SECCIÓN C • Transferencia de genes: Conjugación

Estructura y función del factor F y mecanismo de

Conjugación
NEVILLE FIRTH, KARIN IPPEN-IHLER Y RONALD A. SKURRAY 126
INTRODUCCIÓN

La conjugación, un proceso que promueve la transferencia de ADN de un donante a una célula receptora
mediada por contacto físico (49, 139), ocurre entre bacterias y estreptomicetos gramnegativos y
grampositivos (para revisiones de sistemas específicos, consulte el libro Conjugación bacteriana [55]).
La capacidad del donante es conferida por la presencia de un elemento infeccioso de ADN que se
disemina a otras células. Comúnmente, los genes que codifican funciones de transferencia conjugativa se
asocian con un replicón extracromosómico, denominado plásmido autotransmisible o conjugativo.
Además de la autotransferencia, los sistemas de transferencia de plásmidos conjugativos a menudo
facilitan la transferencia independiente de plásmidos no conjugativos y movilizables que son
coresidentes en la célula donante. Las secuencias de ADN que se cointegren con el plásmido
conjugativo también se pueden transferir; por lo tanto, la integración y otros reordenamientos
recombinacionales pueden dar lugar a la transmisión de secuencias desde el cromosoma bacteriano, de
transposones y de plásmidos no movilizables. Como medio de intercambio genético entre células y
poblaciones individuales, tanto dentro como entre especies bacterianas, la conjugación es un fenómeno
de consecuencia evolutiva y ecológica fundamental (para una revisión, véase la referencia 236). La
importancia de este proceso se ha puesto de relieve aún más por la evidencia de que los sistemas de
conjugación también pueden facilitar la transmisión entre conflictos de material genético. La
transferencia de ADN-T mediado por plásmidos Ti de especies de Agrobacterium a plantas parece
representar una nueva forma de conjugación bacteriana (177, 211, 324, 364, 372). También se ha
demostrado la transferencia de plásmidos de rango amplio y estrecho (R751 y F, respectivamente) de
Escherichia coli a Saccharomyces cerevisiae (142, 143).
Responsable de la observación más temprana de la transferencia genética (206), el factor F (fertilidad)
de E. coli K12 fue el primer plásmido en ser descrito (49) y, como sujeto y herramienta, se ha estudiado
desde entonces. La perspicacia y el ingenio de los primeros investigadores permitieron que las
características principales de la transferencia de ADN mediada por F, F y la configuración circular de los
ADN plásmidos y cromosómicos se determinaran únicamente a través del análisis de cruces genéticos
que involucran marcadores cromosómicos (para un relato interesante, ver La genética de las bacterias y
sus virus). [140]). Las deducciones clave fueron (i) que F es un "episoma" circular capaz de replicarse
de forma autónoma o integrarse en el cromosoma bacteriano y (ii) que la transferencia eficiente de
marcadores cromosómicos de cepas donantes Hfr (recombinantes de alta frecuencia) refleja una
integración estable de F. El orden y la hora de entrada de los marcadores transferidos por los donantes de
Hfr podrían entonces verse reflejando la posición y orientación de un sitio específico, el origen F de la
transferencia (oriT). Se percibió que la transferencia de ADN siempre debe comenzar en este sitio y
proceder unidireccionalmente alrededor del genoma circular. Posteriormente se demostró que una sola
hebra de ADN (56, 124, 269) se transfirió en la dirección 5′ → 3′ (152, 269). Estos parecen ser preceptos
básicos para la conjugación, y se ha encontrado que los sitios oriT en muchos otros elementos
conjugativos estudiados posteriormente funcionan de manera similar en la dirección de la transferencia
de ADN contiguo.
 La observación de la conjugación y los cruces síncronos de Hfr necesarios para los experimentos de
tiempo de entrada también dependieron de la forma eficiente en que los donantes de F contactan a los
receptores. Los "pares de apareamiento" podrían formarse rápidamente en suspensiones líquidas,
persistir durante una dilución suave y ser interrumpidos por una agitación severa. F pili, los filamentos
que se extienden desde la superficie de la célula donante para iniciar estos contactos, se descubrieron
después de que se aislaron bacteriófagos que infectaban las células F + pero no F-. La adsorción de fagos
de ARN a lo largo de la longitud de F pili los distinguió de otros apéndices fimbriales (60). La expresión
de un filamento pilus también ha demostrado ser esencial para otros sistemas de conjugación de
plásmidos entéricos y pseudomonados (36, 38, 100, 161, 286), y se cree que toda la transferencia de
plásmidos conjugativos entre estos organismos gramnegativos depende de los contactos creados por
estas estructuras.

ESTRUCTURA DEL PLÁSMIDO F

El plásmido F es una molécula circular de ADN, de 100 kb de tamaño (359). Las diversas regiones
funcionales de F y la posición de oriT (coordenada 66.7F) se indican en el mapa que se muestra en la
Fig. 1. Estos confieren sus propiedades básicas, resumidas briefly de la siguiente manera.

FIGURA 1 Mapa físico y funcional del plásmido F. Los números dentro del mapa indican
coordenadas de kilobase basadas en el mapa F de 100 kb. Los elementos transponibles IS2, 1S3 y
Tn1000 están representados por cajas sólidas. Las extensiones de la replicación (RepFIA, RepFIB y
RepFIC), la transferencia y las regiones principales se indican fuera del mapa. El origen de la
transferencia conjugativa y las regiones principales se indican fuera del mapa. El origen de la
transferencia conjugativa (oriT) se denota por un triángulo que indica la dirección de la transferencia de
ADN monocatenario (región principal transferida primero). El mapa está adaptado de la referencia 359.

Región líder

Se presume que las secuencias de ADN F ubicadas entre el origen de la transferencia conyugal , oriT y
RepFIA son las primeras en ingresar a la célula receptora durante la conjugación y, por lo tanto, han sido
designadas como la región principal (296). Se cree que los productos genéticos de la región líder ayudan
a establecer el ADN F en el receptor y se discuten en una sección posterior.
Replicación autónoma

La región RepFIA, que se cree que es la principal responsable de las propiedades de replicación
típicas de F, contiene orígenes de replicación unidireccionales (oriS) y bidireccionales (oriV) (201). Las
características de mantenimiento de los plásmidos mini-F que incluyen solo el fragmento F-EcoRI f5
(44.6 a 53.7F) se parecen mucho a las de F. La regulación estricta de RepFIA y los mecanismos de
mantenimiento y partición asociados actúan en concierto para mantener el plásmido en una o dos copias
por célula (57, 97).
La región de replicación secundaria, RepFIB, es funcional de forma independiente y puede sostener la
replicación de plásmidos en ausencia de RepFIA. La región RepFIC incluye un remanente incompleto
de un sistema de replicación que es utilizado por algunos otros plásmidos relacionados (31). Las
complejidades de la replicación de F se han revisado en otros lugares (184, 185, 359).

Elementos transponibles

La secuencia F incluye una sola copia de Tn1000 (también conocida como γδ) e IS2 y dos copias de IS3
(Fig. 1) (129, 147–149) (ver capítulos 111 y 124 para descripciones de elementos transponibles). Tn1000
parece haber interrumpido RepFIC (300), mientras que la inactivación IS3 del gen regulador de la región
de transferencia, finO, es responsable de los niveles constitutivamente altos de transferencia conjugativa
exhibidos por F (52, 371). Estos elementos también median los eventos de integración cromosómica F
que forman los donantes de Hfr (véanse los capítulos 127 y 128) que, a través de una escisión imprecisa,
pueden generar posteriormente plásmidos F-prime (F′) (véase el capítulo 129). La inserción de elementos
transponibles en un progenitor de plásmido F fue fortuita para la transferencia eficiente de marcadores
cromosómicos cruciales para la detección original de la conjugación y para la utilidad posterior de F
(353; véase también el capítulo 137).

Transferencia conjugativa

Incluyendo el sitio oriT (posición del mapa 66.7F) y extendiéndose al sitio de escisión de restricción
HindIII en IS3 (coordenada 100/0F), la región de transferencia (tra) codifica todos los loci F que se sabe
que son necesarios para una transferencia conjugativa eficiente; su secuencia de nucleótidos de 33.3 kb
se ha compilado recientemente (103). El mecanismo del proceso de transferencia y las características y
funciones de los productos tra se detallan en secciones posteriores.
La inserción del fragmento BamHI-HindIII F de 41 kb (coordenadas 59.3 a 100F) que incluye la
región de transferencia hace que otros replicones se vuelvan autotransmisibles (174, 295). El fragmento
circularizado hindIII de 55 kb que incluye RepFIA, así como las regiones tra y líderes de F, forma un
plásmido útil, pOX38 (130), que tiene propiedades de transferencia y mantenimiento de F pero carece de
elementos transponibles, secuencias RepFIC y RepFIB, y otros loci entre las posiciones de mapa 100/0F
y 45F. Estos últimos incluyen el "gen asesino" srnB (116) y pif loci responsables de la inhibición del
desarrollo del bacteriófago T7 (249). Las posiciones cartográficas de estos y otros loci nombrados F han
sido tabuladas previamente (359).

PLÁSMIDOS TIPO F

El sistema de transferencia F es el prototipo de los diversos sistemas de conjugación expresados por un

gran grupo de plásmidos conjugativos conocidos colectivamente como F-like. La relación de estos
plásmidos fue indicada inicialmente por la similitud morfológica y serológica de los pili que expresaban
y las sensibilidades bacteriófagos que estos conferían (66, 204). Las relaciones entre los plásmidos
similares a F se han subdividido aún más sobre la base de la incompatibilidad (Inc), lo que resulta en los
siete grupos Inc, IncFI a través de IncFVII. Esta subdivisión generalmente se asocia con los replicones
de un plásmido, ya que los plásmidos se colocan en el mismo grupo Inc si no pueden coexistir de manera
estable en la misma célula huésped (66). La incompatibilidad, que constituye la base de la clasificación
de plásmidos F y no F, generalmente ocurre si los plásmidos comparten funciones de replicación
similares (30). La relación de los plásmidos Flike se demostró aún más mediante el análisis heterodúplex
(311) y, más recientemente, mediante la secuenciación del ADN (para una revisión, véase la referencia
103). Además de los determinantes clínicamente significativos, que incluyen aquellos para resistencias a
antibióticos y producción de hemolisinas y toxinas, se ha encontrado que los plásmidos similares a F
codifican una serie de factores ecológicamente importantes, como las colicinas y las actividades
metabólicas (ver referencia 164 para una tabulación). Los plásmidos similares a F se encuentran en toda
la familia Enterobacteriaceae (171).
La clasificación de otros plásmidos conjugativos de la familia Enterobacteriaceae y del género
Pseudomonas, no se sabe que tengan sistemas de conjugación tipo F, se ha basado principalmente en la
incompatibilidad. Sin embargo, a medida que se examinan dichos sistemas de transferencia, están
surgiendo indicios de similitudes más amplias. Los dos tipos estructurales de pili conjugativo detectados
han sugerido que todos los plásmidos conjugativos en estos grupos Inc podrían pertenecer a dos familias
evolutivas. Mientras que muchos, como F, expresan pili largos y flexibles, se transfieren de manera
eficiente en cultivos líquidos y se asocian con frecuencia con fagos f1 (M13, fd) y / o sensibilidad J (por
ejemplo, complejo IncF, plásmidos IncD, IncC e IncJ), un segundo grupo produce pili cortos y rígidos,
se transfiere más eficientemente entre las células en las superficies (a menos que sea asistido por otros
pili) y, a menudo, confiere sensibilidad a los fagos PR4 y / o X (por ejemplo, Plásmidos IncP, IncW,
IncN e IncI) (36–38; revisado en las referencias 100, 161 y 286). El análisis de la organización de genes
de transferencia y las secuencias de ADN generalmente ha apoyado esta agrupación de dos familias
(103, 128) e indicó que los sistemas de transferencia de plásmidos Agrobacterium Ti también se
parecen a los del grupo de plásmidos IncP, IncW, IncN e IncI (210, 211, 213, 282, 344; S. Bolland,
Tesis doctoral, Universidad de Cantabria, España, 1991). Sin embargo, las características de algunos
plásmidos desdibujan incluso esta distinción. Como se indicó en secciones posteriores, también ha
comenzado a surgir evidencia de relaciones que abarcan las dos familias (178, 212, 213, 283, 312, 313).

PROCESO DE CONJUGACIÓN F

La competencia del sistema F-conjugativo en apareamientos líquidos ha permitido estudiar la fisiología

de los contactos celulares mediados por F. La Figura 2 muestra las etapas de contacto intercelular y
transferencia de ADN que se cree que ocurren durante la conjugación mediada por F. Estos son los
siguientes. Se cree que el contacto entre las células donantes F+ y F- receptoras es instigado por una
interacción entre la punta de un F pilus y la superficie celular receptora (144, 264, 274, 276). Existe
evidencia de la ocurrencia de transferencia de ADN entre células que no estaban en contacto superficial
(134, 276), pero también hay evidencia indirecta (9, 279) y directa (78) de que las células conjugantes se
agregan típicamente en asociación pared-pared cercana (5, 275). Cuando se completa la transferencia de
ADN, las células de apareamiento se desagregan activamente (9, 78) para producir dos células capaces
de actividad de donante.
Se cree que la primera asociación superficial de donantes y receptores en agregados refleja la
retracción del pilus, mediada por la despolimerización de la subunidad del pilus, en la(s) envoltura(s)
celular(es) donante(s) y/o receptor(es) (63, 162, 265, 315). Estos contactos donantes y receptores se
estabilizan de una manera que hace que el agregado sea más resistente a las fuerzas de cizallamiento (5,
9, 230). En secciones delgadas, las células exhiben regiones relativamente grandes y densas en
electrones de asociación de envolturas, denominadas uniones conjugativas (78). Las reacciones
bioquímicas involucradas y la vía para el transporte de ADN siguen sin estar claras. Se ha sugerido que
la entrada de ADN en el receptor ocurre a través de un paso directo al citoplasma del receptor (359) o a
través del periplasma del receptor, donde los componentes de transporte del receptor podrían facilitar la
absorción de ADN (78).
 Un gran número de los productos F requeridos para la transferencia conjugativa están involucrados en
la síntesis de F-pilus y la estabilización de agregados. Las células receptoras portadoras de mutaciones
que alteran la estructura del lipopolisacárido (20) o la proteína de la membrana externa OmpA (232)
también afectan a las interacciones de las células del donante F, pero no está claro si estos componentes
de la superficie celular están involucrados en los contactos iniciales con el pilus o en una etapa de
estabilización posterior (para revisiones, ver referencias 10, 161 y 358). Los efectos son específicos del
plásmido, ya que los mutantes de ompA que actúan como receptores pobres para los donantes de F + se
aparean de manera eficiente con células que albergan R100-1 o R136 (231, 320) y dado que las
transferencias de F, ColB2 y R100-1 se ven afectadas de manera diferente por mutaciones en genes
individuales de biosíntesis del núcleo de lipopolisacáridos (rfa) (20). Además, estas especificidades no
dependen de la subunidad pilina (20), y los defectos de transferencia asociados con los receptores
defectuosos de conjugación a menudo se pueden omitir si los apareamientos se realizan en una
superficie sólida en lugar de en medios líquidos (137, 138).
Se cree que los procesos de transferencia de ADN F están precipitados por una "señal de
apareamiento" generada por la formación de pares funcionales (183, 277). Se han caracterizado muchos
aspectos de los eventos relacionados con el ADN necesarios para la transferencia conjugativa (para las
revisiones, ver referencias 202 y 349). Brevemente, un complejo proteico (complejo oriT) se asocia con
el origen de la transferencia de plásmidos transmisibles y movilizables. Una hebra de ADN en el sitio
oriT es "cortada" por una relaxasa que cataliza la unión covalente del extremo 5′ del ADN a la proteína.
La relaxasa del plásmido F, TraI, también es una helicasa y puede desenrollar la hebra cortada en la
dirección de 5' → 3'.
Durante la transferencia, se sugiere que esta proteína está asociada con el sitio de conexión intercelular a
través del cual se pasa esta sola hebra de ADN; debido a que está unido al extremo 5′ de oriT, también
puede catalizar la recircularización de la hebra transportada para terminar la transferencia (202, 234,
235, 297, 349, 359, 360). La síntesis de hebras de reemplazo en el donante y la síntesis de hebras
complementarias en el receptor dependen de las enzimas del huésped (183, 350) y no son esenciales para
la transferencia de ADN per se (183, 304). La Figura 2 muestra la síntesis en el donante mediante un
mecanismo de círculo rodante (349); también se ha sugerido una variación en la que los extremos oriT
de 5′ y 3′ permanecen asociados con TraI (359, 360). La proteína F-TraI forma un enlace covalente solo
con el extremo 5′ oriT; aún no está claro si el extremo 3′ permanece unido en alguna otra asociación
persistente (235).
 Las proteínas codificadas por la región principal también pueden contribuir a establecer el ADN
plásmido en el receptor, pero F no parece codificar o transferir una primasa como la asociada con los
sistemas de conjugación de plásmidos IncI e IncP (202, 349).
ORGANIZACIÓN DE LA REGIÓN DE TRANSFERENCIA

La secuencia de nucleótidos de toda la región F-tra de 33,3 kb ha revelado su estructura genética a

máxima resolución (número de acceso de GenBank U01159) (103). La Figura 3 muestra la organización
y clasificación funcional de los 36 marcos de lectura abiertos (ORF) conocidos o considerados
susceptibles de codificar productos. Con una excepción, artA, todos los genes traducidos están
codificados en la misma cadena de ADN. La secuencia finO es interrumpida por una copia del elemento
transponible IS3 (52, 371).
Las clases funcionales representadas en la Fig. 3 reflejan el fenotipo de la mutación relevante y
determinan la categoría en la que se discute cada producto y actividad del gen de la región tra individual
en este capítulo. Las técnicas genéticas clásicas se utilizaron inicialmente para definir las funciones de
transferencia codificadas por plásmidos F (12, 13, 92, 160, 270, 271). Posteriormente, las técnicas de
ADN recombinante confirmaron la autonomía de la región para la transferencia de ADN conjugativo
(174, 214, 295) y facilitaron el refinamiento del mapa genético y físico (11, 225, 229, 257, 321, 334). La
participación de loci que no habían sido representados en colecciones tempranas de mutantes ha sido, en
la mayoría de los casos, probada por mutagénesis de inserción empleando casetes de genes de resistencia
antes del reemplazo de genes a través de recombinación homóloga (180).
Una variedad de métodos de expresión génica y análisis de proteínas ahora también se han aplicado a
la detección de productos genéticos de la región tra. En la mayoría de los casos, y particularmente con
genes que se sabe que están involucrados en la conjugación, se han identificado los productos codificados
y también se ha examinado la ubicación subcelular de muchas de estas proteínas (Tabla 1). La figura 4
correlaciona la ubicación conocida o prevista de los productos de la región con su tamaño y función.

ESTRUCTURA Y BIOGÉNESIS DE F PILI

Típicamente se visualizan de uno a tres F pili que se extienden de 1 a 2 mm desde la superficie de una
célula donante (10, 162). La producción de un filamento grueso y flexible similar a un F pilus en
apariencia se ha asociado con la capacidad de los donantes de plásmidos F y F-like para conjugar
eficientemente en líquido (39, 100). El análisis de F pili purificado ha detectado un solo tipo de
subunidad proteica, F pilin (21, 42, 65, 144). Los estudios de difracción óptica y de rayos X indican que
estos se disponen helicoidalmente para formar una estructura pilus cilíndrica de 8 nm de diámetro, con
un orificio axial de 2 nm (233). La hélice básica contiene 25 subunidades en dos vueltas y tiene un paso
de 16 nm. La elevación unitaria es de 1,28 nm, y la repetición cristalográfica es de 32 nm. Las
subunidades de Pilin en F pili están relacionadas por simetría quíntuple alrededor del eje pilus. Por lo
tanto, Pili puede visualizarse como formado por discos en forma de rosquilla, compuestos por cinco
segmentos que cada uno corresponde a una subunidad de pilin; los discos se apilan de tal manera que
cada uno se gira 28.8° con respecto al disco de abajo (100, 278). Una visión alternativa es que cinco
hebras de pilin polimerizada se enrollan juntas de manera helicoidal. Se han utilizado tratamientos con
Triton X-100 o PPi de sodio para visualizar fibras muy finas de pilina (42, 241).
Además de su requerimiento para la transferencia de ADN conyugal, los F pili son utilizados como
receptores por bacteriófagos específicos masculinos; Los fagos de ARN, como R17 (por ejemplo, f2,
MS2 y Q β), se adhieren a los lados del pilo (60), mientras que los fagos filamentosos de ADN
monocatenario, como f1 (por ejemplo, M13 y fd), se adsorben a su punta (47). La inhibición de la
formación de pares de apareamiento por fagos de ADN específicos de F proporciona evidencia de que la
punta del pilus es crucial para los contactos iniciales entre las células donantes y receptoras (159, 264),
aunque también se han sugerido interacciones inespecíficas que involucran el lado del pilus (274).

Síntesis de la subunidad F-Pilus

Los productos de tres genes F, traA, traQ y traX (Tabla 1), claramente espaciados dentro de la región
tra (Fig. 3), están involucrados en la síntesis de subunidades de F-pilin. El gen traA codifica el
precursor de 121 aminoácidos (aa) de la subunidad pilus, la propilina (TraA) (Fig. 5), un polipéptido de
12,8 kDa que requiere procesamiento proteolítico para producir el polipéptido de pilina de 7,2 kDa (106,
163, 247). La Polín F madura tiene una secuencia correspondiente a la de los últimos 70 aa en TraA
(Fig. 5) y posee un extremo N acetilado, que forma su principal determinante antigénico (87, 104). Los
pasos de procesamiento y N α-acetilación en la maduración de la propilina dependen de la expresión de
traQ (163, 180, 256) y traX (252), respectivamente.
 TraQ, una proteína de membrana interna de 94-aa de 10,9 kDa (367, 369), parece proporcionar una vía
eficiente, secAindependiente y resistente al etanol para la inserción rápida de propilina en la membrana
interna (N. Majdalani y K. Ippen-Ihler, datos no publicados; N. Majdalani, D. Moore, S. Maneewanakul, y
K. Ippen-Ihler, datos no publicados). El péptido líder de propilina 51-aa se elimina en un solo paso de
escisión que depende de la señal peptidasa I (Majdalani et al., no publicado). Aunque inusualmente
largo, el líder de propilina contiene todas las características típicas de las secuencias de señales
escindidas por esta enzima: los residuos cargados positivamente son seguidos por una región central
hidrofóbica y una secuencia de procesamiento, Ala-3Met-Ala51- Ala+1, que se ajusta a la regla –3,–1
(Fig. 5) (106, 272, 342). En ausencia de TraQ, se cree que el plegamiento de propilina interfiere con su
translocación de membrana; el producto traA se degrada rápidamente y solo un porcentaje muy pequeño
se procesa (223). La inusual secuencia N-terminal y la longitud del péptido líder de la propilina no son,
sin embargo, responsables de estos efectos. Los resultados recientes muestran que la maduración de un
producto traA alterado con una secuencia líder en escorzo equivalente a los residuos de propilina 28 a
51 sigue siendo dependiente de TraQ. Además, cuando la secuencia líder de propilina 52-aa y el sitio de
procesamiento se unieron a la porción madura de β-lactamasa o fosfatasa alcalina, el procesamiento de la
proteína de fusión y la secreción de la enzima en el periplasma ocurrieron de manera eficiente y
completamente independiente de TraQ (Majdalani et al., no publicado). Por lo tanto, las secuencias
dentro de la porción madura de propilina parecen dictar la dependencia TraQ de la maduración de la
subunidad pilina.
TABLA 1 Genes de la región de transferencia implicados en la conjugación
Gen Grupo funcionala Longitud del producto Tamaño del producto Ubicación del productoc Referencia(s)
(aa)b (kDa)b
finOd
Regulación 186 21.0 Citoplasma 59, 371
finP Regulación 78 nte Citoplasma 88, 339

traA Biogénesis de Pilus 121 [70] 12.8 [7.2] Membrana interna y 106, 252, 255, 278
extracelular
trote Biogénesis de Pilus 475 50.5 Membrana interna 257; Frost, datos no publicados
citados en la referencia 103
Trac Biogénesis de Pilus 875 99.2 Citoplasma/membrana 306, 307
internaf

Unido Metabolismo del ADN 717 81.7 Membrana interna 173, 280, 370
traE Biogénesis de Pilus 188 21.1 Membrana interna 7, 106, 163, 200
Conocido Biogénesis de Pilus 247 [228] 28,0 [25,9] Periplasma 368
tragg
Biogénesis de Pilus y 938 102.4 Membrana interna 94, 230, 254, 356
estabilización de agregados
Razas Biogénesis de Pilus 458 [434] 50,2 [47,8] Periplasma 94, 132, 230
traIg
Metabolismo del ADN 1,756 192.0 Citoplasma 2, 40
traJ Regulación 229 27.0 Citoplasma 62, 328
Tiró Biogénesis de Pilus 242 [221] 25,6 [23,3] Periplasma 287
traL Biogénesis de Pilus 91 10.4 Membrana interna 103, 106
tranvía Metabolismo del ADN 127 14.5 Citoplasma 73, 328
Tran Estabilización de 602 [584] 65,7 [63,8] Membrana externa 224
agregados
traQ Biogénesis de Pilus 94 10.9 Membrana interna 223, 367, 369
traS Exclusión de superficie 149 16.9 Membrana interna 7, 172
Pateó Exclusión de superficie 244 [233] 26.0 [23.8] Membrana externa 6, 172, 245, 246, 248, 288
traU Biogénesis de Pilus 330 [308] 36,8 [34,2] Periplasma 253
trote Biogénesis de Pilus 171 [153] 18,6 [16,6] Membrana externa 76, 257
Hierba Biogénesis de Pilus 210 [193] 23,6 [21,7] Periplasma 225, 227
traX Biogénesis de Pilus 248 27.5 Membrana interna 59, 222, 252
bandeja Metabolismo del ADN 131 15.2 Citoplasma 95, 157, 199, 261
trbC Biogénesis de Pilus 212 [191] 23,4 [21,2] Periplasma 226
trbI Biogénesis de Pilus 128 14.1 Membrana interna 227
aEn el texto se muestran las referencias primarias para la asignación de genes a grupos funcionales.
bLos tamaños y longitudes se calculan a partir de la secuencia de aminoácidos deducida de cada producto. Los tamaños y longitudes de los productos procesados
se muestran entre paréntesis. Los valores para los productos procesados basados en sitios de escisión predichos (es decir, no secuenciación N-terminal) se italizan.
cLas
ubicaciones de los productos se han determinado experimentalmente a menos que se muestren en cursiva, en cuyo caso se enumera la ubicación prevista.
dEl gen
finO de F es inactivado por un elemento IS3 insertado, y su clase de complementación se basa en el fenotipo of alelos finO de otros plásmidos similares a F. Las

características del producto finO son valores hipotéticos calculados después de eliminar la secuencia IS3 (ver texto). ESincece finP codifica una molécula de ARN

antisentido, su longitud de producto está en nucleótidos. fTraC

es una proteína citoplasmática que fracciona con la membrana interna en presencia de otros productos
tra (ver el texto). gAdemás
de los productos mostrados, se ha encontrado que traG y traI codifican los productos más pequeños TraG* y TraI*, respectivamente
(véase el texto).
 La expresión del gen traX es necesaria para la N α-acetilación del polipéptido F-pilina (252). El
producto predicho del traX ORF tiene una longitud de 248 aa y parece ser una proteína politópica de la
membrana interna (59). Los análisis in vivo e in vitro han detectado dos productos traX, TraX1 (24
kDa) y TraX2 (22 kDa), que se asocian con la membrana interna (222, 223a) pero parecen
significativamente más pequeños que los 27,5 kDa calculados a partir de la secuencia (59). Aunque
ambos productos parecen estar traducidos del traX ORF, puede haber más de un sitio de iniciación de
traducción. Los codones traX 29 a 225 codifican una región esencial para la actividad de acetilación de
pilina (Maneewannakul et al., no publicado). La N α-acetilación de pilin es una propiedad común a todos
los sistemas similares a F caracterizados hasta ahora (87, 104, 365, 366), pero parece no ser esencial para
la biogénesis o función de F-pilus. En condiciones típicas de laboratorio, se encontró que un mutante F-
traX era fenotípicamente normal tanto para la transferencia de ADN conyugal como para la sensibilidad
al fago (252). Sin embargo, las características de unión a anticuerpos de pili elaboradas en ausencia de
TraX difieren de las de pili de tipo salvaje (126, 127, 252).
Se ha detectado similitud de secuencia de aminoácidos entre TraX, TrbP del incP α plásmido RP4
(282), producto del gen FimC Dichelobacter nodosus (anteriormente Bacteroides nodosus) (145), y el
producto deducido de un ORF del fago filamentoso de ADN monocatenario Cf1c de Xanthomonas
campestris pv. citri (94a, 197). Paralelamente a lo que se ha observado para traX, dos polipéptidos se
han asociado con la expresión de fimC, que se encuentra inmediatamente aguas abajo del gen de la
subunidad fimbrial principal, fimA, en algunos serotipos de D. nodosus (145).
Los intentos de confirmar la sugerencia de que la pilina F podría estar fosforilada o glicosilada (42,
65, 144) no han logrado identificar ninguna modificación covalente de este tipo (22, 101). Sin embargo,
recientemente se ha demostrado que una proporción menor de subunidades de pilina, tanto dentro de un
grupo de membrana interna como de pili ensamblados, tienen una modificación no caracterizada que
hace que migren en la electroforesis en gel de dodecil sulfato de dodecil-poliacrilamida de sodio (SDS-
PAGE) un poco más lentamente que la mayoría de las subunidades (223, 252). Esta modificación, que se
presume que es realizada por productos codificados por el huésped, parece ocurrir después de la escisión
del péptido de señal y no interfiere con, pero es inhibida por, N α-acetilación (223). Se encontró que
ambas formas de F pilin exhiben una estabilidad considerable in vivo (223).
Topología de la subunidad F-Pilin

En circunstancias normales, la mayoría de las subunidades de pilina en una célula F + parecen estar
asociadas con la membrana interna en lugar de con pili ensamblados (127, 254, 255, 323). La topología
de F pilin en la membrana interna ha sido analizada por fusiones de genes traA′-′phoA, lo que indica que
la proteína contiene dos segmentos transmembrana y está orientada de tal manera que sus residuos N- y
C-terminales se localizan en el periplasma (278). El marcado immunogold de los esferoplastos ha
sugerido que las subunidades de F-pilin se agrupan en ubicaciones discretas en la membrana interna
(278).
Las secuencias de mutations F-traA que afectan la sensibilidad de los fagos y de los genes traA
transportados por plásmidos conjugativos tipo F (Fig. 5) han proporcionado información sobre la
topología de la pilina ensamblada y las especificidades asociadas con estos filamentos (100, 102, 103,
286). Tanto la secuencia de señal de propilina larga como la estructura de pilin parecen estar altamente
conservadas entre los plásmidos similares a F (Fig. 5). Entre los plásmidos similares a F, las diferencias
en la secuencia N-terminal del polipéptido de pilina madura alteran el epítopo dominante y confieren
especificidades de plásmidos. Sin embargo, esta región de la proteína, aunque expuesta en pilin de
membrana y las perillas basales que se encuentran en el pili libre, parece estar enmascarada en el
filamento ensamblado, excepto posiblemente en la punta (104, 278, 365). Los residuos en o cerca del
extremo de la pilina C y en un rigión, incluidos los residuos maduros de pilina 12 a 22 (Fig. 5) parecen
ser importantes para la unión ARN-fago y se ha sugerido que están disponibles en el exterior del pilus
(100, 105). La comparación de las secuencias de pilina deducidas bastante diferentes de F y pED208
(IncFV), que confieren sensibilidad al bacteriófago f1, ha sugerido que el sitio de unión de estos fagos
filamentosos de ADN podría involucrar residuos en la región de mayor identidad (residuos de F-pilina
16 a 24 [Fig. 5]) (84). Otra sugerencia, sin embargo, es que los residuos más cercanos al extremo F-pilin
N (cerca de M9) son importantes para la unión de f1 en la punta del pilus (100); los estudios de unión de
anticuerpos indican que tanto un epítopo de F-pilin que incluye estos residuos como el epítopo N-
terminal de la secuencia de pilin pED208 están enmascarados a lo largo de la longitud de F pili, pero
pueden estar expuestos al final del filamento (104, 365). Se ha sugerido que los residuos de F-pilina
K46 a K49 se localizan en el citoplasma de la pilina de membrana y en la luz del filamento ensamblado
(278).

Montaje F-Pilus

Estudios genéticos exhaustivos han demostrado que la mayoría de los genes de la región F-tra están
implicados en el ensamblaje del pilus (Fig. 3 y 4). Como se discutió anteriormente, el gen de la
propilina, traA, y los productos traQ y traX involucrados en su maduración, logran la síntesis de la
membrana F pilin. Sin embargo, las mutaciones en traL, traE, traK, traB, traV, traC, traW, traU, traF,
traH, traG, trbC o trbI también han demostrado tener efectos sobre los fenotipos asociados a la piliación
(13, 226, 227, 243, 252, 362). Dado que tales mutaciones permiten la acumulación de pilina F de
membrana (252, 255), se presume que los productos de estos genes están involucrados en el ensamblaje
de subunidades en el filamento pilus. Las características conocidas o predichas de estas proteínas se
resumen en la Tabla 1. Aunque se sabe poco sobre sus funciones específicas, cada una de estas proteínas
parece estar asociada con la envoltura celular, dando crédito a la noción de que constituyen un complex
de ensamblaje de pilus (162, 200, 359). Como indica la Fig. 4, los estudios de localización subcelular
sugieren que este complejo podría conectar las membranas internas y externas de la célula.
Los productos de traW, traU, traF y trbC poseen secuencias de señal típicas de peptidasa I N-
terminal, y su escisión y translocación al periplasma se han demostrado experimentalmente (Tabla 1)
(226, 227, 253, 368). También se cree que TraK y TraH están localizados periplásmicamente, ya que la
secuencia de aminoácidos deducida de cada uno contiene un péptido de señal de peptidasa I N-terminal
identificable (132, 287). La inhibición de la globomicina del procesamiento de la peptidasa II de la señal
ha demostrado que el traV codifica una lipoproteína, como sugiere el péptido de señal característico
evidente en el extremo N de la secuencia de TraV deducida (76). Se presume que la modificación
lipídica de TraV representa los tamaños mayores de lo previsto de TraV maduro y su precursor (16,6 y
18,6 kDa, respectivamente [Tabla 1]) calculados a partir de su migración en SDS-PAGE (20 y 21,5 kDa,
respectivamente) (76, 257). Como lipoproteína, es probable que el TraV maduro esté atado a la
membrana externa a través de la modificación lipídica covalente y, como tal, puede representar el único
producto tra requerido para que la biogénesis del pilus se localice de esa manera (Fig. 4) (76).
Los estudios de fraccionamiento celular y/o análisis de hidropatía de los seis productos adicionales
codificados por traB, traC, traE, traG, traL y trbI sugieren que, con la excepción de TraC, se trata de
proteínas integrales de la membrana interna (Fig. 4; Cuadro 1) (103). Mientras que el TraC parecía estar
localizado en el citoplasma cuando se sintetizaba de forma aislada, Schandel et al. (306, 307)
encontraron que se fraccionaba con la membrana interna en presencia de otros productos de la región
tra. Por lo tanto, se presume que TraC normalmente se asocia con una o más de estas proteínas de la
membrana interna (307), aunque no se han identificado sus interacciones específicas. Los motivos del
sitio de unión ATP/GTP tipo A que pueden ser importantes para la energía del ensamblaje del pilus se
han identificado en la secuencia de aminoácidos deducida de TraC y en la de una proteína de ensamblaje
periplásmico, TraH (103). Aunque la importancia de estas secuencias aún no se ha establecido
experimentalmente, debe tenerse en cuenta que la proteína de transferencia de ADN-T agrobacteriano,
VirB4, que comparte la similiaridad de la secuencia de aminoácidos con TraC, ha demostrado exhibir
actividad ATPasa (313).
Mientras que las mutaciones en la mayoría de los genes de la clase de ensamblaje de pilus
generalmente resultan en células donantes que carecen de pili y son completamente resistentes a los
fagos específicos de pilus y a la transferencia desafiante, algunas causan diferentes fenotipos que pueden
proporcionar información funcional. Aunque todas las mutaciones de traC parecen abolir el crecimiento
de Fpilus, se encontró que la mutación de sentido erróneo traC1044 causa solo defectos parciales en la
formación de apareamientos y la infección filamentosa de fagos de ADN de cadena simple, lo que
sugiere que al menos la punta del pilus está expuesta en tal mutante (305, 306). Se ha encontrado que las
mutaciones de deleción/inserción que eliminan la expresión de la proteína periplásmica TrbC exhiben un
fenotipo similar en el que se conserva una sensibilidad significativa a f1, pero no se detectan filamentos
F-pilus (226). Se encontró que las células donantes incapaces de expresar traU sintetizan un número
reducido de F pili aparentemente normal (253). La mutación de trbI también permitió la producción de
pilus, y tales mutaciones tampoco tuvieron un efecto discernible en la eficiencia de transferencia de
ADN, pero se encontró que alteraban las sensibilidades de los fagos específicos masculinos, lo que
indica una función de pilus alterada; se encontró que la sobreproducción de TrbI causaba el mismo
efecto (227). Algunos mutantes trbI también sintetizan pili inusualmente largos (227).
El gen traG es único en el sentido de que las mutaciones en este gen caen en cualquiera de las dos
clases fenotípicas. Mientras que todas las mutaciones de traG resultan en deficiencia de transferencia,
solo la región N-terminal del producto gen es esencial para la biogénesis de pilus. La mutación o
deleción de la región C-terminal no afecta a la piliación (11–13, 160), y la función traG esencial para el
crecimiento del filamento puede expresarse a partir de un fragmento de SmaI que lleva solo codones
traG 1 a 534 (94). Se sugiere que la región N-terminal relevante para la piliación incluye un gran
dominio periplásmico, anclado en la membrana interna por las regiones circundantes que abarcan la
membrana (94). Se cree que la deficiencia de transferencia resultante de la mutación de la porción C-
terminal del producto traG refleja un defecto en la estabilización del agregado de apareamiento (230;
también ver más abajo). Presente en 500 a 600 copias por célula F+ (230), se cree que TraG es
bifuncional (Fig. 3 y 4) (11, 13).
La microscopía electrónica de secciones delgadas ha indicado que el crecimiento de F-pilus ocurre en
regiones de adhesión entre las membranas internas y externas (27). Aunque la existencia y naturaleza de
tales zonas de adhesión (también conocidas como uniones de Bayer) siguen siendo controvertidas (28,
181), las ubicaciones de la envoltura asociadas con las proteínas de ensamblaje de pilus (Fig. 4; Tabla 1)
sugieren que podrían interactuar entre sí y con pilin para crear tales conexiones, formando un sitio para
la extensión del filamento y tal vez también una ruta para el ADN.
Se presume que el ensamblaje del filamento depende de la energía, ya que los venenos respiratorios,
como el cianuro y el arseniato, dan lugar a la retracción del pilus (265, 266). Como se sugirió
anteriormente, los sitios de unión a ATP en las proteínas de ensamblaje, TraC y TraH, podrían ser
importantes para este proceso. Aunque se ha planteado la posibilidad de que las subunidades de Fpilina
se sumen a la punta del filamento (315), hay datos que demuestran que los pili conjugativos gruesos y
flexibles de un plásmido IncH se alargan por adición de subunidades en la base (220), lo que sugiere que
F pilin también puede polimerizarse de esta manera. Los análisis de Sowa et al. (323) sugirieron que los
monómeros de F-pilina en el grupo de membranas pueden ensamblarse transitoria y reversiblemente en
F pili. Estos autores propusieron un modelo en el que la pilina se conserva en una piscina de membrana
interna y se recicla a través del crecimiento de pilus y la posterior retracción (323). El ensamblaje del
filamento se puede ver como un proceso de transporte, involucrado en la secreción y absorción de pilin,
es decir, como una "bomba" dependiente de la energía que puede mover pilin desde la membrana interna
a través del periplasma, excretarlo como un polímero y tomarlo nuevamente. Otro punto de vista es
considerar las proteínas de ensamblaje de pilina para formar un centro organizador de filamentos y, al
igual que las proteínas que median la polimerización de actina y tubulina, para organizar, activar y
desactivar la polimerización de pilina. Existe evidencia que sugiere que los filamentos también pueden
estar involucrados en otros tipos de transporte macromolecular en bacterias (292). Las similitudes
detectadas entre las proteínas implicadas en la conjugación, así como sus posibles implicaciones, se
analizan al final de este capítulo.

ESTABILIZACIÓN DE AGREGADOS DE APAREAMIENTO

Las células portadoras de derivados F que llevan mutaciones en el promotor porción distal de traG o
dentro de traN elaboran pili aparentemente normal. Sin embargo, no logran transferir ADN (13, 230,
243), a pesar de que se puede iniciar el metabolismo del ADN conyugal (183). Esto, junto con la
observación de que tales mutantes forman agregados con las células receptoras de manera ineficiente, ha
llevado a la asignación de estos genes a la etapa de estabilización de apareamiento del proceso
conjugativo (Fig. 3 y 4) (230). Se cree que esta etapa, definida clásicamente por el fenotipo agregado de
apareamiento de los mutantes ompA receptores (230), representa la conversión de los contactos
inestables iniciales entre las células donantes y receptoras a una forma que es resistente a la interrupción
por fuerzas de cizallamiento (137, 138, 230). Sin embargo, a diferencia de la transferencia a mutantes
ompA receptores, la transferencia de donantes de traG no muestra un aumento en la eficiencia cuando
los apareamientos se realizan en una superficie sólida, y un defecto del donante de traN se suprime solo
en una medida muy limitada en tales condiciones (230). Se encontró que la incapacidad de las células
donantes de piliato traG para formar agregados de apareamiento estables no se debía a una defección en
la retracción del pilus (265).
Se encontró que el producto traN es una proteína que se expresa como precursor, se somete a
procesamiento de secuencia de señales y fracciona con la membrana externa en su forma madura (Tabla
1). Este gen codifica un polipéptido de 65,7 kDa y 602 residuos, con una señal de peptidasa I que se
predice que eliminará 18 aa y producirá un producto de 63,8 kDa (224). Los experimentos de
susceptibilidad a la proteasa también han demostrado que una porción de TraN está expuesta
extracelularmente, lo que aumenta la posibilidad de que esta proteína interactúe directamente con un
componente surface de la envoltura celular receptora (224). Sin embargo, un gran segmento del
polipéptido es resistente a la digestión proteolítica externa y puede incluir un dominio (s) periplásmico
(s). La secuencia de aminoácidos TraN deducida contiene un motivo de sitio ATP/GTP-binding tipo A,
aunque se desconoce la importancia de este sitio (103, 224). Hasta ahora, la función de TraN se ha
definido mediante la caracterización fenotípica de un solo plásmido mutante de TraN, en el que una
mutación ámbar trunca el producto en el residuo 130 (224).
 Como se indicó anteriormente, traG parece ser bifuncional, con secuencias en el extremo 5′ del gen
que son esenciales para la piliación y las que están en el extremo 3′ del gen son prescindibles para la
función de ensamblaje del pilus pero esenciales para su papel en la estabilización agregada (Fig. 3 y 4;
Tabla 1) (11, 13, 230). Sobre la base de experimentos de susceptibilidad a la proteasa y predicciones
estructurales basadas en secuencias de ADN, Firth y Skurray (94) han sugerido una topología en la que
TraG se divide en dos grandes dominios periplásmicos involucrados en el desempeño de sus funciones
duales: que más cercano al extremo N es suficiente para la función de ensamblaje de Pilus de TraG, y el
segundo, compuesto por aproximadamente la mitad de la longitud del polipéptido e incluyendo el
término C, se requiere adicionalmente o por separado para la estabilización. La detección de TraG*
(Fig. 4), una proteína periplásmica reactiva de 50kDa con anticuerpos elevados contra secuencias de
regiones C-terminales de TraG y sugerida para ser liberada de TraG por escisión proteolítica, ha
planteado la posibilidad de que esta poción de TraG funcione en estabilización como una proteína
independiente (94). Aún no está claro si el dominio N-terminal de TraG también es necesario para
agregar la estabilización y si la liberación de TraG* está influenciada por eventos de etapa de contacto
temprana y/o es necesaria para la estabilización de agregación. Sin embargo, los fenotipos de los
mutantes traN y traG, junto con las posiciones de envoltura de TraN y TraG/TraG*, sugieren que podría
ser necesaria una interacción entre los dominios periplásmicos de estas proteínas para formar una
conexión funcional estable entre las células conjugantes. Tal interacción puede estar asociada con la
formación de uniones de conjugación densas en electrones observadas en secciones delgadas (Fig. 2)
(78).
COMPONENTES INVOLUCRADOS EN LAS ETAPAS DE TRANSFERENCIA DE ADN DE
LA CONJUGACIÓN

Una vez que se realizan los contactos de apareamiento, el ADN del plásmido F se somete a un
procesamiento y eventos replicativos (Fig. 2) que resultan en el establecimiento de copias completas de
plásmidos tanto en células donantes como receptoras. El corte de una hebra de ADN ocurre como
preludio de estos eventos; Esa hebra se desplaza y entra en la célula receptora en una dirección de 5′ →
3′ (152). Las actividades de corte dual y desenrollamiento de ADN demostradas para F TraI indican que
su papel es central en estos eventos. Sin embargo, hay evidencia de que los productos de los genes
FtraY, -traM y -traD también están involucrados en el corte de oriT, el desplazamiento de hebras y los
eventos de transferencia de ADN que ocurren durante la conjugación (Tabla 1) (81, 183). Como se
indicó anteriormente, se cree que la síntesis de un reemplazo para la hebra transferida (síntesis de ADN
conyugal del donante) y la generación de la hebra complementaria en el receptor (síntesis de ADN
conyugal del receptor) ocurren concomitantemente con la transferencia de ADN conjugativo (183).
Dado que estos procesos parecen ser llevados a cabo por actividades codificadas por el huésped y la
transmisión de ADN aparentemente puede ocurrir incluso si dicha replicación se inhibe (183, 304, 350),
no se discutirán en detalle aquí. Wilkins y Lanka (349) han revisado recientemente el tema en
profundidad.
Originalmente identificada como una site de acción cis requerida para la transferencia de ADN (361),
la región oriT contiene el sitio en el que se corta la hebra única de ADN que se transferirá y desde la
cual esta hebra se desenrolla y se transporta al receptor. Las secuencias en la región oriT también son
importantes para la recircularización de la hebra transferida y la terminación de la transferencia de F
(111) y otros plásmidos conjugativos (80, 182, 202). Para mayor comodidad, la región oriT se ha
definido tradicionalmente como el segmento entre el sitio BglII en 66.6F y el gen traM (Fig. 3 y 6)
(329), aunque el mapeo de deleción ha demostrado que la región mínima requerida para la actividad
oriT en cis es algo más pequeña que esto (107). Se han determinado las secuencias de nucleótidos de las
regiones oriT de ocho plásmidos similares a F, a saber, F (IncFI) (329), P307 (IncFI) (117, 123), RI
(IncFII) (273), R100 (IncFII) (240), ColB4-K98 (IncFIII) (86), pSU316 (IncFIII) (218), pED208
(IncFV) (72) y pSU233 (IncFVII) (302). El segmento de ADN entre el sitio BglII en 66.6F y la región
rica en CA que une el límite hacia la izquierda de la región oriT mínima contiene los promotores y el
extremo 5′ de una región líder cistrón conocida de diversas maneras como orf169 o gen X (Fig. 6) (214,
329) y el gen 19 en R1 (122).
Una especificidad funcional considerable se asocia con los sistemas de metabolismo del ADN
conyugal de plásmidos similares a F (357). Se presume que la especificidad plasmática observada de
TraI, TraM y TraY es el resultado de las diferencias de secuencia de ADN dentro de las diversas
regiones oriT en las que actúan estas proteínas y la variación correspondiente en las secuencias de las
proteínas. Un componente de dicha especificidad del plásmido también puede reflejar la interacción de
las propias proteínas (357). Las regiones de oriT plásmidos típicamente contienen una serie de
repeticiones invertidas y directas; mientras que algunas de estas son ecognizadas por proteínas como
TraM (73), la importancia funcional de otras aún no se ha determinado. La presencia de curvas
intrínsecas y sitios de unión para las proteínas que doblan el ADN indica que la región F-oriT tiene una
forma característica (219, 336). Esta noción está respaldada por correlaciones entre el espaciado y la fase
de las diversas características oriT (107). A pesar de las diferencias de secuencia de nucleótidos
evidentes entre las regiones oriT tipo F secuenciadas, una organización estructural y funcional común es
apparente (Fig. 6).

Nicking en oriT

El sitio de corte, que se ha determinado para los plásmidos F y R100 (158, 234, 330), se encuentra
dentro de una región que exhibe un alto grado de conservación de la secuencia que se extiende al menos
40 nucleótidos a la izquierda del site nick y aproximadamente 100 nucleótidos a la derecha. El sitio nick
está centrado en y sobre la hebra complementaria a un segmento rico en CA de aproximadamente 40
nucleótidos. El límite hacia la izquierda de la región F-oriT se define por la extensión de esta región rica
en CA, ya que las deleciones en ella desde ese lado abolen el nicking (107). El resto del segmento
conservado a la derecha del sitio nick tiene un alto contenido de A + T y contiene una curva intrínseca,
una secuencia limitada por el factor host de integración (IHF) y un sitio (sbyA) para which el producto
traY se une (199, 219, 336); Los sitios de unión A IHF y TraY en la región R100-oriT tienen
también se ha identificado (154, 156). La eliminación de las secuencias F de la derecha ha demostrado
que solo la mitad izquierda de la secuencia de unión a sbyA TraY es esencial para el corte oriT (107,
199). Recientemente se demostró que el TraY unido induce la flexión y que esta proteína puede unirse a
secuencias adicionales a la izquierda de sbyA; el sitio, sbyC, se superpone a la secuencia de unión a IHF
(219).
Los genes traI de los plásmidos F y R100 codifican un polipéptido 1.756-aa (40, 370); los motivos de
unión a ATP/GTP tipo A ocurren tanto en las regiones N-terminales como en las C-terminales de las
secuencias de proteínas deducidas (40). Presente en aproximadamente 600 copias por célula F+ (186), la
proteína F de 192 kDa localizada citoplasmáticamente, TraI, corresponde a la enzima bien caracterizada
E. coli ADN helicasa I (2) y exhibe la actividad de desenrollamiento de ADN de 5′ → 3′ apropiada para
el desplazamiento de la hebra transferida (1, 199). Los ensayos con componentes purificados han
demostrado ahora que la proteína TraI de F y R100 es responsable de introducir la rotura de una sola
hebra en oriT (158, 234, 297). Una fosfodiéster transferasa, TraI se une covalentemente al extremo 5' de
la cadena de ADN cortado (Fig. 2 y 6); no se ha detectado tal enlace al extremo 3′ del nick (155, 235,
297). Se ha demostrado que la función F-oriT-nicking depende de las secuencias N-terminales de TraI,
algunas de las cuales son prescindibles para la función de desenrollamiento de la proteína (335). Se ha
detectado similitud de secuencia de aminoácidos entre esta región de TraI y las proteínas TrwC, TraI y
VirD2, que son proteínas que cortan el ADN codificadas por R388, RP4 y plásmidos Ti agrobacterianos,
respectivamente (213, 282, 283; también ver más abajo); todas estas proteínas pertenecen a una
superfamilia de enzimas de corte de ADN (153, 189, 213). TraI*, una proteína de 88 kDa, originalmente
conocida como 2b y luego conocida como TraZ, se pensaba anteriormente que derivaba de un cistrón
genéticamente indefinido al que se le asignó el nombre traZ, y una vez se sugirió que funcionara en el
corte oriT (7, 81). Sin embargo, este producto parece derivar de un segundo sitio de inicio traslacional
dentro del marco de preparación traI y carecer de los dominios TraI N-terminal esenciales para el
nicking (334, 335). Por lo tanto, se desconoce la importancia de TraI*.
Ninguna proteína codificada en F o R100 que no sea TraI es esencial para la reacción de corte de oriT
in vitro (155, 234, 297). Aunque no se detectó ningún efecto de la proteína F-TraY en la cinética de la
reacción in vitro mediada por F-TraI (261), estudios recientes con componentes R100 purificados han
encontrado que la reacción R100nicking es estimulada por la proteína R100-TraY y la IHF (155, 158).
Otros ensayos indican que también existe un requisito accesorio para F TraY en la reacción in vivo de
TraI con oriT.
La expresión tanto de traI como de traY fue necesaria para la observación original del nicking in vivo
(81) y para la detección de eventos de recombinación estimulados por F oriT (48). Además, se ha
demostrado que los productos purificados F- y R100traY se unen a los sitios de la región oriT cerca del
sitio de corte (Fig. 6) (156, 199, 219, 261), y se ha demostrado que los principales determinantes de
secuencia definidos para la unión De TraY dentro del sitio F, sbyA, son necesarios para un corte eficiente
in vivo (111, 219). Se ha demostrado que el TraY unido induce la flexión del ADN en esta secuencia
(219) indica que el TraY puede afectar la conformación del complejo oriT.
Los polipéptidos F- y R100-TraY son proteínas citoplasmáticas de 15,2 y 8,5 kDa, respectivamente.
La comparación de la secuencia de aminoácidos deducida de F TraY (95, 157) consigo misma y con
alelos codificados por otros plásmidos IncFI (P307) (123), IncFII (R1 y R100) (85, 157, 193), IncFIII
(ColB4-K98) (86) e IncFV (pED208) (84) ha revelado que F traY ha resultado de un evento de
duplicación de genes (157); F TraY tiene una longitud de 131 aa, mientras que los productos de otros
alelos varían en tamaño de 71 a 77 aa para los genes P307 y pED208, respectivamente. Sugestivo de un
grado de regulación a nivel traslacional, se ha encontrado que todos los genes traY secuenciados hasta
ahora inician la traducción en un triplete GUG o UUG en lugar de en el codón de inicio AUG más
utilizado (157).
El análisis de perfil ha revelado que TraY es un miembro de una clase de proteínas de unión al ADN
que incluye los represores Mnt y Arc del fago P22 y el represor de metionina E. coli, MetJ (35, 41). Los
análisis estructurales de Arc y MetJ han indicado que dos dímeros de estas proteínas se unen a sus
secuencias de operadores cognados mediante el uso de una estructura de lámina de β antiparalela N-
terminal (41, 322). La naturaleza duplicada de F TraY llevó a la sugerencia de que la dimerización
podría no ser necesaria para la consolidación (261). De acuerdo con esta noción, se encontró que F TraY
existe como un monómero en solución (261), y los datos de unión indican que dos monómeros F-TraY
se unen por separado a sbyA (219). La relación estructural con los represores de transcripción y la
demostración de la unión a TraY en las proximidades del promotor PtraY tanto en F (Fig. 3) como en
R100, aunque con menor afinidad que en el sitio de la región oriT, sby, han planteado la posibilidad de
que esta proteína regule negativamente su propia transcripción y, por lo tanto, la de la mayoría de los
genes de la región tra (156, 261).
Nicking en oriT representa el paso inicial en el procesamiento del ADN plásmido durante la
conjugación, pero no hay evidencia que sugiera que este sea el evento decisivo precipitado por el
reconocimiento de un contacto de apareamiento. Por definición, el corte oriT demostró ser occurrado in
vitro en ausencia de cualquier señal generada por la formación de pares de apareamiento. Asimismo, una
proporción de moléculas cortadas se han aislado de donantes en ausencia de receptores y de células
portadoras de mutaciones en los genes tra necesarios para la formación de agregados mating (81).
Posiblemente, las condiciones utilizadas para detectar el ADN cortado podrían eludir un requisito de
señal. Sin embargo, los datos implican un equilibrio de ADN plásmido circular abierto-circular y
covalentemente cerrado en poblaciones de células donantes; por lo tanto, se sugirió que la señal puede
precipitar pasos posteriores en el metabolismo conjugativo del ADN al desencadenar el inicio del
desenrollamiento del ADN (81).

Desplazamiento y transferencia de cadenas de ADN

La existencia de una señal se dedujo del hallazgo de que la síntesis de hebras de reemplazo se produjo
solo en donantes que podían elaborar F pili y que se habían mezclado con células receptoras (183). Se
encontró que dicha síntesis, que debería reflejar la progresión del desenrollamiento, también dependía de
traM y, en menor medida, de traD, así como de traI (183). El gen traM es prescindible para el
ensamblaje de pilus y la estabilización de agregados, así como para el corte oriT per se. Como TraM era
necesario para la transferencia de ADN y la síntesis de reemplazo de hebras de donantes que lo
acompañaba, se sugirió que TraM podría transducir la señal que compromete la maquinaria de corte
oriT para desenrollar el ADN (81, 360). Alternativamente, se puede requerir TraM para anclar la región
oriT a un aparato de transferencia en la membrana interna (3) o para alterar las propiedades
conformacionales del ADN (103). Estas posibilidades, que no son mutuamente excluyentes, son
consistentes con el hallazgo de que una proporción de los productos localizados citoplasmáticamente de
los genes F-, R100- y pED208-traM se detecta en preparaciones de membrana interna; tal patrón de
fraccionamiento sugiere una interacción con una proteína intrínseca de la membrana interna (3, 72, 73).
Aunque el producto 127-aa deducido de F-traM tiene un tamaño previsto de 14,5 kDa (328), TraM
migra como una proteína de 10 kDa sobre SDS-PAGE (73). En forma de tetrámero, se ha encontrado
que TraM se une a tres sitios dentro de la región oriT (Fig. 6) (73). Los dos sitios de unión más cercanos
al gen F-traM se superponen a las dos secuencias promotoras de traM identificadas por análisis de
transcripción, y se ha demostrado que la expresión de este gen F es objeto de autorregulación negativa
(S. S. Penfold y L. S. Frost, datos no publicados). Parece que la presencia de la proteína TraY puede
determinar qué sitios de unión a TraM pueden ser ocupados; la expresión de TraY e IHF contribuyó a la
máxima expresión del producto traM (Penfold y Frost, inéditos). Los productos traM de R1, R100 y
pED208 también se unen a múltiples sitios dentro de sus respectivas regiones oriT (3, 72, 309), y se ha
demostrado la autorregulación de los alelos R1 y R100-traM (4, 310). También se ha sugerido que la
unión a TraM regula la transcripción de un promotor para el gen 19 en el plásmido R1 (192). Como se
ha demostrado que un producto traM mutante que carece de los ocho residuos de aminoácidos C-
terminales de la proteína de tipo salvaje forma tetrámeros, pero que no puede reprimir traM o unirse al
ADN, se ha sugerido un papel para la región C-terminal de la proteína en la unión al ADN (Penfold y
Frost, no publicados). Otros estudios sugieren que los residuos de aminoácidos en la región N-terminal
de TraM también pueden ser críticos para la actividad de unión al ADN (310).
Mientras que la región oriT mínima requerida para el corte es el segmento de aproximadamente 100
nucleótidos delimitado por el límite hacia la izquierda de la región rica en CA y la primera mitad de la
región de unión a TraY, se requieren secuencias adicionales hacia la derecha, incluidos los sitios de
unión a TraM, para una transferencia eficiente (Fig. 6) (107, 111). El segmento entre la región rica en
AT y el gen traM muestra una divergencia de secuencia considerable entre los plásmidos F
caracterizados y, además de los sitios que se unen a TraM, incluye otra curva intrínseca y un segundo
sitio de unión a IHF (73, 154, 156, 336). Las deleciones de secuencias de ADN que se extienden desde la
derecha hasta esta región dan como resultado una disminución de la eficiencia de la transferencia a
medida que aumenta la duración de la deleción; los que afectan a la mitad izquierda del lugar de unión a
TraM más cercano a oriT suprimen completamente la transferencia (73, 107).
Las características de F TraI que contribuyen al desplazamiento de la hebra se hicieron evidentes con
el descubrimiento de que esta proteína correspondía a la ADN helicasa I (2), que exhibe una actividad de
desenrollamiento de ADN dependiente de ATP de 5' → 3' (1, 64). Un motivo de secuencia de
aminoácidos característico de las helicasas dependientes de ATP está presente en la región C-terminal de
la secuencia de proteínas deducidas (370). Los informes relacionados con el número de molúsculos TraI
requeridos para la actividad máxima de desenrollamiento de hebras han sido contradictorios; las
estimaciones han oscilado entre 5 y 90 por agregado, e incluso se ha encontrado que una relación
ADN/proteína de 1: 1 resulta en un desenrollamiento significativo (29, 64, 195, 198, 348). TraI ha sido
estimulado para desenrollar el ADN a una velocidad de aproximadamente 1.200 pb / s (195). La
actividad de la helicasa 5′ → 3′ dependiente de ATP de TraI ha llevado a la sugerencia adicional de que
TraI también podría energizar la transmisión de la cadena de ADN durante la conjugación (315, 360).
Tales modelos asumen que TraI está de alguna manera inmovilizado, tal vez en interacción con una
proteína codificada por tra o codificada cromosómicamente asociada con la membrana interna (Fig. 2)
(315); se ha sugerido que TraD podría proporcionar tal asociación (64). En el sentido de la actividad de
desenrollamiento mediada por TraI, pero no de la actividad de corte, alguna otra helicasa aparentemente
puede sustituirla, aunque con una eficiencia de transferencia menor (335).
El gen F-traD codifica una proteína de membrana interna de 81,7 kDa (280). La secuencia del gen
indica que TraD tiene una longitud de 717 aa (40, 173). La secuencia de aminoácidos R100-TraD
deducida es homóloga a la de F pero contiene en su extremo C la secuencia de tres residuos Gln-Gln-Pro
reiterada 10 veces en lugar de la única ocurrencia en F TraD (370). Aunque los mutantes traD elaboran
pili aparentemente normales, forman agregados de apareamiento con los receptores y desencadenan el
metabolismo del ADN conyugal, no pueden transferir el ADN (183, 279, 354). Además, parece que la
TraD funcional sólo se requiere después del formato de acoplamiento agregado (279). Estas
características han llevado a la sugerencia de que TraD está involucrado en el transporte de ADN
monocatenario a través de la envoltura celular hacia el receptor (183). Varias observaciones apoyan la
idea de que TraD desempeña un papel en el transporte transmembrana de ácido nucleico. En primer
lugar, los fagos de ARN, como MS2, son capaces de adsorber a los pili de los mutantes de traD, pero la
infección se aborta debido a un defecto en la penetración del ARN (284, 308). En segundo lugar, se
requiere traD para la movilización del plásmido ColE1 y los plásmidos relatados, a diferencia de los
otros genes del metabolismo del ADN traM, traI y probablemente traY (355). Finalmente, se ha
encontrado que la TraD purificada se une al ADN de manera inespecífica (280).
Recientemente, se ha detectado similitud de secuencia de aminoácidos entre TraD y polipéptidos
codificados por sistemas de transferencia que anteriormente se pensaba que eran distintos de los de F, a
saber, TraG de RP4, TrwB de R388 y VirD4 de plásmidos ti agrobacterianos (212, 213; también ver más
abajo). Además, es probable que proteínas similares también estén involucradas en los mecanismos de
transferencia de ADN grampositivo, porque un miembro de esta familia de proteínas está codificado por
la región de transferencia de los plásmidos estafilocócicos conjugativos (93, 258). Se ha demostrado que
la TraD purificada posee actividad ATPasa dependiente del ADN (280). De acuerdo con esta
observación, las secuencias de aminoácidos F- y R100-TraD deducidas contienen motivos de sitio de
unión a nucleósidos de tipo A (370) y tipo B (212). El motivo tipo B está particularmente bien
conservado en otros miembros de la familia de proteínas a la que Parece pertenecer TraD (93, 212). Se
ha propuesto que las proteínas de esta familia pueden vincular la maquinaria del metabolismo del ADN
conyugal al aparato de transporte de ADN (202, 345).

Terminación de la transferencia F

Las propiedades de TraI han sugerido que esta proteína es también el mediador de la terminación de la
transferencia, y se han empleado plásmidos que transportan dos sitios oriT directamente repetidos para
probar los requisitos de secuencia de ADN asociados con este proceso (111, 202). Se ha propuesto que la
finalización de la transferencia depende del reconocimiento del sitio oriT reconstituido por síntesis de
hebra de reemplazo, escisión y ligadura del extremo 3′ recién generado al extremo 5′ de la hebra
transferida (Fig. 2) (202, 349). En apoyo de este modelo, Gao et al. (111) han obtenido datos que
sugieren que la terminación puede ocurrir en secuencias ForiT que no contienen un nick preexistente. La
secuencia requerida para la terminación no se extiende más de 36 bases a la derecha del sitio nick e
incluye tractos poli(A) en fase que especifican una curva determinada por la secuencia (111). Dado que
las mutaciones puntuales que afectan a los pares de bases cuarta y novena a la derecha del sitio nick
afectan tanto a la mordida como a la terminación, se suggested un paso que involucra TraI para ambos
procesos (111). Las secuencias anteriores a orf169 (Fig. 6) también pueden estar involucradas en la etapa
de terminación de la conjugación, ya que las deleciones de secuencia en esta región resultaron en la
transferencia de plásmidos de longitud superior a la unidad (107).

EXCLUSIÓN DE SUPERFICIE

La región de transferencia del plásmido F codifica dos genes responsables de la exclusión superficial
(Sfx). Esta propiedad limita la capacidad de la célula huésped para que actúe como receptora del mismo
plásmido o de un plásmido estrechamente relacionado. Los genes traS y traT (Fig. 3; Tabla 1) parecen
ser responsables de aspectos independientes del fenómeno, actuando en concierto para reducir las
eficiencias de transferencia en varios órdenes de magnitud (6, 8, 10). La expresión de la exclusión
superficial es probablemente un requisito fundamental de la capacidad del donante, ya que en su
ausencia, las poblaciones de células donantes soportarían el costo metabólico de la actividad continua e
inútil receptor-donante (54).
Se han identificado cinco clases de especificidad de exclusión de superficie, SfxI a SfxV,
representadas por F, ColB2-K98, R1, R100 y pED208, respectivamente (89, 357). Los dos genes traS
secuenciados hasta ahora, los de F (172) y pED208 (89), codifican productos que difieren notablemente
en la secuencia primaria (103). Esto contrasta con los datos disponibles para los alelos F (172), ColB2-
K98 (325), R100 (268) y pED208 (89) traT, en los que solo una o dos diferencias de aminoácidos
parecen definir las especificidades fenotípicas observadas (135).
El gen traS codifica una proteína de membrana interna de 16,9 kDa (Fig. 4), que, cuando está presente
en el receptor, parece prevenir la activación del metabolismo del ADN conyugal donor (6, 172, 248). Por
lo tanto, se ha sugerido que TraS bloquea la transmisión de una señal de acoplamiento (230). Presente en
un estimado de 20,000 a 30,000 copias por célula (6, 246), el producto de lipoproteína de 26 kDa del
gen traT (172, 288) constituye un componente importante de la membrana externa de las células que
contienen F (Fig. 4). Expuesto en la superficie celular (228), se cree que TraT abarca la membrana
externa (325) en forma multimérica (135, 228, 245, 248). TraT parece funcionar inhibiendo el formato
de los agregados de apareamiento (6). Esto, junto con la observación de que el TraT purificado podría
reducir la eficiencia de transferencia, llevó a Minkley y Willetts (248) a proponer que el TraT puede
interactuar con la punta del pilus sexual, tal vez compitiendo con el receptor celular normal. Sin
embargo, recientemente se ha encontrado que la especificidad entre los alelos traT y el sistema de
transferencia correspondiente que inhibe no está asociada con la secuencia de pilina cognado (20).
También se ha sugerido que TraT puede ejercer su efecto enmascarando una región de OmpA (298).
Existe evidencia circunstancial de que el producto del gen traT puede desempeñar un papel en la
patogénesis bacteriana además de su función de exclusión de superficie (para una revisión, ver referencia
325). Varios estudios han demostrado que al menos en algunos huéspedes, TraT puede contribuir a la
resistencia bacteriana del complemento sérico (250, 267, 268). Se sospecha que TraT inhibe el
funcionamiento del complejo de ataque a la membrana del complemento (291, 333). La susceptibilidad
reducida a la fagocitosis también se ha atribuido a la presencia de TraT (14). Aunque los estudios de
aislados clínicos no han logrado establecer un vínculo inequívoco entre traT y patogénesis (34, 179,
251), la identificación de homólogos de traT en plásmidos no conyugales asociados a Salmonella y
Yersinia ha dado crédito a la proposición de que el producto de este gen puede actuar como un factor de
virulencia (53, 325).

TRANSFERENCIA EXPRESIÓN GÉNICA Transcripción de la región tra y su regulación

Se han identificado promotores transcripcionales anteriores a los genes F-plásmido traM, traJ, traY,
trbF, traS, traT y traD (Fig. 3) (96, 132, 328). Además, se ha encontrado que dos promotores, PfinP y
PartA, inician la transcripción en la dirección opuesta a la de la mayoría de los genes de la región tra
(Fig. 3) (260, 367). La imagen de la transcripción de la región tra que está emergiendo, aunque no está
completa, es consistente con un modelo en el que PtraY es responsable de la iniciación de un ARNm
policistrónico que puede codificar 34 genes, desde traY hasta finO, de forma inclusiva. Esto
representaría un operón de aproximadamente 32 kb. Aunque la extremidad 3 ′ de la transcripción
originada en PtraY no se ha determinado con precisión, análisis recientes que han indicado que este
promotor es necesario para niveles normales de expresión de los genes distales, traD y traI, apoyan esta
noción (222). Los promotores PtrbF, PtraS, PtraT y PtraD pueden, en comunación con un terminador de
transcripción propuesto identificado después del gen traT (131), servir para modular y/o regular
diferencialmente la expresión de genes de operón tra distales . La expresión de traT, en particular,
parece ser algo independiente de los factores regulatorios que afectan a la transcripción de PtraY (51, 294).
A partir de los datos acumulados, las unidades transcripcionales probables evidentes en la región tra se
resumen en la Fig. 3. El análisis de las transcripciones que codifican traK ha sugerido que la polaridad
inusual de la mutación ámbar traK4 se debe a la presencia de un elemento de terminación de la
transcripción rododependiente (287). El análisis informático sugiere que tales secuencias de terminación
dependientes de rho se colocan en varios sitios dentro de la región tra (287); por lo tanto, es probable
que la transcripción se vea influenciada por la eficiencia traslacional.
Dos promotores ubicados entre el sitio de corte oriT y el gen traM, que aparentemente dirigen la
transcripción del gen 19, han sido identificados recientemente en R1 (192). Estos promotores se
encuentran dentro del segmento conservado de la región oriT (Fig. 6) y se suman a los promotores en
tándem ubicados inmediatamente aguas arriba de orf169 y el gen 19 de F y R1, respectivamente (192,
214).
PtraY parece estar regulado, directa o indirectamente, por varias proteínas codificadas por plásmidos y
codificadas cromosómicamente. El gen traJ (Fig. 3; Tabla 1) codifica un producto citoplasmático de 27
kDa (62) que regula positivamente la transcripción originada en el promotor del operón tra, PtraY (109,
260, 318, 319, 351). Se estima que traJ, una proteína 229-aa (95), está presente en aproximadamente
2.000 copias por célula F+ (62). Los productos traJ codificados en F-, P307-, R1-, R100-, y pED208-
codificados son bastante distintos, el mayor grado de similitud está en su N termini (72, 85, 95, 123,
157), una región que se ha predicho que formará un dominio de unión al ADN hélice-giro-hélice (74,
285). Los datos de sedimentación de la zona indican que TraJ puede ser dimérico (62).
Se ha demostrado que PtraY es utilizado en vitro por la ARN polimerasa E. coli σ 70 (115). Sin
embargo, se encontró que la ARN polimerasa forma un complejo estable en PtraY solo cuando la secuencia
promotora estaba en una conformación superenrollada (115). A partir de este hallazgo y la participación
observada de secuencias aguas arriba en la regulación descendente de PtraY en ausencia de TraJ (319),
Gaudin y Silverman (115) han sugerido que en ausencia de un activador transcripcional, las secuencias
anteriores a PtraY contribuyen a la relajación local de la región promotora. En tal modelo, TraJ puede
invocar la transcripción de PtraY facilitando la restauración de la superhelicidad normal (115). Los ensayos
que emplean fusiones transcripcionales de galK han indicado que en presencia de TraJ, PtraY es un
poderoso promotor (260).
Recientemente se ha encontrado que el TraY purificado derivado de F y R100 se une a secuencias que
se superponen a los sitios de iniciación de la transcripción de sus promotores cognate PtraY (156, 261). Por
lo tanto, es probable que la transcripción de traY esté autorregulada (156). Si esto es así, la transcripción
de la mayoría de los genes tra está sujeta a una regulación positiva y negativa mediada por productos
codificados en la región tra, a saber, TraJ y TraY, respectivamente.
TraJ también se ha implicado en la transcripción mejorada de PtrbF, mientras que PtraS, PtraT y PtraD parecen
ser promotores independientes de traJ (131, 172). Los hallazgos relacionados con el efecto de TraJ en la
transcripción de traM han sido confusos. Los análisis que emplearon fusiones transcripcionales de lacZ
indicaron que PtraM fue estimulado por TraJ (109), sin embargo, experimentos análogos que utilizaron
galK como gen reportero no revelaron tal efecto (260). Se han identificado dos sitios de iniciación
responsables de la transcripción de F traM (Penfold y Frost, inéditos) y de los alelos traM de los
plásmidos R1 y R100 (4, 194). Mientras que la unión de TraM afecta a ambas transcripciones de F-traM
(Penfold y Frost, inéditas), sólo el más ascendente de los promotores R100-traM es reprimido por la
unión De TraM; el segundo promotor más débil parece funcionar constitutivamente (4). El gen R1-traM
también está autorregulado (310).

Inhibición de la fertilidad FinOP

En las células donantes que albergan la mayoría de los plásmidos similares a F, la expresión del gen tra,
y por lo tanto la transferencia conjugativa en sí, es reprimida por un fenómeno conocido como inhibición
de la fertilidad (aleta) (90, 242). En combinación, una pequeña molécula de ARN antisentido, FinP, y un
polipéptido codificado por el gen tra más distal , finO, inhiben la expresión del gene regulador, traJ
(Fig. 3) (99, 207, 351). La ausencia de TraJ, a su vez, impide la transcripción del principal promotor de
la región de transferencia PtraY descrito anteriormente. La transferencia del plásmido F se desreprime
como resultado de la inactivación insercional del gen finO por el elemento transponible IS3 (Fig. 3) (52,
371). Sin embargo, la expresión de un gen finO a partir de un plásmido coresident compatible puede
reprimir la transferencia F en trans (92).
Aproximadamente 78 nucleótidos de longitud (339), la molécula de ARN FinP se transcribe
constitutivamente from un promotor, PfinP, ubicado dentro y en orientación opuesta al líder no traducido
de la transcripción traJ (Fig. 3) (88, 260). Se cree que el emparejamiento de bases complementarias
entre FinP y el ARNm de traJ impide la traducción de ese ARNm a TraJ, ya que el dúplex formado se
superpone a las señales de iniciación de traducción de traJ (83, 88). Sin embargo, la evidencia reciente
indica que la escisión mediada por la RNasa III del dúplex podría ser responsable de la inactivación del
ARNm de traJ (339). FinP y el region complementario de la transcripción traJ se pliegan cada uno en
dos estructuras de asa de tallo (339). Las secuencias dentro de los bucles de estructura secundaria de las
moléculas de ARN traJ/FinP parecen ser críticas para las interacciones entre las especies de ARN (191)
y parecen constituir la base de las especificidades de plásmidos observadas (357).
Los genes finO de F, ColB2, R6-5 y R100 han sido secuenciados y, después de la eliminación de las
secuencias IS3 intermedias y la duplicación objetivo del alelo F, se ha encontrado que codifican para
productos 186-aa altamente homólogos (59, 239, 337, 370, 371). El producto finO de 21 kDa es
hidrófilo y, por lo tanto, se presume que reside en el citoplasma, una ubicación consistente con su papel
regulador (Tabla 1) (332, 337, 371). FinO parece ejercer su efecto corregulador sobre la expresión de
traJ mediante la estabilización del ARN antisentido FinP (207). La extensión mediada por FinO de la
vida media de FinP, de ≈2 min a >40 min, ocurre incluso en ausencia del mensajero traJ
complementario (207). Esto y la incapacidad de FinO para proteger las transcripciones de FinP que
llevan una mutación fisO (91) han sugerido que la proteína FinO y el ARN FinP podrían interactuar
directamente (99, 207). Recientemente, se demostró que FinO es, de hecho, una proteína de unión a
ARN que interactúa con uno de los dos bucles del tallo en FinP (Fig. 4) y con la estructura
complementaria en el ARNm traJ (338). Se ha encontrado que las especificidades alélicas atribuidas al
gen finO (357) son el resultado de la expresión diferencial por plásmidos similares a F (337).
La inhibición de la fertilidad de alto nivel exhibida por plásmidos como R6-5 y R100 se correlaciona
con la presencia en los plásmidos these de un gen conocido como orfC u orf286, ubicado entre traI y
finO (59, 370). Los plásmidos similares a F como ColB2 (y presumiblemente el progenitor F) carecen
de las secuencias que codifican orf286 y expresan niveles más bajos de inhibición de la fertilidad (59,
337, 357, 370). La cotranscripción de orf286 y finO conduce a la síntesis de FinO a niveles muy
superiores a los observados en ausencia de secuencias orf286 y se cree que es el resultado de un
aumento en la vida media del ARNm de finO (337). Esta mejora de la expresión de finO ocurre solo en
cis, lo que indica que no está mediada por el producto traslacional orf286 (337). De hecho, este efecto
estabilizador, resultante de la cotranscripción con el gen aguas arriba, parece ser independiente de la
traducción orf286 (337). Se cree que la estructura secundaria en el ARNm como resultado del
emparejamiento de bases entre secuencias dentro de orf286 y finO aumenta la resistencia de la
transcripción a la degradación ribonucleolítica (337).
Se ha propuesto un mecanismo ligeramente diferente para la regulación de la región de R100.
Denominado relé de cierre, este modelo se basa en la competencia entre las transcripciones que inician
aguas arriba y dentro de traM, y el líder traJ no traducido , para las moléculas FinP antisentido (69).
Bajo tal esquema, la condición normal de estado estacionario está "desactivada"; cualquier evento que
pueda afectar a este estado puede resultar en la activación de la transcripción de la región tra y, por lo
tanto, en la desrepresión transitoria (70). Dempsey (68) también ha descrito un segundo promotor de
finP aguas arriba en R100 y ha identificado una tercera estructura potencial del tronco único de la
molécula de ARN R100-FinP. Un mecanismo similar puede operar en R1, ya que también se cree que
las transcripciones de traM regulan la actividad de FinP expresada por este plásmido (194).
Se cree que la represión de transferencia mediada por FinOP refleja la penalización evolutiva asociada
con la expresión constitutiva de las funciones conjugativas. Además de soportar la sobrecarga
metabólica asociada con la expresión constitutiva, las células huésped que albergan plásmidos similares
a F desreprimidos son vulnerables a la infección por fagos específicos de pilus (141). Se cree que los
plásmidos reprimidos escapan a tales costos mientras mantienen el potencial de transferencia, porque la
desrepresión transitoria en un donante individual puede conducir a una "propagación infecciosa" a través
de una población receptora (43, 358). Tal spread resulta de la transferencia de alta frecuencia exhibida
por las células que han recibido recientemente el plásmido, debido al tiempo de retraso requerido para la
síntesis de FinO y FinP a niveles inhibitorios y la consiguiente dilución de TraJ y otros productos tra
(337, 363). También se ha sugerido que la transferencia conjugativa sólo puede ser necesaria para
introducir un plásmido en una población, porque cualquier ventaja seleccionada conferida por ese
plásmido facilitaría su posterior establecimiento a través de la supervivencia y el crecimiento
preferencial de las células huésped (61).

Otros sistemas de inhibición de la fertilidad

Además del sistema FinOP normalmente codificado endógenamente, se han identificado otros cinco
sistemas de inhibición de la fertilidad en plásmidos que, cuando son coresidentes con F, reducen la
eficiencia de la transferencia de F. Estos sistemas de inhibición de la fertilidad también afectan, en
diversos grados, la eficiencia de apareamiento de otros plásmidos similares a F (114). Además de los
beneficios asociados con la represión enumerados anteriormente, se ha sugerido que los plásmidos que
codifican uno de estos mecanismos de transicción pueden competir con más éxito por nuevos huéspedes
(109, 113). Sin embargo, también es posible que la represión causada por estos sistemas sea casual
(162). La inhibición de la transferencia del plásmido IncP RP4 por F parece representar una exmuestra
de tal interacción inadvertida (326); se cree que el producto del gen repC autorregulado de F (también
conocido como pifC), que regula la replicación de oriV (184, 327), es responsable de este fenómeno
(244).

Se cree que los sistemas de inhibición de fertilidad FinQ y FinW actúan independientemente de traJ a
nivel de transcripción (109, 112). FinQ está codificado por plásmidos IncI1 (anteriormente IncI α) como
R62, R820a, TP102 y TP108 (109, 114). El gen finQ de R820a codifica un producto de 40 kDa, que se
propone que causa la terminación rho-independiente de la transcripción que se inicia en PtraY en varios
sitios entre traC y traD (109, 114, 133; L.M. Ham y R. A. Skurray, datos no publicados). Codificado por
el plásmido IncFI R455, FinW parece actuar reduciendo la transcripción de traM (109, 113).
Se cree que los sistemas de inhibición de la fertilidad FinC, FinU y FinV actúan
posttranscripcionalmente. FinC se expresa por el número de copias mutantes del plásmido
bacteriocógeno movilizable CloDF13, como JN62 y JN77 (352). Además de reducir el nivel de
transferencia de F, la inhibición de FinC hace que las células que contienen F sean resistentes a la
infección por el fago de ARN f2, pero no al fago filamentoso de ADN f1, un fenotipo característico de
los mutantes F-traD (352). La inhibición de la fertilidad FinC es el resultado de la sobreexpresión de los
genes CloDF13 mobA o rpi (262, 340). El producto de mobA es una proteína de 58 kDa, MobB,
involucrada en la movilización, mientras que el único fenotipo hasta ahora atribuido al producto rpi de
16 kDa es la resistencia mediada por FinC a la infección por FA de ARN específico de F descrita
anteriormente (262). Como se encontró que la transcripción de traD no se vio afectada por FinC,
Willetts
(352) alegó que este mecanismo inhibe la TraD. Esta afirmación se ha visto reforzada por el
reconocimiento de la proteína CloDF13 MobB como un homólogo de TraD (26, 46; también ver más
abajo). La presencia de un gen que codifica una proteína similar a TraD también puede explicar por qué
traD no es necesaria para la movilización de CloDF13, sino que es esencial para la transferencia del
plásmido relacionado ColE1, que codifica una proteína diferente desde una posición análogamente
ubicada en su genoma (341, 352).
Se desconoce la base de los sistemas de inhibición de transferencia FinU y FinV, codificados por los
plásmidos JR66a (IncI1) y R485 (IncX), respectivamente (113). FinU inhibe tanto el ensamblaje de pilus
como la exclusión de la superficie y, por lo tanto, se sospechó que afectaba la transcripción de la región
tra (113). Aunque se encontró que la presencia de JR66a reduce la transcripción de los cistrones distales
de F-tra, el alcance de la reducción fue desproporcionado para la inhibición de transferencia de 7.000
veces especificada por el sistema FinU (109). Sobre la base de estos hallazgos, Gaffney et al. (109)
sugirieron que aunque el efecto sobre la transcripción puede ser responsable de la reducción observada
en la exclusión de la superficie, el objetivo principal de la inhibición de FinU era más probable que fuera
la traducción y / o función de uno o más genes tra. Sin embargo, la síntesis de los 11 productos tra
detectados en el estudio no se vio afectada por FinU (109).
El sistema de inhibición de la fertilidad FinV codificado por el plásmido R485 inhibe la piliación F y,
por lo tanto, la transferencia, pero no reduce la exclusión de la superficie, lo que indica que es poco
probable un efecto sobre la transcripción de la región tra (113). Estudios transcripcionales posteriores
apoyaron esta afirmación (109). Por lo tanto, se cree que FinV impide la traducción y/o función
adecuada de uno o más de los productos tra necesarios para la biogénesis del pilus; Gaffney et al. (109)
de hecho notaron una reducción en la cantidad de una proteína de 30 kDa sintetizada en presencia de
R485, aunque el origen de este polipéptido no estaba claro.
Factores ambientales y de las células huésped que influyen en la transferencia de plásmidos F

Además de las actividades codificadas por el huésped requeridas para la síntesis de ADN que acompaña
a la transferencia, se ha encontrado que una serie de factores ambientales y especificados por el huésped
influyen en la capacidad de donante de las células F +, reforzando la noción de que la conjugación es un
proceso celular. Se cree que los F pili se retraen cuando los cultivos se enfrían por debajo de 25 ° C
(265). Además, se encontró que la síntesis de la subunidad de pilina en sí disminuía a medida que se
reducía la temperatura de incubación (265, 323). Las reducciones paralelas en la síntesis de varios otros
productos tra llevaron a Sowa et al. (323) a especular que la transcripción de la región tra puede estar
regulada por la temperatura.
El hallazgo temprano de que las fenocopias F de células donantes (es decir, cultivos de células F + o
Hfr con capacidad receptora) se producen por crecimiento en fase estacionaria tardía (205) sugiere que la
expresión de la exclusión de la superficie se ve afectada por inanición o fase de crecimiento (6). Los
cultivos de F-fenocopias tampoco elaboraron números normales de F pili (42). Por lo tanto, es probable
que el crecimiento en fase estacionaria tenga un efecto general sobre la expresión del operón tra y pueda
estar asociado con reguladores celulares encerrados en el huésped, como los que se analizan a
continuación (véanse también otros capítulos de este volumen sobre crecimiento y regulación de la
expresión génica, por ejemplo, capítulo 93).
También se ha informado que los niveles intracelulares de AMP cíclico (cAMP) influyen en la
expresión de actividades relacionadas con la transferencia de plásmidos similares a F, aunque los datos
disponibles son muy limitados. Harwood y Meynell (136) encontraron que la adición de cAMP exógeno
a mutantes cya portadores de varios plásmidos similares a F desreprimidos redujo la piliación, aunque
este efecto no fue evidente en las células que albergan F. En contraste, la reducción observada en las
propiedades relacionadas con la transferencia expresadas por los huéspedes mutantes cya y crp llevó a
Kumar y Srivastava (196) a sugerir que la expresión de F-tra depende de cAMP y su proteína receptora.
La identificación de una secuencia en las proximidades de PtraJ con similitud con el motivo del sitio de
unión del producto crp, la proteína activadora de catabolitos, da crédito a esta propuesta (285).
Varios otros genes cromosómicos parecen desempeñar funciones reguladoras, es decir, la expresión
de las funciones de transferencia de F. Los productos de cpxA (mapeo a 88.34 min en el cromosoma E.
coli; también llamado ecfB, ssd y eup) (16, 17, 293) y sfrA (99.95 min; alternativamente conocido como
arcA, fex, cpxC, msp y tinte) (44, 165, 166, 208, 209, 314) representan homólogos transductores y
efectores, respectivamente, de las dos familias de proteínas reguladoras de componentes (18, 77, 346;
para revisiones, ver referencias 125, 151 y 343). El fenotipo SfrA + es de hecho una actividad del
producto 29-kDa (45, 77) codificado por el gen arcA, que es un regulador transcripcional de genes
implicados en el metabolismo aeróbico (45, 77, 166, 167). La actividad de ArcA es modulada, a través
de la fosforilación de histidina, por el transductor de señal codificado por arcB (72.11 min), que detecta
el estado redox de la célula (165, 168-170).
Se ha demostrado que las funciones Arc+ y Sfr+ de ArcA son genética y fisiológicamente separables
(316). Si bien es posible que SfrA (ArcA) sea actuado por CpxA además de ArcB, esta relación aún no
se ha establecido claramente (165). La evidencia indica que el producto cpxA de 52 kDa se requiere
principalmente para la expresión eficiente de traJ (18, 317, 346), mientras que SfrA parece ser un
activador del promotor PtraY (109, 318). Por lo tanto, es posible que sfrA y cpxA actúen
independientemente el uno del otro. Quedan por responder varias preguntas clave relacionadas con SfrA
y CpxA, a saber, la identidad de la proteína efectora sobre la que actúa CpxA, la posibilidad de que un
segundo transductor afecte a SfrA y la naturaleza de los estímulos a los que responden estos sistemas.
Codificado por un gen aguas arriba de cpxA y que exhibe similitud de secuencia de aminoácidos con
proteínas reguladoras de otros dos sistemas componentes, el producto de la cpxR recientemente
identificada es un candidato para el efector CpxA (75), al igual que el producto aún no identificado de
otro gen cromosómico requerido para una expresión tra eficiente , cpxB (41.01 min) (237, 238, 303,
317).
 El gen sfrB (86,64 min; también conocido como rfaH y hlyT) codifica un producto de 18 kDa, que
suple la terminación prematura rho-dependiente de la transcripción de la región tra (24, 33, 109). Se han
localizado dos sitios de terminación de transcripción asociada a SfrB dentro de la región tra, entre traC
y traG y entre traG y traS (33, 109). Las mutaciones en sfrB son pleiotrópicas, afectando también la
formación de flagelos, la sensibilidad a bacteriófagos y antibióticos, y la síntesis de lipopolisacáridos y
hemolisinas (24, 32, 290).
La proteína de unión al ADN IHF, similar a histonas y específica de la secuencia, está involucrada en
una serie de procesos adsociados por ADN en E. coli, incluida la replicación, la transposición, la
recombinación específica del sitio y la expresión génica (para revisiones, ver referencia 98 y capítulo
125). Se ha demostrado que la IHF es necesaria para la transcripción eficiente de genes de la región tra
tanto de F como de R100 (67, 110; Penfold y Frost, inéditos); se encontró que la cantidad y la longitud
de las transcripciones de los genes X, traM y traJ sintetizadas por R100 se vieron afectadas en los
huéspedes IHF (71). La iniciación de la transcripción de PtraY de F también parece reducirse en tales
mutantes (318), aunque esto puede representar un efecto indirecto debido a la reducción de la expresión
de traJ.
Los sitios de unión a IHF se han localizado en la región oriT, entre la región nick y traM, desde F y
R100 (Fig. 6) (71, 156). La presencia de estos sitios de unión dentro de la región oriT sugiere que IHF
también desempeña un papel en los procesos que conducen al corte y, en última instancia, a la
transferencia de ADN, tal vez a través de una interacción con TraM (4, 336). La proteína IHF contribuye
al corte de R100 oriT in vitro (155) y can reprime parcialmente el promotor R100-traM más ascendente
(4). También se ha detectado unión de IHF en las cercanías de PtraJ (71).

Modulación posttranscripcional de la expresión génica tra

Además de los controles reglamentarios que rigen la traducción de los ARNm traJ y finO, se cree que los
mecanismos posttranscripcionales que involucran el procesamiento y la estabilidad del ARNm están
involucrados en la regulación de la expresión de la transcripción larga del operón tra. Se ha propuesto que
la escisión endoribonucleolítica de 5′ y la protección de las exoribonucleasas de 3′ conducen a la
acumulación de especies pequeñas y estables de ARNm R1-19 que derivan del ARNm policistrónico que
se inicia en PtraY pero codifican solo el gen traA product (propilin) (190). Las repeticiones invertidas que
se presume que forman las estructuras secundarias del asa del tallo de ARN responsables de la resistencia
a la exoribonucleasa de las transcripciones R1-19-traA se conservan en F (103). Al igual que traA, el gen
F-traT también se expresa en abundancia y se ha encontrado de manera similar que se encuentra en
ARNm estables (131). Se ha demostrado que la expresión del gen R1 19 está controlada por la
endoribonucleasa RNasa III. Una transcripción que inicia aguas arriba y en la orientación opuesta a traM
parece ser procesada de manera similar (192).
Los codones de iniciación de la traducción de la mayoría de los genes que se cree que están
codificados por la transcripción principal de la transcripción de la traducción iniciada en PtraY se
superponen o están muy cerca del codón de parada del cistrón anterior (40, 76, 94, 103, 131, 173, 224,
225, 227, 253, 306, 367, 368, 370). Tal disposición sugiere un acoplamiento traslacional (15). Aunque
no se ha detectado un acoplamiento activo dentro de la región tra, la yuxtaposición de las señales de
control de traducción probablemente sirva para maximizar la expresión a través de la reiniciación de la
traducción.

OTROS GENES CODIFICADOS POR PLÁSMIDOS POTENCIALMENTE

INVOLUCRADOS EN LA CONJUGACIÓN

La secuenciación de nucleótidos dentro de la región tra reveló una serie de ORF que se presume que
corresponden a genes previamente no detectados (40, 76, 103, 132, 224, 227, 367). La participación en
el proceso conjugativo de muchos de estos cistrones y varios otros genes tra identificados solo sobre la
base de la detección de productos se ha investigado mediante el uso de mutagénesis de casete de genes
de resistencia seguida de recombinación homóloga en derivados de plásmidos F (180, 221, 222, 224,
226, 227, 253). Los análisis posteriores han indicado que varios de estos mutantes exhiben fenotipos
indiscernibles de los de tipo salvaje F, según lo juzgado por los ensayos de laboratorio estándar. Las
características de los genes de la región tra de función desconocida se muestran en la Tabla 2. Se ha
sugerido que tales genes aparentemente prescindibles pueden contribuir a la transferencia conjugativa
desde diferentes huéspedes o en condiciones alternativas (164). También es posible que algunos de estos
genes codifiquen productos que realizan funciones no relacionadas con la transferencia de ADN; la
presencia de un gen adicional, orfE, entre traT y traD y la ausencia de trbH en la región R100-tra
parecen apoyar este punto de vista (40, 370).
Aunque la autonomía de la región F-tra ha sido demostrada por la competencia de transferencia de un
plásmido recombinante que contiene el segmento 66.6 a 100F (214), hay evidencia acumulada de que los
genes en la región principal de 13 kb (Fig. 1) también pueden desempeñar normalmente un papel en la
conjugación. Además de conservarse en plásmidos similares a F (121, 214, 311), se ha encontrado que
las secuencias de regiones principales se hibridan a plásmidos no similares a F (118, 119, 146, 214, 311).
Se han identificado varios ORF en la región principal, pero hasta ahora solo tres funciones se han
asociado con este segmento de ADN (para revisiones, consulte las referencias 164 y 349), a saber, un
sistema de mantenimiento de plásmidos designado flm (F leading region maintenance; anteriormente
llamado parL y también conocido como stm, y homólogo al parB hok / sok sistema de R1) (216, 217),
una proteína de unión al ADN de cadena simple codificada por el gen ssb (también conocido como ssf)
(50, 187), y un inhibidor de la respuesta SOS mediada por RecA, expresada por el gen psiB (25, 79,
215). Se han previsto roles para todas estas funciones en el receptor después de la transferencia
conjugativa (164).
Apoyando la noción de que la región principal puede desempeñar un papel en la transferencia
conjugativa, se ha demostrado que la expresión de los genes ssb y psiB del plásmido conjugativo IncI1,
ColIb-P9, se induce al transferirse a una célula receptora (175). El gen psiB de F también parece ser
inducido cigóticamente (23). Además, se cree que el gen ssb de R1 está regulado coordinadamente con
los genes tra de ese plásmido (120). Se han identificado genes que codifican proteínas de unión al ADN
monocatenarias en varios plásmidos conjugativos (véase más adelante y la referencia 176).
Aunque el gen de la región principal orf169 (Fig. 6) no parece ser esencial para la conjugación F
(214), los experimentos con el sistema de transferencia de plásmidos R1 similar a F sugieren que el
producto correspondiente del gen 19 es necesario para la transferencia eficiente de ese plásmido (26a).
El producto del gen 19 se sintetiza como un
precursor que posteriormente es procesado, presumiblemente por la señal peptidasa I, a una forma
madura de 17 kDa (192, 214). Se ha detectado similitud de secuencia de aminoácidos entre el producto
deducido de orf169/gen 19 e IpgF codificado por el locus mxi del plásmido de virulencia Shigella
flexneri, pWR100 (19) y, más recientemente, con R64 PilT, pMK101 TraL, RP4 TrbN, Ti VirB1 (Tabla
3) y Slt70, la transglicosilasa lítica soluble de E. coli (26 bis; G. Koraimann, comunicación personal).
Además de otros ORF de función desconocida en la región principal (122, 214), se han identificado dos
secuencias de iniciación monocatenarias, designadas ssiD y ssiE, en la región líder F; es probable que
estos sitios desempeñen un papel en la síntesis de ADN conyugal receptor (263).
CONJUGACIÓN BACTERIANA: UN MECANISMO DE TRANSPORTE
MACROMOLECULAR

Recientemente se han observado similitudes entre proteínas codificadas por genes de una serie de
sistemas de transferencia de ADN bacteriano (Tabla 3). Lo más llamativo es la homología evidente entre
el sistema de transferencia de ADN-T codificado por los genes vir de los plásmidos agrobacterianos Ti
y Ri y los sistemas de conjugación de los plásmidos IncN, IncP e IncW pMK101, RP4 y R388,
respectivamente. La semejanza de estos sistemas, que se extiende a los niveles de función proteica y
organización genética, ha dado un fuerte apoyo a la hipótesis de que la transferencia de ADN-T a las
plantas representa una modificación de la conjugación bacteriana (324). Además, también se han
detectado similitudes de secuencia de ácido amino entre los productos de estos sistemas y los de los
plásmidos IncF e IncI e incluso con proteínas asociadas a la transferencia codificadas por plásmidos de
organismos grampositivos (ilustrado por pSK41 y pS194 en Table 3). Los productos de plásmidos como
pED208 (IncFV) (103) y R751 (IncP β) (128), que parecen haber divergido relativamente recientemente
de los linajes representados por F y RP4, respectivamente, se omiten de la Tabla 3 debido a limitaciones
de espacio, pero sirven para recordar el grado de variación que existe. En algunos casos, la homología
evidente entre las proteínas del metabolismo del ADN de diferentes sistemas es paralela a la similitud
reconocible en las secuencias de nucleótidos de sus respectivos sitios nick; las regiones oriT de R64,
RP4, pTF-FC2 y pS194 y las secuencias de borde ti-plásmido son ejemplos de esta dualidad (202, 281,
282, 299). Las similitudes descritas anteriormente han llevado a la comprensión de que los mecanismos
de transferencia de ADN de origins huéspedes aparentemente diversos comparten genes de ascendencia
evolutiva común.
El papel del F pilus en el proceso conjugativo ha sido objeto de debate durante varias décadas (10, 42,
63, 353). La hipótesis de que el pilus actúa como el conducto para el paso del ADN del donante to
receptor ha dado paso gradualmente a la noción prevalente de que el pilus actúa como un "gancho de
agarre" que se retrae para poner las células de apareamiento en contacto físico cercano, lo que permite el
establecimiento de uniones de conjugación (78), los sitios en los que el ADN se presume que se produce
la transferencia. Sin embargo, hay varias razones para pensar que esta última sugerencia puede
representar una simplificación excesiva de la función pilus y que el pilus o un vestigio del mismo que
queda después de la retracción puede representar un poro especiado que facilita la transmisión del ADN
a través del donante y posiblemente de la(s) envoltura(s) celular(es) receptora(es). Tal estructura podría
incluir al menos algunos de los productos tra actualmente definidos como proteínas de ensamblaje de
pilus (Fig. 4; Tabla 1) y puede corresponder a estructuras visualizadas recientemente por microscopía
electrónica de congelación-fractura y congelación-grabado (301).
En primer lugar, el apareamiento observado, aunque con baja eficiencia, entre células separadas
físicamente indica que la luz del pilus puede soportar la transmisión de ADN plásmido de cadena single
(134, 275). En segundo lugar, las mutaciones en el gen traD, que se cree que está involucrado en la
transmisión del ADN plásmido monocatenario (ver arriba), dan como resultado un nivel ligeramente
mayor de piliación de la célula huésped (21), lo que sugiere un vínculo entre la maquinaria de
procesamiento de ADN conyugal y la función pilus. De hecho, se ha sugerido que los homólogos de
TraD de otros sistemas de transferencia de ADN (Tabla 3) median una interacción entre las proteínas del
metabolismo del ADN conyugal y el poro de transferencia de ADN (202, 345). En tercer lugar, la
aparente complejidad de la biogénesis de Fpilus puede reflejar un papel multifuncional para el pilus y las
proteínas asociadas. No menos de 16 productos genéticos parecen estar involucrados en la elaboración
del F pilus, y se cree que los representantes de estas proteínas están asociados con el citoplasma, la
membrana interna, el periplasma y la membrana externa, con el propio pilus extendiéndose hacia el
entorno externo de la célula (Fig. 4). En contraste, solo alrededor de la mitad de este número de
proteínas parecen estar directamente involucradas en la elaboración de E. coli P no conjugativa y pili
tipo 1, y varias de ellas representan subunidades del propio pilus (150).
TABLA 2 Genes de la región de transferencia de función desconocida
Gen Longitud del producto Tamaño del Ubicación del Comentariosc y referencia(s)
(aa)a producto (kDa)a productob

Arte 104 12.1 Membrana interna Producto no esencial aún por identificar (180); traducción
apoyada por artA′-′lacZ fusion (367).
trampa 196 22.0 Membrana interna Producto probable identificado pero función desconocida
(257; Frost, datos no publicados citados en la referencia
103)
traR 73 8.3 Citoplasma Producto identificado que no es esencial (221, 257); El
producto deducido comparte similitud de secuencia de
aminoácidos con el supresor dnaK dependiente de la dosis
de E. coli, DksA y las proteínas coliphage 186 y P2 de
función desconocida (76)
trbA 115 12.9 Membrana interna Producto identificado que no es esencial (180, 367, 369)
 trbB 179 [159] 19.5 [17.4] Periplasma Producto identificado que no es esencial (180, 367, 369)
trbD 65 7.1 Citoplasma Producto de función desconocida aún por identificar
(Frost, datos no publicados citados en la referencia 103)
trbE 86 9.9 Membrana interna Producto identificado que no es esencial (224)
trbF 126 14.5 Membrana interna Producto de función desconocida aún por identificar (132);
traducción apoyada por fusiones trbF′-′phoA (Y. N. Lin, J.
Tennent, N. Firth y R. A. Skurray, datos no publicados)
trbG 83 9.1 Citoplasma Producto de función desconocida aún por identificar (76)
trbH 239 26.3 Membrana interna Producto no esencial aún por identificar (40, 221)
trbJ 93 10.2 Membrana interna Producto identificado que no es esencial (221, 367)
aLos tamaños y longitudes se calculan a partir de la secuencia de aminoácidos deducida de cada producto. Los tamaños y longitudes de los
productos procesados se muestran entre paréntesis. Los valores de los productos procesados se basan en los sitios de escisión previstos. bLas

ubicaciones de los productos se han determinado experimentalmente a menos que se muestren en cursiva, en cuyo caso se enumera la
ubicación prevista.
cEl término "no esencial" indica que se encontró que una mutación en este gen no causa ningún efecto identificable en los fenotipos relacionados con la
transferencia examinados.

El apoyo de Compelling para la afirmación anterior de que los componentes del pilus forman un canal
de apareamiento ha sido proporcionado por similitudes de secuencia con las proteínas de ensamblaje F-
pilus TraB, TraC, TraE y TraL y el propio precursor de la subunidad F-pilus, TraA (Tabla 3). Kado y
sus colleagues (178, 313) no solo identificaron la similitud de la secuencia de aminoácidos entre estas
proteínas y los productos VirB que se cree que forman una estructura de apareamiento que facilita la
transferencia de ADN T agrobacteriano a las células vegetales (331), sino que también demostraron que
VirB2 se procesa de manera análoga a la propilina F (312). Estas relaciones evolutivas se han ampliado
para incluir productos que se sabe o se sospecha que están involucrados en la biogénesis del pilus /
formación de pares de apareamiento codificados por otros plásmidos conjugativos, such como pMK101,
RP4 y R388 (Tabla 3) (210, 289; Bolland, tesis doctoral). Dado que no se ha atribuido ninguna
estructura tradicional similar al pilus a los plásmidos ti agrobacterianos (82), las relaciones entre las
proteínas "asociadas al pilus" y el sistema de transferencia de ADN-T son particularmente intrigantes.
Quizás aún más provocativas, sin embargo, han sido las similitudes detectadas entre tales proteínas
asociadas al pilus y las proteínas Ptl responsables de la exportación de la toxina de subunidad múltiple
bordetella pertussis (Tabla 3) (58, 347).. La detección de un aparato evolutiva y funcionalmente
relacionado involucrado en la exportación de una molécula distinta del ADN (a saber, la toxina B.
pertussis) ha llevado a la comprensión de que los mecanismos de transferencia de ADN discutidos aquí,
incluido el codificado por F, representan miembros de una familia de sistemas de transporte
macromolecular relacionados con pilus.
TABLA 3 Similitudes entre proteínas de sistemas de transporte macromoleculara
Conjugación Movilización Proteína Referencia(s)
Secresión
(Ptl)
F (IncF1) R64 (IncI1) pMK10 RP4 R388 Ti pSK4 CloDF13 pTF-FC2 pS194
1 (Incpa) (IncW) 1
(IncN)
Orf169 (p19)b TraL TrbN VirB1 26a, 289

Traa Tranvía TrbC TrwLc

VirB2 PtlA 58, 177, 210,
211, 289,
312
TraL Traa TrbD Camión VirB3 PtlB 58, 177, 210,
211, 289,
312, 347
Trac Trote TrbE TrwKc
VirB4 PtlC 58, 178, 210,
211, 289,
313, 347
TraE Trac TrbF TrwJc
VirB5 178, 210,
211, 289
 Unido TrbL TrwIc
VirB6 PtlD 178, 211,
289, 347
Tran TrwHc
VirB7 178, 289

TraE TrwGc
VirB8 PtlE 178, 211,
289, 347
Pasar TrwFc
VirB9 PtlF 178, 211,
289, 347
Rab TrbI TrwEc
VirB10 PtlG 178, 210,
211, 289,
Conocido
347
TraG TrbB TrwDc
VirB11 PtlH 178, 210,
211, 259,
289, 347
TraL VirC1 MobD 188, 282,
299, 349
Tranvía VirC2 MobE 282, 299

Nika TraJ Toma VirD1 MobB 108, 178,

213, 282,
299
Masculino NikB TrwC VirD2 Moba R1x 26, 108, 153,
178, 189,
Masculino
211, 213,
282, 283,
299
Razas VirD3 282

Unido TraG TrwB VirD4 Tiró MobB 26, 46, 93,

178, 212,
213, 282,
373
Tiró MobC 282, 299

TraX TrbP 94a

ArdB KlcA 203

Ssb Ssb Ssb 93, 176

Tranvía
aLas proteínas mostradas son de los sistemas de conjugación gramnegativos de los plásmidos F, R64, pMK101, RP4 y R388; el sistema de transferencia de ADN-
T de los plásmidos Agrobacterium tumefaciens Ti; el sistema de conjugación grampositivo del plásmido Staphylococcus aureus pSK41; los sistemas de
movilización del plásmido gramnegativo CloDF13, el Thiobacillus ferrooxidans plásmido pTF-FC2, y el plásmido grampositivo pS194; y el sistema de secreción
de toxina Pt1 de Bordetella pertussis. La tabla está adaptada y ampliada de las de Kado (177, 178). bSe
observaron similitudes con el producto del gen 19
deducido (p19) codificado por el plásmido IncFII, R1 (26a); el gen 19 es homólogo a F orf169 (ver el texto). cLos
datos de las relaciones entre las proteínas
R388 Trw y Ti VirB son de Bolland (tesis doctoral), amablemente proporcionados por F. de la Cruz.
En los últimos años, se han logrado avances considerables en nuestra comprensión de la base
bioquímica del metabolismo del ADN conyugal, como lo ejemplifican F y los sistemas de transferencia
de ADN relacionados. Sin embargo, los conocimientos sobre la base mecanicista del transporte de ADN
célula-célula hasta ahora han demostrado ser más difíciles de alcanzar. Se espera que las relaciones
recientemente identificadas entre las proteínas asociadas a F-pilus y las de otros mecanismos de
transporte macromolecular, que destacan un papel para el pilus en la transmisión del ADN, estimulen el
progreso en este proceso biológico clave en los años siguientes. Los estudios del factor F sin duda
seguirán siendo fundamentales para estos esfuerzos.