La espectrofotometría es una técnica muy eficiente para la determinación de la

concentración de sustancias que absorben energía a una determinada longitud de

onda; dicha absorción se debe a grupos como el carbonilo, imino, diazo este último
presente en el rojo congo, nitro, enlaces C-Y (Y posee pares de electrones libres) y
sistemas aromáticos. [5]
Por otro lado, están los grupos auxocromos, que son los sustituyentes que alteran
tanto la longitud de onda máxima y/o energía máxima; tales grupos son los metilos
y halógenos presentes en azul de bromotimol y los grupos amino, hidroxi y alcoxis
presentes en rojo Congo. Estos grupos pueden ser los responsables de mover las
bandas de absorción a longitudes de onda mayores o menores, incluso hacer que
la intensidad de la banda de absorción.
De acuerdo con los resultados obtenidos en la práctica, se puede observar que el
barrido de la mezcla de azul de Bromotimol y Rojo Congo (tabla 2 y grafica 2),
muestra dos picos pronunciados (máximo de absorción) uno a 610 nm y el otro a
490 nm aproximadamente. A pH de 7.5 el azul de bromotimol presenta un color
complementario entre verde y azul, (predominando el azul), lo que indica que
absorben los colores que van desde el amarillo al naranja esto se ve representado
en un pico de absorción a 610 nm referente al azul de Bromotimol.
En el caso del rojo Congo con un pico de absorción a 490 nm (tabla 1 y grafica 1)
su color complementario es naranja rojizo por lo que absorbe lo colores verde-azul.
Se determinó la concentración de una muestra problema de rojo Congo realizando una
curva de calibración de 8 puntos a diferentes concentraciones del compuesto (tabla 3 y
grafica 3) ya que como se mencionó anteriormente la muestra absorbe luz ultravioleta con
un máximo de 490 nm aproximadamente. Para encontrar este valor se utilizó la ley de
Beer que establece que la absorbancia es proporcional a la concentración de la especie
absorbente que en este caso es el rojo Congo y se pudo verificar en el caso de estas
soluciones diluidas de la curva. La concentración hallada fue de 7,34 ppm de rojo Congo en
la muestra con un error de 2,3 %. El error presente en la determinación es bajo y
posiblemente se deba a fallas aparentes de la ley de Beer en las soluciones con mayor
concentración ya que las moléculas del soluto interactúan entre si debido a su proximidad
cambiando propiedades eléctricas incluyendo la absorción de la luz como se puede
observar en las lecturas de absorbancia mayores a 1 lo cual no es válido para la ley de
Beer, también los espectrofotómetros presentan un error mínimo para valores de
absorbancia intermedios (0,4- 0,9), cuando emerge poca luz de la muestra (absorbancia
alta) la intensidad es difícil de medir mientras que cuando emerge demasiada luz
(absorbancia baja), es difícil detectar la diferencia de absorbancia por eso se desea que la
concentración de la muestra se ajuste para que la absorbancia quede en el intervalo
intermedio además la celda del equipo no estaba completamente limpia ya que presento
una pequeña mancha contaminado la superficie y causando dispersión en la luz.
El espectro electromagnético, representa lasregiones visible y no visibles más importantesde la
distribución energética, al considerar laluz (fotón) de máxima Absorbancia queabsorben las
sustancias, donde cada fotóntiene una energía , que está dada por(E=hcv/λ), donde h
corresponde a laconstante de planck y v corresponde alnúmero de ondas, donde se observa
que la energía es inversamente proporcional a lalongitud de onda y directamente
proporcionalal número de onda, por lo tanto en el casodel azul de bromotimol en medio
acido,mostró una longitud de onda muy pequeña430 nm y una Absorbancia de color Violeta.El
pH, la polaridad del solvente o moléculasvecinas y la orientación de los cromóforos “esla parte
o conjunto de átomos de unamolécula responsable de su color”, sonfactores que originan
variaciones en losvalores, en el caso del pH son debidas alefecto de éste sobre la ionización
delcompuesto. Aún así la existencia de ionesinorgánicos en disolución acuosa
absorbesuficiente energía radiante en la región delvisible, lo que permite su
determinaciónespectrofotométrica directa, incluso en muybajas concentraciones, en la mezcla
de azulde bromotimol pH 7.5 más Rojo Congo laAbsorbancia de una solución a una longitudde
onda dada es la suma de las Absorbanciade cada una de las especies en la solución aesta
longitud de onda, es decir laAbsorbancia es aditiva en esta mezcla seencontró una longitud de
onda de (610 nm)que era de color Amarillo (Harris, 1992)

Por otro lado, en la segunda parte de lapráctica se comprobó la ley de Beer-Lambert,utilizando

nuevamente el espectrofotómetro;pero esta vez se utilizó el máximo deabsorbancia obtenido
en el espectro deabsorción de un analito, que mostrará lalongitud de onda que proporciona la
mayorsensibilidad posible, y por tanto será la quese utilizará en el análisis
espectrofotométricode dicho analito (Wade, 2004).Hay que tener en cuenta que las
sustanciasutilizadas (analito), se encuentran en laregión visible;se puede apreciar el
colorvisible de una solución y corresponde a laslongitudes de onda de luz que transmite,
noque absorbe. El color que absorbe es elcomplementario del color que transmite. Portanto,
para realizar mediciones de absorciónes necesario utilizar la longitud de onda en laque
absorbe luz la solución coloreada. Lafuente de radiación visible suele ser unalámpara de
tungsteno y no proporcionasuficiente energía por debajo de 320 nm.(Díaz Nieves Abril,et
al. 2004)Por su parte, La ley de Beer-Lambertestablece que la absorbancia de una soluciónes
directamente proporcional a suconcentración a mayor número de moléculasmayor interacción
de la luz con ellas; tambiéndepende de la distancia que recorre la luz porla solución a igual
concentración, cuantomayor distancia recorre la luz por la muestramás moléculas se
encontrará.Durante la práctica se analizó la variación dela absorción con respecto a
la concentraciónde una sustancia como el azul debromotimol. En el caso del azul
debromotimol, se trabajó a un pH de 7.5 y a unpH ácido (otro Grupo) y se observó que apesar
de que en algunas concentracioneseran muy similares sus absorbancias, lalongitud de onda
trabajada para cada uno deellos era distinta; por lo que no se pudo decirque en el azul de
bromotimol exista un punto isobéstico. Mediante medidas espectrofotométricas sedeterminan
las concentraciones de la formaasociada y de la disociada de una sustanciasobre la base de
que: ambas formas

obedecen la ley de Lambert-Beer y que lasconcentraciones de las mismas sondeterminables,

ya sea porque absorben adiferentes longitudes de onda o bien porquese cumple la condición
de aditividad(Duymovich Claudio, 2005).Para realizar correctamente la medición delas
sustancias mencionadas anteriormente,se midió en contra de un blanco que contienetodas las
sustancias usadas en la prueba,excepto el compuesto que se quiere medir.El blanco se colocó
primero en el instrumentoy se ajustó luego la extinción a cero (100%de transmitancia) antes
de tomar las lecturaspara la muestra, lo cual se realizóefectivamente en la práctica
(Plummer,1981).Para llevar a cabo la etapa de calibración, serepresentó la absorbancia de las
muestras deconcentración conocida a la longitud de ondade máxima absorbancia, frente a
laconcentración de dichas muestras. De estamanera se obtiene la curva de calibración.Esto fue
entonces lo obtenido al graficar laconcentración vs. Absorbancia, en la cual seobservó que la
segunda aumentaba amedida que aumentaba la primera, la cualposee un comportamiento
lineal (regida porla ley de Beer) (Plummer, 1981).Mostrando que la absorbancia
estárelacionada linealmente con la concentraciónde las especies absorbentes y con la
longitudde la trayectoria de la radiación. La relaciónlineal entre la absorbancia y la longitud de
latrayectoria de la radiación a unaconcentración fija, es una generalizaciónpara la que hay
pocas excepciones.(Anónimo)Para el cálculo de la relación linealfotométrica se realizó un
estudio de regresiónlineal de la recta hallada: Y = a + b X, Donde b es la pendiente de la recta y
a la ordenadaal origen. La pendiente b representa lalinealidad fotométrica. La recta ideal sería
Y =X por lo cual la pendiente ideal es 1,00 queindica que el instrumento respondelinealmente
en el rango de absorbanciasestudiadas. Por el método de mínimoscuadrados se calculó a y b,
fue utilizado elprograma Excel.Determinado el espectro de absorción de esasustancia al
graficar de la absorbancia de lasustancia en función de la longitud de onda.

Al determinar las longitudes de onda de lospicos de absorción, estos puedencorrelacionarse

con los tipos de enlace enuna determinada molécula, y son valiosospara determinar los grupos
funcionalesdentro de la molécula. La absorción UV-Visno es, sin embargo, una prueba
específicapara ningún compuesto determinado. Lanaturaleza del disolvente, el pH de
lasolución, la temperatura, la concentración deelectrolitos, y la presencia de
sustanciasinterferentes pueden influir en los espectrosde absorción de los compuestos, así
comolas variaciones en la anchura de la hendidura(ancho de banda efectivo) en
elespectrofotómetro. (Anónimo, 2007)Por medio de esta práctica se logró aprenderel uso
correcto y manejo delespectrofotómetro de absorción UV-visibleutilizándose sustancias que
presentan color yque por medio de la espectrofotometría sepuede observar su región de
absorbancia endeterminada longitud de onda; tambiéndeterminó la longitud de onda de
máximaabsorbancia de cada sustancia, efectuandoademás espectros de absorción de luz
visibley corroborando la relación lineal entreabsorbancia y concentración, según la ley deBeer-
Lambert.
Antes de la realización de cada una de las lecturas primero se debe establecer la longitud de
onda a la que se va a trabajar, es necesario calibrar el espectrofotómetro, verificando que la
absorbancia este en 0,000 y la transmitancia en 0,0%; es ahí cuando se debe proceder a leer
con el equipo debido a que de no estar calibrado el mismo los datos obtenidos serán erróneos.
 Uno de los errores que se comenten con mayor frecuencia al momento de realizar las
lecturas en el espectrofotómetro es al momento de colocar la cubeta en el interior del equipo
ya que las cubetas están formadas por dos tipos de caras una que es transparente y esta debe
ir en dirección por donde atraviesa el haz de luz y el otro tipo que son opacas deben ir en
dirección frente a nosotros para que de esta manera los resultados obtenidos sean los
correctos. Se debe tener en cuenta que al momento de colocar las distintas sustancias en las
cubetas estas deben estar limpias y de igual manera se debe respetar las señales hasta donde
deben ser llenadas ya que si se infringe en dichos parámetros pueden estos ser factores que
afecten en las lecturas y esto nos lleva a tener resultados erróneos.  El punto isosbéstico es el
punto para el cual la longitud de onda para dos sustancias en equilibrio presentan la misma
absortividad, así a partir del gráfico el punto isosbéstico se dio a una longitud de 570 nm con
una absorción de 0,1057.  Mediante la gráfica de absorbancia vs concentración, se
comprueba que la absorbancia es directamente proporcional a la concentración, es decir que
mientras más concentrada sea la solución mayor será la absorbancia.