Secuenciación del ADN por medio de

nanoporos en grafeno

http://es.wikipedia.org/wiki/Secuenciaciondeadnpornanoporos

Marcelo Bustelo y Pedro Martin Granovsky Moroni

Nanotecnólogos por un día 2013

Fundación Argentina de Nanotecnología

Página 1
Marcelo Bustelo:

Edad: 16

Fecha de Nacimiento: 20/12/1996

D.N.I: 39868830

Correo Electrónico: [email protected]

Teléfono: 02920-15-401779

Escuela: C.E.M N°98 “Quimeln Niyeu”. Las Grutas, Río Negro

Pedro Martín Granovsky Moroni:

Edad: 17

Fecha de nacimiento: 01/09/1996

D.N.I: 39649468

Correo Electrónico: [email protected]

Teléfono: 02920-15-301154

Escuela: C.E.M N°98 “Quimeln Niyeu”. Las Grutas, Río Negro

Tutora del trabajo:

Nombre: Alicia Liliana Calendino

D.N.I: 17778031

Correo: [email protected]

Teléfono: 02920-15-473188 02934-497209

Materia a cargo: Química

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Escuela: C.E.M N°98 “Quimeln Niyeu”. Las Grutas, Río Negro

Indice:

Introducción….……………………………………………………….……Página 4

1. Carbono…………………………………………………………………..Página 4

2. Grafeno……………………………………………………..…………….Página 4

2.1. Propiedades………………………………………………………......Página 5

2.2. Obtención……………………………………………….…………….Página 6

3. ADN………………………………………………..………………………Página 6

4. Secuenciación de ADN………………………………………...…...Página 7

4.1. Secuenciación de ADN por nanoporos en grafeno…..Página 8

4.2. Materiales y Métodos……………………………….………...….Página 9

5. Secuenciación en Argentina……..….………….……………….Página 11

Conclusión…………………………..………………..……….…………...Página 12

Bibliografía…………………………………………………..……………Página 13

Agradecimientos…………………………………...………….......…….Página 15

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Introducción

Los avances en el campo de la ciencia y la tecnología, han permitido estudiar y

experimentar cada vez con sustancias más pequeñas hasta el punto de manipular
moléculas y átomos. A la rama de la tecnología que trabaja con esta escala (1nm = 10⁻⁹
m) se la llama nanotecnología. Para dar un ejemplo, una cadena doble de ADN esta
dentro de esta escala, midiendo de 2,2 nm a 2,6 nm de diámetro. A este nivel las
propiedades de la materia cambian, se presentan fenómenos y propiedades nuevas. Esto
permite crear materiales con propiedades únicas. Uno de estos nanomateriales es el
grafeno, al que se lo puede utilizar para secuenciar el ADN de cualquier especie, de lo
cual hablaremos en esta monografía. Además, trataremos sobre la situación en nuestro
país sobre este tema, sus aplicaciones y los dilemas éticos a los cuales nos lleva este
avance en el campo de la nanotecnología.
En particular nos interesó investigar acerca de este tema por las características únicas
del grafeno como nanomaterial, ya que éste es un elemento accesible, y es muy
apropiado para secuenciar el ADN, debido a que es más rápido y económico que otros
métodos actuales. Para abordar este tema específico, primero desarrollaremos conceptos
básicos, tales como el carbono, el grafeno y el ADN y luego nos avocaremos a explicar
la secuenciación de ADN a través de nanoporos en grafeno.

1. Carbono

Se estima que el Carbono es uno de los elementos químicos más abundantes en el

Planeta Tierra, junto al Hidrogeno, el Oxígeno y el Silicio. El mismo tiene increíbles
propiedades, como la de combinarse consigo mismo formando cadenas y ciclos
carbonados. El Carbono presenta diferentes formas alotrópicas. Según su hibridización,
algunas de ellas son el diamante (hibridización sp3) o el grafito (hibridización sp2). El
grafito está compuesto de muchas capas de grafeno.

2. Grafeno

El grafeno es una lámina de un átomo de carbono de grosor (0,34 nm). El origen de la

palabra procede de grafito: del griego γράφειν graphein, "dibujar/escribir" (por su uso
en lápices) + terminación eno.

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El enlace químico y su estructura fue calculada como una “estructura límite del grafito”
en el año 1949 por Phillip Russel Wallace. Hasta el año 1994 se lo conocía como
“monocapa de grafito”, sin embargo en este año se lo nombro oficialmente como
grafeno. El impulso definitivo se produjo, cuando Andréy Gueim y el que fuera su
alumno de doctorado, Konstantín Novosiólov, de la Universidad de Manchester, en el
año 2004, aislaron las primeras muestras de grafeno a partir de grafito mediante un
proceso de exfoliación mecánica. El proceso fue muy simple y consistió en la
exfoliación de láminas de grafito mediante el uso de una cinta adhesiva reiteradas veces.
Por este descubrimiento ellos recibieron el Premio Nobel de Física 2010.

El grafeno está compuesto por átomos de carbono entramados hexagonalmente. La

longitud del enlace Carbono-Carbono es de 0,142 nm. Los Carbonos se unen mediante
enlaces covalentes formados a partir de la superposición de los orbitales híbridos sp 2.
Cada uno de estos carbonos tiene 4 electrones de valencia. Tres de esos electrones se
alojan en híbridos sp2 formando los enlaces covalentes simples (σ) de la estructura, y el
electrón sobrante estará en el orbital atómico p puro, de forma perpendicular al plano de
los híbridos. El solapamiento lateral de estos orbitales p originará los orbitales π,
generando un gigantesco orbital molecular deslocalizado. Debido a esta deslocalización
de los electrones π por sobre y debajo del plano de los átomos de carbono, se explica la
alta conductividad eléctrica.

El grafeno perfecto está constituido exclusivamente de celdas hexagonales, aunque en

presencia de impurezas pueden presentarse celdas pentagonales o heptagonales que
podrían modificar las propiedades del mismo. Se observa que existen interacciones
entre las distintas capas de anillos hexagonales densamente empaquetados, formando
una red cristalina.

2.1 Propiedades

Entre las más destacadas propiedades del grafeno, se incluyen las de la

impermeabilidad, conductividad eléctrica, dureza, flexibilidad, auto regeneración,
resistencia, menor efecto Joule, transparencia y alta densidad. Nos interiorizaremos en
este trabajo en la conductividad eléctrica. Los electrones móviles que se trasladan sobre
el grafeno se comportan como cuasi-partículas eléctricas sin masa, llamadas fermiones.
Estos fermiones se mueven a velocidad constante, de manera independiente de su

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energía, como ocurre con los fotones, a una velocidad de 10 6 m/s. Además, el grafeno
presenta el efecto Hall Cuántico mediante el cual la corriente toma valores discretos o
cuantizados. Por lo tanto, la conductividad del grafeno nunca puede ser 0. Los
electrones pueden moverse libremente por toda la lámina de grafeno, y nunca quedar
aislados en una zona. Este es el efecto llamado “localización de Anderson”.

2.2. Obtención

Para obtener el grafeno se han empleado diferentes técnicas. Las podemos dividir en
“Bottom Up”, cuando se obtiene la estructura de grafeno a partir de átomos de carbono
generados mediante descomposición de moléculas orgánicas; y “Top Down”, cuando se
obtiene grafeno de un espesor nanométrico a partir de un material de espesor
micrométrico.
Una de las técnicas Bottom Up es la de deposición química en fase vapor (CVD) y la
otra es la de descomposición térmica de obleas de SiC en ultra alto vacío.
En cuanto a las técnicas Top Down, se destacan la exfoliación química y la mecánica.

3. ADN

La sigla ADN significa Acido Desoxirribonucleico. Es el componente químico primario

de los cromosomas y el material por el cual los genes están formados. El papel del ADN
es guardar la información genética y entregarla intacta a la nueva generación. Además,
el ADN contiene las “instrucciones” necesarias para construir otros componentes de las
células como las proteínas o las moléculas de ARN.

En el año 1869 el médico suizo Friederich Miescher descubrió los ácidos nucleicos, los
llamó nucleina. Phoebus Levene en el año 1930 identificó que un nucleótido está
formado por una base nitrogenada, un azúcar y un fosfato. El y su maestro Albrecht
Kossel comprobaron que la nucleina es ácido desoxirribonucleico (ADN), formado por
cuatro bases nitrogenadas: Adenina, Timina, Citosina y Guanina, el azúcar
desoxirribosa y un grupo fosfato. No fue hasta el año 1953 cuando James Watson y
Francis Crick descubrieron la estructura de doble hélice del ADN. Esto dejaba claro que
el ADN se podía “desenrollar” para que fuese posible su lectura o copia.

Una hebra de ácido nucleico está compuesta por una base nitrogenada, un ácido
fosfórico (de fórmula química H3PO4) y una pentosa (de fórmula química C 5H10O4), que
están unidas mediante enlaces covalentes.
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Cada base nitrogenada está siempre unida a su complementaria de la otra hebra:
Adenina-Timina y Guanina-Citosina. La unión entre Adenina y Timina es por puente
Hidrogeno doble mientras que la unión entre la Citosina y Guanina es por puente
Hidrogeno triple. Cuando se realizan estas uniones, la hebra se enrolla alrededor de otra
hebra complementaria formando un par entrelazado. Así las bases de cada cadena se
encuentran hacia el interior de la hélice y la desoxirribosa-P forma el esqueleto exterior.

El diámetro de la doble
cadena de ADN es de 2,2 nm
a 2,6 nm. Un nucleótido, una
unidad de ADN, mide 0,33
nm de largo. Una hélice de
ADN mide 3,4 nm de paso de
rosca y 2,37 nm de diámetro.

Imagen 2. Estructura química del ADN.

http//es.wikipedia.org/wiki/Ácido Desoxirribonucleico

4. Secuenciación de ADN

Se llama secuenciación de ADN al conjunto de métodos y técnicas, cuya finalidad es la

determinación del orden de los nucleótidos Adenina (A), Timina (T), Citosina (C) y
Guanina (G) en una cadena de ADN de cualquier especie.

Existen distintas técnicas que se han aplicado para la secuenciación del ADN. Entre las
más destacadas están las de Maxam-Gilbert, el Método de Sanger y la
Pirosecuenciación.

Las aplicaciones que se le pueden dar a la secuenciación del ADN son variadas y
abarcan un campo muy amplio. Desde el punto de vista científico ayudaría a resolver
cuestiones básicas del conocimiento de la estructura y la fisiología celular; aplicándolo
al campo social ayudaría a la identificación inequívoca de personas, con fines policiales

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o legales; en el campo de la salud prevendría y diagnosticaría enfermedades genéticas; y
con respecto a la eugenesia, se podría modificar la información genética para intentar
obtener individuos con características determinadas.

Los conocimientos sobre la manipulación del genoma humano avanzan a un ritmo

acelerado y por esto se ha visto la necesidad de legislar en este sentido. Por ejemplo, la
UNESCO, hizo una declaración sobre la protección del genoma humano; que determina
que no hay que dejar de tener en cuenta la reflexión sobre las consecuencias de estas
investigaciones y la imposición de límites para proteger la individualidad e intimidad de
las personas.

Desde el año 1995 se estudia la posibilidad de secuenciar el ADN por medio de

nanoporos en distintos materiales como silicona o grafeno.
Actualmente se está intentando crear dispositivos portátiles capaces de secuenciar todo
el genoma en 15 minutos, con un valor de 1000 dólares; aunque esto aún se esté
investigando y todavía no pueda ser comercializado.

4.1. Secuenciación de ADN por nanoporos en grafeno

Se ha reconocido recientemente que los nanoporos en estado sólido en membranas de

grafeno de un solo átomo de espesor pueden ser usados para detectar electrónicamente
cada una de las bases que componen al ADN. Las ventajas potenciales del uso de
nanoporos en grafeno incluyen la alta sensibilidad y una resolución a escala
nanométrica a lo largo del polímero que puede ser secuenciado a través del nanoporo.

Un grupo de investigadores de la Universidad de Harvard en EEUU, integrado por

Jene Golovchenko y Daniel Branton, entre otros, se han dedicado a investigar desde el
año 1996 la secuenciación del ADN por medio de nanoporos en diversos materiales.

Desde el aislamiento del grafeno en el año 2004, se ha experimentado con este material,
ya que tiene excelentes condiciones químicas y físicas que reemplazarían a otros
materiales experimentados por este grupo anteriormente. El último trabajo de este grupo
de investigadores trata de la secuenciación del ADN por nanoporos usando como
material al grafeno. El mismo fue lanzado en mayo del año 2013, “Molecule-hugging
graphene nanopores” y es en el cual nos basaremos en la presente monografía.

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4.2. Materiales y métodos

La membrana de grafeno se obtuvo por medio de deposición química en fase vapor

(CVD) en un papel de cobre y luego fue transferida sobre un film de Nitruro de Silicio
(SiN) de 200 nm x 200 nm, colocado sobre un marco de silicona.

A esta membrana de grafeno se le realizó un nanoporo en su centro por medio de un

microscopio electrónico llamado “JEOL 2010F EM”, operando a 200 kV, el cual hizo
pasar electrones a través de la membrana de grafeno. Los nanoporos son orificios
creados artificialmente a escala nanométrica, en un material, en este caso, grafeno. El
diámetro del nanoporo obtenido en la membrana de grafeno varía entre 3 nm y 7 nm.

Por encima y por debajo de la membrana de grafeno se colocaron dos cámaras que
fueron llenadas con solución de Cloruro de Potasio (KCl) 3M, a pH 10, cada una con su
respectivo electrodo de Ag/AgCl. Cada cámara fue cargada eléctricamente, generándose
una corriente iónica en la solución. La carga aplicada a la solución fue de 160mV ya
que el grafeno mantiene estables sus propiedades químicas y físicas en estas
condiciones eléctricas. Esto se comprobó cuando a las membranas de grafeno se les
aplicó una carga de 500 mV, en donde las mismas perdieron una gradual resistencia
eléctrica que podría afectar resultados posteriores. Así, el único camino a través del
cual los iones podrían trasladarse de un electrodo al otro es mediante el nanoporo. Esta
solución salina genera una conductividad eléctrica de 27,5 S/m. Estas 3 condiciones
óptimas no permitirían la posible adsorción entre el ADN y la superficie del grafeno.

Aquí se muestra la base de silicona, el

marco de SiN, la membrana de
grafeno, el nanoporo, el ADN siendo
secuenciado, los electrodos de
Ag/AgCl, la fuente con la carga
aplicada y el medidor de bloqueos de
corriente iónica (indicado con A). En
la imagen no se muestran las cámaras
con solución de KCl, las cuales están
Imagen 3. Método de secuenciación de ADN
“Molecule-hugging nanopores in graphene”. en contacto con los dos electrodos.

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El proceso de secuenciación consiste en el paso del ADN cargado electroforéticamente
a través del nanoporo. A medida que este polímero atraviesa el nanoporo, surgen
bloqueos de corriente iónica de diferentes magnitudes dependiendo cuál sea la base que
en ese momento esté pasando por el nanoporo (A, C, T, G). Así, el registro de las
diferentes magnitudes de bloqueo permite saber el orden de las bases que componen la
molécula del ADN secuenciado.

Además de las pruebas con nanoporos en grafeno, se experimentó con nanoporos en

SiN y esto demostró que el grafeno es un nanomaterial óptimo para este proceso, ya que
en él las magnitudes de bloqueo, al pasar las bases de ADN por el nanoporo, son más
pronunciadas que en otros materiales.

En la imagen 4, las membranas de SiN con las que se ha experimentado están

representadas por las líneas de color violeta, azul y negra, de 5 nm, 10 nm y 30 nm de
espesor, respectivamente.

Imagen 4. “Molecule-hugging nanopores in graphene”. Mayo 2013

Esta imagen muestra resultados experimentales en donde se muestra la variación de la

corriente iónica ΔI en nano amperes (nA) según el diámetro D del nanoporo (nm).

De esta forma se comprueba que mientras menor sea el diámetro del nanoporo, más
marcada será la variación de corriente iónica generada por el bloqueo.

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Además de que el nanoporo en grafeno tiene que ser del menor diámetro posible para
generar una mejor resolución en las variaciones de corriente, el ADN muestra mejores
resultados siendo de doble hélice (ADN-hd) respecto al ADN simple (ADN-hs),
obteniéndose un pico de corriente más pronunciado. Esto lo muestra la imagen 5.

Imagen 5. “Molecule-hugging nanopores in graphene”. Mayo 2013.

En esta imagen se comparan los eventos de secuenciación de ADN de doble hélice

(azul) y simple hélice (negro). Se puede notar la diferencia en cuanto a la variación de
corriente iónica producida por los bloqueos, que al ser ADN de doble hélice los picos
son más marcados. Además de esto, se puede concluir que el tiempo (micro s) que tarda
la secuenciación de la muestra de ADN de doble hélice es mucho menor al tiempo que
tarda la muestra de hélice simple. Esta variación de tiempo se debe a las interacciones
entre los electrones π del grafeno y las bases nitrogenadas del ADN de hélice simple
(Interacciones de van der Walls).

Los eventos de secuenciación se realizaron con fragmentos de ADN extraídos del virus
bacteriófago λ (Lambda). Cada fragmento de λ-ADN posee 10.000 pares de bases, lo
que representa aproximadamente 3.400 nanómetros de largo.

5. Secuenciación en Argentina

En nuestro país también se realizan experiencias de secuenciación de ADN desde hace

aproximadamente 10 años. Un grupo de investigadores formó una empresa llamada
“Fullgen” en donde científicos de diferentes ramas de las ciencias (Biología, Química,
Física, Electrónica, etc) investigan y analizan el ADN. Uno de estos temas en los que se
interiorizan es en la secuenciación de ADN por nanoporos. Estos proyectos están
respaldados en diversos sentidos por instituciones, tales como el Consejo Nacional de
Investigaciones Científicas y Técnicas (CONICET), la Universidad Tecnológica
Nacional (UTN), la Universidad Nacional del Litoral (UNL), la Universidad de Buenos

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Aires (UBA), el Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA) y el Instituto de
Investigaciones Científicas y Técnicas para la Defensa (CITIDEF).

Las condiciones, en general, del método de secuenciación de ADN en Argentina

-comparándolo con el de EEUU experimentado en Harvard-, son similares;
manteniendo el mismo diámetro del nanoporo en la mayoría de los casos (3 nm de
diámetro), y el mismo pH alto de valor 10. Sin embargo, en Argentina la membrana en
donde se ubica el nanoporo no es de grafeno si no que es de Silicio.

La idea de este proyecto es secuenciar el ADN a bajo costo y hacerlo rutinario, teniendo
en cuenta que actualmente el costo de la secuenciación del genoma humano cuesta de
10.000 dólares a 30.000 dólares aproximadamente, tardando uno o dos días el proceso.
Sin embargo, con estos nuevos métodos con nanoporos se estima que se podría llegar a
secuenciar el genoma en una o dos horas y a un costo no mayor de 1.000 dólares.
Actualmente montar un equipo de secuenciación de ADN, que no funciona con el
método de nanoporos, cuesta alrededor de 1.500.000 dólares, siendo éste un presupuesto
muy elevado. El método de secuenciación por nanoporos en cambio, promete bajar los
costos de la infraestructura a menos de 300.000 dólares, incluyendo así a un sector de la
sociedad el cual hoy en día le es imposible realizar este examen de ADN.

Conclusión

Los avances en el campo de la biología molecular han permitido ampliar enormemente

los conocimientos sobre las enfermedades genéticas, hereditarias o adquiridas, de las
que hasta hace algunos años apenas teníamos nociones limitadas, y en la actualidad
pueden ser definidas con gran precisión desde el punto de vista molecular.

Creemos que la secuenciación del ADN se justifica cuando se la utiliza para

diagnosticar y clasificar enfermedades de origen genético, siempre considerando los
decretos de la UNESCO de protección del genoma y los derechos de las personas. Para
nosotros no es así cuando a estos exámenes se los usa con fines eugenésicos, como el
de idear o modificar personas con características determinadas.

De acuerdo a lo desarrollado en esta monografía, podemos decir que la secuenciación de

ADN a través de nanoporos en grafeno proporciona óptimos resultados y en menor
tiempo que con otros métodos, aunque esta técnica todavía esté en investigación.

Página 12
Bibliografía

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Tutor Sánchez, Joaquín. “Grafeno: sueño o realidad de la nanotecnología”. Anales,

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Molecular y Biotecnología). 2012, obtenida en:
http://www.infobioquimica.com/index.php/radio-menu/entrevistas/789-cv-maximiliano-
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https://www.nanoporetech.com/

http://aportes.educ.ar/

http://grafenos.wikispaces.com

http://mundografeno.blogspot.com.ar

http://www.microscopy.ou.edu

http://www.ehu.es

http://www.enciclopedia.us.es/

Agradecimientos

Agradecemos a toda la gente que hizo posible la realización de este trabajo directa o
indirectamente, ayudando con buena predisposición y entusiasmo. A Sebastián
Ardenghi, investigador del CONICET especializado en grafeno; Maximiliano Pérez,
Doctor en Biología Molecular y Biotecnología; Alicia Calendino, Profesora de
Química; Cecilia Gutiérrez, Profesora de Idioma Extranjero; Luciana Hidalgo,
Profesora de Literatura; Ángel Malvido, Profesor de Historia; Mauro Aguilera,
Ingeniero Electrónico y Carolina Ardenghi, Profesora de Historia. Queremos agradecer
también el apoyo emocional por parte de nuestras familias, compañeros y amigos.

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