Taller 1 Biología Celular.

Departamento de Biología Celular e Histología

1° Unidad Académica, FMED, UBA.

TALLER 1 DE BIOLOGÍA CELULAR

Atención: Este documento contiene hipervínculos (fuente azul, subrayados) que les permitirán
acceder a fuentes de información adicionales.

Los contenidos del TALLER 1 están asociados a las Unidades 1 y 2 del Programa de Contenidos

Objetivos del Taller 1:

• Conocer los fundamentos moleculares del mecanismo de replicación de los ácidos

nucleicos.
• Identificar las diferencias de la replicación de ácidos nucleicos en el contexto celular de
la replicación in vitro.
• Comprender algunas aplicaciones de uso clínico de las técnicas basadas en la reacción
en cadena de la polimerasa (PCR)

PARTE A

Introducción:
El conocimiento científico acerca de los procesos moleculares que subyacen al mantenimiento
del genoma y que permiten simultáneamente su variabilidad, han permitido comprender los
fenómenos biológicos de replicación, reparación, mutación y reorganización del ADN.
Pero, además, este conocimiento ha permitido desarrollar procedimientos tecnológicos
innovadores que poseen múltiples aplicaciones en la clínica y en la investigación básica. En este
taller analizaremos dos de estas técnicas: PCR (Reacción en cadena de la polimerasa) y RT-qPCR
(PCR cuantitativa con retrotranscripción), cuyos desarrollos están basados en los procesos de
replicación de los ácidos nucleicos.

La técnica de PCR y sus variantes

La técnica de reacción en cadena de la polimerasa (PCR, Polymearse Chain Reaction) permite la
amplificación de un fragmento de ADN en una reacción in vitro. Como consecuencia de la
aplicación de esta técnica pueden generarse millones de copias del fragmento de ADN
amplificado a partir de un número muy bajo de copias iniciales. Esta técnica fue desarrollada en
1983 por el bioquímico estadounidense Kary Mullis por la que recibió el premio Nobel de
Química en 1993.
Una variante de esa técnica, denominada RT-PCR, permite la amplificación indirecta de
moléculas de ARN. Para ello, incluye un paso de retrotranscripción (RT) que es seguido por la
amplificación de moléculas de ADN complementario (cADN) a moléculas de ARN.
Ambas variantes de la técnica, PCR y RT-PCR, pueden, a su vez, subclasificarse por el momento
en el que se detectan y analizan los productos de la amplificación. Si esta detección se hace una
vez finalizada la amplificación, hablamos de PCR (o RT-PCR) de punto final, que tiene usualmente
fines cualitativos. Es decir, la información proviene de determinar si hubo o no amplificación, y
a veces, del tamaño (en pares de bases) del producto amplificado. Cuando, por el contrario, la
detección se realiza de manera continua – en tiempo real- a lo largo de los ciclos de
amplificación, esto permite una interpretación cuantitativa de los datos (qPCR o RT-qPCR, ‘q’
por quantitative), lo que implica poder inferir con precisión las cantidades de moléculas de
ácidos nucleicos que actuaron como molde en el inicio del proceso.

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Para contestar las siguientes preguntas, le sugerimos que lea previamente los fundamentos de
la técnica de PCR de la bibliografía recomendada en la materia.
Para quienes quieran profundizar la lectura, sugerimos el siguiente artículo de lectura optativa
(también disponible en el campus):
Tamay DL, Ibarra C, Velasquillo C. Fundamentos de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
y de la PCR en tiempo real. Investigación en Discapacidad. 2013;2(2):70-78.

IMPORTANTE:
Se trabajará sobre la resolución de esas preguntas durante la clase o videollamada (según el
turno asignado a su comisión) correspondiente. Es muy importante resolver, o intentar resolver
las preguntas previamente para aprovechar la clase.

Guía de Actividades

Aplicaciones de la PCR en medicina: Diagnóstico de enfermedades infecciosas

Una aplicación de rutina de la técnica de PCR en el ámbito clínico es en el diagnóstico de

enfermedades infecciosas, mediante la detección de ADN específico del agente patógeno
(bacterias, virus, hongos, etc.) en muestras de pacientes.
Un ejemplo de esta aplicación se describe en un trabajo de investigación publicado en el año
20131 (ver anexo), en el que se utiliza una reacción de PCR para la detección de brucelosis
humana en áreas endémicas.
La brucelosis es una enfermedad infecciosa de distribución mundial, frecuente en zonas rurales,
que constituye un problema persistente en muchos países en desarrollo. Esta enfermedad es
producida por bacterias del género Brucella, que suelen transmitirse de animales utilizados
como ganado a los seres humanos (zoonosis), en los que produce un síndrome febril agudo
severo.
Los síntomas producidos por la brucelosis suelen solaparse con aquellos producidos por otros
agentes etiológicos, por lo que es alta la probabilidad de diagnóstico incorrecto basado
únicamente en la sintomatología, lo que puede conducir a la administración de tratamientos
ineficaces a los pacientes.
El trabajo de investigación mencionado propone un método de diagnóstico de la brucelosis que
consiste en los siguientes pasos:

PASO 1- Toma de muestras de sangre de pacientes con síntomas de síndrome febril agudo.
PASO 2- Extracción de ADN del suero de las muestras.
PASO 3- Utilización del ADN extraído en el paso anterior como molde en una reacción de PCR de
punto final, con primers diseñados para amplificar un fragmento de 223 pb del gen bcsp31,
específico de bacterias del género Brucella.

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Kamal, I. H., Gashgari, B. Al, Moselhy, S. S. & Abdullah, T. "Two-stage PCR assay for detection of human
brucellosis in endemic areas". BMC Infecttious Dis. 13, 145 (2013)

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1 Represente en el siguiente esquema de un gel de agarosa el patrón de bandas esperado al

realizar la detección por PCR de brucelosis. Considere que las muestras de los pacientes A y
C resultaron positivas para la presencia de Brucella y que la muestra del paciente B resultó
negativa. (M: marcador de peso molecular).

2 ¿Cuál es la utilidad de incluir controles positivos y negativos en la reacción de PCR? ¿Qué

tipo de muestras podrían utilizarse como controles positivo y negativo?

3 Explique cuál es el fundamento de la especificidad de la técnica. ¿Podría esta técnica dar un

falso positivo si hubiera ADN del paciente en la muestra de suero?

4 ¿Cuáles son las principales diferencias que encuentra entre la replicación in vitro de ácidos
nucleicos y la replicación celular del genoma?

Cuatro especies de bacterias del género Brucella son patogénicas para humanos, siendo las más
prevalentes B.meltiensis (transmitida por ganado caprino y ovino) y B.abortus (transmitida por
bovinos).
Determinar cuál es la especie de Brucella responsable de la enfermedad de cada uno de los
pacientes puede brindar información epidemiológica que permita elaborar estrategias de
prevención primaria. Con ese objetivo, los autores del trabajo de investigación mencionado
desarrollaron una segunda reacción de PCR para realizar con aquellas muestras que hubieran
resultado positivas para la presencia de Brucella. Para ello, realizaron una PCR multiplex: una
variante de la técnica que PCR que utiliza varios pares de primers simultáneamente en una
misma reacción. En este caso, se utilizaron primers para amplificar un producto de 113 pb,
específico de B.abortus, y otros para amplificar un producto de 252 pb específico de B.melitensis.

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5- Interprete la siguiente figura extraída del trabajo de investigación y determine para cada
uno de los pacientes (del 1 al 9) la(s) especie(s) de Brucella encontradas en sus muestras.

NOTA 1: El trabajo de investigación en el que está basado este ejercicio puede encontrarlo en
este hipervínculo. Los trabajos de investigación, usualmente denominados informalmente con
de la palabra inglesa ‘papers’, son el vehículo de comunicación de resultados que utiliza la
comunidad científica. Recomendamos la lectura de ese trabajo de investigación (optativo). Si le
resultara muy difícil, puede concentrarse en la lectura e interpretación del resumen (abstract)
al inicio del trabajo.

NOTA 2: La PCR también se utiliza como técnica para detectar mutaciones en el contexto del
diagnóstico molecular de algunas enfermedades genéticas. Profundizaremos en ese uso de la
técnica de PCR durante la cursada de Genética.

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TALLER1- PARTE B

Aplicaciones en medicina: Diagnóstico de COVID-19 con la técnica de RT-qPCR

El 11 de marzo del 2020 la Organización Mundial de la Salud declaró el estado de pandemia

global por la enfermedad COVID-19, provocada por el nuevo coronavirus SARS-CoV-2. Este virus,
que posee un genoma de ARN de hebra simple, infecta preferencialmente células del epitelio
respiratorio, y puede provocar un síndrome respiratorio agudo y severo.

El método indicado para la confirmación de la infección aguda por el SARS-CoV-2 se basa en la

detección de secuencias específicas del genoma viral mediante pruebas de amplificación de
ácidos nucleicos, como la reacción en cadena de la polimerasa con retrotranscripción, en su
variante cuantitativa o en tiempo real (RT-qPCR). Este método consiste en la amplificación del
material genético viral luego de su extracción a partir de una muestra de vías respiratorias y es
considerado el método gold standard, un término que en medicina denomina a la técnica
diagnóstica que define la presencia de la condición con la máxima certeza conocida.

Para realizar la próxima actividad le invitamos a ver el siguiente video explicativo:

https://www.youtube.com/watch?v=r4C5p8m-f14

Considere el siguiente gráfico que representa un resultado típico de la técnica de PCR

cuantitativa.

En el gráfico se representa la intensidad de fluorescencia detectada en una muestra en función

del número de ciclos de amplificación. Allí puede observarse en azul a una curva
correspondiente a una muestra en la que se observa acumulación del producto de amplificación,
y en rojo una curva correspondiente a una muestra que no amplifica.

1.1 Explique por qué la curva correspondiente a la muestra en la que hay amplificación tiene
forma sigmoidea, respondiendo las siguientes preguntas: ¿Por qué durante los primeros
ciclos no se observa un incremento en la fluorescencia? ¿Qué representa el valor Ct? ¿Por
qué en los últimos ciclos la curva deja de crecer (llega a un plateau)?

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Ud. es médico/a, y recibe el resultado de la prueba de RT-qPCR para el diagnóstico de COVID-

19, para tres de sus pacientes:

Región amplificada por los primers utilizados Ct

Paciente A gen ORF1ab del genoma de SARS-CoV-2 36
Paciente B gen ORF1ab del genoma de SARS-CoV-2 15
Paciente C gen ORF1ab del genoma de SARS-CoV-2 >40

1.2 ¿Cuál es su interpretación (positivo/negativo para infección por SARS-CoV-2) para el

diagnóstico de cada uno de sus pacientes? ¿Puede determinar cuál de sus pacientes
presentó mayor carga viral en su hisopado, de acuerdo con el resultado de la prueba?
Justifique sus respuestas.

Para disminuir el número de falsos negativos, en muchos casos se realiza una segunda
determinación con la muestra: además de utilizar primers para amplificar un gen viral, se utiliza
otro par de primers para amplificar un ARN humano, proveniente de las células del paciente.

Considere los resultados obtenidos para otros tres de sus pacientes, en los que se han realizado
las dos determinaciones:

Región amplificada por los primers utilizados Ct

gen ORF1ab del genoma de SARS-CoV-2 >40
Paciente D
gen humano 27
gen ORF1ab del genoma de SARS-CoV-2 >40
Paciente E
gen humano >40
gen ORF1ab del genoma de SARS-CoV-2 31
Paciente F
gen humano 18

1.3 ¿Cuál es, en este caso, su interpretación (positivo/negativo para infección por SARS-CoV-2)
para el diagnóstico de cada uno de sus pacientes? Justifique su respuesta.

Otra aplicación clínica de la técnica de RT-qPCR: Determinación de la carga viral de VIH-1 en

muestras de plasma.

La infección con el virus de la inmunodeficiencia humana tipo 1 (VIH-1) afecta aproximadamente

a 38 millones de personas. De ellas, 36,2 millones son adultos y 1,8 millones niños (estadísticas
del año 2019, fuente ONUSIDA).
La determinación de la carga viral VIH-1 es casi imprescindible para el manejo de los pacientes
infectados por este virus, sobre todo, por su utilidad como marcador de eficiencia del
tratamiento antirretroviral. En este momento, la metodología empleada en la mayoría de los
servicios de microbiología clínica es la RT-qPCT. Esta metodología presenta como ventajas
respecto a otras metodologías utilizadas anteriormente: un mayor rango de cuantificación,
mayor sensibilidad y que los resultados se pueden obtener en un período muy corto.
El genoma del VIH está formado por una molécula de ARN que mide aproximadamente 9,8 Kb y
consta de 3 genes esenciales: gag, pol y env. Cuando infecta una célula humana (CD4+), el ARN
es inmediatamente transcripto por la acción de una ADN-polimerasa-ARN dependiente,
comúnmente conocida como retrotranscriptasa o transcriptasa inversa, generándose un ADN

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de doble hebra que atraviesa la membrana nuclear y que, por la acción de otra enzima viral, la
integrasa, se integra de manera crónica en el genoma humano. El provirus integrado sirve como
molde para la transcripción de genes virales por ARN polimerasas endógenas, generando copias
de ARN de VIH-1.
La cuantificación del ARN del VIH-1 es un reflejo de la replicación viral activa y es esencial en
algunas situaciones clínicas de la infección por este virus. Las indicaciones principales son las
siguientes:

A- La carga viral es un marcador predictivo del tiempo de progresión de los síntomas del
síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA) independientemente del número de linfocitos
CD4+.

B- La cuantificación de la carga viral de VIH-1 debe ser realizada antes de iniciar un tratamiento
con antirretrovirales, y periódicamente durante su administración, para medir la eficacia o
respuesta al tratamiento y en el caso de que se sustituya o añada algún fármaco, bien por efectos
secundarios o por sospecha de fracaso.

C-Hay situaciones excepcionales en las que la carga viral es muy útil para el diagnóstico o
confirmación de infección por VIH-1. Por ejemplo, en el diagnóstico de infección neonatal (la
determinación de anticuerpos no es útil) e incluso cuando se sospecha infección aguda (reduce
el período ventana).

Los resultados de la medición de carga viral suelen expresarse en número de copias de ARN
viral/ml de plasma. Esta cuantificación absoluta se consigue mediante la inclusión en el test de
muestras estándar con cantidades conocidas de ARN viral, que se procesan de manera paralela
a las muestras de los pacientes. Así, pueden generarse curvas estándar para relacionar los Ct
obtenidos con el número de copias de ácidos nucleicos que se encontraban en la muestra
original. Se muestran tres ejemplos:

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En el caso del paciente C, el resultado se informa como “carga viral indetectable”. Lograr una
carga viral indetectable es uno de los objetivos primordiales del tratamiento, no sólo por los
efectos en la salud del paciente, sino por su impacto poblacional. ¿Has escuchado hablar del
concepto “indetectable= intransmisible”?
Encontrarás un breve resumen de ese concepto en el siguiente video:

https://www.youtube.com/watch?v=WVJ4v_P6dCM

2.1 En los análisis de rutina que realizan los bancos de sangre con la sangre donada se incluye la
determinación de la presencia de anticuerpos (proteínas) contra el virus del VIH-1, como
indicador de la infección por este virus.
¿Observa Ud., en ese contexto, alguna ventaja de esta metodología para la detección de VIH, en
comparación con la utilización de la técnica de RT-qPCR? Justifique se respuesta