U A C J

Practica #1

Cultivo e identificación de los hongos

Microbilogía II L-1

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 PRÁCTICA # 1
CULTIVO E IDENTIFICACIÓN DE LOS HONGOS

OBJETIVO DE LA PRÁCTICA
Aprender a determinar las características macro y microscópicas más sobresalientes de algunos
grupos de hongos (mohos y levaduras) patógenos humanos y comprobar su alta distribución en
el ambiente.

INTRODUCCIÓN

Dentro de la división Eukaria se encuentra el reino Fungi que incluye a los hongos. El cuerpo
de los hongos se denomina talo, ya sea unicelular o pluricelular. Los hongos se dividen según
su morfología:
a) hongos filamentosos formados por hifas (pluricelulares), a éstos se les conoce como mohos
y están formados por hifas microscópicas que consisten de filamentos tubulares ramificados,
con un crecimiento apical; las hifas pueden ser cenocíticas (sin divisiones y multinucleadas) o
tabicados (divididas en segmentos). La masa de hifas constituye el micelio. En las hifas se
producen diferentes clases de esporas reproductivas, tales como esporas asexuales (conidios,
esporangiosporas) o esporas sexuales, como las ascosporas y las basidiosporas.
b) las levaduras son unicelulares, se reproducen asexualmente por blastoconidios (gemación).
Dimorfismo es la condición en la que un mismo hongo puede exhibir ya sea la forma de
levadura o la forma de hifa, dependiendo de las condiciones de crecimiento, sea parásito o
saprófito.
La presencia / ausencia de conidios y su tamaño, forma y ubicación son las características
principales utilizadas en el laboratorio para identificar las especies de hongos en muestras
clínicas.

CLASIFICACIÓN DE LOS HONGOS HUMANOS

Los hongos patógenos humanos se encuentran en tres divisiones dentro del reino Fingi:
Zygomycota (zigomicetos), Ascomycota (ascomicetos) y Basidiomycota (basidiomicetos). Los
Zigomicetos se caracterizan por poseer micelios cenocíticos no-tabicados y reproducción
sexual mediante zigosporas. Los Zigomicetos del orden Mucorales causan infecciones graves,

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de rápida evolución y frecuentemente fulminantes en pacientes inmunodeprimidos. Las
especies más frecuentes pertenecen al género Rhizopus y a Mucor.
Los Ascomicetos se caracterizan por tener hifas tabicadas y producir ascosporas endógenas
en ascas. Pueden ser unicelulares o pluricelulares. Son la división más grande dentro del reino
de los hongos y también la que cuenta con un mayor número de patógenos humanos, entre
ellos Candida albicans y Aspergillus sp., últimamente Fusarium y Scedosporium.
Los Basidiomicetos se caracterizan por producir basidiosporas en basidios, como resultado de
una reproducción sexual. A este grupo pertenecen las setas comestibles. El género
Cryptococcus se compone de organismos unicelulares encapsulados, responsables de la
criptococosis que es una micosis sistémica.

CLASIFICACION DE LOS HONGOS, SEGÚN EL AREA ANATÓMICA AFECTADA

Uno de los métodos más comunes de clasificar las micosis humanas, se basa en la
localización del hongo en el huésped, lo que refleja en parte su variable grado de severidad y
su grado de invasividad. De acuerdo con este tipo de enfoque, las micosis se consideran
superficiales (cutáneas: piel, uñas y cabello), subcutáneas (capas superiores de la piel, los
huesos, los tendones y los músculos) y profundas (son sistémicas, causadas por hongos que
infectan pulmón y se diseminan a todo el cuerpo).
Los hongos patógenos oportunistas que normalmente no están asociados como patógenos en
personas inmunocompetentes, pueden causar infecciones severas en las personas
inmunodeficientes. Así también, llegan a producir enfermedades que varían en su gravedad,
pudiendo asociarse con una infección superficial de la piel o las mucosas hasta llegar a
producir una afectación sistémica con afectación de múltiples órganos internos. Ejemplos
comunes de hongos oportunistas son Candida albicans, Aspergillus, Cryptococcus y
Pneumocystis carinii.

IDENTIFICACIÓN DE LOS HONGOS FILAMENTOSOS (MOHOS):

Los hongos filamentosos presentan requerimientos nutricionales muy simples, pero su
desarrollo es más lento que el de las bacterias, necesitando varios días de incubación. Las
características más empleadas para la identificación de los hongos filamentosos (mohos) son: el
tipo de talo, la morfología macroscópica del micelio, micelio aéreo y profundo, es decir las
características coloniales, tanto de frente como en el reverso. Las colonias de hifas son

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macroscópicas, de variados aspectos y colores (algodonoso, aterciopelado, polvoso. La
morfología microscópica del micelio se refiere al tipo de hifas, estructura y modo de formación
del cuerpo reproductivo sexual, tipo de esporas: forma, tamaño, aspecto externo, agrupación,
número de células, flagelos.
Cuando el crecimiento detectado corresponda a un hongo filamentoso, la identificación se
debe hacer por el examen macroscópico de la colonia: forma, color, textura, velocidad de
crecimiento y reverso. Si el hongo tiene abundantes formas de reproducción se emplea la
técnica del scotch o cinta adhesiva transparente, que consiste en tocar la superficie de la
colonia con la cinta adhesiva y colocarla sobre un porta, en el que se ha depositado una gota
de azul de lactofenol y observar al microscopio. (Impronta)
Cuando no se puede conseguir una buena observación de las formas de reproducción por las
técnicas anteriores, es necesario hacer un microcultivo. Esta técnica consiste en depositar
sobre un porta un trozo de agar de Sabouraud, o del medio recomendado según el género de
hongo filamentoso que se presume, de 2 cm2 de superficie aproximadamente, en cuyos
extremos se inocula el hongo problema (en profundidad). Posteriormente se le coloca un
cubre encima y se incuba en cámara húmeda a 25ºC hasta observar crecimiento.
Los criterios de identificación son fundamentalmente morfológicos basados en la presencia de
estructuras de reproducción sexual, estructuras de reproducción asexual y características
especiales de las hifas, cuya descripción pueden ser consultados en atlas micológicos. En
ocasiones, la identifi-cación se complementa con pruebas bioquímicas, como la investigación
de la ureasa, que diferencia T. mentagrophytes (positivo) de T. rubrum (negativo).
Todavía limitada a determinados laboratorios especializados, pero en continuo desarrollo, está
la identificación molecular de los aislamientos fúngicos, basada en los mapas de restricción de
fragmentos del operón ribosomal, digeridos con un panel de enzimas de restricción, que
permite la elaboración de árboles filogenéticos.

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 Aspergillus Penicilium levaduras

IDENTIFICACIÓN DE LEVADURAS
Forman colonias semejantes a las bacterianas. Para la identificación de levaduras se requiere
conocer además de la morfología, la determinación de características fisiológicas y bioquímicas,
especialmente su acción sobre azúcares. La identificación de la especie de toda levadura
aislada en sangre o en cualquier otro líquido corporal estéril está plenamente justificada.
También es conveniente la identificación de las levaduras de otras procedencias, sobre todo
cuando ocurre de forma reiterada en diferentes muestras clínicas del mismo paciente, y
siempre que se asuma que se trata de un organismo responsable de patología.
La mayoría de los organismos levaduriformes crecen fácilmente en un gran número de medios
de cultivo usados rutinariamente en el laboratorio de microbiología (agar sangre, agar
chocolate, agar Cled, etc.). Sin embargo, el AGS, con o sin antibióticos añadidos, es el medio
de aislamiento por excelencia para la identificación de levaduras. En el medio AGS las
colonias de levaduras suelen ser completas, ligeramente abombadas o planas, de
consistencia cerosa, lisa o rugosa, con olor dulzón agradable, volviéndose más pastosas a
medida que la colonia envejece. Por lo general, las colonias de levaduras no desarrollan
micelio aéreo, aunque en ocasiones pueden aparecer prolongaciones aracneiformes en la
periferia de las colonias.
Identificación convencional: Si se visualiza crecimiento en cualquier medio que sugiera
posibilidad de levaduras, se realiza un frotis en fresco. Si en el mismo se observan levaduras,
se procede a la identificación mediante subcultivo a un medio cromogénico, Cromocandida. En

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el caso que no se trate de ninguna de las especies que este medio identifica, se procede a
hacer la identificación mediante alguno de los métodos comerciales. La identificación
bioquímica debe completarse con una identificación morfológica mediante un subcultivo al
medio agar harina de maíz con o sin Tween 80. Si se observa un micelio aéreo definido, debe
considerarse la posibilidad de que se trate de un hongo dimórfico o de ciertas especies de
levaduras que pueden formar micelio verdadero como Geotrichum, Dipodascus o
Trichosporon. Una colonia de aspecto y consistencia mucoide sugiere la formación de
cápsulas y puede ser el paso inicial para la identificación de C. neoformans. Las colo-nias de
color rojo–anaranjado o naranja, de aspecto cremoso o rugoso son características de las es-
pecies del género Rhodotorula ( rhodo: rojo), color que manifiesta esta levadura por su riqueza
en carotenoides.
Ideas secundarias
 Los hongos crecen como levaduras o mohos; estos últimos constituyen la mayor
diversidad. Algunas especies pueden crecer ya sea como levadura o en fase de moho,
lo que depende de las condiciones ambientales. A éstos se les conoce como hongos
dimórficos. Varios patógenos para los humanos muestran dimorfismo; crecen en forma
de moho en el medio ambiente y en medios de cultivo a temperatura ambiental, pero se
convierten en levaduras o en alguna otra forma en tejidos infectados.
 Los hongos pueden cultivarse con el empleo de métodos similares a los utilizados para
aislar bacterias. El crecimiento ocurre con facilidad en medios bacteriológicos
enriquecidos utilizados a menudo en laboratorios clínicos (p. ej., agar chocolate y agar
sangre). Sin embargo, muchos cultivos de hongos requieren días a semanas de
incubación para lograr el crecimiento inicial; las bacterias presentes en la muestra
crecen con mayor rapidez y pueden interferir con el aislamiento de un hongo de
crecimiento lento. Por tanto, los procedimientos de cultivo en la micología diagnóstica
se diseñan para favorecer el crecimiento de hongos más que de bacterias y para
permitir la incubación por el tiempo suficiente para aislar las cepas de crecimiento lento.
 El medio utilizado más a menudo para el cultivo de hongos es el agar de Sabouraud,
que contiene sólo glucosa y peptonas como nutrientes. Tiene un pH de 5.6, que es
óptimo para el crecimiento de dermatofitos y satisfactorio para el crecimiento de otros
hongos. La mayor parte de las bacterias no proliferan o muestran proliferación
inadecuada en el agar de Sabouraud. Se han utilizado diversos medios de cultivo,

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 muchos de los cuales tienen como base el agar de Sabouraud o la adición de tejido
encefálico-cardiaco. Una vez que se ha aislado el hongo, los procedimientos de
identificación dependen de si el hongo es una levadura o un moho. Las levaduras se
identifican por pruebas bioquímicas similares a las utilizadas para bacterias, lo que
incluye algunas que son idénticas (p. ej., producción de ureasa). La capacidad de
formar seudohifas también se utiliza desde el punto de vista taxonómico entre las
levaduras. Los mohos se identifican más a menudo por la morfología de sus conidias y
sus conidióforos.

MATERIALES Y MÉTODOS
I. AISLAMIENTO DE HONGOS DE DIFERENTES MATERIALES
Mantenga abierta una caja de Sabouraud-agar-penicilina en el jardín, en alguna habitación, o en
cualquier otro lugar, durante 15 min. Después de este tiempo tápela e incúbela a temperatura
ambiente o a 28oC, durante una semana, hasta observar el desarrollo de colonias de hongos,
las cuales pueden mostrar diferentes colores, con aspecto algodonoso, aterciopelado, velloso,
polvoso, granuloso, etc.
1. En otra caja espolvoree unas cuantas partículas de polvo del jardín e incube igual.
2. Guarde en una bolsa de plástico unas fruta y verduras, incube igual y revise
periódicamente, hasta observar el desarrollo de colonias de hongos en los vegetales.
3. En una caja Petri coloque tierra del jardín e introduzca verticalmente hasta la mitad, varias
uñas y pequeños manojos de cabellos. Humedezca la tierra con agua destilada. Incube
igual, por varios días. Vigile diario y vuelva a regar la tierra con agua destilada, para impedir
que se seque, hasta observar desarrollo de hongos, mismos que colonizarán las uñas y
pelos. Guarde este cultivo de tierra, para observarlo en la siguiente práctica referente a
Micosis Superficiales (no se utilizará en esta práctica).
4. Compare las colonias desarrolladas entre sí, tanto en los medios de cultivo como en los
vegetales. Note las diferencias de la morfología colonial. Haga dibujos.

II. IDENTIFICACIÓN DE LOS HONGOS AL MICROSCOPIO

1. Coloque una gota de lactofenol en el centro de un portaobjetos. Enseguida corte un
fragmento de cinta adhesiva transparente del largo de un portaobjetos y ayudándose con un
lápiz, doble la cinta a la mitad con la parte adhesiva hacia afuera sujetando con los dedos los
dos extremos. Adhiera la parte del doblez sobre la colonia del hongo, haciendo una impronta,
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enseguida coloque la cinta sobre el portaobjetos, haciendo que coincida la muestra de la
colonia del hongo con la gota de lactofenol, de tal forma que la cinta actúe como cubreobjetos.
Observe al microscopio a 10 y a 40 X.
2. Identifique los hongos hasta género, mediante una comparación de las hifas y esporas
observadas al microscopio, con los claves de los libros. Haga dibujos detallados, con los
nombres de las estructuras del hongo y el nombre del género identificado.
3. A partir de levadura para pan o cerveza, haga observaciones entre porta y cubre, en una
gota de lactofenol. Haga dibujos.
Diagrama

RESULTADOS

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Trichophyton

Aspecto de la colonia: las

colonias son algodonosas, con el
tiempo toman un aspecto
aterciopelado y pulverulento, de
color blanquecino a amarillento o
rojo

Pencillium

Aspecto de la colonia: su aspecto

era puntual y circular con tubos,
parecido a una planta
floreciendo. Son de crecimiento
rápido, filamentosas y vellosas,
lanosas o de textura algodonosa.

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 Aspecto de la colonia: colonias
de aspecto algodonoso de
diverso tamaño y color.

Aspecto de la colonia: se
formaron colonias elevadas,
opacas, grandes y bien definidas

DISCUSIÓN

Los hongos que se encontraron en los cultivos del aislamiento de hongos ambientales tienen
una amplia distribución en la naturaleza, por ejemplo:

Trichophyton, se puede encontrar en el suelo y en las plantas herbáceas en descomposición.

Penicillium, sus hábitats naturales son el suelo, la vegetación caída y el aire

En alimentos ácidos y en los de baja actividad de agua, los hongos filamentosos y las
levaduras crecen con mayor rapidez que las bacterias provocando importantes pérdidas
por alteración de frutas frescas, vegetales, quesos, productos derivados de los cereales y

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encurtidos, así como en los alimentos congelados y en los deshidratados cuyo
almacenamiento se realiza en condiciones inadecuadas.

En alimentos no ácidos que conservan humedad, los hongos filamentosos y las levaduras
crecen más lentamente que las bacterias y por ello pocas veces determinan problemas en
tales alimentos.

Agar Diclorán Rosa de Bengala con Cloranfenicol (DRBC)

El agar DRBC es un medio de cultivo selectivo para el recuento de hongos filamentosos y

levaduras en alimentos
- La combinación de diclorán y rosa de bengala restringe notablemente el desarrollo
colonial de los hongos filamentosos de esta forma se reprime que el crecimiento
exacerbado de algunas colonias enmascara a las más lentas y, al mismo tiempo, facilita el
recuento. La presencia de cloranfenicol y el reducido pH (5,6) impide el crecimiento de las
bacterias.

El hongo identificado en la bebida alcohólica para ser más precioso una cerveza, es una
levaduriforme, que esta pertenece a ejemplos de Ascomycota, este contiene más especies
que se encuentran en el pan.

Una de las practicas con la que se comparo mencionaban que durante el procedimiento
presentaron diversos factores que causo una interrupción en el correcto crecimiento del
hongo, por lo cual se debe de ser cuidadoso y aplicar bien los fundamentos de las técnicas
a utilizar para poder lograr un correcto desarrollo.

CONCLUSIÓN

El objetivo establecido de esta práctica es poder saber identificar y determinar las

características tanto microscópicas como macroscópicas mas importantes de los grupos de
hongos que causan alguna patología en los humanos, esta fue logrado. Es importante el
estudio de la micología debido a la extensa gama de patologías que estos microrganismos
pueden causar daño a los humanos.

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Como se mencionaba, es delicado realizar el cultivo de los hongos, pues se debe de cuidar
de algunos factores que son muy importantes para el correcto desarrollo del hongo en el
agra, estos factores son los siguientes:
1. Nutrientes del material: El carbono y el nitrógeno son los principales elementos que
constituyen el micelio y el esporocarpo. Se debe de proporcionar la energía necesaria para
el crecimiento y el desarrollo.
2. Humedad: el agua en el sustrato es la principal fuente de agua que se necesita en el
cultivo. Un contenido adecuado de agua varía entre 65 y 75 % dependiendo el material del
sustrato.
3. Temperatura: la temperatura de preferencia para la etapa de incubación varía con el
tipo de hongo.
4. Oxígeno y dióxido de carbono: la falta de oxígeno provocará que el crecimiento del
micelio y de los esporocarpos sea pobre. En el caso de estos últimos, observaremos
malformaciones.
5. Iluminación: el micelio puede crecer bajo condiciones oscuras, mientras que los
esporocarpos, dependiendo nuevamente del tipo de hongo, no tiene mucha demanda de
iluminación. Sin embargo, se debe evitar una luz demasiado potente, como la solar, de
forma directa.
6. Valor de pH: el valor general del pH es de aproximadamente 5,5 y 6,5, pero no más de
7,0.
En conclusión, el estudio de la micología ha sido importante debido a las patologías que
puedan ocasionar, pero, no todo es malo, se ha estudiado como es que algunos cultivos
de hongos producían sustancias que interfieren en el crecimiento de las bacterias; es decir
se comportan como antibióticos. De estas observaciones surgió la penicilina.

Bibliografias

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+  J. Alexandro Bonifaz Trujillo. (2012). micología medica básica . México D.F.: McGraw
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+ Instituto Nacional de Seguridad e Higiene en el Trabajo. (2013). Trichophyton spp..
2013, de Instituto Nacional de Seguridad e Higiene en el Trabajo Sitio web:
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http://coli.usal.es/web/demos/demo_alteracion/RtoHongosLev/RtoHongosLev.html fruta

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