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Desarrollo de la diapositiva FUJI DRI-CHEM v-LIP-P que tiene el alto

Especificidad de la lipasa pancreática

Kentaro NAKAMURA *, Shigeki KAGEYAMA *, Hideaki TANAKA **,

Kazuya KAWASAKI * y Kaoru TERASHIMA *

Abstracto

La lipasa de la sangre es principalmente una enzima de desviación del páncreas y su actividad es un índice altamente evaluado para el diagnóstico de pancreatitis en la atención médica humana. Sin embargo, la sensibilidad y

especificidad para la pancreatitis de la actividad de la lipasa sanguínea es baja en la atención médica veterinaria para perros y gatos, y ha sido difícil realizar un diagnóstico rápido. La inmunorreactividad de la lipasa pancreática (PLI), un

método de diagnóstico de sangre, es el más superior en sensibilidad y especificidad como marcador de pancreatitis para perros y gatos en la actualidad. Sin embargo, debido a que PLI no es fácil y rápido, existe una gran necesidad de

desarrollar un método fácil y rápido de detección de pancreatitis. FUJI DRI-CHEM (FDC), un método de química seca, es un sistema que permite la medición de diversas actividades enzimáticas en la sangre de forma fácil y rápida. que se

ha utilizado ampliamente en la atención veterinaria. Ahora hemos desarrollado el portaobjetos FDC v-LIP-P que tiene una alta especificidad para medir la lipasa del páncreas. El principio de medición que usamos es el método de los

triglicéridos. La especificidad de la lipasa del páncreas también se ha mejorado prescribiendo colipasa, sal biliar y dodecil benceno sulfonato de sodio, que es un detergente aniónico. Además, se ha mejorado la reactividad

prescribiendo trioleína, un sustrato emulsionado, para asegurar el área de la interfaz aceite-agua para la reacción a la lipasa pancreática. Se confirmó que la correlación de FDC v-LIP-P Slide y PLI fue excelente. Esto demuestra que esta

diapositiva es un producto de diagnóstico muy eficaz para la detección rápida de pancreatitis. Ahora hemos desarrollado el portaobjetos FDC v-LIP-P que tiene una alta especificidad para medir la lipasa del páncreas. El principio de

medición que usamos es el método de los triglicéridos. La especificidad de la lipasa del páncreas también se ha mejorado prescribiendo colipasa, sal biliar y dodecil benceno sulfonato de sodio, que es un detergente aniónico. Además,

se ha mejorado la reactividad prescribiendo trioleína, un sustrato emulsionado, para asegurar el área de la interfaz aceite-agua para la reacción a la lipasa pancreática. Se confirmó que la correlación de FDC v-LIP-P Slide y PLI fue

excelente. Esto demuestra que esta diapositiva es un producto de diagnóstico muy eficaz para la detección rápida de pancreatitis. Ahora hemos desarrollado el portaobjetos FDC v-LIP-P que tiene una alta especificidad para medir la

lipasa del páncreas. El principio de medición que usamos es el método de los triglicéridos. La especificidad de la lipasa del páncreas también se ha mejorado prescribiendo colipasa, sal biliar y dodecil benceno sulfonato de sodio, que es

un detergente aniónico. Además, se ha mejorado la reactividad prescribiendo trioleína, un sustrato emulsionado, para asegurar el área de la interfaz aceite-agua para la reacción a la lipasa pancreática. Se confirmó que la correlación

de FDC v-LIP-P Slide y PLI fue excelente. Esto demuestra que esta diapositiva es un producto de diagnóstico muy eficaz para la detección rápida de pancreatitis. La especificidad de la lipasa del páncreas también se ha mejorado

prescribiendo colipasa, sal biliar y dodecil benceno sulfonato de sodio, que es un detergente aniónico. Además, se ha mejorado la reactividad prescribiendo trioleína, un sustrato emulsionado, para asegurar el área de la interfaz aceite-agua para la reacción a la lipasa pancr

1. Introducción Se evaluarían las actividades de múltiples tipos diferentes de lipasas

porque hay muchas isoenzimas de lipasa distintas de la lipasa
Si bien la lipasa sanguínea, así como la amilasa y la tripsina, son
pancreática, incluida la lipasa gástrica, la lipasa hepática o la
enzimas de desviación del páncreas, las actividades de la lipasa y amilasa
lipoproteína lipasa en la sangre de estos animales.
sanguínea aumentan significativamente en pacientes con pancreatitis
Por lo tanto, Steiner et al. de la Universidad A&M de Texas
aguda. Se sabe que la actividad de la lipasa es más específica del
desarrolló el método de diagnóstico de inmunorreactividad de la
páncreas y refleja las funciones pancreáticas más específicamente que la
lipasa pancreática (PLI) mediante el uso de un anticuerpo que se
actividad de la amilasa, lo que sugiere que el aumento de la actividad de
une específicamente a la lipasa pancreática solamente e informó
la lipasa es un índice altamente evaluado para el diagnóstico de
que el método es eficaz para diagnosticar la pancreatitis. En la
pancreatitis.1). Si bien la corriente principal de reactivos para determinar
actualidad, el método PLI se considera el marcador de pancreatitis
la actividad de la lipasa en sangre es el método de enzima acoplada, los
métodos de química húmeda incluyen el método de sustrato de 1,2-
más superior en sensibilidad y especificidad para perros y
gatos2), 3).
diglicéridos desarrollado por Asahi Kasei Corporation y los métodos de
química seca incluyen el método de diacetinasa desarrollado por Sin embargo, el método como único método de diagnóstico de

Eastman Kodak Company. sangre en la actualidad para la pancreatitis en perros y gatos no es

Por otro lado, a diferencia de los seres humanos, se ha un procedimiento fácil y rápido que requiera unos días para

demostrado que la sensibilidad y la especificidad para la obtener resultados de medición. Debido a que tales desventajas del

pancreatitis de la actividad de la lipasa en sangre determinada por método no conducen a un diagnóstico rápido, existe una gran

los reactivos antecedentes son bajas en la atención médica necesidad de desarrollar un método fácil y rápido para la detección
veterinaria, incluido el diagnóstico de pancreatitis en perros y de pancreatitis.
gatos, y Se sabe que en estos animales es difícil el diagnóstico Según se informa, el método de sustrato DGGR, un reactivo para

rápido de pancreatitis. Como las razones, se considera que totalizó determinar la actividad de la lipasa en sangre (una química húmeda

Documento original (recibido el 2 de diciembre de 2010) * * División de producción de materiales de

* Laboratorios de investigación farmacéutica y sanitaria imágenes Fábrica de Kanagawa

Sede de gestión de investigación y desarrollo FUJIFILM FUJIFILM Corporation

Corporation Nakanuma, Minamiashigara, Kanagawa 250-0193, Japón
Ushijima, Kaisei-machi, Ashigarakami-gun, Kanagawa
258-8577, Japón

INVESTIGACIÓN Y DESARROLLO DE FUJIFILM (No 56-2011) 5

método) que fue desarrollado por Roche Diagnostics y se ha vuelto 2.1.2 Evaluación de viabilidad del método de sustrato
común recientemente, tiene una mayor especificidad para la DGGR y el método de triglicéridos como
detección de la actividad de la lipasa pancreática canina y es más métodos de química seca
útil como método para determinar la actividad enzimática en El ensayo de tasa sustitutiva DGGR es un método a utilizar
comparación con el método de sustrato de 1,2-diglicérido que 1, 2 - O - dilaurilo - rac - glicero -3-ácido glutárico- (6'-
alguna vez había ha sido la corriente principal de esos métodos de metilresorufina) -ester como sustrato. El sustrato se descompone
diagnóstico4). Presumiblemente, indica que la medición específica por la lipasa en condiciones alcalinas para formar 1,2-O-dilaurilo-rac
de la actividad de la lipasa pancreática se puede lograr utilizando -glicerol y un intermedio inestable, éster de ácido glutárico- (6'-
diferentes sustratos, diferentes ayudas y diferentes condiciones de metilresorufina). En condiciones alcalinas, esta última se
reacción. descompone espontáneamente para formar ácido glutárico y
FUJI DRI-CHM (en lo sucesivo, FDC) como método de química metilresorufina con un pico de absorción alrededor de 580 nm (Fig.
seca es un sistema de ensayo fácil y rápido para determinar una 1). El ensayo de sustrato DGGR es un método para medir la tasa de
variedad de actividades enzimáticas en la sangre y se ha utilizado aumento en la absorbancia del color rojo de la metilresorufina.5). Es
ampliamente ahora en la atención médica veterinaria. Por lo tanto, decir, el sustrato utilizado para el método de sustrato DGGR es muy
realizamos un estudio para desarrollar un método de ensayo con inestable y, por lo tanto, su estabilidad temporal estaba
alta especificidad para la actividad de la lipasa pancreática con el fin preocupada. Un sustrato DGGR se podía dispersar en líquidos a un
de abordar las necesidades de diagnóstico de pancreatitis. El pH ligeramente ácido y era estable durante un año en el frigorífico.
presente informe se refiere a los resultados del estudio. Por otro lado, se demostró que el sustrato se descomponía
fácilmente a pH neutro y su velocidad de descomposición se
2. Puntos de desarrollo aceleraba en las condiciones ligeramente alcalinas (pH = 8; el pH
óptimo para la lipasa) o en presencia de desoxicolato de sodio, un
2.1 Determinación del principio de medición que se
activador de lipasa. Mediante análisis de RMN y MASA de los
adoptará para la preparación de portaobjetos
mecanismos de descomposición del sustrato, se identificó que el
2.1.1 Selección del principio de medición enlace éster (indicado por una flecha en la figura 1) adyacente al

Si bien hay una variedad de métodos para determinar la cromóforo preferentemente entre 2 enlaces éster se descomponía

actividad de la lipasa, los enumerados en la Tabla 1 a continuación preferentemente.

proporcionan los métodos colorimétricos representativos que O O CH3

utilizan luces visibles aplicables al analizador FDC. A partir de varios O (CH2)3 O O O

O
estudios llevados a cabo aquí, se ha informado que el método del O norte

sustrato de 1,2-diglicéridos5), 6) así como el método de la diacetinasa 1,2-O-dilaurilo-rac-ácido glicero-3-glutárico- (6'-metilresorufina) -ester

7) tienen baja especificidad por la lipasa pancreática. Por el Lipasa pancreática ＋ OH-

OH O O CH3
contrario, se ha informado que el método de sustrato DGGR tiene - (CH2)3
O O O O O
+
una alta especificidad4). Además, se ha informado que los métodos O

para usar triglicéridos, un sustrato natural de la lipasa pancreática,

norte

Éster de ácido glutárico (6'-metilresorufina)

tienen una mayor especificidad para la lipasa pancreática en
comparación con la de la lipoproteína lipasa o la lipasa hepática.8). Descomposición espontánea ＋ OH-

CH3
En consecuencia, se eligieron el método del sustrato DGGR y el -
O O O O O
método de los triglicéridos para la selección del principio de + -
O (CH2)3 O

medición y se realizó la evaluación para la preparación de los

norte

Metilresorufina color rojo， Λ = 580 nm Ácido glutárico

métodos de química seca.
Figura 1 Esquema de reacción del método DGGR.

Tabla 1 La lista de los principios de medición de la lipasa.

Maker desarrollado
Nombre del método Método de ensayo Especificidad para la pancreatitis Maker adoptó el método
el método
También pueden producirse reacciones Diagnóstico ortoclínico
Método de diacetinasa Enzima acoplada
EK positivas para enfermedades distintas de Laboratorios IDEXX (uso exclusivo para
(un método de química seca) método
la pancreatitis.7). animales)
Se observa una baja especificidad para la Varias empresas nacionales, incluida Wako Pure
Método de sustrato de 1,2-
Enzima acoplada pancreatitis canina y un aumento de la Chemicals Industries, tienen la participación
diglicéridos Asahi Kasei
método actividad de la lipasa en el plasma con número 1 en el mercado farmacéutico para
(un método de química húmeda)
heparina añadida. humanos y animales.

Roche Diagnostics, participación número 2 de Kyowa

Método de sustrato DGGR Sustrato de resorufina Alta especificidad para la
Roche Diagnostics Medex Co. en el mercado farmacéutico para seres
(un método de química húmeda) método pancreatitis humana y canina.4).
humanos

Método de triglicéridos La especificidad de los triglicéridos

Enzima acoplada
(un método de química húmeda / Asahi Kasei por la lipasa pancreática es mayor que
método
un método de química seca) la de la lipasa hepática o LPL.8).

6 Desarrollo del portaobjetos FUJI DRI-CHEM v-LIP-P que tiene una alta especificidad para la lipasa pancreática
 En los métodos de química húmeda, un sustrato inestable frente
a cierto pH se almacenaría antes de usarlo en soluciones en las
Sustrato emaulsion
condiciones de pH en las que es estable. Tras el análisis mediante
un autoanalizador, se mezclaría con otro reactivo de reacción a pH
8, que es el pH óptimo para la lipasa para permitir una medición de
Sal biliar
la actividad de la lipasa. Por el contrario, en el caso del portaobjetos
FDC, todos los reactivos necesarios para medir la actividad de la colipasa
Domo N-terminal
lipasa deben empaquetarse en el portaobjetos como se describe en
Domo C-terminal
la sección 2.3. Por consiguiente, debe contener agentes Lipasa pancreática
tamponantes y componentes alcalinos necesarios para preparar un Domo "tapa"

entorno a pH 8 además de los reactivos de reacción. Sería muy Figura 2 Vista esquemática de la reacción de la lipasa del páncreas.
difícil almacenar DGGR como sustrato en el portaobjetos en tales
condiciones.
Dado que también se ha utilizado una formulación combinada
Por el contrario, en el caso del portaobjetos de FDC preparado
de sal biliar y colipasa para el método de sustrato DGGR con alta
utilizando triglicéridos como sustrato, se demostró que no hubo
especificidad para la lipasa pancreática, la formulación del método
cambios en su reactividad en una prueba de estabilidad acelerada de 2 o
de química seca se diseñó basándose en dicha formulación.
3 semanas a 45 ° C incluso a pH 8, lo que sugiere su estabilidad
extremadamente superior en comparación con DGGR.
2.2.2 Estudio de formulaciones para el método de química
seca con alta especificidad para la lipasa
En base a los resultados anteriores, se determinó que se llevaría
pancreática
a cabo el desarrollo de un método de química seca para el método
de los triglicéridos. El estudio de las formulaciones se realizó con el uso de
trioleína como sustrato de reacción y además, mediante el uso
2.2 Estudio de mejora de la reactividad y de colipasa y sal biliar. Mientras que el desoxicolato de sodio se
especificidad de la llipasa pancreática usó principalmente como sal biliar, se usó una formulación

2.2.1 Mecanismo de reacción de la lipasa pancreática5) combinada de desoxicolato de sodio y taurodesoxicolato de

sodio soluble en agua porque la solubilidad en agua del
Una de las propiedades enzimáticas de la lipasa pancreática es
primero no era tan alta. Además, se formularon varios reactivos
que la enzima requiere colipasa, una proteína con un peso
para lograr el siguiente esquema de reacción porque el
molecular de 11 kDa, para su eficiente actividad enzimática. La
principio de medición de este ensayo fue el método de enzima
colipasa es secretada por el páncreas como procolipasa que luego
acoplada (Fig. 3).
se transforma en colipasa activa por la acción de la tripsina en la luz
intestinal para unirse a la lipasa. La lipasa pancreática también se Li pase, Colipase
caracteriza por otra propiedad claramente diferente de las de otras l I + 2H2O
Trío en 2-monoglicérido + 2 ácido oleico

esterasas, es decir, ejerce su alta actividad enzimática solo después MGLP

2-Monog lycer de
I + H2O l
Glicerol + ácido oleico
de que se forma una interfaz entre los ésteres de ácidos grasos y la
capa de agua. En consecuencia, la actividad de la lipasa se vería GK, MgCl2
G lycero l + ATP L -α-g icerofosfato
l + ADP
influida por la presencia de sustancias como las sales biliares que
afectan a la formación de la emulsión.9), 10). GPO
L -α g- ly cerofosfato + O2 I
H2O2 + D hidrox y
acetona fosfa e t

Las propiedades únicas de la lipasa pancreática se VAINA

Diario lI I oe
m da z euco
l l tinte + H2O2 l azul + 2H2O
Co o tinte
consideran atribuibles a su estructura característica
denominada dominio "tapa" que cubre el centro activo de esta Fig.3 Esquema de reacción del FDC v-LIP-P Slide.
enzima. Se considera que, por ordinario, la “tapa” está cerrada y
su actividad enzimática solo es modesta cuando está sola. Sin En muestras caninas, se demostró una correlación del
embargo, su conformación cambia en presencia de colipasa y portaobjetos FDC preparado de acuerdo con la formulación
sal biliar y su centro activo quedaría expuesto como se muestra anterior y el método de sustrato DGGR.
en la Fig. 2. Luego, el dominio hidrofóbico del centro activo se Si bien estos 2 métodos se correlacionaron relativamente bien
une a los sustratos de manera estable para ejercer actividad entre sí [coeficiente de correlación (r) = 0,930], hubo separaciones
enzimática.11), 12). En las condiciones fisiológicas, se considera de algunos datos en el rango de concentración de lipasa más bajo
que la lipasa pancreática forma un complejo de este tipo con entre los proporcionados por el portaobjetos FDC y especialmente
colipasa, sal biliar y lípidos para digerir grasas. los obtenidos por el método de sustrato DGGR [Liquitech Lipase
Color II (Roche Diagnostics), en adelante, denominado

INVESTIGACIÓN Y DESARROLLO DE FUJIFILM (No 56-2011) 7

como el método de sustrato DGGR] (Fig. 4a). La lipasa se evaluó mediante el desarrollo de un método para preparar
Se consideró que las separaciones de los datos observados en el emulsiones de torioleína de antemano. Para preparar emulsiones de
intervalo de concentración de lipasa inferior eran atribuibles a la trioleína, se usó dodecilbencenosulfonato de sodio como detergente,
formación insuficiente de una interfaz entre los ésteres de ácidos mientras que se usó gelatina y polivinilpirrolidona como coloides
grasos y la capa de agua donde la lipasa ejerce su actividad. Por protectores. La emulsificación se realizó con un emulsionante / dispersor
consiguiente, se evaluaron los efectos de la adición de un de alta presión para preparar emulsiones con un diámetro medio de
detergente con el fin de proporcionar una mejor interfaz aceite- partícula de aproximadamente 200 nm.
agua como campo de reacción para la lipasa. Un punto a considerar Se evaluaron las reactividades de los portaobjetos de FDC que
para seleccionar un detergente es encontrar un detergente que no contienen el tipo disuelto de trioleína y el tipo emulsionado de
afecte la reactividad de las lipasas distintas de la lipasa pancreática. trioleína para la muestra de control de la lipasa pancreática con alta
Por el contrario, se sabe que los detergentes aniónicos, incluido el actividad (800 U / L) y la de baja actividad (40 U / L) para comparar la
dodecilsulfato de sodio, inhiben la actividad de las lipasas distintas velocidades de reacción proporcionadas mediante el uso de estos
de la lipasa pancreática.13), 14), 15). En los resultados de las diferentes estados de sustrato. Como resultado, se demostró que la
evaluaciones realizadas en base a estos informes, se encontró que reactividad para la lipasa pancreática del portaobjetos de FDC que
el dodecilbencenosulfonato de sodio entre los detergentes contiene el tipo de sustrato emulsionado es aproximadamente un
aniónicos eleva la actividad de la lipasa pancreática sin cambiar la 30% mayor que la que contiene el tipo de sustrato disuelto (Tabla
actividad de las lipasas distintas de la lipasa pancreática. En la 2).
evaluación de una correlación entre los 2 métodos anteriores En base a los resultados anteriores, se seleccionó el método para
realizada con la misma muestra canina que la utilizada en la prueba aplicar y secar las emulsiones de torioleína preparadas de antemano
antes mencionada, se observó una mejora en el rango de para preparar el portaobjetos FDC (un método de química seca).
concentración de lipasa inferior con muy buen coeficiente de
Tabla 2 Comparación de reactividad por diferencia de estado del sustrato
correlación [(r) = 0,977] observándose (Fig. 4b).
(trioleína) en FDC v-LIP-P Slide.

ａ. Colipasa × 1 、 SDBS × 0 （Ｎ = 46）

ｂ. Colipasa × 1 、 SDBS × 1 (n = 46) Disuelto Emulsionado
1800 1800
escribe escribe
y = 1.0985x - 6.935
1500 R2 = 0,8658 1500 Diferencia en la velocidad de reacción ( ODr / min) 0,07 0.091
r = 0 .930
Diferencia porcentual en la velocidad de
FDC v-LIP-P (U / L)

1200
FDC v-LIP-P (U / L)

1200
reacción del tipo emulsionado en relación con 100% 130%
900
900 la del tipo disuelto
600 y = 1,3313x - 9,2031
600
R2 = 0,9551

300 300 r = 0,977

0
0 300 600 900 1200 1500 1800
0
0 300 600 900 1200 1500 1800
2.3 Estructura de la diapositiva FDC
Método de sustrato DGGR (H7180, U / L) Método de sustrato DGGR (H7180, U / L)

La estructura del portaobjetos FDC v-LIP-P se muestra en la Fig.5.

Figura 4 Correlación de muestras caninas de FDC v-LIP-P Slide
y método DGGR (a. Sin dodecilbencenosulfonato de
【Capa de extensión】
sodio (SDBS), b. Con SDBS). Emulsión de trioleína
(Trioreína, dodecilbenceno sulfonato de sodio,
gelatina, polivinilpirrolidona)
Colipasa
2.2.3 Mejora de la reactividad de la lipasa pancreática Ácido biliar
Dodecilbenceno sulfonato de sodio
[Emulsificación del sustrato (Torioleína)] monoglicérido lipasa
Cloruro de calcio
La formación de una interfaz entre el éster de ácido graso y la
capa de agua es importante para la expresión de la actividad de la 【Capa de reactivo】
Polímero
lipasa. Sin embargo, se anticipó que la velocidad de reacción de la Glicerol quinasa, cloruro de magnesio
Adenosina trifosfato sal disódica
lipasa disminuiría en el caso de los métodos de química seca, Glicerol-3-fosfato oxidasa
Peroxidasa
porque sería difícil asegurar el área efectiva de la interfase aceite- Colorante leuco de diarilimidazol

agua debido a la agregación y unión de la velocidad sustitutiva 【Soporte transparente】

Película de PET
emulsionada también. como pérdida de agua como medio de
dispersión provocada por la aplicación y secado del sustrato Figura 5 Estructura de la diapositiva FDC v-LIP-P.

emulsionado sobre el portaobjetos, incluso cuando se consiguió

una emulsificación homogénea en presencia de un detergente y El portaobjetos FDC v-LIP-P está compuesto por 2 capas que incluyen una
coloides protectores. En la evaluación previa de los portaobjetos capa de reactivo y una capa de extensión colocada sobre una película de
preparados, se aplicó torioleína disuelta en un disolvente orgánico soporte transparente hecha de tereftalato de polietileno. Mientras que la capa
como el etanol y se secó sobre el portaobjetos, mientras que la sal de reactivo consiste en enzimas acopladas que reaccionan con la glicerina
biliar y el dodecilbencenosulfonato de sodio, necesarios para la generada en la capa de esparcimiento y los tintes formadores de color, la capa
formación del campo de reacción, se agregaron a la diapositiva por de esparcimiento contiene emulsión de torioleína que es un sustrato de la
separado. Por el contrario, la reactividad del páncreas lipasa pancreática, colipasa y ácido biliar.

8 Desarrollo del portaobjetos FUJI DRI-CHEM v-LIP-P que tiene una alta especificidad para la lipasa pancreática
necesario para la expresión de la actividad de la lipasa pancreática, el utilizando el método de la diacetinasa o el método de 1,2-diglicéridos
dodecilbencenosulfonato de sodio como auxiliar de reacción y una que mostraron bajas correlaciones con el método PLI fueron más altas
enzima acoplada. Cuando se aplicó una muestra de prueba en el en muchos casos que los datos obtenidos por el método PLI,
portaobjetos FDC v-LIP-P, se esparce uniformemente en la capa de especialmente en el caso de muestras de prueba con un valor de PLI
extensión para reaccionar con el sustrato (trioleína). El 2-monoglicérido bajo. Por tanto, se sugirió que las isoenzimas de lipasa distintas de la
generado por la acción de la lipasa es descompuesto por la lipasa pancreática pueden medirse mediante estos 2 métodos.
monoglicérido lipasa para formar glicerol y ácido graso. El glicerol se Se presume que tanto el método de sustrato DGGR como la
convierte en ácido L-α-glicerofosfórico por la acción de la glicerol diapositiva FDC v-LIP-P muestran una alta especificidad para la lipasa
quinasa en presencia de ATP y Mg.2+. El ácido L-α-glicerofosfórico se pancreática a partir de los resultados de que se observaron muy buenas
oxida por la acción de la glicerol-3-fosfato oxidasa para generar correlaciones entre estos 2 métodos y el método PLI mediante el uso de
peróxido de hidrógeno. Por la acción de la peroxidasa, el peróxido de muestras caninas de prueba. Por lo tanto, se evaluó una correlación
hidrógeno oxida el tipo de leucopigmento de diaril imidazol para entre el método de sustrato DGGR y el portaobjetos FDC v-LIP-P
generar un pigmento azul. La velocidad de formación de este pigmento utilizando muestras de prueba caninas y felinas (Fig. 7a).
azul se determina midiendo los cambios en la densidad óptica reflejada Al utilizar muestras caninas de prueba, se observó una muy
a 650 nm de 3,0 min a 5,0 min que, luego, se convertiría en actividad de buena correlación entre el método de sustrato DGGR y el
lipasa mediante una curva de calibración construida en un instrumento portaobjetos FDC v-LIP-P con un coeficiente de correlación (r) =
dedicado. 0,993. Aunque las cantidades de muestras de prueba con contenido
intermedio y alto de lipasa fueron limitadas en el caso de muestras
3. Confirmación de la eficacia de felinas, se observó una buena correlación entre el método de
FDC v-LIP-P Slide sustrato DGGR y el portaobjetos FDC v-LIP-P con un coeficiente de
correlación (r) = 0,983 ( Figura 7b).
3.1 Confirmación de la especificidad de la
lipasa pancreática ａ. Portaobjetos FDC v-LIP-P (un método de química seca) ｂ. Método de diacetinasa
(un método de química seca, IDEXX Laboratories)
(N = 40) （N = 40）
800 6000
Para validar la efectividad del portaobjetos FDC v-LIP-P
5000
desarrollado esta vez, confirmamos una correlación de los datos 600
Deslizador FDC v-LIP-P （U / L)

Corredera IDEXX LIP （U / L)

4000
generados por el portaobjetos FDC v-LIP-P y los generados por el
400 3000
método PLI (Spec cPL: IDEXX Laboratories, Inc. , denominado
2000
método PLI), que se dice que es solo un método eficaz de 200 r = 0 .931
1000 r = 0,314
diagnóstico de sangre de la pancreatitis en perros y gatos. Además,
0 0
se confirmaron correlaciones de datos entre los generados por el 0 200 400 600 800 0 200 400 600 800
Método PLI (un método de diagnóstico de inmunorreactividad) （μg / L) Método PLI (un método de diagnóstico de inmunorreactividad) （μg / L)

portaobjetos FDC v-LIP-P, el método de diacetinasa (VetTest Slide

ｃ. Método de sustrato DGGR
(un método de química húmeda, Roche Diagnostics) ｄ.(un método de química húmeda, Wako Pure Chemical Industries)
Método de sustrato de 1,2-diglicéridos

LIPA: IDEXX Laboratories, Inc., denominado método de diacetinasa), 800

（N = 40)
1400
（N = 24)

que es un método convencional de análisis de lipasa en sangre. 1200

600
como método de química seca, el método de 1,2-glicérido (Lipase 1000
Roche LIP （U / L)

Wako LIP （U / L)

800
Color Auto Test Wako kit: Wako Pure Chemical Industries, 400
600
denominado método de 1,2-diglicérido) y el método de sustrato
400
200 r = 0,972 ｒ = 0,401
DGGR como métodos de ensayo húmedo (Fig.6 ). 200

Se observó una buena correlación entre el FDC v-LIP-P Slide 0 0

0 200 400 600 800 0 200 400 600 800

y el método PLI con un coeficiente de correlación (r) = 0,931. Método PLI (un método de diagnóstico de inmunorreactividad) （μg / L) Método PLI (un método de diagnóstico de inmunorreactividad) （μg / L)

Por otro lado, se encontró una baja correlación entre el método Figura 6 Correlación de muestras caninas de PLI y diversas medidas de la
de la diacetinasa, como otro método de química seca y el actividad de la lipasa (a. FDC v-LIP-P Slide (química seca), b. Método
de diacetinasa (química seca), c. Método DGGR (química húmeda),
método PLI, con un coeficiente de correlación (r) = 0.314.
d.1,2 -Método de los diglicéridos (química húmeda)).
Con respecto a los métodos de química húmeda, se observó
una buena correlación entre el método de sustrato DGGR y el ａ. Muestra de prueba canina, correlación entre muestras múltiples ｂ. Muestra de prueba felina, correlación entre muestras múltiples
(n = 61) (n = 30)
método PLI con un coeficiente de correlación (r) = 0.972, y se 1200
y = 0,986 x + 3,041
800
y = 1.044 x + 5.577

confirmó que la lipasa pancreática podría medirse 700

R2 = 0,986
1000 R2 = 0,966

r = 0,993 600 r = 0,983

específicamente por este método como se reporta en los
Deslizador FDC v-LIP-P (U / L)

Deslizador FDC v-LIP-P (U / L)

800
500

artículos. . Por otro lado, se confirmó que el coeficiente de 600 400

correlación (r) = 0,401 cuando se evaluó una correlación entre 400

300

200
el método de 1,2-diglicéridos y el método PLI. 200
100

Con base en estos resultados, se supone que el FDC v-LIP-P Slide que 0 0
0 200 400 600 800 1000 1200 0 100200300400500600700800
muestra una buena correlación con el método PLI es un método con alta Método de sustrato DGGR (U / L) H-7180 Método de sustrato DGGR (U / L) H-7180

especificidad para la lipasa pancreática de forma similar al método del Fig.7 Correlación del método FDC v-LIP-P Slide y DGGR
sustrato DGGR. Por el contrario, los datos proporcionados (a. muestras caninas, b. muestras felinas).

INVESTIGACIÓN Y DESARROLLO DE FUJIFILM (No 56-2011) 9

 En cuanto a la muestra de prueba felina, no se han la lipasa pancreática. 1,2-O-dilaurilo-rac-ácido glicero-3-glutárico- (6'-
confirmado correlaciones entre el método PLI y el FDC v-LIP-P metilresorufina) -ester, un sustrato que se utilizará para el método
Slide o el método de sustrato DGGR. Además, serían necesarios DGGR, es muy degradable e inestable a pH 8, es decir, pH óptimo para la
más estudios sobre la especificidad de estos métodos para la lipasa pancreática, mientras que la torioleína, un sustrato de el método
lipasa pancreática, ya que no se sometieron a la evaluación de los triglicéridos, es estable a pH 8.0. En el caso del portaobjetos FDC,
cantidades suficientes de muestras de ensayo con contenido de debe contener todos los reactivos necesarios para medir la actividad de
lipasa intermedio y alto. Sin embargo, se supuso que con estos la lipasa. Dado que la trioleína, un sustrato del método de los
métodos no se medirían isoenzimas distintas de la lipasa triglicéridos, era estable a pH 8, es decir, en condiciones de
pancreática porque se observó una alta correlación entre estos almacenamiento, se consideró aplicable como sustrato de un método de
2 métodos. química seca y se seleccionó el método de los triglicéridos como
principio de medición.
3.2 Confirmación de reproducibilidad simultánea
Para asegurar la especificidad de la lipasa pancreática, se
Para evaluar si el grado de variación de los datos proporcionados por
prescribió dodecilbencenosulfonato de sodio además de
ensayos repetidos con el portaobjetos FDC v-LIP-P está en el rango
colipasa y sal biliar. Al prescribir estos materiales, se podría
aceptable, se realizaron ensayos de reproducibilidad simultáneos. En la
lograr una buena correlación en muestras de prueba caninas.
Tabla 3, se proporcionan los resultados de los ensayos realizados 20
Además, la mejora de la reactividad del método para la
veces repetidamente para cada una de las 3 muestras de suero canino
lipasa pancreática podría lograrse emulsionando y
con diferentes actividades de lipasa. Dado que un coeficiente de
dispersando trioleína, un sustrato, y prescribiendo el
variación (CV) como medida de variación fue inferior al 4% en cada nivel
sustrato emulsionado en el portaobjetos.
de actividad, se confirmó que la reproducibilidad del ensayo con el
Se observó una muy buena correlación entre el método PLI y
portaobjetos FDC v-LIP-P estaba en el rango aceptable para el
el portaobjetos FDC v-LIP-P, en el que se introdujeron las
diagnóstico de pancreatitis.
medidas anteriores, con el uso de muestras caninas de prueba.

Tabla 3 Reproducibilidad en la medición con FDC v-LIP-P Slide Además, se observó una muy buena correlación entre el
para sueros para perros. portaobjetos FDC v-LIP-P y el método DGGR, que mostró

suero de perro 1 suero de perro 2 suero de perro 3

también una muy buena correlación con el método PLI.
1 37 678 412 También se confirmó que el grado de variación de los datos
2 36 706 406 proporcionados por el método FDC se encontraba en el rango
3 38 671 392
4 37 707 396
aceptable.
5 37 723 375 El método PLI, único método de diagnóstico eficaz que se dice que
6 37 686 382 está disponible en la actualidad para la pancreatitis en perros y gatos, no
7 38 719 386
es un procedimiento fácil y rápido que requiere unos días para obtener
8 35 680 393
9 36 695 377 resultados de medición y tiene las desventajas de que no conduce a
10 37 713 386 resultados rápidos. diagnóstico. Dado que el portaobjetos FDC v-LIP-P
11 37 725 394
que se desarrolló esta vez tiene una alta especificidad para la lipasa
12 35 700 399
13 35 722 399 pancreática y se puede empaquetar en el sistema FDC fácil y rápido que
14 34 749 397 se ha utilizado hasta ahora en la atención médica veterinaria, se espera
15 38 730 397 que el portaobjetos sea un producto de diagnóstico muy eficaz para la
dieciséis 34 704 400
pancreatitis en la atención médica veterinaria.
17 36 708 397
18 36 683 388
19 37 676 390
20 40 685 394 5. Reconocimiento
promedio (U / L) 36,5 703.0 393,0
SD (U / L) 1,47 21,1 9.0 Los autores expresan su profundo agradecimiento al Sr. Jun
CV (%) 4.0 3,0 2.3 Arakawa de Pharmaceutical & Healthcare Research Laboratories
por su cooperación en la evaluación de sustratos y la posterior
fabricación / introducción de un emulsionante. Los autores también
4. Conclusión agradecen a todos los miembros de FUJIFILM Medical Co., Ltd. que
amablemente nos proporcionaron muestras de animales.
Evaluamos el portaobjetos FDC v-LIP-P que se desarrolló para
permitir una detección rápida y fácil de la pancreatitis en la
atención médica veterinaria.
El método del sustrato DGGR o el método de los triglicéridos es
adecuado para el cribado de pancreatitis como principio de
medición porque estos métodos tienen una alta especificidad para

10 Desarrollo del portaobjetos FUJI DRI-CHEM v-LIP-P que tiene una alta especificidad para la lipasa pancreática
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INVESTIGACIÓN Y DESARROLLO DE FUJIFILM (No 56-2011) 11