División de Ciencias de la Salud, Biológicas y Ambientales DCSBA

Alumno: Juan Pablo Cervantes Morales

Matricula: ES1421013091

Carrera: Ing. en Biotecnología

Profesora: Marcela Adriana Galicia Alcántara

Asignatura: Técnicas de laboratorio de biología

Evidencia de aprendizaje. Aplicación de reactivos y colorantes a

las biomoleculas.
Unidad: 4

Fecha de entrega: 23/marzo/2018

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Introducción.

El presente trabajo de investigación se hablara de los métodos de obtención de

muestras y coloración para microrganismos, células vegetales, células animales y
colorantes para biomoleculas, con el fin de obtener el conocimiento de la
aplicación de técnicas de laboratorio y aplicarlos para su estudio e investigación
en diversos campos de la biotecnología.
Para ello se utilizaran diversas operaciones y la utilización de herramientas y
equipos de laboratorio, de igual forma se utilizaran reactivos, técnicas para la
obtención de muestras y técnicas de tinción, lo cual nos permitirá un desarrollo
concreto de lo que queremos investigar.
En esta actividad básicamente se pretende, que como estudiante de biotecnología
tenga los conocimientos suficientes para la elaboración de una investigación,
aplicando ciertos métodos de trabajo y sobre todo la utilización de diversas
herramientas como materiales y aparatos de laboratorio y en su caso especial las
técnicas de coloración para una mejor visualización y detectar posibles
enfermedades ya sean de seres humanos, animales o plantas por decir algunas, o
el posible mejoramiento o modificación de microrganismos y células.
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1. Pasos para el proceso de tinción.

El proceso habitual para teñir una muestra consiste en fijarla de manera física o
química, la inclusión en parafina, secar y cortar finamente puede ser opcional.
Para montar un frotis se utiliza un portaobjetos nuevo o esterilizado, se limpia la
superficie con un algodón impregnado con alcohol puro. Para el frotis de la
muestra se hace un barrido o se coloca el corte en la superficie de otro
portaobjetos (se puede fijar con calor o dejar secar al aire); se aplica un colorante
en una charola o tina de tinción, se decolora con alcohol, se suministra otro
colorante o se lava el exceso con agua, dejando caer los residuos en latina, se fija
finalmente con calor o secado al aire y se monta para observarlo al microscopio
electrónico.

El proceso de tinción requiere llevar a cabo los siguientes pasos:

1. Elección de la muestra, ya sea célula, órgano, tejido.

2. Fijación física o química.
3. Inclusión en parafina, secado y corte fino.
4. Montaje de la muestra en el portaobjetos.
5. Fijarlo con calor.
6. Aplicar un colorante.
7. Lavarlo con agua.
8. Aplicar otro colorante de contraste o un mordiente.
9. Decolorarlo con alcohol puro (96%).
10. Secar al aire o con calor (opcional).
11. Montaje de muestra para observarla al microscopio electrónico.
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2. Obtención de muestras y colorantes para microorganismos.

Muestras de orina.
Técnica de recolección:
• Explicar el procedimiento al paciente incluyendo la técnica de asepsia.
• Rotular el frasco con el nombre completo del paciente, registro, fecha de
nacimiento, hora de recolección y cama.
• Desechar los primeros 5-10 mL en el inodoro, comenzar a recolectar la muestra
de orina subsecuente (orina del chorro medio).
• Recolectar 5-10 mL de orina.
• Eliminar el resto de la orina en el inodoro u orinal.
• Tapar perfectamente el frasco recolector para evitar que la orina se salga y
contamine.
• Enviar inmediatamente al laboratorio.

Para esta prueba se utilizara la técnica de tinción de Gram

Se necesitara:
 Portaobjetos.
 Agua destilada.
 Pipetas Pasteur, haza, mechero.
 Cristal violeta
 Lugol
 Alcohol acetona
 Safranina (u otra tinción de contraste)
Procedimiento de fijación.
Colocar una pequeña gota de agua destilada en el porta objetos (con pipeta por
ejemplo).
Re-supender muestra en el porta objetos. Secar al mechero.
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Procedimiento de tinción.
1. Se debe colocar cristal violeta cubriendo toda la muestra por 1 minuto.
2. Se lava con agua corriente.
3. Luego debe agregarse Lugol. Este debe aplicarse como el cristal violeta y
también debe cubrir la muestra por 1 minuto. Luego se lava con agua corriente.
4. El cubrir la muestra con alcohol acetona para decolorarla es el paso más crítico
del procedimiento. Este debe cubrir la muestra por el tiempo que puede ir de 15s a
30s según corresponda y la reacción debe ser detenida con el lavado con agua
corriente. El tiempo debe ser el mismo para todas las muestras.
5. El último paso consiste en agregar una tinción de contraste, para teñir las
bacterias que pierden el cristal violeta. Para esto se agrega safranina cubriendo la
muestra por 15s o por un minuto, dependiendo. Luego se lava con agua corriente
y se deja secar.
Resultados de microscopia:
Bacterias Gram positivas.
Corresponden a las bacterias que mantienen la coloración de cristal violeta
después del alcohol acetona, lo que les da un color violeta/morado.
Bacterias Gram negativas.
Corresponden a las bacterias que pierden la coloración del cristal violeta después
del alcohol acetona y se tiñen con el colorante de contraste (safranina), lo que les
da un color rosado/rojizo.
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3. Obtención de muestras y colorantes para células vegetales.

Muestras vegetales.
1.- Las muestras tienen que ser representativas del problema que se observe en
campo. Es importante seleccionar los órganos o partes de la planta que muestren
los síntomas característicos de diferentes estados o grados de desarrollo de la
enfermedad.
2.- Si las plantas son de gran tamaño, seleccione únicamente la parte o partes que
presenten el problema, esto es, hojas, partes del tallo, flores o raíces afectadas. Si
las plantas son pequeñas, seleccione dos o tres plantas completas. Enviar junto
con las muestras plantas o partes sanas que sirvan para comparar.
3.- Recoja la muestra cuando las plantas se encuentren sin humedad de lluvia o
rocío para evitar el desarrollo de hongos y bacterias.
4.- Revisar la presencia de cualquier alteración visible en la planta: lesiones,
agallas, grietas, tumores, chancros que pueda tener la raíz, el tronco o las ramas.
En el caso de que se observen enviar muestra.
5.-· Enviar la muestra lo más rápido posible al laboratorio.
6.- Identificar correctamente las muestras para evitar confusiones

Técnica de tinción para vegetales.

1. Separamos una de las hojas interna de la cebolla y desprendemos la fina
membrana que está adherida por su cara inferior cóncava.
2. El fragmento de membrana lo colocamos en un porta con unas gotas de agua.
3. Después de poner el porta sobre la cubeta de tinción añadimos el colorante que
hemos seleccionado (azul de metileno, safranina, verde de metilo acético, cristal
violeta, rojo neutro) durante 5 minutos, aproximadamente. Si vemos que se arruga
la preparación, estiramos el trozo de epidermis con ayuda de dos agujas
enmangadas. ¡No debe secarse la epidermis por falta de colorante o por
evaporación del mismo!
4. Con el frasco lavador bañamos la epidermis con agua abundante hasta que no
suelte colorante. Colocamos un cubre, evitando que se formen burbujas y
observamos al microscopio.
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4. Obtención de muestras y colorantes para células animales.

Órganos y tejidos.
La recolección de la muestra, se realiza con asepsia y máximo una hora después
de la muerte del animal.
1. Evitando topar el lugar de la lesión a muestrear, cortar trozos de tejido u órgano
afectado de un grosor no menor de 3x3 cm.
2. Para evitar contaminación y sangrado, sin topar el sitio de la lesión, sellar la
muestra flameándola directamente o utilizando una espátula previamente
flameada.
3. Depositar la muestra en un frasco estéril individual de boca ancha.
4. Para análisis histopatológico las muestras deben colocarse con formol al 10% y
enviarse al laboratorio en envases bien sellados e identificados.
5. En caso de análisis bacteriológico las muestras deben enviarse refrigeradas al
laboratorio. No utilizar formol.
Técnica de tinción para animales.
1. Raspa con cierta energía y sirviéndote de la espátula, la cara interna de la
muestra 2 o 3 veces.
2. Limpiar con alcohol el portaobjetos. Deposita el producto mucoide blanquecino
obtenido sobre un portaobjetos limpio.
3. Extienda uniformemente el producto obtenido, haciendo rodar la aguja
enmangada por el centro del portaobjetos
4. Calienta suavemente, haciendo pasar la parte de abajo del portaobjetos 3-4
veces, por la llama del mechero, hasta que la preparación quede completamente
seca.
5. Deposita unas gotas de orceina acética, cubriendo toda la extensión y deja que
actúe el colorante durante 5 minutos. Si empleas azul de metileno, el tiempo de
tinción será de 2 minutos.
6. Limpia, pasado el tiempo de tinción, utilizando agua y cuentagotas, la
preparación por los dos lados hasta que no destiña más.
7. Coloca suavemente el cubreobjetos.
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8. Seca con papel de filtro las dos caras del portaobjetos. Trata de arrastrar la
muestra con el papel
9. Observa al microscopio, enfocando en primer lugar con el objetivo de menor
aumento, hasta que localices una zona donde se encuentran células. Pasa a
mayores aumentos.

5. Colorantes para biomoléculas.

 Sudán III.
 Escarlata.
 Hematoxilina o carmín.
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Conclusiones.
En esta actividad de investigación, se pudo analizar diversas técnicas para la
obtención de muestras y técnicas de tinción para observación de coloración para
microrganismos, células vegetales, células animales y colorantes para
biomoleculas. En lo personal esta práctica me sirvió para tener un conocimiento
amplio de las actividades que se realizan en un laboratorio de biología y así poder
aplicar estos conocimientos en el ámbito profesional para la investigación o
estudio de diversas muestras.

Fuentes.
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marzo del 2018 de https://mmegias.webs.uvigo.es/6-tecnicas/1-proceso.php
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http://www.biblioteca.upibi.ipn.mx/Archivos/Material%20Didactico/Microbiología%2
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microbiológicas, Recuperado dehttp://iso9001.inr.gob.mx/Descargas/iso/doc/MOP-
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Pontificia Universidad Católica de Valparaíso, Procedimiento para la toma de
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T/03/BTLB_151217/U4/Unidad4.Usodecolorantesyreactivosenelprocesamientode
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