Aldana-Cabañas A.1, Olivo-Zepeda I.B.1*, Toscano-Torres I.A.1, Flores-Padilla J.P. 2, Núñez-Anita R.E.

1,
Conejo-Nava J.J.1

CAPACIDAD FERTILIZANTE DEL SEMEN CRIOPRESERVADO DE PERRO DOMÉSTICO (Canis

familiaris) MEDIANTE ENSAYOS DE UNIÓN.

FERTILIZING CAPACITY OF SEMEN CRYOPRESERVED FROM DOMESTIC DOG (Canis familiaris)

THROUGH BINDING ASSAY.

1
Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, Universidad Michoacana de San Nicolás de Hidalgo, Unidad de
Servicios Integrales en Reproducción Animal. *[email protected]
2
Instituto de Investigaciones Agropecuarias y Forestales, Universidad Michoacana de San Nicolás de Hidalgo,
Centro Multidisciplinario de Estudios en Biotecnología.

El presente trabajo se llevó a cabo en la Unidad de Servicios Integrales en Reproducción Animal (USIRA) de la
Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia de la U.M.S.N.H., misma que se ubica en el km. 9.5 de la
carretera Morelia-Zinapécuaro, en el municipio de Tarímbaro, Michoacán. El semen se obtuvo de 5 machos de
perro doméstico en etapa reproductiva, mediante la técnica de manipulación digital y electroeyaculación,
utilizando una descarga de 9 voltios, siguiendo el protocolo descrito por (Johnston et al., 2007). Inmediatamente
después el semen fresco fue evaluado macroscópicamente (volumen, color, consistencia y pH) y
microscópicamente (movilidad masal, movilidad progresiva, concentración espermática, viabilidad y
anormalidades morfológicas) (Conejo, 1991). El semen se diluyó en la solución comercial Triladyl1 en una
proporción de 1:3. Posteriormente el semen se envasó en pajillas de 0.5 ml con una concentración de 50X106.
Las pajillas se sellaron en uno de sus extremos con alcohol polivinílico para ser colocadas dentro de los
gobelets, para su refrigeración. El semen diluido en Triladyl se mantuvo a una temperatura de 5 °C durante 3
horas. Durante el período de equilibrio, las lipoproteínas de la yema de huevo se incorporaron a las membranas
plasmáticas de los espermatozoides, para su protección contra el choque térmico. Las pajillas con semen
refrigerado se colocaron sobre una rejilla de acero inoxidable y fueron sometidas a vapor de nitrógeno (-120 C)
durante 10 minutos y luego se sumergieron en nitrógeno líquido a -196 °C durante 2 minutos y se almacenaron
en termos criogénicos de 20 L hasta su evaluación. Para descongelar el semen, se tomó una de las pajillas con el
semen congelado y se mantuvo 1 minuto a baño María (Fisher Scientific) a 37 ºC. Después se realizó la
evaluación microscópica (movilidad progresiva y viabilidad) del semen postdescongelación. Se realizaron dos
ensayos para evaluar la capacidad fertilizante de los espermatozoides de canino postdescongelación, mediante
ensayos de unión heteróloga y homóloga in vitro. La recolección de ovocitos fue a partir de ovarios de perras
domésticas ovariohisterectomizadas en la Secretaria de Salud y Jurisdicción Sanitaria de Morelia y
transportados al laboratorio en solución salina (PBS) y ovarios de cerda, sacrificadas en el rastro municipal de
Morelia. La recolección de ovocitos de cerda se realizó mediante la aspiración de folículos visibles de la
superficie del ovario de 3 a 6 mm de diámetro, utilizando una jeringa. El fluido folicular se recuperó en tubo
cónico dejando sedimentar a 38 °C el paquete celular. Los ovarios de perra se diseccionaron con una hoja de
bisturí para la recuperación de los ovocitos. Posteriormente los ovocitos se mantuvieron en PBS para ser
seleccionados en medio de manipulación (2.5ml SFB, 500μl estreptomicina-penicilina). Se seleccionaron los
complejos cumulus-ovocitos (CCOs), considerando aquellos que presentaron 3 o más capas celulares y un
citoplasma homogéneo. Los ovocitos se mantuvieron en la estufa de CO2 a 38°C con 5% de CO2. Se
removieron las células de la granulosa con 0.1% de hialuronidasa en vortex. Para llevar a cabo las pruebas de
unión homóloga-heteróloga se emplearon los ovocitos inmaduros, los cuales fueron colocados en gotas de 500µl
e incubados con los espermatozoides (2000/ovocito) en cajas de cuatro pozos (nunc). Las microgotas se
cubrieron con aceite mineral y se incubaron a 38 ºC en 5% de CO2 durante 8 h. Transcurrido el tiempo, los
1
Triladyl, MR por Minitube, hecho en Alemania.
ovocitos con los espermatozoides fueron lavados en medio TALP y teñidos con el fluorocromo Hoechst 33248
durante 3 min, para posteriormente ser evaluados al microscopio de contraste de fases (Zeiss) y determinar si los
espermatozoides se adhirieron a la zona pelúcida o penetraron la membrana del ovocito.

Canis familiaris or domestic dog semen is cryopreserved to facilitate the breeding success of diverse individuals
and safeguard the genetic characteristics of species at risk of extinction, including the Mexican wolf (Canis
lupus Baileyi). The aim of this study was to standardize a technique for cryopreservation of canine semen using
Tris-egg yolk (Triladyl)-based diluent, supplemented with 8% glycerol as the cryoprotectant, and to determine
its in vitro fertilizing capacity with binding assays. Eight ejaculates by manual manipulation and four by
electro-ejaculation were obtained from five Creole males with a reproductive age of 1.5 years. Each ejaculate
was macroscopically and microscopically evaluated and only the ejaculates obtained by manual manipulation
were frozen. The in vitro fertilizing capacity of canine sperms after thawing was evaluated using two
sperm-oocyte binding assays: one heterologous with sow oocytes and another counterpart with canis familiaris
oocytes. The after thawing results showed a 42.2% ± 9.3 progressive mobility and a 70% ± 6.15 of viability. The
homologous binding assay showed that frozen-thawed sperm has the ability to adhere to the granulosa cells but
not to the zona pellucida of the oocytes female canine. No adhesion was observed in the heterologous binding
trial. The results show that Triladyl is able to preserve after thaw mobility and the viability of canine sperm, but
in vitro or in vivo fertilization is required to confirm its fertilizing capacity.

La destrucción y fragmentación del hábitat está conduciendo a un aumento de la consanguinidad que amenaza la
viabilidad, tanto de poblaciones naturales como de programas de cría en cautividad aumentando la mortandad y
disminuyendo la capacidad reproductiva de los individuos. Es importante resaltar que, en ocasiones, la
preservación del medio natural no es una estrategia posible, al menos al nivel que sería deseable. Por lo que la
reproducción es un fenómeno esencial para la supervivencia de las especies y, por tanto, la biología y la
tecnología conllevan un papel esencial en la conservación de la biodiversidad (Roldán y Garde 2009).
Finalmente todas estas estrategias son consideradas como esfuerzos en conjunto para intercambiar
conocimientos y experiencias sobre el manejo y reproducción de especies, evitando lo que Charles Darwin
(1859) afirmó algún día, al decir que las razas fuertemente marcadas de algunas especies domésticas, tienen
motivos para presumir y hasta pruebas evidentes, de que todas descienden de un origen salvaje único, por lo que
finalmente las especies raras se modifican o mejoran con menor rapidez y son derrotadas en la lucha por la
existencia por los descendientes modificados y mejorados de las especies más comunes. Por estas diferentes
consideraciones es inevitable que, al formarse en el curso del tiempo nuevas especies por medio de la selección
natural, se hagan otras cada vez más raras hasta que finalmente se extinguen. Ejemplo de ello es el problema
global de la declinación de grandes depredadores de la familia canidae la cual cuenta con aproximadamente 34
especies, de las cuales 22 son consideradas como amenazadas o en peligro de extinción como lo afirma la
Convención sobre el Comercio Internacional de Especies Amenazadas de Fauna y Flora Silvestre (Zindl, 2006).
Las biotecnologías reproductivas (BR), son herramientas y/o procesos tecnológicos que el hombre utiliza desde
hace cientos de años con el objetivo de manejar la reproducción de los animales, teniendo gran impacto en el
mejoramiento animal a nivel mundial, por lo que históricamente, el desarrollo y la evolución de las BR se deben
en gran medida a los animales domésticos que son verdaderos artificies en el desarrollo zootécnico (Palma,
2008). En la actualidad, la crianza de perros es una afición de distribución mundial; consecuentemente, la
conservación de semen y la inseminación artificial se han constituido en temas de alta relevancia en la actividad
médico veterinaria (Linde-Forsberg, 1993). Uno de los temas más investigados dentro de la biología de la
reproducción del perro, ha sido la conservación de gametos (Bohórquez et al, 2005). La congelación de semen
de perro se inició a finales de los años 60 (Seager 1969; Gill et al., 1970; Andersen 1972) y ha sido adaptada de
las técnicas utilizadas en las especies pecuarias. Se han evaluado diversos protocolos para la criopreservación de
semen canino para ser utilizados en programas de inseminación artificial o fecundación in vitro. Sin embargo,
existe una tasa de fertilidad baja respecto al semen diluido. Esta circunstancia hace que la inseminación artificial
canina, se realice principalmente empleando semen fresco. (Parrado y Casallas 2004). De ahí la necesidad de
desarrollar técnicas de criopreservación y de mejores metodologías sistemáticas para evaluar el espermatozoide
y su capacidad fertilizante. Finalmente el desarrollo de estas biotecnologías reproductivas no solo sería en
beneficio del “Canis familiaris”, ya que debido a sus similitudes filogenéticas de este animal con otros
carnívoros, constituiría un papel importante para la conservación de especies silvestres, en cautiverio o en
peligro de extinción. El objetivo de este trabajo fue estandarizar una técnica para la criopreservación de semen
canino mediante el uso de un diluyente a base de Tris-yema de huevo (Triladyl) suplementado con 8% de
glicerol como crioprotector, así como determinar su capacidad fertilizante in vitro mediante ensayos de unión.

La calidad del semen colectado mediante estimulación manual fue satisfactoria (Cuadro 1), obteniéndose un
volumen promedio de 1.55 ± 0.55 ml. Este valor es similar a lo descrito por Nelson y Couto (2000), los cuales
establecen que tanto la raza, el tamaño testicular y la frecuencia de eyaculación afecta el volumen de eyaculado;
las razas más pequeñas producen menos eyaculado que las razas grandes. En movilidad progresiva se obtuvo un
valor promedio de 86% ± 10.75 de los cuales se consideran normales según Therfall, (2005), quien menciona
que la movilidad de semen fresco en la especie canina se encuentra entre 85 y 95 %, mientras que otros autores
(Burke, 1986 y Allen, 1992), afirman que el semen presenta una buena movilidad con valores que van desde 70
hasta un 90 %. El recuento de espermatozoides presentó una concentración promedio ± 475.4X106, con una
variación de ±57X106, resultado que según lo descrito por Nelson y Couto, (2000) y Sánchez et al., (2006),
concentraciones de 200 a 2000 millones por /ml en un perro adulto, deben considerarse como normales. El
porcentaje de anormalidades establece un promedio 23.2 % ±5.31, el cual se considera como aceptable, pues
como máximo debe encontrarse de un 20 hasta 25 % de morfoanomalías en semen de buena calidad en perros en
edad reproductiva (Peña, 2004). Finalmente dentro de la evaluación seminal encontramos en promedio un 79 %
±3.23 de espermatozoides vivos, con 21 % ±3.23 de espermatozoides muertos. El valor normal es de 80 % de
espermatozoides vivos, aunque algunos autores aceptan valores de 65-70% según lo establecido por
(Concannon, 1993). De los cuatro eyaculados colectados por Electroeyaculador, ninguno fue apto para la
congelación, por lo que solo se congelaron los eyaculados obtenidos por estimulación manual. Se obtuvo una
movilidad espermática postdescongelación de 42.2%±9.3 (Cuadro 2). Este resultado fue superior al reportado
por Bohórquez et al. (2005), quienes obtuvieron un 30% de espermatozoides móviles postdecongelados en un
diluyente a base de Tris y por Rota et al., (2005), con un porcentaje de 39.8%. Finalmente, algunos autores
hacen referencia a inseminaciones realizadas con semen congelado que presentaba una movilidad ligeramente
por encima del 35% (Santana, 2007). En este estudio se obtuvo, 70 %± 8.3 de viabilidad espermática (Cuadro
2). Peña y Linde-Forsberg, (2000), señalan que los valores normales para esta variable oscilan entre un 55-65%.
En el ensayo de unión heteróloga, para determinar la capacidad fertilizante, se observó que los espermatozoides
no se adhirieron a la zona pelúcida de los ovocitos de cerda (Figuras 1 y 2). Por lo cual se confirman los
resultados de estudios previos en los que demuestran que la ZP está compuesta principalmente por
glicoproteínas (Sánchez y De los Reyes, 2004) con diferencias específicas de especie. Además, la ZP contiene
receptores para la unión de espermatozoides, los cuales restringen la unión de espermatozoides de especies
heterólogas (Rivera, 1998). En el ensayo de unión homóloga, se pudo observar múltiples adhesiones de
espermatozoides a las células de la granulosa, que se mantuvieron pegadas al ovocito a pesar de que se trataron
con hialuronidasa (Figuras 3, 4 y 5). Sin embargo, no se observó unión de los espermatozoides a la ZP (Figura
5); contrario a lo que informa Gadea (2001), quien afirma que este método se ha convertido en una buena
herramienta para valorar la capacidad fecundante en la mayoría de las especies.

Semen freezing
Progressive motility
Viability
Extensor
Binding assay.
Congelación de semen
Movilidad progresiva
Viabilidad
Diluyente
Ensayos de unión

Allen W. E. (1992): Fertilidad y obstetricia canina. Editorial Acribia. ISBN: 8420007455.

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El diluyente Triladyl a base de Tris, utilizado en la criopreservación de semen bovino, fue capaz de conservar la
movilidad y viabilidad de los espermatozoides caninos postdescongelación. Los ensayos de unión tanto
homóloga como heteróloga ayudan a determinar la capacidad de adhesión de los espermatozoides a los ovocitos,
lo que es un indicativo de su capacidad fertilizante. Sin embargo, es necesario confirmar la capacidad
fertilizante de los espermatozoides caninos mediante técnicas de fertilización in vitro o in vivo.

El semen de Canis familiaris o perro doméstico, es criopreservado para facilitar las posibilidades de
reproducción de diversos individuos y así salvaguardar las características genéticas de las especies en riesgo de
extinción como el Lobo Mexicano (Canis lupus Baileyi). El objetivo de este trabajo fue estandarizar una técnica
para la criopreservación de semen canino mediante el uso de un diluyente a base de Tris-yema de huevo
(Triladyl) suplementado con 8% de glicerol como crioprotector, así como determinar su capacidad fertilizante in
vitro mediante ensayos de unión. Se utilizaron cinco machos criollos en edad reproductiva (1.5 años). Se
obtuvieron ocho eyaculados mediante manipulación manual y cuatro por electro-eyaculación. Cada eyaculado se
evaluó macro y microscópicamente y solo los eyaculados obtenidos por manipulación digital se congelaron. Se
evaluó la capacidad fertilizante in vitro de los espermatozoides caninos después de la descongelación mediante
dos ensayos de unión espermatozoide-ovocito: Uno heterólogo, con ovocitos de cerda y otro homólogo, con
ovocitos de canis familiaris. Los resultados postdescongelación fueron: movilidad progresiva del 42.2% ± 9.3 y
viabilidad del 70%± 6.15. En el ensayo de unión homóloga, se observó que los espermatozoides
congelados-descongelados tiene la capacidad de adherirse a las células de la granulosa pero no a la zona
pelúcida de los ovocitos de la hembra canina. En el ensayo de unión heteróloga no se observó adhesión de
espermatozoides. Por lo tanto, se concluye que el Triladyl es capaz de conservar la movilidad y viabilidad del
semen canino después de la descongelación pero es necesario confirmar su capacidad fertilizante mediante
fertilización in vitro o in vivo.
Tabla 1. Resultados de la evaluación de semen fresco (Evaluation results of fresh semen).
Muestra Vol./ Movilidad % % % Concentración %
No. ml masal Movilidad Muertos vivos espermática Anormalidades
progresiva /ml
Macho 1 1.0 5 90 20 80 463.5 X106 24
Macho 2 1.0 4 70 23 77 290.500 X106 28
Macho 3 1.5 5 100 20 80 1,080 X106 23
Macho 4 1 .0 4 70 15 85 360 X106 26
6
Macho 5 1.0 5 80 25 75 440 X10 27
Macho 6 2.0 5 90 24 76 495 X106 21
Macho 7 1.5 5 90 20 80 480 X106 13
Macho 8 2.0 5 100 18 82 345 X106 24
Macho 9 2.5 5 90 25 75 410 X106 16
Macho
2 5 80 20 80 390 X106 30
10
Media 1.55 4.8 86 21 79 475 X106 23.2
Desv. ±0.5 ±3.2
±0.42 ±10.75 ±3.23 ±57,435, 263 ±5.31
Est. 5 3

Tabla 2: Movilidad y viabilidad espermática de semen postdescongelación (Motility and sperm viability of
semen postthawing).
No. Muestra (%) Movilidad (%)
Progresiva Viabilidad
1 40 70
2 35 60
3 50 70
4 45 60
5 32 80
6 60 80
7 40 70
8 40 60
9 30 60
10 50 60
Media 42.2 70
Desv. Est. ± 9.3 ± 8.3
Figura 1. Ovocitos de cerda con espermatozoides de perro doméstico congelados-descongelados (Sow oocytes
with sperm frozen-thawed domestic dog).

Figura 2. Ovocito de cerda sin evidencia de adherencia de espermatozoides de perro doméstico (Sow oocyte
without adhesion of domestic dog sperm).
Figuras 3 y 4. Adherencia de espermatozoides en células de la granulosa de ovocito de perra (Adhesion of sperm
in granulosa cells of the canine oocyte).

Figura 5. Ovocito de perra, en ausencia de adherencias de espermatozoides caninos en zona pelúcida (Canine
oocyte, without adhesions of canine sperm in zona pellucida).