IDENTIFICACIÓN BACTERIANA

Dra. Yhosseline Banegas Terrazas

Bioquímica - Microbióloga
TINCIÓN
GRAM

Tiñe (+) Mordiente Elimina exceso Tiñe (-)

TINCIÓN
ZIEHL
Fucsina fenicada
NEELSEN
PEQUEÑOS M.O.
Forman: POBLACIONES Crecen como: CULTIVOS
Poca información
 TEMPERATURA

ACIDEZ O GRADO DE
ALCALINIDAD HUMEDAD

MEDIO

NUTRIENTES Y
PRESIÓN DE
FACTORES DE
OXÍGENO
CRECIMIENTO
KIRBY
BAUER
 FLORA NORMAL FLORA NORMAL MICROORGANISMOS
INTESTINO DELGADO INTESTINO GRUESO PATÓGENOS
Estreptococos Enterobacterias E. coli enteropatógena
Lactobacilos Bacteroides E. coli enteroinvasiva
Shigella
Salmonella
 Tomar 2 hisopos, introducir en el
Recipiente estéril boca ancha de plástico recto (2cm) rotar y retirar.
(2 horas a T° amb o en Cary Blair). Los niños en pañal (al revés).
 EXAMEN DIRECTO
P • Observar al microscopio en búsqueda de parásitos, leucocitos,
R eritrocitos.
I
M TINCIÓN DE GRAM
E • Evaluar flora intestinal
R
- CULTIVO O SIEMBRA
D
Í • Partes mucosas, sanguinolentas tomar una porción con asa (solfis) e
A inocular en caja de Mac Conkey y SS.
• Estriar en un extremo, quemar asa y distribuir el inóculo.
• Tomar 1 gramo de heces e inocular en 10 ml de caldo selenito.
• Incubar 18 a 24 horas a 35°C.
 Después de 24 horas buscar colonias sospechosas de:
Salmonella Shigella E. Coli enteropatógenas
S SS: colonias translúcidas Mac Conkey y SS: Mac Conkey: colonias
E con punto negro (lactosa translucidas (lactosa rosadas y opacas (lactosa
G negativa, productora de negativa) positiva)
U SH2).
N
D
O
-
D
Í
Elegir una colonia de cada tipo del medio en que hubo desarrollo y sembrar en TSI,
A
Citrato, Urea, Citrato y S.I.M. (Galería bioquímica).

Tomar una asada del caldo inoculado el día anterior y sembrar en otro SS.
 LECTURA
T • Leer las pruebas bioquímicas de las bacterias inoculadas el día anterior
E (utilizando las tablas de identificación de Enterobacterias).
R
C SEROLOGÍA
E
• Realizar la serología en caso de sospecha de una bacteria enteropatógena.
R
-
D
ANTIBIOGRAMA
Í • Realizar antibiograma de la bacteria enteropatógena identificada por
A serología previamente.
• Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae, Enterobacter y Serratias
flora normal por lo tanto no se realiza Antibiograma, a menos que estén
solas en pacientes hospitalizados.
MICROORGANISMOS COMENSALES MICROORGANISMOS PRODUCTORES
DE URETRA DE INFECCIONES URINARIAS
Staphylococcus epidermidis Escherichia coli
Streptococcus viridans Proteus mirabilis
Corynebacterium sp. Proteus vulgaris
Enterococcus sp. Klebsiella sp.
 Primer orina de la
mañana.
Lavar genitales con
agua y jabón, secar con
toalla.
Colocar tapón vaginal.
Desechar el primer
chorro, colocar en
frasco el chorro medio.
En refrigerador hasta 4
CHORRO MEDIO horas.
 Inmediato al recambio.
Pinzar a 10 cm del
meato por 1 a 2 horas.
Desinfectar con yodo
povidona al 10% a 3-4
cm por encima de la
pinza.
Extraer con punción
(jeringa).
Colocar la orina en
SONSA PINZADA frasco estéril.
 Con rigurosa asepsia.

Previa desinfección y
anestesia local

Se punciona la sínfisis
pubiana, en la línea
media, en posición
decúbito supino, con
Cuando hay recuentos
jeringa de 10 ml calibre
bajos o nulos y
clínica, repetidos. 19
 En los lactantes que no
pueden colaborar en la
obtención de muestras,
se utiliza bolsa
colectora estéril.

Lavar con agua y jabón

neutro el área genital,
dejar secar y adherir la
bolsa.

BOLSA COLECTORA Retirarla de inmediato

ESTÉRIL después de la
obtención de orina.
 EXAMEN DIRECTO
P • Centrifugar 10 ml de orina, desechar el sobrenadante y con el
R sedimento realizar un examen microscópico.
I
M TINCIÓN DE GRAM
E • Con el sedimento realizar un extendido para tinción de Gram.
R
-
D
CULTIVO O SIEMBRA
Í • Con un asa bacteriológica calibrada tomar el volumen de orina de 10 ul
A o 1 ul, sembrar en agar CLED haciendo una estría vertical en el centro y
luego estriar en forma horizontal.
• Sembrar en Mac conkey
• Incubar a 37°C durante 18 a 24 horas.
 Observar el agar CLED (hacer
S el recuento tomando en Realizar pruebas de identificación
E cuenta el volumen de orina para Enterobacterias.
G sembrado).
U
N Exprese el resultado: UFC
D ATB
N° de colonias x 100 (10ul)
O N° de colonias x 1000 (1ul)
-
D Verificar e identificar en las
Gram, y si son CG(+) realizar
Í colonias: forma, tamaño,
color y aspecto.
pruebas correspondientes.
A
 LECTURA
T
E • Leer las pruebas bioquímicas de las bacterias inoculadas
R el día anterior tanto para Cocos Gram Positivo como para
C
E Bacilos Gram Negativo (utilizar las tablas de identificación
R de Enterobacterias).
-
D ANTIBIOGRAMA
Í
A • Realizar la lectura del Antibiograma, anotando el
diámetro de los halos formados alrededor de los discos.
• Realizar el informa respectivo de los UROCULTIVOS.
INFECCIÓN URINARIA:
Kass, Sanford, Mac Donal  Presencia de infección urinaria  Recuento > 100.000 UFC/ml de muestra (segundo
chorro-primer orina-paciente sintomático)

PRESENCIA DE INFECCIÓN SI:

Orina obtenida con menos de 3 horas de retención.
Pacientes que hayan terminado recientemente terapia antimicrobiana.
Pacientes con frecuentes recidivas: <10000 = contaminación, EXCEPTO:

a) Muestras obtenidas por punción suprapúbica, cualquier número de colonias que crezca se considerará
cultivo positivo.

b) En control de tratamientos para infección urinaria, siempre que la muestra hubiese sido obtenida
asépticamente.

Si hay 2 tipos de colonias  CONTAMINACIÓN  solicitar nueva muestra.

Si el resultado se repite y los pacientes estuvieron hospitalizados o son inmunosuprimidos,
considerar ambos microorganismos y realizar por separado ANTIBIOGRAMA.
FLORA NORMAL EN LA INFANCIA FLORA NORMAL EN LA MENARCA
(pH 6.5 – 7) (pH 4.5)
Staphylococcus Lactobacilos
Streptococcus Difteroides
Difteroides Streptococcus
Flora anaerobia Staphylococcus
Anaerobios (Peptococcus y bacteroides)
El flujo genital patológico es provocado por la acción de diferentes microorganismos que
pueden ser de transmisión sexual o de flora endógena:

VAGINA UTERO Y TROMPAS URETRA GENITALES

(vaginitis) (cervicitis, (uretritis) EXTERNOS
salpingitis) (úlceras)
Gardnerella Neisseria Neisseria Treponema
vaginalis gonorrhoeae gonorrhoeae pallidum
Enterobacterias Chlamydia Chlamydia Haemophilus
(niñas) trachomatis trachomatis ducreyi
Ureaplasma Chlamydia
urealyticum trachomatis
SECRECIÓN VAGINAL
 Observar prepucio en busca de
lesiones, manchas, etc.

Introducir hisopo en uretra,

sembrar en AS, Amc, TM y hacer
2 extendidos para Gram.

Cuando no hay secreción se

solicita al paciente hacer masaje
de arriba hacia abajo en el
órgano genital para obtener
secreción.
SECRECIÓN URETRAL
Si no hay solicitar los primeros 5
ml de la primer orina de la
mañana.
 EXAMEN DE GOTA EN FRESCO
P • Tomar una gota del solfis entre porta y cubre, evitando burbujas.
R
I PRUEBA CON KOH 10%
M • Colocar 3 gotas de KOH al 10% en el tubo que contiene la muestra, taparlo, agitarlo y
E esperar 15 segundos. Retirar la tapa.  olor a pescado  Gardnerella vaginalis
R
- TINCIÓN DE GRAM
D • Buscar diplococos Gram Negativos intra y extracelulares, cocobacilos Gram Negativos,
Í células guía, Cocos Gram Positivo, Bacilos Gram Negativo y Bacilos Gram Positivo.
A
CULTIVO O SIEMBRA
• Estriar las muestras depositadas en los medios de cultivo: Agar Sangre, Agar Thayer
Martin, Agar Mac Conkey, Agar Sabouraud. Colocar en microaerofilia a 35 °C.
S Buscar en Thayer Martin colinas pequeñas, blanco
E grisáceas, transparentes, típicas de Neisseria
G gonorrhoeae, si lo son hacer Gram, Oxidasa, etc.
U
N
D ATB
O
-
En agar sangre, buscar colonias pequeñas, grises,
D
circulares con hemólisis sospechosas de Gardnerella
Í
vaginalis, si lo son hacer tinción, Oxidasa, Catalasa.
A
Buscar también CGP, BGN, etc.
 LECTURA
T
E
• Leer las pruebas bioquímicas de las bacterias inoculadas el
R día anterior e informar.
C
E CARACTERÍSTICAS DEL CULTIVO
R
- • Secreción amarillenta, espumosa, mal oliente
D Gardnerella vaginalis.
Í
A • Secreción blanco amarillenta, abundantes
Neisseria gonorrhoeae
• Úlcera en pene de bordes definidos (chancro duro)
herpes genital (Treponema pallidum).
 FLORA NORMAL PATÓGENOS

No existe flora normal Streptococcus agalactiae

Listeria monocytogenes
Streptococcus pneumoniae
Neisseria meningitidis
 La realiza un médico con experiencia en
punción lumbar.

Paciente en posición fetal, con rodillas

encogidas hacia el abdomen y la
barbilla pegada al tórax.

Se desinfecta con alcohol al 70%, luego

con yodopovidona.

Se introduce aguja en espacio

subaracnoideo entre 3ra y 4ta vértebra
lumbar.

ESPACIO Obtener 5 a 10 ml y recibir en 3 tubos:

SUBARACNOIDEO 1er tubo  Estudio bioquímico
2do tubo  estudio microbiológico.
3er tubo  investigación de células.
 RECUENTO CELULAR
• Separar una alícuota.
P
R SIEMBRA Y TINCIÓN
I • Si es turbio sembrar (AS, AC, BHI) y colocar una gota en portaobjetos para la tinción de
M Gram, otra para Ziehl, otra para Giemsa.
E • Si es límpido centrifugar (15 min-1500 r.p.m.) y sembrar sedimento, colocar una gota de
R sedimento en portaobjetos y teñir con Gram, otro para Ziehl Neelsen y Giemsa.
- • Incubar a 35°C 48 a 72 horas.
D • Si la punción fue traumática solo se verá sangre en el primer o segundo frasco.
Í PRUEBAS QUÍMICAS
A
• Utilizar el sobrenadante.

OTROS
• Detección de antígenos, tinta china (Criptococcus neoformans), etc.
 IDENTIFICACIÓN
S • Una vez aislado el microorganismo se procede a la identificación del
E mismo.
G
U ANTIBIOGRAMA
N
• Si hay crecimiento se procede a realizar antibiograma.
D
O
- CARACTERÍSTICAS
D
• Glucosa normal: 50-80 mg/dL
Í
A • Proteínas normal: 15-45 mg/dL
• Hipoglucorraquia+hiperproteinorraquia = Proceso infeccioso
bacteriano.
 FLORA NORMAL PATÓGENOS

Streptococcus viridans Streptococcus B-hemolíticos (pyogenes)

Staphylococcus sp. Bordetella pertussis (coqueluche)
Haemophilus influenzae Haemophilus influenzae (epiglotitis)
Streptococcus sp. Borrelia vincenti y F. nucleatum
 Realizar asepsia de cavidad oral
(enjuague con agua).

Enfermo  posición cómoda, hacer

pronunciar la letra A.

Con bajalenguas deprimir la lengua

para visualizar bien.

Introducir el hisopo sin tocar úvula ni

lengua.

Frotar faringe posterior y amígdalas,

empapando el hisopo.
HISOPADO FARÍNGEO
Difteria buscar pseudomembrana y
arrancar con pinza.
P SIEMBRA
R
I • Agar Sangre, Agar Chocolate, Agar EMB o Mac
M Conckey. Incubar a 36°C (CO2-10%).
E
R
- TINCIÓN GRAM
D
Í • Colorear un portaobjetos y buscar:
A • Leucocitos, CG(+) en cadenas (Streptococcus),
espiroquetas Gram (-), BG(-), BG(+)= Corynebacterium
diphteriae.
 IDENTIFICACIÓN
S
• En Agar Sangre  colonias pequeñas, transparentes, secas,
E
G
hemólisis beta (Streptococcus pyogenes) BACITRACINA
U • En Agar MacConckey  BG(-)GALERÍA BIOQUÍMICA + ATB
N • En Agar Chocolate  colonias de tamaño regular, planas,
D amarillentas que se deslizan al tocarlas y salen por completo
O Haemophilus influenzae (FACTORES); buscar también DCG(+),
- colonias medianas, lisas, oxidasa positiva Neisseria.
D
Í ANTIBIOGRAMA
A
• Si hay crecimiento se procede a realizar antibiograma.
 LECTURA
T • Leer las pruebas bioquímicas y el antibiograma si se hubiesen realizado.
E
R NOTAS
C
E • En caso de identificarse Pseudomonas, investigar si el paciente está
R hospitalizado y si hay algún brote en la sala.
- • Leer la prueba de Bacitracina. En caso de ser sensible, se informa
D Streptococcus pyogenes y no se realiza ATB, por ser la Penicilinas de
Í elección.
A
• Si se identifica Haemophilus influenzae informar como comensal de
paciente asintomático. A menos que hayan signos de epiglotitis o se
esté pidiendo investigarlo.
 FLORA NORMAL PATÓGENOS

No existe flora normal Streptococcus pneumoniae

Staphylococcus aureus
Haemophilus influenzae
Klebsiella pneumoniae (H)
Pseudomonas aeruginosa (H)
 ELIMINACIÓN NATURAL DEL ESPUTO

Lavarse la boca con bicarbonato de sodio al

1% (para retirar flora comensal).
Explicarle que debe expulsar la expectoración
con tos profunda, SALIVA no sirve.
Tomar la muestra en las primeras horas de la
mañana por su acumulación en la noche.
Usar recipiente estéril boca ancha y tapa
rosca  llevar de inmediato.

INDUCIDO
Por aerosol con solución de ClNa 15% y
glicerol 10% por 10 min.  Efecto tusígeno
ESPUTO intenso (ACUOSO).

ASPIRADO GÁSTRICO

Con sonda por aspiración.

P
SIEMBRA
R • Previa esterilización del ansa tomar la porción más purulenta o
I sanguinolenta de la muestra y sembrar en Agar Sangre, Agar
M
E
Chocolate, Agar Mac Conkey e incubar por 24 horas.
R
-
TINCIÓN GRAM
D
• Realizar 2 extendidos, 1 para tinción de Gram y otra para Ziehl
Í
A
Neelsen.
• Buscar leucocitos e informar la cantidad encontrada, CBG(-) y
encapsulados (Haemophilus influenzae), DCG(+) con cápsula
(Streptococcus pneumoniae), CG(+) en racimos (Staphylococcus).
 IDENTIFICACIÓN
S
E • Streptococcus pneumoniae  colonias pequeñas,
G transparentes, planas, alfa hemolíticas  OPTOQUINA y
U OXACILINA.
N
D • Pseudomonas  colonias transparentes o verduzcas,
O oxidasa, etc. De ser oxidasa negativa seguir procedimiento
- para Enterobacterias y realizar Antibiograma.
D
Í • Haemophilus influenzae  colonias medianas, planas que
A se recorren y salen completas. Si son oxidasa positiva y BGN
continuar la identificación.
 LECTURA
T • La observación de la tinción de Gram permite ver si es esputo o
E saliva.
R
C
• De ser esputo  se observan más de 10 leucocitos por campo,
E escaso número de bacterias y células epiteliales. Si no cumple estos
R criterios se debe rechazar y pedir nueva muestra.
-
D INFORME
Í
• Informar como “desarrollo de flora normal” si no hay desarrollo de
A
ninguna bacteria patógena.
• Si en la tinción de Ziehl Neelsen se observan B.A.A.R. debe
informarse de inmediato al médico.
 FLORA NORMAL PATÓGENOS

No existe flora normal. Staphylococcus aureus

La sangre es estéril. Klebsiella pneumoniae
Escherichia coli
Pseudomonas aeruginosa
Acinetobacter sp.
 MEJOR MOMENTO
2 horas a 30 minutos antes del pico febril.
Pero como no se puede predecir el momento
del pico se recomienda obtener de forma
arbitraria tres hemocultivos en 24 horas (cada
30 a 90 minutos).

VOLUMEN DE SANGRE
5 a 10 ml
Depende de la edad del paciente, se
recomienda:

5 ml niños.
1-2 ml lactantes.
HEMOCULTIVO
SIEMBRA
• Realizar subcultivos ciegos dentro de 24 horas de incubación
previa homogeneizada, desinfectar frasco con alcohol al 70%.
Repetir el día 5 y 7.
• Extraer sangre, inocular una gota del hemocultivoen Agar Sangre,
Mac Conckey, hacer frotis y tinción.
LECTURA
• Observar crecimiento de las colonias.
• Cuando se ha confirmado crecimiento bacteriano por sulbcultivo
se realiza identificación y antibiograma.