependen de
varios eslabones de la cadena trfica y son capaces de acumular sustancias
txicas y responden fcilmente a bajas concentraciones de agentes mutagnicos.
(Gustavino 2001).
En los ltimos aos, la formacin de las alteraciones morfolgicas nucleares en
eritrocitos ha sido utilizado por diversos autores como posibles indicadores de
genotoxicidad (Cavas y Ergene-GZKARA, 2005a, b; Da Silva Souza y
Fontanetti, 2006;. Ergene et al, 2007a ).
El ensayo cometa se ha aplicado con xito en los eritrocitos de varias especies de
peces, mostrando as la sensibilidad de las clulas de la sangre de estos animales
a los efectos genotxicos. (Padrangi et al, 1995;. Belpaeme et al, 1998;.. Gontijo et
al, 2003).

Por otra parte es conocido que en los estudios de genotoxicidad in vivo se utilizan
sustancias mutagnicas, dentro de las ms utilizadas se encuentra la
ciclofosfamida, la cual es un agente alquilante que causa alcalinacin en el anillo
de purina, y esto resulta en una mala codificacin y replicacin de ADN.
En el presente estudio, se tuvo como objetivo estandarizar el ensayo cometa en
condiciones de laboratorio con ciclofosfamida a diferentes concentraciones y
periodos de exposicin en eritrocitos de Oreochromis sp., con el fin de ajustar el
mtodo con materiales y equipos con los que se cuentan en el laboratorio de
Mejora gentica y reproduccin animal.

II. MARCO TERICO

2.1. Genotoxicidad:
La genotoxicidad es el resultado nocivo de la interaccin de agentes qumicos o
fsicos con el aparato hereditario de la clula, y se manifiesta como alteraciones
genticas y/o cambios en el nmero o estructura de los cromosomas, que
pueden incorporarse en generaciones celulares subsecuentes llamadas
mutaciones (Clayson, y Grant, 1992).
2.2. Agentes alquilantes
Los agentes alquilantes comprenden un nmeroso grupo de compuestos
qumicos que contienen grupos alqulicos, muy reactivos, capaces de formar
uniones covalentes con los puntos nuclefilos (ricos en electrones) de los
compuestos orgnicos (Flores, 2006).
Esta unin se realiza sustituyendo los tomos de hidrgeno por los grupos
alqulicos. A nivel celular, los lugares que se alquilan con mayor frecuencia son,
por este orden, los cidos nucleicos, las protenas y los fosfolpidos; las
macromolculas alquiladas sufren profundos cambios estructurales que se

manifiestan en la clula por mutaciones, prdida de las funciones y muerte

(Flores, 2006).
El DNA es la macromolcula preferentemente afectada. La unin del alquilante
y el DNA se efecta habitualmente a nivel del nitrgeno 7 de la guanina,
formndose una 7-alquilguanina; a partir de esta unin puede ocurrir que la
base se destruya como tal o que se una a otra base no complementaria (por
ejemplo, tmina, en vez de unirse a la citosina), dando lugar a mutaciones
celulares. La alquilacin de dos bases puede provocar la destruccin de ambas,
con la consiguiente prdida de informacin gentica. La accin citocida parece
estar ligada a la formacin de uniones estables guanina-guanina, que
impediran la separacin de las cadenas en el momento de la replicacin del
DNA (Llopis, 2009).
2.3. Ciclofosfamida
La ciclofosfamida es un frmaco antineoplsico que tambin tiene propiedades
inmunosupresoras. Pertenece a la familia de los frmacos alquilantes entre los
que se encuentran el busulfan, clorambucil y melfalan. La ciclofosfamida es
activa en la enfermedad de Hodgkin, el linfoma no de Hodgkin, la leucemia
linfoctica aguda, el carcinoma de mama, el cncer de ovario, los cnceres
pulmonares, la micosis fungoide, el mieloma mltiple, el neuroblastoma y el
retinoblastoma.

Tambin

se

ha

utilizado

para

tratar

enfermedades

inmunolgicas como el sndrome nefrtico, la granulomatosis de Wegener, la

artritis reumatoide, la enfermedad injerto contra husped y el rechazo despus
de los trasplantes de rganos.
La ciclofosfamida necesita ser activado por el sistema de enzimas
microsomales hepticas para ser citotxico. Esta enzimas hepticas convierten
la ciclofosfamida en primer lugar a aldofosfamida y 4-hidroxiciclofosfamida, y
luego a acrolena y fosforamida, dos potentes sustancias alquilantes del ADN.
Al reaccionar con el ADN, los agentes alquilantes forman unos puentes que

impiden la duplicacin del mismo y provocan la muerte de la clula (Enns Et. al.,
1999).
2.4. Tilapia Oreochromis sp
Los peces cclidos Oreochromis (Linnaeus) son uno de los taxones ms
importantes en la acuicultura global de hoy (FAO, 1980). El gnero se
encuentra de forma natural en frica oriental y occidental, aunque su
distribucin no es continua. Es probablemente el gnero ms extendido y el
ms abundante de todas los que han sido introducidos ampliamente en muchas
reas del mundo (Welcomme, 1981). Estas poblaciones introducidas de
Oreochromis se han creado a partir de una variedad de fuentes naturales y
cultivadas (Trewavas, 1983).
Dentro de las caractersticas que tiene paras ser una especie modelo
bioindicadora tenemos la tolerancia a condiciones extremas: resistencia a
concentraciones bajas de oxgeno, niveles altos de amonio, valores bajos de
pH. Fcil manejo: resistencia al manipuleo en siembra, transferencias,
cosechas, manejo de reproductores.
2.5. Ensayo cometa:
Existen una gran variedad de bioensayos tiles para evaluar genotoxicidad,
entre ellos se encuentra el de electroforesis unicelular en gel, llamado
comnmente ensayo cometa, El cual es un mtodo genotoxicolgico sensible
para la evaluacin de daos en el ADN en las clulas individuales, lo que
permite la cuantificacin de las roturas del ADN y de sitios lbiles alcalinos. En
comparacin con otras pruebas de genotoxicidad, las ventajas del ensayo de
cometa son la deteccin de ligero dao en el ADN, el bajo nmero de clulas
requerido, de bajo costo, precisin, facilidad de aplicacin, reproducibilidad, y
corto perodo de tiempo para llevar a cabo el experimento (Belpaeme et al,
1998;. Tice et al, 2000;. Bcker et al, 2006).

Rydberg y Johanson (1978) fueron los primeros en cuantificar directamente el

dao del ADN en las clulas individuales mediante la lisis de clulas embebidas
en agarosa en portaobjetos bajo condiciones alcalinas suaves para permitir el
desenrollado parcial del ADN. Despus de la neutralizacin, las clulas se tian
con naranja de acridina y el grado de dao en el ADN se cuantificaba midiendo
la proporcin de verde (indicando ADN de doble hebra) a rojo (indicando ADN
de una sola hebra) de fluorescencia utilizando un fotmetro.
Para mejorar la sensibilidad para la deteccin de dao en el ADN en las clulas
aisladas, el mismo laboratorio (Ostling, O., and Johanson, K. J., 1984)
desarroll una tcnica de electroforesis en microgel. En esta tcnica, las clulas
estaban incrustadas en gel de agarosa en portaobjetos, se lisaron por los
detergentes y la alta concentracin de sal, y luego a electroforesis durante un
corto perodo de tiempo en condiciones neutras. Las clulas con aumento de la
pantalla de dao en el ADN aument la migracin de ADN desde el ncleo
hacia el nodo. El ADN migracin se cuantific por tincin con bromuro de etidio
y por la medicin de la intensidad de fluorescencia a dos posiciones fijas dentro
del patrn de migracin con un fotmetro microscopio.
Actualmente, varios grupos de investigacin internacionales han publicado
recomendaciones que describen los protocolos y criterios para el ensayo
cometa, cuyo objetivo es establecer altos estndares para obtener datos
vlidos, reproducibles y precisos (Klaude et al, 1996;. Brendler-Schwaab et al,
2005;. Di -Paolo, 2006).
El fundamento de este ensayo para detectar daos al ADN producidos por un
rompimiento simple o doble en la cadena, dao oxidativo inducido y
entrecruzamiento de ADN-ADN/ADN-protena, se basa en la fragilidad que
poseen los sitios daados; al ser sometidos a un pH superior a trece y su
comportamiento en una electroforesis. Los fragmentos de ADN, producto de la
accin de la sustancia a probar, afectados por el pH alcalino, migran a una
velocidad diferente del resto del material nuclear formando la cola del cometa,
entre ms larga sea esta porcin mayor ser el dao ocasionado al ADN.
10

Es una tcnica electrofortica sensible, reproducible, simple y de gran utilidad

en monitoreo en poblaciones humanas expuestas a radiaciones y a diversas
sustancias mutagnicas.

III. OBJETIVOS
3.1. Objetivo general
Estandarizar el ensayo cometa para evaluar genotoxicidad de ciclofosfamida en
eritrocitos de sangre perifrica de tilapia, Oreochromis sp. en condiciones de
laboratorio.
3.2. Objetivos especficos
3.2.1. Estandarizar las sustancias y concentraciones a utilizar en las
diferentes fases del ensayo cometa.
3.2.2. Estandarizar los tiempos de cada fase del proceso.
3.2.3. Ajustar la tcnica con los equipos y materiales del laboratorio.
3.2.4. Estandarizar la tincin con nitrato de plata para observarse por
microscopia simple.

IV. MATERIALES Y MTODOS

4.1. Animales: se trabaj con 112 peces adquiridos en la Facultad de
Pesquera de la Universidad Nacional Agraria La molina. Las medidas de stos
fueron de 2,5 cm de longitud (juveniles). Se mantuvieron en una piscina de 2,5 x
2,0 x 0.7 m. llena de agua hasta sus tres cuartas partes. Fueron alimentados
con comida peletizada dos veces por da.

11

4.2. Sustancia: la ciclofosfamida se obtuvo del laboratorio NEOPHOS S.A.

presentacin en polvo para solucin inyectable.

Fig.1 Ciclofosfamida usada para el trabajo

4.3. Concentracin y Tiempo: Las concentraciones ensayadas fueron: 2, 4, 6

y 8 mg/L con tres individuos por cada una. Las concentraciones fueron
seleccionadas sobre la base de los resultados de experimentos inmersin por
otros autores para las especies de peces tales como Anguilla anguilla (Pacheco
y Santos, 1996).
Los periodos de sometimiento de los peces a la sustancia fueron de 12, 24, 48,
72 horas. Se hizo dos repeticiones por cada concentracin. Y se trabaj con un
control de agua destilada.

Fig. 2 Envases de plstico de 1 litro que contienen los peces a la solucin indicada de
ciclofosfamida en agua destilada.
12

4.4. Materiales
Lminas portaobjeto

Agarosa normal punto de

Lminas cubreobjeto

fusin

Probetas

NaCl

Matraces

NaOH

Baguetas

Tris

Esptulas

Tritn X-100

Balanza analtica

Nitrato de plata

Fiolas

EDTA

Erlenmeyer

DMSO

Beackers

Formaldehdo 37%

Agua destilada

Ciclofosfamida

Cmara electrofortica

PBS 1X

Microscopio

Bencina

Estuche de diseccin

Peces Oreochromis sp.

Agarosa bajo punto de

fusin

4.5. Mtodos:
4.5.1. Ensayo Cometa
4.5.1.1. Preparacin de la lmina:
Previamente se limpian las lminas en bencina para retirar la capa de
grasa que contiene, secar con papel tis para no dejar pelusas.

13

4.5.1.1.1. Primera capa de agarosa: en un portaobjetos limpio formar

una capa delgada de agarosa de normal punto de fusin al 1.5%
(Christofoletti et.al, 2009). en un beacker colocar la agarosa lquida y
sumergir el portaobjetos unas 25 30 veces dejando un espacio de
30 segundos en cada una. Dejar secar a temperatura ambiente por 1
- 2 horas.
A

Fig. 3 A) Preparacin de primera capa de agarosa. B) observacin de la

fina lmina formada.

4.5.1.1.2. Segunda capa de agarosa: aplicar sobre la primera capa la

mezcla de 5 L de sangre perifrica de Oreochromis sp. con 85 L
de agarosa de bajo punto de fusin al 0.5% (Christofoletti et.al,
2009). Colocar un cubreobjetos sobre ella y llevar a 4 C por 10
minutos.

14

Fig. 4 Formacin de la segunda capa de agarosa con la muestra de sangre.

4.5.1.1.3. Tercera capa de agarosa: retirar la laminilla cubreobjetos y

agregar 85 L de agarosa de bajo punto de fusin 0.5%
(Christofoletti et.al, 2009), colocar una laminilla cubreobjetos y llevar
a 4 C por 10 minutos.

Fig. 5 Observacin de la forma de retiro del cubreobjetos.

4.5.1.2. Fase de Lisis:

Colocar las lminas en una solucin de lisis (volumen suficiente como
para cubrirlas) constituida por 2,5M NaCl, 100mM EDTA, 10mM Tris
pH10, 20 mL DMSO y 1 mL Triton X-100. Por una hora y media a 4C en
oscuridad.
B

15

Fig. 6 A) sustancias qumicas utilizadas para la solucin de lisis. B) solucin de

lisis en lminas con muestra.

Al cabo del tiempo sacar las lminas y lavar con solucin de

electroforesis. Dejar secar
4.5.1.3. Fase de denaturacin:
Las lminas se colocan en una placa Petri con solucin de denaturacin
(volumen suficiente como para cubrirlas) compuesta por NaOH 300mM y
EDTA 1mM, pH 12, durante 20 minutos en oscuridad y a 4C.

Fig.7 Sustancias qumicas para la preparacin de la solucin de denaturacin.

4.5.1.4. Fase de electroforesis:

Colocar las lminas en la camra electrofortica oscura con solucin de
electroforesis (NaOH 300mM y EDTA 1mM) por 20 minutos, 21 V. y 270
mA.
A

16

Fig. 8 A) fuente de poder y cmara electrofortica oscura. B) muestras en

cmara electrofortica

4.5.1.5. Fase de Neutralizacin:

La lmina pasa por tres baos de 5 minutos cada uno con 3 mL de
solucin de neutralizacin: 0.4M Tris-HCl, pH 7.5.

Fig. 9 Sustancias utilizadas para la solucin de Neutralizacin

Dejar secar la lmina.

Fig. 10 Imagen de lminas secando a temperatura ambiente en un lugar tenue

para no alterar la muestra.

4.5.1.6. Fijacin
Se sumergieron las lminas en etanol absoluto por 10 minutos. Luego se
dejaron secar.
17

Fig.11 Lminas en fijacin con alcohol absoluto

4.5.1.7. Tincin
Se utiliz una solucin de 0.25 % de Nitrato de plata, 40 L/100mL de
formaldehdo 37% y agua destilada. Las lminas fueron cubiertas de la
solucin por 15 minutos o hasta observar un oscurecimiento de la lmina,
luego enjuagarlas con agua destilada y dejar secar.
A

Fig 12. A) Nitrato de Plata. B) Solucin de nitrato de plata 0.25 %. C) Lminas

en proceso de tincin.

18

4.5.1.7. Observacin de cometas:

Las lminas se observaron a aumento de 400x.

V. RESULTADOS
Se observ que el uso de las sustancias utilizadas en la metodologa fue ptimo
para el desarrollo de la tcnica.
En cuanto a la tcnica para la formacin de la primera capa de agarosa de
normal punto de fusin y el tiempo de secado, se tuvo una fina capa casi
uniforme y una adherencia positiva del gel en el 90% de las lminas que
permiti el ptimo desarrollo de los siguientes pasos.
La rapidez al obtener la muestra de sangre perifrica cumple un proceso
importante para evitar la coagulacin de una muestra tan pequea (5 L). El
xito de la toma de muestra sin coagulacin fue del 95 % del total. An as las
muestras que se llegaron a semi coagular se aplicaron en el gel. Al final del
ensayo se observ una sola diferencia entre ellas, la aglomeracin de los
cometas en el caso de las lminas con sangre semi coagulada.
El tiempo de 10 minutos para el secado de la segunda y tercera capa de
agarosa fue tambin importante para no perder muestra mientras se retiraba el
cubreobjetos, pues al dejarlo menos o ms tiempo se corra el riesgo de retirar
parte de la muestra por no haberse gelificado bien o por haberse adherido
fuertemente el cubreobjetos al agar impidiendo de las dos formas asegurar que
la muestra se hubiese mantenido all.
En las fases de lisis, denaturacin, electroforesis y neutralizacin, las
concentraciones de las sustancias se siguieron segn lo propuesto en la
metodologa de Christofoletti et.al, 2009. En todo momento se minimiz la
exposicin a la luz, usando una luz muy tenue o en todo caso muy alejada, lo

19

suficiente como para permitir trabajar. Para la fase de electroforesis la cmara

usada fue negra.
La concentracin de nitrato de plata usada en el trabajo mostr una tincin
buena en los cometas observados. El tiempo de tincin fue relativo, en la
mayora de los casos se esper 15 minutos para observar el oscurecimiento de
las lminas y un mximo de 25 minutos.
Hubo muerte de algunos de los individuos durante la exposicin en las
concentraciones de 8 mg/L en 24 horas, 4mg/L en 48h y 8mg/L en 72 horas.
Aparentemente la muerte de stos habra sido por condiciones de alimentacin
o por la poca concentracin de oxgeno disuelto porque en los frascos de
repeticiones de esas mismas concentraciones los peces s se mantuvieron
vivos.
Para cada lmina, 100 ncleos fueron analizados. Todas las pruebas realizadas
con las diferentes concentraciones de Ciclofosfamida utilizando el ensayo
cometa indican dao en el ADN.
Los cometas fueron clasificados visualmente empleando una escala arbitraria
de cinco categoras segn la formacin de ADN en la cola, asignando a cada
cometa un valor de 1, sin dao; 2, bajo nivel de dao; 3, dao moderado; 4,
dao elevado 5, dao extremo (Kobayashi et al. 1995).

20

Fig.13 Cometas observados a 400X A) tipo 3, B y C) tipo 1, D) E) nivel 2, F) tipo 4, G)

tipo 3, H) tipo2, I y J) nivel 4.

21

VI. DISCUSIN
La electroforesis en gel de una sola clula se ha usado por los investigadores en
una amplia variedad de organismos y tejidos, mejorando de este modo su utilidad.
Por lo tanto, para entender mejor los efectos de los diferentes valores de pH en los
eritrocitos de las tilapias, se hicieron ciertos cambios, sobre la base de estudios de
Tice et al. (2000), Gontijo et al. (2003) y David (2007), el uso de pH 12,1, el tiempo
de desenrrollamiento equivalente a 20 min y el tiempo de electroforesis de 20 min,
21 V y 270 mA., la variacin de pH durante las etapas de lisis y electroforesis
influyen en el tipo de rupturas de ADN que pueden ser detectadas, como se
desnaturaliza ADN y desenrolla en valores de pH de alrededor de 12, debido a las
interrupciones en puentes de hidrgeno entre las cadenas de ADN (Kohn, 1991).
La sensibilidad y la reproducibilidad son puntos crticos para cualquier
biomarcador de dao en el ADN, e incluso cuando es un mtodo estandarizado a
fondo es necesario para poner a prueba la capacidad de los laboratorios para
producir resultados reproducibles.
En el ensayo de cometa, la sensibilidad depende en primer lugar de cmo se llev
a cabo el ensayo. El uso del tinte, intensidad de ste, cambios en las condiciones
de electroforesis, etc, juegan un papel importante en la sensibilidad (Singh, 2000).
De acuerdo con Padrangi et al. (1995) y Lemos et al. (2005), los diferentes tejidos
de organismos acuticos se pueden utilizar para el ensayo cometa. Sin embargo,
en la mayora de los casos, los eritrocitos se han utilizado como clulas diana, ya
que requieren pequeos volmenes que se pueden obtener a travs de una
tcnica no perjudicial y la disociacin celular no es necesario (Belpaeme et al.,
1998). Para nuestro caso, al trabajar con animales tan pequeos, la muestra se
obtuvo matando a stos.
La agarosa forma una matriz de fibras de hidratos de carbono que encapsulan las
clulas, de anclaje en su lugar. La agarosa se considera que es osmtica-neutro,
por lo tanto, las concentraciones usadas permitieron que las soluciones puedan
22

penetrar en el gel y afectar a las clulas. Aunque otras revisiones nos sugieren
otras concentraciones (Singh, 1988, Wclcomme, 1981, Di-Paolo, 2006) se tom
las de Christofoletti 2009 por ser empleada especficamente en Oreochromis sp.
En la solucin de lisis el papel de cada sustancia es importante; la sal acuosa
altera los patrones de unin dentro de la clula, as como interrumpe el contenido
de ARN de la clula. El detergente se disuelve las membranas celulares. A travs
de la accin de la solucin de lisis de las clulas se destruyen. Todas las
protenas, ARN, membranas y componentes citoplasmticos y nucleoplasmticos
se interrumpen y se difunden en la matriz de agarosa. Slo el ADN de la clula se
mantiene, y se desenreda para llenar la cavidad en la agarosa que toda la clula
anteriormente llena.
En la tincin con nitrato de plata, Garca et. al., 2004, Wclcomme, 1981, Di-Paolo,
2006 y muchos ms usan un mtodo de nitrato de plata con otros componentes.
Algunos de ellos son restringidos en su obtencin. Es por eso que se opta por
emplear slo formaldehdo y nitrato de plata en una solucin con agua destilada
sacada de un protocolo de tincin en geles de poliacrilamida (Duina Posso Duque
y Thaura Ghneim) modificndolo. El protocolo para la tincin de plata aplicada en
este ejercicio permiti observar los cometas, ste era el principal objetivo de
estandarizacin. Se podra jugar un poco con la concentracin del nitrato de plata,
en este caso, se logr observar bien los cometas.
El laboratorio se acondicion con respecto a la luz, las ventanas oscuras y la luz
indirecta. El uso de guantes, la rapidez de la toma de muestra, el tiempo de
secado, de exposicin a las diferentes soluciones fueron importantes para obtener
resultados confiables y un protocolo que pueda reproducirse.
Se observ que el uso de las sustancias utilizadas en la metodologa fue ptimo
para el desarrollo de la tcnica.

23

VII. CONCLUSIONES
- Se logr acondicionar la tcnica del ensayo cometa a las condiciones del
laboratorio.
- La modificacin en la tincin con nitrato de plata, dio resultados objetivos en la
observacin de cometas bajo microscopa simple.
- Esta estandarizacin de la tcnica de ensayo cometa es reproducible en
Oreocrhomis sp. bajo diferentes sustancias txicas.

24

VIII. REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS

1. Belpaeme K, Cooreman Kand, Kirsch-Volders M (1998) Development
and validation of the in vivo alkaline comet assay for detecting genomic
damage in marine flatfish. Mutat Res Genet Toxicol Environ Mutagen
415:167-184.
2. Brendler-Schwaab S, Hartmann A, Pfuhler S and Speit G (2005) The in
vivo comet assay: Use and status in genotoxicity testing. Mutagenesis
20:245-254.
3. Bcker A, CarvalhoWand Alves-Gomes JA (2006) Avaliao da
mutagnese e genotoxicidade em Eigenmannia virescens (Teleostei,
Gymnotiformes) expostos ao benzeno. Acta Amaznia 36:357-364.
4. Cavas, T., Ergene-Gozukara, S., (2005). Induction of micronuclei and
nuclear abnormalities in Oreochromis niloticus following exposure to
petroleum renery and chromium processing plant efuents. Aquat.
Toxicol. 74, 264271
5. Cavas, T., Ergene-Gozukara, S., (2005b). Micronucleus test in sh cells:
a bioassay for in situ monitoring of genotoxic pollution in the marine
environment. Environ. Mol. Mutagen. 46, 6470.
6. Clayson, D.B. y Grant, D.L. (1992). The assessment of mutagenicity.
Health protection branch mutagenicity guidelines. Enviromental and
Molecular Mutagenesis: Vol. 21:15-37.
7. Christofoletti et.al, (2009). Application of the comet assay in erythrocytes
of Oreochromis niloticus (Pisces): A methodological comparison

25

8. Da Silva Souza, T., Fontanetti, C.S., (2006).Micronucleus test and

observation of nuclear alterations in erythrocytes of Nile tilapia exposed to
waters affected by renery efuent. Mutat. Res. 605, 8793.
9. Di-Paolo C (2006) Aplicao do ensaio do cometa a estudo de danos ao
DNA de robalos, Centropomus parallelus (Poey, 1860), expostos naftoflavona

(Master

Thesis,

USP,

So

Paulo,

2006),

http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/21/21131/tde-17102006154149/ (January 25, 2008)

10. Duina Posso Duque y Thaura Ghneim. (2009). Electroforesis de
cidos nuclicos en geles de poliacrilamida. Protocolos de laboratorio
UEG (http://www.ivic.gob.ve/ecologia/ueg/). Instituto Venezolano de
Investigaciones Cientficas, Altos de Pipe- Venezuela.
11.

Ergene, S., Cavas, T., Celik, A., Kleli, N., Kaya, F., Karahan, A.,

(2007). Monitoring of nuclear abnormalities in peripheral erythrocytes of

three sh species from the Goksu Delta (Turkey): genotoxic damage in
relation to water pollution. Ecotoxicology 16, 38539.
12. Enns, G. M., Roeder, E., Chan, R. T., Ali-Khan Catts, Z., Cox, V. A. and
Golabi, M. (1999), Apparent cyclophosphamide (cytoxan) embryopathy: A
distinct phenotype?. Am. J. Med. Genet., 86: 237241.
13. Gustavino, B.; Scornajenghi, K.A.; Minissi, S.; Ciccotti, E. (2001).
Micronuclei induced in erythrocytes of Cyprinus carpio (teleostei, pisces)
by X-rays and colchicine. Mutation Research. 494 (1), 151-159.
14. FAO, (1980). Report of the Ad Hoc Consultation on Aquaculture
Research. FAO Fisheries Report 238, FIR/R238. FAO, Rome, 26 pp.
15. Flrez

Jess.

(2006).

Quimioterapia

antineoplsica

I.

Bases

fundamentales. Antimetabolitos, fijadores a la tubulina, inhibidores de

26

topoisomerasas, en: Farmacologa humana. 3 edicin. Editorial:

masson. SA. Barcelona Espaa
16. Gontijo AMMC, Barreto RE, Speit G, Reyes VAV, Volpato GL and
Salvadori DMF (2003) Anesthesia of fish with benzocaine does not
interfere with comet assay results. Mutat Res 534:165-172.
17. Klaude M, Eriksson S, Nygren J and Ahnstrm G (1996) The comet
assay: Mechanisms and technical considerations. Mutat Res 363:89-96.
18. Kobayashi H, Sugiyama C, Morikawa Y, Hayashi M, Sofuni T. (1995). A
comparison between manual microscopic analysis and computerized
image analysis in the single cell gel electrophoresis assay. MMS
Commun 3:103115.
19. Llopis

Garca

Carmen.

(2009)

Tesis

Doctoral:

Modelado

farmacocintico de ciclofosfamida en pacientes con cncer de mama.

[Tesis doctoral].Valencia, Espaa, Universidad de Valencia.
20. Ostling, O., and Johanson, K. J. (1984) Biochem. Biophys. Res.
Commun. 123, 291-298.
21. Pacheco, M., Santos, M.A., (1996). Induction of micronuclei and nuclear
abnormalities in the erythrocytes of Anguilla anguilla l exposed either to
cyclophophamide or to bleached Kraft pulp mill effluent. Fresenius
Environ. Bull. 5, 746751.
22. Padrangi R, Petras M, Ralph S and Vrzoc M (1995) Alkaline single cell
gel (comet) assay and genotoxicity monitoring using bullheads and carp.
Environ Mol Mutagen 26:345-356.
23. Rydberg, B., Johanson, K. J. (1978) in DNA Repair Mechanism
(Hanawalt, P. C., and Friedberg, E. C., Eds), pp. 465468, Academic
Press, New York.

27

24. Shaposhnikov S, Frengen E, Collins AR. Mutagenesis. (2009).

Increasing the resolution of the comet assay using fluorescent in situ
hybridization--a review. Sep;24(5):383-9. doi: 10.1093.
25. Singh, N.P., McCoy M.T., Tice R.R. y Schneider E.L. (1988). A simple
technique for quantitation of low levels of DNA damage in individual cells.
Experimental Cell Research. Vol. 175: 184-191.
26. Singh, N.P. (2000) Microgels for estimation of DNA strand breaks, DNA
protein crosslinks and apoptosis, Mutat. Res. 455 111127.
27. Trewavas, E., (1983). Tilapiine Fishes of the Genera Oreochromis,
Surorherodon and Dunukiliu. British Museum of Natural History, London,
583 pp.
28. Tice RR, Agurell E, Anderson D, Burlinson B, Hartmann A, Kobayashi
H, Miyamae Y, Rojas E, Ryu JC, Sasaki YF. (2000).Single cell gel/Comet
Assay: guidelines for in vitro and in vivo genetic toxicology testing.
Environ. Mol. Mutagen; 35: 206-21.
29. Wclcomme, R.L., (1981). Register of International Transfers of Inland
Fish Species. FAO Fish-cries Technical Paper No. 2 13. FAO, Rome, 120
pp.

28

ANEXOS
Anexo I. Esquema de la formacin del cometa propuesta por Shaposhnikov,
et al. 2009. Tomado de http://ddd.uab.cat/record/64777

29

Anexo II. Esquema tpico de un portaobjetos con las capas de agarosa

dispuestas tipo sndwich. Tomado de http://ddd.uab.cat/record/64777

Anexo III. Clasificacin visual esquemtica usada por Kobayashi et al. 1995
Clasificacin

de

clases

de

http://ddd.uab.cat/record/64777

30

cometas.

Tomada

de