Universidad del Magdalena.

Facultad de Ciencias de la salud.

Programa: Odontología.
Asignatura: Bioquímica.
Docente: Martha López Arvilla
Laboratorio #5 Espectrofotometría.

Yorcelis Muñoz Buelvas Cod: 2018163016

Daniel Caro García Cod: 2018163006

INTRODUCCION
La Espectrofotometría es una de las técnicas experimentales más utilizadas para la detección
específica de moléculas. Se caracteriza por su precisión, sensibilidad y su aplicabilidad a
moléculas de distinta naturaleza y estado de agregación
Se basa en la relación que existe entre la absorción de luz por parte de un compuesto y su
concentración. Cuando se hace incidir luz monocromática (de una sola longitud de onda)
sobre un medio homogéneo, una parte de la luz incidente es absorbida por el medio y otra
transmitida, como consecuencia de la intensidad del rayo de luz sea atenuada desde Po a P,
siendo Po la intensidad de la luz incidente y P la intensidad del rayo de luz transmitido.

OBJETIVO GENERAL
En esta práctica se tiene como objetivo el conocer cómo usar el espectrofotómetro y como
utilizar los datos que este arroja. Además, aplicar la espectrofotometría como una técnica
cualitativa y cuantitativa de análisis.
OBJETIVOS ESPECÍFICOS
El estudiante adquiera habilidades en el manejo del espectrofotómetro
Dominar los criterios para la selección de la longitud de onda adecuada en la cuantificación
de moléculas en solución.
Realizar los cálculos teóricos mediante la aplicación de formulas o factores de conversión
para en la práctica preparar soluciones liquidas aplicando normas de bioseguridad, utilizando
correctamente materiales y equipos en el laboratorio.
Analizar conceptos relacionados con la espectrofotometría para entender su importancia
como técnica de análisis bioquímico.
Realizar la lectura de absorbancia y transmitancia.
MARCO TEÓRICO
La espectrometría de absorción en el UV-visible es una de las herramientas más útiles y
ampliamente utilizada en Química Analítica, tanto en el análisis cualitativo como cuantitativo
para la identificación y la determinación de la concentración de un analito en disolución,
respectivamente.
La ley de Lambert-Beer establece que cuando pasa luz monocromática por un medio
homogéneo, la disminución de la intensidad del haz de luz incidente es proporcional al
espesor del medio, lo que equivale a decir que la intensidad de la luz transmitida disminuye
exponencialmente al aumentar aritméticamente el espesor del medio absorbente
La ley de Absorción o ley de Lambert-Beer relaciona la concentración de un analito
absorbente con el espesor de muestra y con su absorbancia.
Es necesario considerar una serie de limitaciones químicas e instrumentales a la hora de
aplicar esta ley. Esta ley expresa la relación entre absorbancia de luz monocromática y
concentración de un cromóforo en solución.
Mediante la Ley de Lambert-Beer es posible determinar el valor de concentración de una
solución con base a la relación entre la energía emitida por una fuente y la absorbida por un
cuerpo. Es posible medir así con la ayuda de un espectrofotómetro la relación entre la energía
emitida y la energía absorbida por la muestra mediante la medición de los valores de
transmitancia y absorbancia.
La longitud de onda es la magnitud que representa la distancia en la dirección de propagación
entre dos puntos sucesivos de una onda periódica en la cual la fase es la misma.
La transmitancia(T) de una sustancia en solución es la relación entre la cantidad de la luz
transmitida que llega al detector una vez que ha atravesado la muestra, lt y la cantidad de luz
que incidió sobre ella, lo1 y se representa normalmente en tanto por ciento: % T = lt/lo x100
La transmitancia nos da una medida física de la relación de intensidad incidente y transmitida
al pasar por una muestra. La relación %T y la concentración no es lineal, pero asume una
relación logarítmica inversa.
La absorbancia (A) es un concepto más relacionado con la muestra puesto que nos indica la
cantidad de luz absorbida por la misma, y se define como el logaritmo de 1/t, en
consecuencia: A= log 1/t = -log T = -log lt/lo. cuando la intensidad incidente y transmitida
son iguales (lo =lt). La transmitancia es del 100% e indica que la muestra no absorbe a una
determinada longitud de onda y entonces A vale log 1 =0
La absorbancia de una solución es directamente proporcional a su concentración, a mayor
número de moléculas mayor interacción de la luz con ellas, también depende de la distancia
que recorre la luz por la solución, a igual concentración, cuanto mayor distancia recorre la
luz por la muestra más moléculas se encontrará y, por último, depende de una constante de
proporcionalidad denominada coeficiente de extinción, que es específica de cada cromóforo.
Exactitud de la Longitud de Onda: diferencia entre la longitud de onda que indica el
seleccionador y la longitud de onda real. Es el corrimiento de longitud de onda y se mide en
nm.
Precisión de longitud de onda: Es la capacidad del instrumento de reproducir la longitud de
onda elegida. Se mide también en nm.
Exactitud fotométrica: Exactitud de las medidas de absorbancia, es decir, diferencia entre la
absorbancia real y la absorbancia medida de una solución.
Precisión fotométrica: Repetibilidad de las medidas de absorbancia.
El espectrofotómetro es una herramienta importante del laboratorio y de su buen
funcionamiento depende la calidad de los resultados que se obtienen.
Para informar un resultado confiable es necesario estar seguros de que el equipo utilizado
funcione correctamente. Por eso se realizan los controles espectrofotométricos. Estos
permiten controlar y analizar determinados parámetros y verificar si se encuentran dentro de
los rangos de aceptabilidad establecidos, o bien en caso contrario, proceder a calibrar o a
repararlo. A su vez, la realización de los controles espectrofotométricos debe efectuarse con
cierta periodicidad que dependerá de cada control el particular.
Control de linealidad fotométrica, Indica la linealidad de respuesta del sistema de detección,
y por ende el rango de utilidad de medida del instrumento. En espectrofotómetros de alta
calidad se obtienen respuestas lineales hasta valores cercanos a 2,000 de absorbancia. Para
este control se debe trabajar por ejemplo con algún colorante en solución, que se sabe que
cumple con la Ley de Lambert-Beer, es decir que presenta un comportamiento lineal entre
absorbancia y concentración en el rango de trabajo utilizado.
Para realizarlo, se deberán medir las absorbancias de soluciones de concentraciones
crecientes del colorante utilizado y contrastar dichos valores con las absorbancias de
referencia certificadas (que figuran en el inserto que viene con las soluciones o en el rótulo
de los envases de las soluciones de referencia). Si el equipo cumple con el control, el gráfico
de absorbancia experimental en función de absorbancia de referencia será lineal hasta el
último valor de absorbancia experimental y éste último valor será “el máximo valor de
absorbancia aceptable” para cualquier otra medida. En el caso de que el equipo testeado no
presente linealidad en todo el rango, se deberá informar hasta que valor de absorbancia
experimental hay linealidad. Para realizar este control, cuando no se dispone de los valores
de referencia de absorbancias y sí se conocen las concentraciones de las soluciones a medir,
se puede realizar un gráfico de absorbancia en función de concentración a partir del cual
también se podrá evaluar la linealidad fotométrica. Por cualquiera de los dos procedimientos
empleados, el valor máximo de absorbancia obtenido si bien es medido a una determinada l,
será también el máximo valor aceptable a cualquier otra λ del espectro visible.
Una baja linealidad puede ser debido a problemas electrónicos, presencia elevada de luz
espuria (mayor al 1% de T) -entre otros factores- y debe ser corregida por el servicio técnico
del equipo.
 MATERIALES Y METODOS
 Gradilla para tubos de ensayo
 Tubos de ensayo
 Pipetas graduadas de 1, 5 y 10 mL
 Micropipetas de 10 y 1000 uL
 Puntas para micropipetas
 Espectrofotómetros
 Celdas para espectrofotómetros
 Guantes desechables
 Pipeteador manual
 Calculadora
 Agua destilada
 Solución de rojo de fenol 2,5 mg%
 HCL 0,1 N
 NaOH 0,1 N

6. ESPECTRO DE ABSORCIÓN DEL ROJO DE FENOL EN MEDIO ÁCIDO Y

EN MEDIO ALCALINO

1. se prendió el espectrofotómetro 20 minutos antes de empezar la práctica.

2. se preparó la solución patrón de rojo de fenol en un tubo de ensayo limpio y seco, de la
siguiente forma: Se adicionaron 5 mL de la solución de rojo de fenol al 2,5 mg%, 5 mL de
agua destilada y 0,1 mL de HCL 0,1 N.
3. En otro tubo de ensayo se preparó un blanco con 10 mL de agua destilada y 0,1 mL de
HCL 0,1 N.
4. se vertió la solución patrón y blanco en las cubetas del espectrofotómetro.
5. Para la lectura de la transmitancia en el espectrofotómetro, se escogió inicialmente la
longitud de onda de 380 nm. Se introdujo la cubeta correspondiente al blanco en el
espectrofotómetro y la transmitancia a un 100% (100 %T).
6. Se sacó la cubeta del blanco e introduzca la de la muestra patrón. La lectura que registra
el equipo fue anotada en su cuadro correspondiente.
7. se repitieron los pasos 5 y 6, variando la longitud de onda del espectrofotómetro desde 380
a 620 nm con intervalos de 20 nm.
8. Con los datos de la transmitancia se calcularon los datos de la absorbancia utilizando la
siguiente fórmula: A = 2 – log %T.
9. se repitió el procedimiento reemplazando el HCL 0,1 N por una solución de NaOH 0,1 N
y se anotaron sus datos en la tabla correspondiente.
2. CONSTRUCCIÓN DE LA CURVA DE CALIBRACIÓN DE ROJO DE FENOL.
1. se prepararon tres patrones de rojo de fenol, de concentración distinta, a partir de una
solución de rojo de fenol de concentración 2,5 mg%.
2. se calculó la concentración final del rojo de fenol en cada tubo utilizando la siguiente
fórmula:
C2 = (C1 * V1) / V2
3. se mezclaron suavemente los tubos y se dejaron en reposo por 5 minutos.
4. se tomó en el espectrofotómetro la máxima para rojo de fenol en medio ácido (primera
parte de la práctica) y se realizaron las lecturas del % de transmitancia en cada tubo,
cuadrando el 100% de T con el blanco.
5. se realizó el mismo procedimiento con el rojo de fenol en medio básico (con NaOH 0,1 N)
6. la lectura de cada muestra fueron anotadas en la segunda tabla y se calculó el valor de la
absorbancia de cada una de ellas.

RESULTADOS
Tabla #1 en esta tabla se registraron los datos obtenidos con espectro de absorción del
rojo de fenol en medio ácido y en medio alcalino

ʎ MEDIO ÁCIDO MEDIO ALCALINO

%T A %T A
380 78,9 0,11 93,8 0,02
400 67,4 0,17 97,8 0,01
420 59,3 0,22 97,1 0,02
440 58,6 0,232 95,2 0,03
460 65,7 0,18 62,3 0,04
480 76,2 0,11 86,9 0,06
500 87,7 0,05 78,6 0,10
520 95,9 0,01 67,7 0,16
540 99,4 0,002 55,4 0,25
560 100 0 44,3 0,35
580 100 0 74,8 0,12
600 100 0 95,9 0,01
620 100 0 99,0 0,001

Tabla #2 en esta tabla se registraron los datos obtenidos a través de la construcción de

la curva de calibración de rojo de fenol
MEDIO ÁCIDO MEDIO ALCALINO
TUBO CONC. (C2) ABS. (A) CONC. (C2) ABS. (A)
1 0 0.0
2 1,23 0,171
3 2,22 0,040
 DISCUSIÓN

Por medio del experimento y conociendo la teoría del método de la espectrofotometría se

puede decir que se obtuvieron varios momentos de absorbencia o de transmitancia, dado los
valores sensibles en las lecturas, teniendo en cuenta que en algunos casos los valores pueden
mostrar cambios bruscos o pueden existir errores en las lecturas.

El espectrofotométrico es el resultado de utilizar el espectrofotómetro como instrumento que

permite comparar la radiación absorbida o transmitida que contiene una cantidad
desconocida de soluto y una que contiene una cantidad conocida de la misma sustancia

CONCLUSIÓN

Gracias a la utilización del espectrofotómetro pudieron ser hallados los valores de la

transmitancia y la absorbancia, teniendo en cuenta que los valores de la transmitancia se
hallaron en primer lugar. Para hallar los valores de la absorbancia se utilizó la formula (A =
2 – log %T). La utilización del espectrofotómetro permitió determinar que los valores de
absorbancia y transmitancia no son proporcionales a la longitud de ondas, más los valores
entre estas si lo so, podría decirse que son inversamente proporcionales entre sí, ya que, a
mayor transmitancia, menor absorbancia y viceversa.

BIBLIOGRAFÍA

Análisis químico cuantitativo, Daniel C. Harris, Pág. 428, Fundamentos de

espectrofotometría. 3ª Edición.

Métodos ópticos de análisis, Eugene D. Olsen, pág. 76, Editorial Reverte.

Química analítica moderna, W. F. Pickering.

Estadísticas en el laboratorio clínico, aplicaciones al control de calidad y valores de

referencia. Roy N. Barnett, pág. 128, editorial Reverté,1983