DINÁMICA DE LAS FUENTES DE INÓCULO E IDENTIFICACIÓN DEL AGENTE

CAUSAL DE LA ANTRACNOSIS (Colletotrichum sp) EN GUANÁBANA (Annona

muricata L.)

ADRIANA PAOLA LIZARAZO CARRILLO

UNIVERSIDAD FRANCISCO DE PAULA SANTADER

FACULTAD DE CIENCIAS AGRARIAS Y DEL AMBIENTE
PLAN DE ESTUDIOS DE INGENIERIA DE PRODUCCION BIOTECNOLOGICA
SAN JOSE DE CUCUTA
2005
DINÁMICA DE LAS FUENTES DE INÓCULO E IDENTIFICACIÓN DEL AGENTE
CAUSAL DE LA ANTRACNOSIS (Colletotrichum sp) EN GUANÁBANA (Annona
muricata L.)

ADRIANA PAOLA LIZARAZO CARRILLO

Proyecto de grado presentado como requisito para optar al título de

Ingeniero de Producción Biotecnológica

Director
JAIRO ANTONIO OSORIO CARDONA
PhD. Fitopatoligía

UNIVERSIDAD FRANCISCO DE PAULA SANTADER

FACULTAD DE CIENCIAS AGRARIAS Y DEL AMBIENTE
PLAN DE ESTUDIOS DE INGENIERIA DE PRODUCCION BIOTECNOLOGICA
SAN JOSE DE CUCUTA
2005
A mis abuelos, Ruperto y Ana Celia, que los amo con todo mi corazón.

Adriana Paola
 AGRADECIMIENTOS

La autora del presente proyecto de grado, expresa sus agradecimientos:

A la Corporación Colombiana de Investigación Agropecuaria, CORPOICA – Tibaitatá.

Al doctor Jairo Osorio, Coordinador Nacional del Programa Manejo Integrado de Plagas,
por su carisma, enseñanza y colaboración, durante el desarrollo de este proyecto.

A mi primo y amigo, doctor Fernando Rodríguez, investigador del Programa Fisiología y

Nutrición Animal, por su sabiduría, amor, apoyo y paciencia.

Al doctor Jorge Argüelles, Coordinador Nacional del Programa de Biometría, por la

asesoría en el análisis estadístico.

A la señora Lucía Huertas de Castaño, por permitir la ejecución del proyecto en la Finca,
Lomitas de Calaima.

A Juan Clímaco Hío, por la contribución en todas las actividades del proyecto.

A Jorge Rodríguez, por toda la dedicación, enseñanza y paciencia.

A mi amiga, María Fernanda Torres, por su amistad, asesoría y colaboración durante todo
el desarrollo del proyecto.

A mi amigo, Oscar Fuentes, por compartir sus conocimientos, experiencias, por ser siempre
un motivo de alegría y por todos los momentos geniales que vivimos.

A mi amiga, Jeni García, por estar siempre a mi lado, apoyándome en todas mis decisiones.

A mis compañeras y amigas de laboratorio, Erika, Yuri y Ginna, a quienes quiero mucho,
por ayudarme en las actividades de esta investigación y compartir todas las experiencias en
este año.
A Fabiola Monroy, por su interés en la consecución de todo el material bibliográfico
necesario para este proyecto.

A mi amiga Fabiola Gómez, por todo el apoyo emocional durante este tiempo.

A Juan Manuel y Giovanna Cárdenas por brindarme su amor y cariño.

A los abues y a mis hermanos, Juanga y Linda, por hacerme sentir muy cerca de ellos.

A mis papás, Bernardo y Rita, por recordarme siempre lo importante que soy en sus vidas.

A Tatiana García y Alexander Ramírez por ayudarme en todo lo que fue necesario.
 RESUMEN EJECUTIVO

El presente trabajo se propuso determinar las características de distribución de la fuente de

inóculo y la identificación del agente causal de la antracnosis en guanábana. Se realizaron
muestreos mensuales de hojas asintomáticas de forma estratificada de acuerdo con la edad,
orientación y profundidad, las cuales fueron tratadas con paraquat y establecidas en
cámaras húmedas a fin detectar las infecciones latentes (acérvulos). Fue necesario el diseño
de una escala con 5 niveles para cuantificar la presencia de los acérvulos y así determinar la
dinámica de la fuente de inóculo en la copa del árbol de guanábana. La colección de estudio
del patógeno (Colletotrichum sp.) se conformó con 20 cultivos monoconidiales, los cuales
se obtuvieron a partir de aislamientos de acérvulos y de tejido vegetal con síntomas
iniciales de diferentes órganos como hojas, botones florales y frutos. A cada colonia se le
realizó caracterización morfológica como: color de la colonia, tipo de micelio, forma y
tamaño de los conidios, velocidad de crecimiento y sensibilidad al benomyl. Dieciocho (18)
colonias se identificaron molecularmente con el uso de primers específicos tipo ITS, CaInt2
para Colletotrichum acutatum y CgInt para Colletotrichum gloeosporioides, los cuales
fueron acoplados con el primer universal ITS4. La colección de estudio se conservó en
papel filtro y glicerol al 10% a –20ºC.
 CONTENIDO

Pág

INTRODUCCION 7

1. PROBLEMA 9

1.1 TÍTULO 9

1.2 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA 9

1.3 FORMULACIÓN DEL PROBLEMA 10

1.4 OBJETIVOS 10

1.4.1 Objetivo general 10

1.4.2 Objetivos específicos 10

1.5 JUSTIFICACIÓN 11

2. MARCO REFERENCIAL 12

2.1 ANTECEDENTES 12

2.2 MARCO TEÓRICO 13

2.2.1 Generalidades de la guanábana 13

2.2.2 La Antracnosis 15
2.2.3 El patógeno 18

2.3 MARCO CONCEPTUAL 22

2.4 MARCO CONTEXTUAL 23

2.5 MARCO LEGAL 24

3. DISEÑO METODOLOGICO 25

3.1 TIPO DE INVESTIGACIÓN 25

3.2 POBLACIÓN Y MUESTRA 25

3.2.1 Población 25

3.2.2 Muestra 25

3.3 HIPÓTESIS 25

3.4 VARIABLES 25

3.5 FASES DE LA INVESTIGACIÓN 26

3.5.1 Localización 26

3.5.2 Estandarización de envejecimiento foliar para detección de infecciones latentes 26

3.5.3 Establecimiento del follaje envejecido en cámaras húmedas 27

3.5.4 Evaluación de los tratamientos para determinar la presencia de infecciones latentes

en follaje 28
3.5.5 Diseño de una escala para la cuantificación de acérvulos sobre la lámina foliar 28

3.5.6 Diseño de muestreo de la copa del árbol de guanábana 29

3.5.7 Procesamiento de material vegetal 30

3.5.8 Identificación y evaluación de infecciones latentes sobre hojas asintomáticas 32

3.5.9 Aislamiento de Colletotrichum sp. a partir de infecciones latentes en hojas 32

3.5.10 Aislamiento de Colletotrichum sp. a partir de síntomas de antracnosis en frutos,

botones florales y hojas 32

3.5.11 Purificación de los aislamientos de Colletotrichum sp. 33

3.5.12 Conformación de una colección de estudio a partir de cultivos monoconidiales de

Colletotrichum sp. 34

3.5.13 Conservación de la colección de estudio en glicerol y papel 35

3.5.14 Reactivación de cultivos puros de Colletotrichum sp. 36

3.5.15 Caracterización biológica de la colección de estudio de Colletotrichum sp. 36

3.5.16 Caracterización molecular de Colletotrichum sp. 37

3.6 INSTRUMENTOS PARA LA RECOLECCIÓN DE INFORMACIÓN 38

3.7 TÉCNICAS DE RECOLECCIÓN Y ANÁLISIS DE DATOS 39

3.7.1 Evaluación de presencia de acérvulos en el follaje 39

3.7.2 Evaluación del crecimiento de Colletotrichum sp. en diferentes medios de cultivo 39

4. RESULTADOS 40

4.1 ESTANDARIZACIÓN DE ENVEJECIMIENTO FOLIAR PARA DETECCIÓN DE

INFECCIONES LATENTES EN GUANÁBANA 40

4.2 DETECCIÓN DE INFECCIONES LATENTES MEDIANTE LA PRESENCIA DE

ACÉRVULOS DE Colletotrichum sp. 41

4.3 CUANTIFICACIÓN CON ESCALA DE LAS INFECCIONES LATENTES EN

HOJAS ASINTOMÁTICAS DE GUANÁBANA 41

4.4 ANÁLISIS DE LA DISTRIBUCIÓN ESPACIAL DE Colletotrichum sp. EN LA

COPA DE Annona muricata L. 43

4.5 IDENTIFICACIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE SÍNTOMAS DE ANTRACNOSIS

EN DIFERENTES ÓRGANOS DE Annona muricata L. 46

4.6 COLECCIÓN DE ESTUDIO DE Colletotrichum sp. 47

4.7 CARACTERIZACIÓN BIOLÓGICA DE LOS AISLAMIENTOS DE LA

COLECCIÓN DE Colletotrichum sp. 53

4.8 CARACTERIZACIÓN MORFOLÓGICA DE LOS AISLAMIENTOS DE LA

COLECCIÓN 56

4.9 CARACTERIZACIÓN MOLECULAR DE LOS AISLAMIENTOS DE LA

COLECCIÓN 58

5. DISCUSIONES 62

6. CONCLUSIONES 69

7. RECOMENDACIONES 70

BIBLIOGRAFIA 71
 LISTA DE FIGURAS

Pág.

Figura 1. Síntomas de la antracnosis en hojas de guanábana 17

Figura 2. Síntomas típicos de antracnosis en botones florales de guanábana, lesiones

iniciales 17

Figura 3. Lesión avanzada de antracnosis en fruto de guanábana con esporulación de

Colletotrichum sp. 18

Figura 4. Colletotrichum gloeosporioides en medio PDA, 14 días de cultivo 21

Figura 5. Latencia y ciclo corto de infección de Colletotrichum sp 22

Figura 6. Diagrama de la lámina foliar de guanábana con los 5 niveles de cubrimiento

de infecciones latentes (acérvulos) 29

Figura 7. Establecimiento de hojas senescentes de guanábana en cámaras húmedas para

detección de infecciones latentes 31

Figura 8. Árbol de guanábana (Annona muricata L.) 31

Figura 9. Síntomas de la antracnosis vistos en campo y bajo estereoscopio 33

Figura 10. Aislamientos de la colección de Colletotrichum sp. conservados en papel

filtro 36

Figura 11. Acérvulos característicos de Colletotrichum sp. observados sobre el envés de

hojas de guanábana 42

Figura 12. Envés de hoja de guanábana con más del 80% de infecciones latentes
(presencia de acérvulos) después del tratamiento con paraquat al 4%. Valor ubicado en
la división 5 de la escala 42

Figura 13. Medición de conidios de Colletotrichum sp. teñidos con azul de lactofenol 48

Figura 14. Secuencia de síntomas de la antracnosis en la lámina foliar de guanabana 48

Figura 15. Estados iniciales de la antracnosis en el borde de la lámina foliar de

guanabana 49
Figura 16. Secuencia de síntomas de la antracnosis en la nervadura de la lámina foliar
de guanabana 49

Figura 17. Comparación del diámetro de crecimiento de la colonia SHO3 en medio

selectivo para Colletotrichum sp 53

Figura 18. Comparación del crecimiento de la colonia SB04 en diferentes medios de

cultivo 57

Figura 19. Colonias de Colletotrichum sp. de coloración blanco, gris y naranja de la

colección de estudio 57

Figura 20. Amplificación de fragmentos específicos de DNA de los aislamientos

seleccionados de Colletotrichum sp. utilizando los primers CgInt, CaInt2 e ITS4 59

Figura 21. Amplificación de fragmentos específicos de DNA de los aislamientos

seleccionados de Colletotrichum sp. utilizando los primers CgInt, CaInt2 e ITS4 59

Figura 22. Amplificación de fragmentos específicos de DNA de los aislamientos

seleccionados de Colletotrichum sp. utilizando los primers CgInt, CaInt e ITS4 60
 LISTA DE CUADROS

pág.

Cuadro 1. Diseño experimental para la estandarización de envejecimiento foliar con

paraquat a diferentes concentraciones y periodos de tiempo 27

Cuadro 2. Escala de cuantificación de infecciones latentes de Colletotrichum sp.

sobre la lámina foliar de guanábana 28

Cuadro 3. Muestreo estratificado de la copa para el estudio de la dinámica de

Colletotrichum sp. en guanábana 30

Cuadro 4. Solución máster mix para 41 reacciones de PC 37

Cuadro 5. Programa del termociclador COLLE01 utilizado para PCR 38

Cuadro 6. Evaluación bajo estereoscopio del follaje tratado con paraquat 40

Cuadro 7. Porcentaje de infecciones latentes 43

Cuadro 8. Modelo del formato para la toma de datos de infecciones latentes 43

Cuadro 9. Caracterización morfológica macroscópica de la colección de estudio de

Colletotrichum sp 50

Cuadro 10. Caracterización microscópica de la colección de estudio de

Colletotrichum sp 52

Cuadro 11. Comparación de diámetros de crecimiento de los aislamientos de la

colección en medio PDA y selectivo para Colletotrichum sp después de 72 horas de
incubación 54

Cuadro 12. Medición de diámetros de crecimiento de los aislamientos de la colección

en medio PDA con benomyl a las 48 horas de incubación 55

Cuadro 13. Grupos de aislamientos de guanábana caracterizados como

Colletotrichum gloeosporioides y Colletotrichum acutatum 58

Cuadro 14. Caracterización morfológica y molecular de los 20 aislamientos de la

colección 61
 LISTA DE GRÁFICAS

pág.

Gráfica 1. Porcentaje de aislamientos de la colección de estudio que presentaron una

coloración blanco y gris, blanco, naranja y gris en medio PDA 51

Gráfica 2. Porcentaje de los aislamientos de la colección que produjeron masas de

conidias en dos coloraciones naranja y rosado 51

Gráfica 3. Porcentaje de los aislamientos que mostraron mayor y menor velocidad de

crecimiento en medio selectivo para Colletotrichum sp 53

Gráfica 4. Porcentaje de aislamientos resistentes y sensibles al benomyl (2µg/ml)

luego de 48 horas de incubación 55
 INTRODUCCION

La guanábana (Annona muricata), es una fruta de gran importancia para los países
tropicales y subtropicales debido a su amplia aceptación en el mercado. En Colombia se ha
convertido en una de las frutas predilectas dentro de la canasta frutícola familiar; esta fruta
no sólo es preferida por su agradable sabor sino también por su valor nutritivo y
nutracéutico. La guanábana tiene buenas perspectivas en los mercados internacionales, es
apreciada por su tamaño, forma y calidad, su demanda se ha ido incrementando
paulatinamente y a medida que se desarrolla la tecnología para su cultivo el área dedicada
aumenta. Hoy por hoy, se emplea en la industria de helados, jugos, lácteos, consumo fresco,
enlatados y concentrados.

La guanábana es originaria de las regiones tropicales de América del sur, actualmente se

cultiva en América tropical, el sudeste asiático y en las Islas Filipinas. La fruta es conocida
como anona, zapote agrio, “soursop” (inglés), “corossel” (francés) y “zuurzak” (holandés).
Los mayores productores por área cultivada a nivel mundial se encuentran en el Caribe:
Bermuda, Bahamas, Cuba y República Dominicana; Centroamérica: sur de México y Costa
Rica; y Suramérica: Colombia y Brasil. En Colombia existen aproximadamente 1.441
hectáreas cultivadas de las cuales se producen 9600 toneladas anuales. Los principales
departamentos son: Tolima con el 40% de la producción, Valle del Cauca con el 37.5%,
Huila 7.3% y Córdoba con el 6.8%. Sus principales destinos son Japón, Holanda, España y
Canadá.

Dentro de las limitantes de crecimiento y producción, la antracnosis es la enfermedad que

más incide en el cultivo, causada por el hongo Colletotrichum sp., que ataca desde las
plantas tiernas en semillero hasta las ramas, flores y frutos.

El hongo se dispersa por el contacto de gotas de agua con superficies donde se encuentra el
inóculo, la entrada de los conidios en éstas, el salpique y el movimiento a otros órganos del
hospederos. La mayor forma de dispersión de Colletotrichum sp. ocurre a partir de tejido
muerto o senescente sobre el cual se producen abundantes acérvulos, los cuales son
dispersados por acción del viento o el salpique después de las lluvias.

Al inicio de la enfermedad, los síntomas que se pueden apreciar son manchas amarillentas
en las flores, la coloración cambia de verde amarillento a pardo, ennegrecen, finalmente
caen al suelo y en algunos casos, quedan momificadas en las ramas. Cuando el hongo
aparece en período de floración, la infección se presenta en los pétalos, con manchas que se
alargan paulatinamente hasta cubrir toda la flor, la cual toma una coloración negruzca y cae
posteriormente.
Aun en la ausencia de síntomas visibles, los conidios de Colletotrichum sp. pueden
germinar sobre la superficie de hojas y/o frutos donde persisten como microscópicas
infecciones latentes que consisten en un apresorio con desarrollo limitado de hifas
infectivas. En condiciones favorables, el hongo puede crecer rápidamente dentro de la
planta y causar síntomas severos, pero en otras circunstancias Colletotrichum sp. podría
estar latente en los tejidos del hospedero por un tiempo, en algunos casos sólo llega a ser
aparente después de la cosecha. Una vez el hongo está desarrollado en el interior de la
planta, se producen cuerpos fructíferos oscuros que causan síntomas típicos de antracnosis.

El control efectivo de la antracnosis usualmente involucra el uso de uno o más métodos,

como por ejemplo: variedades resistentes, control cultural, control químico y control
biológico, mediante el uso de antagonistas; la aplicabilidad de las estrategias de control
depende en su mayoría de las características del cultivo. La opción de control con
variedades resistentes en cultivos de frutas es complicada, debido a la habilidad de la
mayoría de especies de Colletotrichum para formar infecciones latentes. El control cultural
se refiere a tácticas dirigidas a evitar la antracnosis a través de la fitosanitización,
manipulación de patrones de cultivo, técnicas apropiadas de sanidad durante la cosecha,
transporte, empaque y almacenamiento.

El control químico de la enfermedad se lleva a cabo mediante la aplicación de compuestos

de cobre, ditiocarbamatos, benzimidazoles, triazoles y otros funguicidas, como clorotalonil,
imazalil y procloraz, los cuales son altamente efectivos contra especies del género
Colletotrichum. Sin embargo, el problema de la tolerancia a los fungicidas podría
incremetarse aun más en el patógeno, gracias a las aplicaciones continuas que puedan
ejercer una presión de selección en el hongo.

El principal inconveniente en el manejo de la antracnosis en el cultivo de guanábana, es el

desconocimiento de varios factores: identidad del agente causal, ciclo de la enfermedad,
forma de distribución del patógeno en el árbol y otras características de la fuente de
inóculo. La importancia de este trabajo radica en la generación de información eficaz y
eficiente sobre la enfermedad, conocer los factores anteriormente mencionados para
rediseñar las prácticas de control de la enfermedad con el fin de garantizar una producción
con incidencia mínima posible de antracnosis, lo cual permitiría disminuir la aplicación de
productos químicos, mayor efectividad de las prácticas de control, reducción de costos de
manejo, evitar el desarrollo de la resistencia en el patógeno, y minimizar la contaminación
del medio ambiente.
 1. PROBLEMA

1.1 TÍTULO

DINÁMICA DE LAS FUENTES DE INÓCULO E IDENTIFICACIÓN DEL AGENTE

CAUSAL DE LA ANTRACNOSIS (Colletotrichum sp) EN GUANÁBANA (Annona
muricata L.)

1.2 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

La enfermedad más importante que incide en el cultivo de la guanábana es la antracnosis, la

cual se caracteriza por atacar hojas, botones florales, frutos y tallos. El agente responsable
es un hongo patógeno del género Colletotrichum sp., que ocasiona grandes pérdidas
económicas en frutales en climas templados, subtropicales y tropicales. Su impacto
económico ha conducido a estudios extensos sobre diversos aspectos de su biología como
especificidad del hospedero, biología celular de los procesos de infección, interacción
planta – patógeno, diversidad genética y epidemiología

Existen dos tipos diferentes de enfermedades causadas por Colletotrichum, que afectan
frutos, las que ocasionan daños sobre los frutos inmaduros y en desarrollo (pre-cosecha) y,
las que afectan frutos maduros ya cosechados y durante el almacenamiento (post-cosecha).
Esto se debe a la habilidad de muchas especies de Colletotrichum para causar infecciones
latentes, en las cuales el hongo infecta frutos inmaduros en campo y después de un tiempo,
reanuda su crecimiento y ocasiona el daño en el fruto maduro. Este es un fenómeno donde
la infección toma lugar en estados tempranos del desarrollo del fruto, pero la enfermedad
aparece después, en la etapa madura o muy cercana a ésta.

Los síntomas de la antracnosis en la guanábana se presentan en las hojas, lo que se conoce

como antracnosis foliar; en el fruto, donde ocasiona momificación o pudrición seca y, en
los botones florales. En las hojas se manifiesta como lesiones o manchas necróticas de
coloración café o marrón oscuro, casi negro y de borde definido. En los botones florales se
presentan lesiones definidas de forma variable, hundidas, de color marrón claro u oscuro,
especialmente hacia la base de los sépalos y pétalos. En el fruto, los síntomas iniciales son
manchas de forma irregular o redondeadas de tamaño variable, de color marrón oscuro y
deprimidas o hundidas formando especies de chancros.
De acuerdo con evaluaciones realizadas en el Valle del Cauca, durante un período de ocho
meses, se determinó que la antracnosis foliar es la enfermedad más prevalente, con una
incidencia del 72% y una severidad del 45.2%. La incidencia de la antracnosis del fruto fue
del 41% y la pudrición parda de éste de 43%, mientras que la severidad de estas dos
enfermedades fue, en su orden, del 22.7 y 35.2% respectivamente.

La presencia, incidencia y severidad de esta enfermedad, están ligadas con el manejo del
cultivo, sin embargo, en Colombia, la única forma de controlar la antracnosis es con el uso
de fungicidas preventivos y curativos con aplicaciones hasta tres veces por mes, según el
nivel de afección, condiciones ambientales y estado de desarrollo de los árboles. A pesar de
esto, el manejo actual de la enfermedad no tiene éxito debido al desconocimiento del ciclo
de la enfermedad y por ende, la aplicación de los fungicidas con respecto al lugar, en el
árbol, fecha y cantidad, no es efectiva.

1.3 FORMULACIÓN DEL PROBLEMA

¿Cuál es y cómo se distribuye el agente causal de la antracnosis en la copa del árbol de

guanábana (Annona muricata L.)?

1.4 OBJETIVOS

1.4.1 Objetivo general. Determinar las características de distribución de la fuente de

inóculo en el árbol de guanábana.

1.4.2 Objetivos específicos. Realizar muestreos de campo con el propósito de obtener

aislamientos del patógeno en guanábana.

Identificar mediante técnicas convencionales y moleculares, las especies relacionadas con

la antracnosis en guanábana.

Diseñar y estandarizar metodologías para la determinación de infecciones latentes en el

follaje.

Analizar mediante muestreos periódicos, la distribución de infecciones latentes en árboles

de guanábana.
1.5 JUSTIFICACIÓN

La guanábana se encuentra dentro del grupo de frutas que se comercializan a buen precio
en los mercados nacional e internacional. En Colombia, algunas veces la producción es
escasa, porque el cultivo todavía tiene serios limitantes de producción; una de ellas es el
manejo de las enfermedades propias del árbol, como la antracnosis producida por C.
gloeosporioides.

Se estima que existen aproximadamente 750 especies del género Colletotrichum (Bailey y
Jeger, 1992) y cada una de ellas está ligada a un hospedero diferente; en algunos casos no
es sólo una especie la que ocasiona la enfermedad lo que hace aún más complejo su
estudio. Colletotrichum gloeosporioides y C. acutatum son las especies que están
comúnmente asociadas a la podredumbre de las frutas por antracnosis; estas dos especies
son parecidas morfológicamente y, debido a la coincidencia en el rango de hospederos y a
la gran variabilidad que sus aislamientos presentan en cultivo, ha sido muy difícil
identificarlos de forma independiente, por métodos taxonómicos convencionales. Por estas
razones es necesario utilizar técnicas de biología molecular que contribuyan a confirmar la
identidad del patógeno.

Colletotrichum sp. se caracteriza por tener la capacidad de desarrollar infecciones latentes;

esto lo define como un hongo agresivo, ya que inicialmente sobrevive en la planta de forma
asintomática y cuando se activa, ocasiona daño en el tejido. En esta última etapa la
aplicación de fungicidas preventivos no tiene efecto sobre el patógeno y por esto es
necesario utilizar fungicidas curativos, en dosis cada vez más altas, lo que representa mayor
inversión para el control de la antracnosis, mayor contaminación del medio ambiente y,
aumento de tolerancia por parte del patógeno, a los funguicidas más usados.

Actualmente existen pocos estudios sobre aspectos claves de la enfermedad en guanábana,

no hay certeza de la identidad del agente causal de la antracnosis, se desconoce su ciclo de
vida, la fuente del inóculo y, su distribución a través del tiempo. Es por ello que esta
investigación persigue aportar nuevos conocimientos para el manejo de la enfermedad a fin
de: disminuir la aplicación de los funguicidas y la contaminación ambiental, evitar
fitotoxicidad, reducir los costos de control de antracnosis, lograr que la combinación de
tipos de control sea eficiente y, aumentar la producción de guanábana en el país.
 2. MARCO REFERENCIAL

2.1 ANTECEDENTES

Binyamini (1972) reportó uno de los primeros estudios sobre la antracnosis en aguacate y
determinó la presencia de infecciones latentes por Colletotrichum gloeosporioides. Debido
a la importancia que tomó la enfermedad alrededor del mundo, diferentes investigadores
enfocaron sus trabajos en el conocimiento, tanto del agente causal como la interacción de
éste con su huésped, por ejemplo, Brown (1975) y Fagan (1979) estudiaron el “Postbloom
fruit drop” (caída de los frutos), como una nueva enfermedad en cítricos ocasionada por
Colletotrichum gloeosporioides.

Adikaram y Brown (1981) realizaron investigaciones sobre infecciones latentes en frutos de

Capsicum originadas por Colletotrichum capsici. En 1990, Jeffries publicó la biología y el
control de especies de Colletotrichum en cultivos de frutas tropicales, Agostini y Timmer
(1992) investigaron la dinámica de población, características morfológicas y patológicas de
Colletotrichum gloeosporioides, así como la etiología y epidemiología de la enfermedad en
cítricos y Bailey, en el mismo año publicó las estrategias de infección de especies de
Colletotrichum.

Sreenivasaprasad (1996) reveló, mediante análisis de la secuencia de ADN ribosomal,

nuevos grupos de especies del género Colletotrichum; Freeman y colaboradores (1996)
identificaron y caracterizaron especies de Colletotrichum como agentes causales de
antracnosis en fresa, aguacate y almendra, mediante pruebas moleculares y de
patogenicidad.

Beno-Moualem y Prusky (2000), reportaron los eventos tempranos durante el desarrollo de

la infección latente por Colletotrichum gloeosporioides en frutos inmaduros de aguacate y,
Freeman (2000) realizó análisis moleculares de especies de Colletotrichum en almendra y
otras frutas. Akinwunmi (2001) publicó el perfil patogénico de Colletotrichum y, Ureña-
Padilla, investigó la supervivencia del inóculo de Colletotrichum en fresa, después del
verano.

Ureña-Padilla (2001) publicó la etiología y genética de la población de Colletotrichum sp.

en Fresa. Talhinhas (2002), llevó a cabo la caracterización genética y morfológica de
Colletotrichum acutatum como agente causal de antracnosis en Lupinos y, Peres (2004),
reportó la sensibilidad y tolerancia al benomyl de aislamientos de Colletotrichum acutatum
y C. gloeosporioides de cítricos.
En Colombia existen pocos estudios sobre la antracnosis, sin embargo, dentro de los que
han sido publicados se encuentra la caracterización de aislamientos de Colletotrichum de
tomate de árbol, maracuyá y mango realizado por Afanador-Kafuri y Freeman en el 2004.
Torres (2005) estudió la presencia de infecciones latentes a partir del follaje asintomático
en el Tomate de árbol e identificó el agente causal de la enfermedad.

Hasta el momento no se conocen investigaciones sobre antracnosis en guanábana (Annona

muricata L), pero Villanueva y colaboradores (2005), reportaron la caracterización e
identificación del agente causal de la antracnosis en frutos de Chirimoya (Annona
cherimola Mill).

2.2 MARCO TEÓRICO

2.2.1 Generalidades de la guanábana. Dentro de la familia de las Annonáceas, la

guanábana constituye una de las especies de mayor demanda, por su agradable sabor, ya
que se utiliza comercialmente en la elaboración de jugos, helados, mermeladas, postres y
concentrados; además, tiene propiedades medicinales, alimenticias e insecticidas. Esta fruta
se caracteriza por ser de alto potencial económico; en los últimos años se ha incrementado
su consumo y, se considera como una de las más apetecidas en el mercado nacional e
internacional.

El árbol de guanábana requiere para su buen crecimiento y desarrollo, una altitud entre 500
y 1250 m.s.n.m., una temperatura media entre 25 y 28 °C; no resiste condiciones de frío y,
cuando este es severo, causa defoliación y daños fisiológicos. Es abundante la
productividad en regiones con precipitaciones anuales entre 800 y 1000 mm, humedad
relativa entre el 60 y el 80% y, pH entre 5.5 y 6.5.

Origen y distribución. No se conoce con certeza su centro de origen, aunque se presume

que sea Colombia o Brasil. La guanábana fue uno de los primeros frutales llevados desde
América hasta los trópicos del mundo oriental, ya que en algunos textos antiguos, (1526),
como “Historia Natural de las Indias”, Gonzalo Hernández de Oviedo hace alusión a la
abundancia en la zona norte de Suramérica y Las Antillas.

En la actualidad, la guanábana se encuentra de forma silvestre y cultivada, desde el sur de

México hasta Brasil, islas del Pacífico y Las Antillas. Se cultiva también en los Cayos y en
el extremo del sur de la Florida, así como desde el sureste de China hasta Australia y en las
tierras bajas y calientes del este y oeste del Africa.

Clasificación taxonómica:
• Reino: Vegetal

• División: Spermatophyta

• Subdivisión: Angiosperma o latifolada

• Clase: Dicotiledónea

• Subclase: Archylamudeae

• Orden: Ranales

• Familia. Annonáceas

• Grupo: Guanábani

• Sección: Euannona

• Género: Annona

• Especie: Annona muricata L.

Problemas fitosanitarios. Una alta incidencia de plagas y enfermedades se presenta en

todas las zonas donde se cultiva la guanábana; las pérdidas son muy variables y en
ocasiones, hacen incosteable el cultivo, limitando su expansión. Los problemas
fitosanitarios más importantes son: la antracnosis foliar, la antracnosis o pudrición seca del
fruto, la pudrición parda del fruto, la mancha blanca del follaje y, las pudriciones
secundarias del fruto. Entre las plagas que revisten importancia económica están: el chinche
de encaje, el ácaro de la erinosis, los perforadores del fruto y semilla, como la polilla y la
avispa. De acuerdo con los resultados obtenidos en evaluaciones realizadas durante un
período de 8 meses, se encontró que la antracnosis es la enfermedad más importante del
cultivo de guanábana. Se estima que las pérdidas en producción por el complejo de
problemas fitosanitarios en guanábana, pueden situarse alrededor del 44.1%.

2.2.2 La Antracnosis
Epidemiología. El patógeno se disemina por el agua y por el viento y es probable que los
insectos participen en dicha acción. La enfermedad es favorecida por condiciones
ambientales de alta humedad o lluvias periódicas o, períodos secos y lluviosos alternos, por
árboles en mal estado nutricional, distancias de siembra inadecuadas y por la
susceptibilidad genética de los cultivares. Las conidias empiezan a germinar quince horas
después de estar en contacto con una lámina de agua, logrando la máxima actividad a las 48
horas y, el ciclo de la enfermedad dura entre 7 y 10 días. La penetración del hongo en los
tejidos ocurre directamente, por medio de los apresorios, por aberturas naturales o por
heridas.

C. gloeosporioides forma sus conidias en masas mucilaginosas, razón por la que necesita de
lluvia seguida de alta humedad relativa y, de una capa de agua que persista sobre el follaje
y sobre los frutos para la producción, diseminación y penetración del patógeno. Estas
condiciones unidas a la posibilidad del patógeno para penetrar directamente, sin necesidad
de heridas, o facilitado por éstas, hace más difícil su prevención y control.

Los propágulos de muchos patógenos de plantas son dispersados a partir de huéspedes

infectados por el contacto con la lluvia. La dispersión ocurre por el impacto de las gotas de
agua sobre una superficie que contiene el inóculo, la ubicación de las esporas en las gotitas
que se dispersan y, el movimiento de éstas a nuevos sitios.

Sintomatología

Síntomas en hojas. La enfermedad se manifiesta como lesiones o manchas necróticas en

las hojas. Estas manchas son de color marrón oscuro casi negro y, de borde definido, en
ocasiones rodeadas de un tenue halo clorótico (Véase la Figura 1). Las lesiones se ubican
en cualquier parte de la lámina foliar, siendo redondeadas u ovaladas y con diámetro hasta
los 15 mm. Pueden presentarse aisladas en los bordes y ápices de las hojas; cuando se
ubican en las nervaduras son irregulares e inducen deformación foliar, por lo cual la hoja
tiende a romperse. Cuando las lesiones se necrosan rompen el tejido y pueden dejar
perforaciones. Las lesiones en la nervadura avanzan rápidamente induciendo la caída
prematura de la hoja.

Síntomas en botones florales. En estas estructuras, la antracnosis presenta lesiones

definidas de forma variable, hundidas, de color marrón claro u oscuro, especialmente hacia
la base de pétalos y sépalos (Véase la Figura 2). A medida que la lesión progresa, avanza
hacia el interior del botón floral, crece en diámetro y llega a cubrir gran parte o todo el
botón floral, causando la caída del mismo. Al separar los pétalos de los sépalos en épocas
húmedas, se puede observar a simple vista un crecimiento micelial filamentoso de
coloración gris-blanquecina y, las masas de conidias (esporas) del hongo.
Síntomas en el fruto. La antracnosis del fruto o pudrición seca, nombre dado a la
enfermedad cuando ataca el fruto y debido a las características de las lesiones que induce,
se manifiesta con manchas de forma irregular o redondeadas, de tamaño variable (pudiendo
alcanzar 7 a 9 cm de diámetro), de color marrón oscuro y hundidas, formando chancros.
Varias lesiones se pueden unir afectando gran parte del fruto.

Las lesiones tienen borde definido y necrótico, mostrando el tejido con aspecto seco, duro,
compacto y generalmente el área necrosada se rompe (Véase la Figura 3). La enfermedad
avanza hacia el interior del fruto, destruyendo la pulpa y llegando hasta las semillas y el eje
central del fruto. Se ha comprobado que la pudrición seca del fruto está relacionada con la
incidencia de antracnosis foliar, ya que en árboles afectados por esta última, la pudrición
seca se presenta en forma acentuada.

La pudrición seca del fruto, ataca a éste en cualquier estado de desarrollo, pudiendo llegar a
inducir grandes pérdidas. Cuando el ataque se presenta en frutos jóvenes, la enfermedad
induce momificación del fruto, el cual toma una coloración oscura, casi negra y se
desprende fácilmente del árbol. Las pérdidas tienden a disminuir a medida que el ataque es
más tardío, lo que puede permitir en ciertos casos utilizar parte del fruto afectado. La
enfermedad también se suele presentar cuando hay heridas y perforaciones de los insectos
que atacan el fruto, como es el caso de la polilla perforadora del fruto Cerconota anonella.

Estrategias de control. El control de la antracnosis se lleva a cabo bajo cuatro tipos

convencionales que son: control cultural, biológico, químico y uso de resistencia intrínseca.
La aplicabilidad de estrategias de control, depende en su mayor parte de las características
del cultivo y de la zona de producción.

Control cultural. Se refiere al rango de métodos utilizados en agronomía de cultivos para

controlar enfermedades, la mayoría direccionados a evitar la enfermedad a través de
técnicas de fitosanidad, podas, implementación de patrones de manejo de cultivos o
incremento de resistencia y evitar predisposición. La ubicuidad de las fuentes de inóculo de
Colletotrichum y el desarrollo rápido de la enfermedad bajo condiciones favorables, reduce
la efectividad de muchas prácticas generales fitosanitarias.

En guanábana se considera que la presencia, incidencia y severidad de esta enfermedad

están ligados con el manejo del cultivo. El manejo preventivo se inicia con la localización
del huerto, prefiriéndose zonas de baja humedad relativa y precipitación moderada. Se
recomienda la recolección y eliminación de frutos afectados, la aplicación de prácticas de
control de plagas, desinfección de herramientas, el riego adecuado y la nutrición óptima de
los árboles.
Figura 1. Síntomas de la antracnosis en hojas de guanábana

Se puede observar: A) Síntomas iniciales de antracnosis en la nervadura B) Lesión típica de

antracnosis en el ápice de la hoja C) Lesión avanzada

Figura 2. Síntomas típicos de antracnosis en botones florales de guanábana, lesiones

iniciales
Figura 3. Lesión avanzada de antracnosis en fruto de guanábana con esporulación de
Colletotrichum sp

Control químico. Las enfermedades producidas por Colletotrichum pueden ser controladas
por un amplio rango de productos químicos a base de cobre como ditiocarbamatos,
benzimidazoles y triazoles; otros funguicidas, como clorotalonil, imazalil, y procloraz son
efectivos para combatir a Colletotrichum. Los fungicidas sistémicos son particularmente
efectivos, debido a la habilidad para penetrar el tejido del huésped y erradicar las
infecciones latentes. Sin embargo, el problema de la tolerancia a los funguicidas,
rápidamente se incrementa cuando los benzimidazoles son utilizados de forma frecuente
para controlar esta enfermedad.

En el cultivo de guanábana se recomienda hacer aplicaciones de los siguientes fungicidas:

Benomil, Carbendazim, Mancozeb, Maneb y Clorotalonil (Palomino y Rentería, 1986). El
Benomil y el Carbendazim se emplean como curativos (el hongo ya se encuentra
establecido a niveles medios o altos) y los demás fungicidas como preventivos, es decir,
cuando la enfermedad no ha empezado, se ha iniciado el ataque o los niveles son bajos.

2.2.3 El patógeno. Colletotrichum y su teleomorfo Glomerella han sido reconocidos como

los responsables de diferentes enfermedades en plantas por todo el mundo, generalmente
las que se denominan como antracnosis, pero especialmente como la causa de los
problemas de pre y post – cosecha en los trópicos. Colletotrichum gloeosporioides (Penz.)
causa antracnosis en diferentes frutos incluyendo los de anonáceas (Véase la Figura 4).

Colletotrichum es un género notoriamente variable, acerca del cual se han formulado

muchas preguntas acerca de su taxonomía, evolución, origen de variación, especificidad del
hospedero y mecanismos de patogenicidad y, que todavía no han sido respondidas. La
variación morfológica in vitro de este hongo, dificulta su correcta identificación por vía
convencional (Véase la Figura 4).

Las especies del género Colletotrichum están entre los hongos fitopatógenos más
importantes y atacan un rango extremadamente amplio de plantas, que crecen en ambientes
templados y tropicales. Estos patógenos causan daños en varias partes de la planta como:
raíces, tallos, hojas, flores y frutos, pero algunas veces son muy específicos para algún tipo
de tejido en particular; muchos de ellos también son específicos para especies de plantas o
cultivos.

En Colombia, C. gloeosporioides se ha asociado con la antracnosis en guanábana, de

acuerdo con estudios realizados a partir de aislamientos de frutos, con síntomas de la
enfermedad, provenientes del Valle del Cauca. En México se identificó como el
responsable de la antracnosis en frutos de Chirimoya (Annona cherimola Mill) a
Colletotrichum fragariae.

Fuentes de inóculo. Las lesiones ocasionadas por Colletotrichum, se presentan en más de

una parte de la planta. La antracnosis en mango es probablemente el ejemplo fundamental
de lo anterior, donde la enfermedad se presenta en hojas, flores y frutos, en donde el
inóculo de una fuente infecta el otro órgano.

Las principales fuentes de inóculo son las conidias producidas en acérvulos. En los
acérvulos más jóvenes, las conidias están encerradas en un material húmedo, mucilaginoso
e hidrofílico, algunas veces referido a una matriz de esporas. Este es un complejo mixto
compuesto en su mayoría por polisacáridos y glicoproteínas, con varios componentes
menores que incluyen algunas enzimas. Cuando estas estructuras reproductivas maduran
bajo condiciones de sequía, la matriz forma un depósito de corteza dura, el cual reúne
muchas esporas. La diseminación de las esporas a partir de acérvulos jóvenes ocurre en
pequeñas gotas de agua, mientras que el viento, a su vez, puede distribuir masas de esporas
secas de acérvulos viejos.

Infecciones latentes. El término “infección latente”, describe una relación parasítica

dormante o latente que después de un tiempo cambia a estado activo. La etapa de desarrollo
en la cual el hongo llega a estar de forma latente puede ser al inicio de la germinación,
elongación del tubo germinal, formación del apresorio, penetración o colonización. La
aparición y mantenimiento de la latencia del patógeno sobre o dentro del hospedero, indica
un equilibrio dinàmico entre el mismo hospedero, el patógeno y el ambiente, sin síntomas
visibles (Véase la Figura 5).

Inicialmente la infección se presenta en el campo sobre frutos inmaduros, la cual resulta en

la formación de un apresorio resistente de pared gruesa, con una clavija de infección que
penetra la cutícula del hospedero y la pared celular, con la ayuda de enzimas cutinolíticas y
celulolíticas. Bajo ciertas condiciones, usualmente asociadas con la maduración o afección
por heridas de los frutos, estas infecciones latentes se desarrollan en lesiones necróticas
oscuras, las cuales muestran acérvulos mucilaginosos de coloración naranja.

La antracnosis en banano, causada por Colletotrichum musae, se presenta comúnmente

sobre frutos maduros; las infecciones latentes pueden permanecer de forma dormante hasta
por cinco meses. Síntomas similares se presentan sobre aguacate cosechado y frutos de
papaya, debido a infecciones latentes que ocurren sobre frutos en desarrollo, a partir de
fuentes de inóculo como hojas y ramas en el dosel del árbol.

Hojas, ramas, inflorescencias y frutos en estado senescente junto con el dosel del árbol, son
las mayores fuentes de inóculo para el comienzo de la presencia de enfermedades. La
existencia del patógeno como un componente de la microflora del filoplano o, como
infecciones latentes de tejidos aparentemente saludables del hospedero, también proveen
fuentes de inóculo a partir de las cuales la enfermedad puede desarrollarse, aún cuando las
más obvias fuentes de saprofíticos hayan sido removidas.

Reciente evidencia para C. gloeosporioides en aguacate y mango, sugieren que la latencia

podría ocurrir como una hifa de estructura subcuticular, cuyo crecimiento es inhibido en el
interior del tejido del hospedero. El mecanismo para la latencia de Colletotrichum sp. sobre
otros frutos, podría diferir dependiendo de la combinación del hospedero – patógeno. La
probable explicación para la latencia involucra cambios post-infeccionales y no
características de pre-infección.

Los cambios post-infeccionales podrían involucrar la síntesis/degradación de sustancias

fungitóxicas en el interior del tejido del hospedero, en respuesta a la presencia del patógeno
o a la maduración del fruto. Para frutos de aguacate, la producción de estructuras de
latencia parece ser dependiente de la dinámica de los componentes preformados. La
resistencia al desarrollo fúngico dentro de los tejidos del hospedero, ha sido correlacionada
con cambios en la concentración de inhibidores preformados y al nivel de epicatequina, la
cual previene la degradación natural del componente inhibitorio durante la maduración del
fruto.

Caracterización biológica y molecular de Colletotrichum sp. Colletotrichum

gloeosporioides y Colletotrichum acutatum, son los dos miembros del género que están
comúnmente asociados con la antracnosis en diversos cultivos de frutales. Colletotrichum
gloeosporioides es patógeno de almendra, manzana, aguacate, cítricos, mango y fresa. C.
acutatum ha sido reportado en aguacate, café, guayaba, olivo, papaya, tomate y tamarillo.
Estas dos especies son morfológicamente muy similares y debido a su amplio rango de
hospederos y la extensa variabilidad que sus aislamientos muestran en cultivo, ha sido muy
difícil separarlas por métodos taxonómicos tradicionales. Sin embargo, Colletotrichum
acutatum y Colletotrichum gloeosporioides, han sido caracterizadas con base en morfología
de la colonia, forma y tamaño de las conidias y rango de hospedero. Estas técnicas tienen
que ser utilizadas con precaución ya que son poco confiables.

Otros parámetros para la caracterización del patógeno han sido útiles como por ejemplo
tasa de crecimiento (lenta para C. acutatum y rápida para C. gloeosporioides), temperatura
óptima de crecimiento (25 ºC en C. acutatum vs. 30 ºC en C. gloeosporioides) y
sensibilidad al benomil.

Figura 4. Colletotrichum gloeosporioides en medio PDA, 14 días de cultivo

Existe un medio semi-selectivo para el género Colletotrichum, compuesto por PDA e

hidróxido de cobre, con el cual se compara la velocidad de crecimiento de los aislamientos
objeto de estudio; en este medio, C. gloeosporioides crece más rápido en este medio que C.
acutatum. De esta forma, esta prueba se convierte en un método de caracterización
biológica.

Un método complementario para la identificación de especies, es el uso de técnicas

moleculares, como las que amplifican por la reacción en cadena de la polimerasa, las
regiones intergénicas ribosomales.
Figura 5. Latencia y ciclo corto de infección de Colletotrichum sp

Fuente
Tejido maduro
(Latencia y
Componente del filoplano)
Tejido muerto - saprófito

Esporulación/Dispersión
Dependiente - Agua

Tejido Tejido Adulto

Maduro Tejido joven
Susceptible
Infección
Apresorio
resistente

Largo Latencia
Corto

Fuente: BAILEY, J. y JEGER, A. Colletotrichum: biology, pathology and control. Wallingford:

CAB International, 1992.

El diseño de primers especie-específicos, utilizando secuencias de la región del rDNA

ITS1, es una herramienta útil para la identificación de las especies de Colletotrichum sp.
que afectan a los diferentes frutales. Con el uso de estos primers se confirmó a C. acutatum
como el agente causal de la antracnosis de la almendra en California (Förster and
Adaskaveg, 1999) y, se reclasificó la cepa SGO, responsable del PFD en los cítricos, como
C. acutatum (Brown et al. 1996).

2.3 MARCO CONCEPTUAL

Acérvulo. Cuerpo fructífero asexual que contiene conidios. Colchón de hifas con forma de
plato abierto sobre el cual se levantan los conidios.

Antracnosis. Es una lesión necrótica similar a una úlcera profunda, que puede generarse en
diferentes órganos de las plantas hospederas.

Apresorio. También conocido como célula madre haustorial por su asociación con éste,
puede ser simple o compuesto, de pared delgada y, hialina o gruesa y oscura. Es
responsable de la fijación a la pared celular, penetración y fisiología de la enfermedad.

Conidio. Espora de origen asexual que no se encuentra en el himenio.

Esclerocio. Cuerpo perdurante duro, resistente a las condiciones desfavorables, germinando

después de mucho tiempo, en condiciones favorables.

Haustorio. Célula u órgano especializado que se forma dentro de la célula del hospedero
como ramificación de una hifa, a fin de lograr un contacto íntimo con el citoplasma; tiene
forma de bolsa y realiza la absorción de alimentos.

Hialina. Transparente como el vidrio o parecido a él.

Himenio. Membrana donde están localizados los elementos fértiles, productores de esporas
en los hongos.

Infección latente. Relación parasítica latente que después de un tiempo se activa.

ITS. Secuencias de las regiones intergénicas.

PCR. Reacción en cadena de la polimerasa, técnica de biología molecular que permite

amplificar el ADN.

Peritecio. Ascocarpo cerrado por una pared propia y un poro en el extremo, que constituye
un verdadero ostíolo.

2.4 MARCO CONTEXTUAL

El proyecto se desarrolló en el Laboratorio de Fitopatología de CORPOICA, Corporación

Colombiana de Investigación Agropecuaria, Sede Tibaitatá, ubicada en el Km 14 vía a
Mosquera. CORPOICA es una entidad de participación mixta, de carácter científico y
técnico, sin fines de lucro, creada en 1993. Su objeto es el desarrollo y ejecución de
investigación y transferencia de tecnología agropecuarias y la promoción de procesos de
innovación tecnológica. La misión es generar y transferir conocimientos científicos y
tecnológicos en agricultura, con énfasis en las condiciones del trópico.

La población que recibirá influencia de esta investigación, está relacionada con todos los
cultivos de guanábana que existan en el país; específicamente, aquel que fue objeto de
estudio, ubicado en La Mesa, Cundinamarca.

2.5 MARCO LEGAL

La legislación que avala jurídicamente el desarrollo de esta investigación, está comprendida

por la Ley 29 de Febrero de 1990, ley marco de Ciencia y tecnología, por la cual se dictan
disposiciones para el fomento de la investigación científica y el desarrollo tecnológico y se
otorgan facultades extraordinarias y también, por el Decreto 393 de 1991, por el cual se
dictan normas sobre asociación para actividades científicas y tecnológicas, proyectos de
investigación y creación de tecnologías.
 3. DISEÑO METODOLOGICO

3.1 TIPO DE INVESTIGACIÓN

El presente trabajo busca la adquisición de conocimiento en la dinámica de las fuentes de

inóculo de la antracnosis en guanábana y, el agente causal de la misma, con el fin de que
los resultados contribuyan a un diseño de manejo de la enfermedad más eficiente. La
investigación es de tipo descriptiva, porque se expresan las características de un grupo de
árboles de guanábana midiendo la cantidad de inóculo en follaje asintomático, de acuerdo a
las variables establecidas en el diseño, como: edad, orientación y profundidad de las hojas.

La investigación, según la estrategia es de tipo experimental, ya que se realizaron estudios

de laboratorio y campo. Se planteó una hipótesis de trabajo, que está relacionada con las
variables establecidas.

3.2 POBLACIÓN Y MUESTRA

3.2.1 Población. Está conformada por un cultivo de 3000 árboles de guanábana

provenientes de la finca “Lomitas de Calaima”, ubicada en La Mesa, departamento de
Cundinamarca.

3.2.2 Muestra. La integran 10 árboles seleccionados, 5 en el lote número 1 y los 5 restantes

en el lote número 3.

3.3 HIPÓTESIS

La fuente de inóculo del agente causal de la antracnosis en guanábana, reside en forma de

infecciones latentes en el follaje asintomático.

El agente causal de la antracnosis en guanábana es Colletotrichum gloeosporioides.

3.4 VARIABLES

La variable dependiente en el presente trabajo de investigación es la cantidad de acérvulos

del patógeno, estimada mediante porcentaje, sobre el follaje asintomático de guanábana.

Las variables independientes del estudio son: orientación, profundidad y edad de las hojas,
lote y árbol.

Dentro de las variables intervinientes están: precipitación, humedad, temperatura, podas y

uso de fungicidas.

3.5 FASES DE LA INVESTIGACIÓN

3.5.1 Localización. El estudio se llevó a cabo en la finca Lomitas de Calaima,

perteneciente a la vereda Doima, inspección de policía de La Esperanza, municipio de La
Mesa, departamento de Cundinamarca.

El cultivo está ubicado en la parte oriental del valle del río Apulo, en las estribaciones
occidentales de la cordillera oriental a una altura de 1.180 metros sobre el nivel del mar,
con 4.42° latitud norte y 74.20° longitud occidental. Presenta una humedad relativa del
64%, temperatura mínima de 22°C y máxima de 25°C, brillo solar de 4.48 horas luz y
radiación de 462.1 calorías /cm2.

El cultivo ocupa un área aproximada de once hectáreas, sembradas con 3000 árboles, 1000
en producción plena y 2000 de dos años de edad. Se determinó muestrear dos lotes, cinco
árboles de cada uno durante siete meses, desde febrero a agosto de 2005.

3.5.2 Estandarización de envejecimiento foliar para detección de infecciones latentes.

Se recolectaron al azar 60 hojas jóvenes y viejas de guanábana que no presentaran ningún
síntoma visible de antracnosis, las cuales fueron empacadas en bolsas de papel y éstas, a su
vez, se introdujeron en una nevera de icopor.

De acuerdo con la metodología planteada por Biggs (1995) y utilizada por Torres (2005), se
realizaron cuatro tratamientos con el herbicida paraquat a dos concentraciones, por dos
períodos de tiempo (Véase el Cuadro 1) y, dos tratamientos con choque térmico.

Todas las hojas fueron previamente lavadas con agua destilada durante 15 minutos y se
permitió el secado de las mismas a temperatura ambiente.
Cuadro 1. Diseño experimental para la estandarización de envejecimiento foliar con
paraquat a diferentes concentraciones y periodos de tiempo

Hojas jóvenes Hojas viejas Concentración de Tiempo de

Paraquat (%) Exposición
5 5 2 15 minutos
5 5 2 30 minutos
5 5 4 15 minutos
5 5 4 30 minutos
5 5 6 15 minutos
5 5 6 30 minutos

Para cada tratamiento fue necesario preparar un litro de cada concentración de paraquat,
mediante la fórmula de concentración y volumen siguiente:

C1*V1 = C2*V2

Donde:

C1 = La concentración inicial del paraquat en la presentación comercial

V1 = Volumen desconocido de paraquat

C2 = Concentración para cada tratamiento (2%, 4% ó 6%)

V2 = Volumen deseado de paraquat (1000 ml, 2000 ml, etc.)

El tratamiento con choque térmico se basó en la metodología utilizada por Torres (2005), la
cual consistió en someter grupos de 10 hojas (jóvenes y viejas) previamente desinfectadas y
empacadas en bolsas de papel, a dos temperaturas diferentes (-5 y –10 °C), durante dos
períodos de tiempo (30 y 60 minutos).

3.5.3 Establecimiento del follaje envejecido en cámaras húmedas. Luego de haber

sometido las hojas a cada tratamiento, se introdujeron en cámaras húmedas, previamente
lavadas con detergente y desinfectadas con hipoclorito al 2% y alcohol al 70% sin
enjuague, las cuales consistían en recipientes plásticos con tapa y con las siguientes
dimensiones: 15 cm de altura x 30 cm de ancho y 40 cm de largo (multicaja cristal de
ESTRA TM). En su interior contenían una malla plástica (escurridor individual de Vanyplas
TM
) que debe desinfectarse de la misma forma que los recipientes, sobre la que se colocó
una servilleta ligeramente humedecida con agua destilada estéril. Cada recipiente se llenó
con 500 ml de agua destilada, se tapó debidamente y se selló con vinilpel (Véase la Figura
7). Todos los recipientes se ubicaron de la misma forma durante 7 días, en un sitio con poca
luminosidad.

La humedad que se crea en los recipientes plásticos le permite al patógeno pasar de estado
latente a un estado activo en las hojas senescentes, lo cual se puede comprobar mediante la
aparición de estructuras reproductivas de Colletotrichum sp. sobre la lámina foliar, luego de
7 días de incubación, para hojas de guanábana.

3.5.4 Evaluación de los tratamientos para determinar la presencia de infecciones

latentes en follaje Luego de haber establecido en cámaras húmedas durante 7 días las
hojas sometidas a los distintos tratamientos, se procedió a evaluar la cantidad de estructuras
reproductivas de Colletotrichum sp. sobre cada lámina foliar, con el uso de un
estereoscopio (Wild M3Z TM). Se determinó la presencia de los cuerpos fructíferos
(acérvulos) y de acuerdo con esta evaluación, se seleccionó el mejor tratamiento.

3.5.5 Diseño de una escala para la cuantificación de acérvulos sobre la lámina foliar.
Para evaluar la presencia de acérvulos de Colletotrichum sp. sobre la lámina foliar fue
necesario elaborar una escala con seis niveles (Véase la Figura 6); cada uno de ellos está
determinado por un rango de porcentaje que refleja la cantidad de acérvulos propios de
Colletotrichum sp, ya que pueden existir otro tipo de estructuras pertenecientes a otros
hongos que también crecen sobre la hoja y tienden a confundirse con éstos. Se observaron
aproximadamente 350 hojas, para determinar la precisión del uso de la escala. Esta
metodología permite la cuantificación de infecciones latentes a partir de follaje envejecido
de forma rápida (Véase el Cuadro 2).

Cuadro 2. Escala de cuantificación de infecciones latentes de Colletotrichum sp. sobre

la lámina foliar de guanábana

Nivel Porcentaje de
Infecciones Latentes
0 0
1 1-20
2 21-40
3 41-60
4 61-80
5 81-100
Figura 6. Diagrama de la lámina foliar de guanábana con los 5 niveles de cubrimiento
de infecciones latentes (acérvulos)

Se puede observar: A) 0% B) (1-20)% C) (21-40)% D) (41-60) E) (61-80)% F) (81-100)%

3.5.6 Diseño de muestreo de la copa del árbol de guanábana. Se seleccionaron dos lotes
contrastantes con respecto a la incidencia de la enfermedad; el primero de ellos
caracterizado por tener baja incidencia y el segundo, con alta incidencia de antracnosis. De
cada lote se eligieron cinco árboles ubicados en diferentes puntos del terreno, los cuales
fueron marcados con bandas plásticas de colores, con el objeto de identificarlos con
facilidad y evitar confundirlos en los muestreos siguientes (Véase la Figura 8).

Con el objetivo de determinar la distribución espacial del inóculo en la copa del árbol de
guanábana, fue necesario muestrear las hojas de forma estratificada de acuerdo con la
orientación, profundidad y edad; por cada árbol se trabajaron ocho estratos y en cada uno se
recolectaron dos láminas foliares. Para el primer y segundo estrato se recolectaron dos
hojas viejas internas de la parte oriental y dos hojas viejas internas de la zona occidental
respectivamente; para el tercer y cuarto estrato se tomaron dos hojas viejas externas del
oriente y dos hojas viejas externas del occidente (Véase el Cuadro 3).

Para el quinto y sexto estrato se muestrearon dos hojas jóvenes internas del oriente y dos
hojas jóvenes internas de la parte occidental y finalmente, para el séptimo y octavo estrato,
se recolectaron dos hojas externas de la zona oriental y dos hojas jóvenes de la occidental,
de forma respectiva. En total, se estimó muestrear 16 hojas de cada árbol, las cuales fueron
empacadas en bolsas de papel debidamente marcadas; estas a su vez fueron introducidas en
una nevera de icopor hasta la llegada al sitio de procesamiento. Estos muestreos se
realizaron cada 30 días durante siete meses consecutivos, en los cuales se llevó un registro
de condiciones climáticas como temperatura y precipitación, estado fenológico de la planta
y manejo general del cultivo.

Cuadro 3. Muestreo estratificado de la copa para el estudio de la dinámica de

Colletotrichum sp. en guanábana

Estrato Edad Profundidad Orientación

N° de Hojas
2 Vieja Interna Oriente
2 Vieja Interna Occidente
2 Vieja Externa Oriente
2 Vieja Externa Occidente
2 Joven Interna Oriente
2 Joven Interna Occidente
2 Joven Externa Oriente
2 Joven Externa Occidente

3.5.7 Procesamiento de material vegetal. Las hojas fueron mantenidas en bolsas de papel,
marcadas con el estrato, número de árbol y lote, dentro de una nevera de icopor, hasta la
llegada al sitio de trabajo. El procesamiento de las mismas se llevó a cabo en las
instalaciones del laboratorio de Fitopatología del Programa Manejo Integrado de Plagas de
Corpoica, Tibaitatá. Las muestras se lavaron con agua destilada durante 15 minutos,
teniendo en cuenta el estrato correspondiente, luego se dejaron secar a temperatura
ambiente. Seguidamente se procedió a la inmersión de las hojas en paraquat a una
concentración del 4% durante un período de 30 minutos y por último, se permitió su
secado.

Una vez inducido el envejecimiento del follaje recolectado con el uso del herbicida
paraquat, se procedió a colocar las hojas en las cámaras húmedas, mediante la metodología
descrita anteriormente, para ser incubadas durante 7 días.

Figura 7. Establecimiento de hojas senescentes de guanábana en cámaras húmedas

para detección de infecciones latentes

Figura 8. Árbol de guanábana (Annona muricata L)

3.5.8 Identificación y evaluación de infecciones latentes sobre hojas asintomáticas.
Transcurrido el período de incubación establecido de las cámaras húmedas, se evaluó la
cantidad de acérvulos de Colletotrichum sp. en cada una de las hojas correspondientes a
cada estrato, con el uso de la escala de cuantificación de acérvulos, para confirmar la
presencia de infecciones latentes en el follaje asintomático de guanábana. La evaluación de
la lámina foliar se realizó con un estereoscopio (Wild M3Z TM), a partir de la identificación
de acérvulos cremosos color salmón característicos de Colletotrichum acutatum y,
acérvulos secos de coloración gris propios de Colletotrichum gloeosporioides.

Se elaboró un formato para la toma de datos, en el cual se consignaron la fecha de

evaluación, el lote al que correspondía cada árbol, el número del árbol, la edad de las hojas,
la profundidad y orientación en la que fueron muestreadas y, por último, el nivel de la
escala correspondiente al cubrimiento de infecciones latentes o presencia de acérvulos
sobre cada lámina foliar. Estos datos se analizaron mediante ANAVA y, para discriminar
entre las evaluaciones de cada estrato, se utilizó la Prueba de Tukey.

3.5.9 Aislamiento de Colletotrichum sp. a partir de infecciones latentes en hojas. Luego

de haber evaluado las hojas que fueron sometidas al tratamiento de envejecimiento con
paraquat, durante todos los meses se llevó a cabo el aislamiento de Colletotrichum sp. a
partir de la recuperación de cada una de las masas de conidios (acérvulos), con ayuda de un
asa estéril en agar PDA (62.5 g/L de papa, 10 g/L de glucosa, 10 g/L de agar-agar, 8 g/L de
gelatina industrial), con pH entre 5 y 6. Para la selección de los acérvulos se tuvieron en
cuenta las características que identifican a Colletotrichum acutatum como: masas de
conidios cremosos de coloración salmón o naranja, no presentan setas y pueden estar
acompañados de micelio blanco.
Una vez identificados como acérvulos de Colletotrichum acutatum, se sembraron en cajas
de petri con agar PDA, las cuales se marcaron respectivamente y fueron incubadas durante
7 días a 25° C, bajo condiciones de oscuridad.

3.5.10 Aislamiento de Colletotrichum sp. a partir de síntomas de antracnosis en frutos,

botones florales y hojas. Con el objeto de conformar una colección de estudio para
comparar el agente causal de infecciones latentes en follaje asintomático y, de síntomas en
hojas, botones florales y frutos, se procedió a muestrear estos órganos para aislar el
patógeno. Se seleccionaron frutos, botones florales y hojas con síntomas muy iniciales de la
enfermedad, los cuales fueron cortados con tijeras para poda, luego se empacaron en bolsas
de papel que se introdujeron en una nevera de icopor con hielo seco para evitar el desarrollo
normal del hongo, de esta forma se frena su crecimiento y facilita el aislamiento in vitro
(Véase la Figura 9).

Una vez las muestras fueron recolectadas, se procesaron en el menor tiempo posible.
Inicialmente se realizó la descripción de los síntomas propios de cada órgano muestreado;
luego se llevó a cabo corte de cuadros pequeños de manera que dentro del área
seleccionada estuviera el tejido sintomático rodeado de tejido sano. A su vez, estos
cuadrados fueron cortados en forma diagonal (triángulo). Los cortes vegetales fueron
ubicados con pinzas previamente flameadas en el interior de cajas de petri estériles,
debidamente marcadas con el órgano correspondiente del cual se cortaron. Después, los
cortes fueron transferidos a una solución de hipoclorito de sodio al 2% durante 1 minuto y,
se realizaron tres enjuagues con agua destilada estéril, luego se sumergieron 3 veces en
alcohol al 70% durante 10 segundos y nuevamente se hicieron tres enjuagues con agua
destilada estéril, para terminar de remover los desinfectantes.

Los cortes del tejido vegetal, ya desinfectados, se ubicaron sobre servilletas estériles
marcadas con el órgano correspondiente del cual fueron obtenidos. Cada uno de ellos se
sembró en cajas de petri con agar PDA (39g/L de agar papa-dextrosa-agar, MERCK ®), de
tal forma que el tejido afectado estuviera en contacto directo con la superficie del medio.
Las cajas se sellaron con vinilpel y se incubaron a 25 ºC, durante 5 días en oscuridad.

Figura 9. Síntomas de la antracnosis vistos en campo y bajo estereoscopio

Se puede observar: A) síntoma inicial apropiado para el aislamiento de Colletotrichum sp.
B) lesión en estado avanzado

3.5.11 Purificación de los aislamientos de Colletotrichum sp. Transcurrido el tiempo de

incubación, se verificó el crecimiento de Colletotrichum sp. mediante el reconocimiento de
características macroscópicas propias de este género, como: color de la colonia (naranja o
gris), presencia de anillos concéntricos, masas de conidios color naranja, aspecto ralo de la
colonia y microscópicas como forma y tamaño de los conidios (extremos redondeados o
acusados). La medición de los conidios se realizó con un micrómetro (Olympus ®) 100
veces y se promedió el resultado. Con ayuda de una aguja de disección se hizo un corte de
la colonia de Colletotrichum sp. y se sembró en agar PDA (39g/L de agar papa-dextrosa-
agar, MERCK ®) acidificado con ácido láctico, para ajustar el pH entre 5 y 6. Las cajas de
petri fueron marcadas y selladas con vinilpel durante 7 días e incubadas a una temperatura
de 25ºC, bajo condiciones de oscuridad. Se realizaron varios pases de estos aislamientos
hasta obtener cultivos puros.

3.5.12 Conformación de una colección de estudio a partir de cultivos monoconidiales

de Colletotrichum sp. De todos los aislamientos de Colletotrichum sp. obtenidos a partir de
infecciones latentes, síntomas en hojas, botones y frutos, se seleccionaron 20, 5
correspondientes a cada órgano de origen. Según la metodología propuesta por Wang-
Ching y Wen-Hsiung en 1997 y modificada por Torres en el 2004, se procedió a realizar
cultivos monoconidiales con el fin de obtener un individuo de la colonia pura.

Para lo anterior fue necesario esterilizar a 15 lbp y 115°C durante 15 minutos 80 tubos de
vidrio taparosca, con diámetro de 1.8 cm y 6.5 cm de altura, los cuales se llenaron
previamente con 1 ml de agua destilada y se almacenaron a 4°C hasta el momento en que
fueron utilizados. Simultáneamente, se preparó agar agua (13 g/L de agar-agar, MERCK ®)
para la germinación de los conidios y agar PDA (39g/L de agar papa-dextrosa-agar,
MERCK ®) para el aislamiento de los mismos.
De cada aislamiento se tomó una muestra pequeña con un asa estéril, se diluyó en cada tubo
con 1 ml de agua destilada estéril y se homogenizó con un vórtex. Se calculó la
concentración de la solución en una cámara de Neubauer mediante recuento de conidios en
los 64 cuadrados de los 4 extremos y aplicando la fórmula de la cámara.

Conidios/ml = (recuento de conidios)*(16x104)/64

Luego de conocer la concentración de conidios de los tubos correspondientes a cada

aislamiento, se procedió a ajustar a una concentración de 1 conidio/µl en un volumen final
de la solución de 1 ml, aplicando la fórmula de concentración y volumen dada de la
siguiente manera:

C1*V1 = C2* V2

Donde:

C1 = Conidios/1000 µl

V1 = X (µl)

C2 = 1 conidio/µl

V2 = 1000 µl

Una vez conocidos los microlitros correspondientes al volumen de la solución inicial de

conidios, con ayuda de una micropipeta (Finnpipette ®), esta cantidad se le restó a los 1000
µl de agua destilada estéril contenidos en el tubo taparosca y luego se completó con el
volumen hallado de la solución de conidios, para obtener finalmente una concentración de
1conidio/µl y un volumen final de 1000 µl.

Germinación de los conidios de Colletotrichum sp. sobre agar agua. De la nueva

solución de conidios (C2 = 1conidio/µl), se tomó con la micropipeta un volumen igual a
1µl. Para ubicar de forma correcta este volumen, fue indispensable dibujar con marcador
permanente 10 círculos de 0.5 cm de diámetro por el reverso de las cajas de petri que
contenían agar agua, donde en cada espacio guía señalado se colocaba cada µl, con el
objetivo de ubicar de forma fácil y rápida cada conidio al momento de evaluar la
germinación de los mismos. Cada caja de petri fue marcada de acuerdo al órgano del cual
se aisló Colletotrichum sp., se selló con papel Parafilm® y se incubó a 25°C durante 6 a 8
horas en la oscuridad.

Cumplido el tiempo de incubación, se confirmó con el uso de un microscopio la

germinación de los conidios. La superficie del medio agar agua se observó a 10X,
exactamente se enfocó el área delimitada por los círculos dibujados, y se buscaron conidios
propios del género Colletotrichum sp. que tuvieran tubo germinal. El área de agar agua que
tenía el conidio en germinación, fue cortada con un asa caliente y se sembró en medio PDA
acidificado (39g/L de papa-dextrosa-agar, MERCK ®; 100 µl de ácido láctico y 300 mg/L
de sulfato de estreptomicina). Las cajas con los cultivos monoconidiales fueron incubadas a
25°C en la oscuridad durante 5 días y adicionalmente, se le asignó a cada una un código
escrito así: para infecciones latentes (IL01, IL02 hasta IL05) y para síntomas, en botón
(SB01-SB05), en fruto (SF01-SF05) y finalmente síntomas en hojas (SH01-SH05).

3.5.13 Conservación de la colección de estudio en glicerol y papel. Cada colonia

obtenida con la metodología de cultivos monoconidiales, representa un individuo del
género Colletotrichum sp. y por ende, garantiza la pureza de la misma. Para conservar estos
cultivos se utilizaron 100 tubos eppendorf ® nuevos y estériles de 1 ml con glicerol al 20%
(20g/100ml de glicerol), el cual fue autoclavado en alícuotas a 15 lbp - 115°C por 15
minutos y servido en cada tubo, bajo condiciones estériles.

Se hicieron cortes circulares de cada cultivo con un asa estéril y se transfirieron 3 de ellos
para cada tubo eppendorf ® con glicerol, sobre la tapa del tubo se marcó con el código
correspondiente al cultivo origen, se colocaron en una gradilla, se envolvió en papel
vinilpel y se almacenaron a –10°C.

Para la conservación en papel, fue necesario tener colonias con un diámetro de crecimiento
de 2 cm aproximadamente, sobre las que se colocaron triángulos estériles de papel filtro,
con el fin de que Colletotrichum sp. colonizara el papel (Véase la Figura 10). Las cajas de
petri fueron selladas con vinilpel, marcadas con el código asignado e incubadas a 25°C en
oscuridad hasta que el papel estuvo cubierto de acérvulos y micelio de Colletotrichum sp.
Luego se retiró el papel con pinzas flameadas y se colocó dentro de cajas de petri estériles
marcadas, las cuales se ubicaron en un horno a una temperatura no mayor a 27°C; pasados
2 días se voltearon los triángulos colonizados, para permitir el completo secado de los
mismos por otro período de 2 días. Finalmente, los trozos de papel se colocaron dentro de
bolsas de pergamino estériles marcadas con el código correspondiente y conservadas a –
10°C.

Figura 10. Aislamientos de la colección de Colletotrichum sp. conservados en papel

filtro
3.5.14 Reactivación de cultivos puros de Colletotrichum sp. Se seleccionaron 20 colonias
conservadas en tubos eppendorf ® y se dejaron descongelar a temperatura ambiente; con el
uso de un asa estéril se pasó cada trozo de la colonia a cajas de petri con medio PDA
acidificado (39g/L de papa-dextrosa-agar, MERCK ®; 100 µl de ácido láctico, pH 5-6). Las
cajas se marcaron con cada código y se incubaron a 25°C en la oscuridad, durante 5 días.

3.5.15 Caracterización biológica de la colección de estudio de Colletotrichum sp. De

acuerdo a la metodología propuesta por Timmer (1998) y utilizada por Torres (2005), se
preparó un medio selectivo para el género Colletotrichum compuesto de la siguiente
manera: PDA, hidróxido de cobre (42mg Cu/L) y estreptomicina (300mg/l) con el cual se
evalaron morfología y color de la colonia.

Con el fin de evaluar la sensibilidad a un fungicida, se eligió Benomyl, por ser uno de los
más utilizados para el control de la enfermedad; en la prueba, los 20 cultivos se sometieron
a crecimiento en medio PDA con Benomil propuesto por Bernstein en 1995 (39g/L de
papa-dextrosa-agar, MERCK ®; 100 µl de ácido láctico, pH 5-6; 2ul/ml de Benomil) y se
comparó la velocidad del crecimiento con respecto a medio PDA acidificado ((39g/L de
papa-dextrosa-agar, MERCK ®; 100 µl de ácido láctico, pH 5-6).

3.5.16 Caracterización molecular de Colletotrichum sp. A partir de la colección de

estudio conformada por los 20 cultivos monoconidiales de Colletotrichum sp., se tomó con
un asa estéril una muestra representativa de acérvulos de cada colonia y se diluyó en 1 ml
de agua desionizada destilada estéril contenida en un tubo eppendorf®. Los 20 tubos se
conservaron durante 24 horas en un freezer a –20°C. La extracción del ADN de
Colletotrichum sp. se hizo con el kit Ultraclean DNA Soil de MOBIO®.

Para realizar la amplificación del ADN de Colletotrichum sp. se utilizaron dos primers
específicos tipo ITS1 del ADN ribosomal (Invitrogen®) para el género objeto de estudio,
tomando como referencia las secuencias publicadas por Mills en 1994, los cuales se
emparejaron con el primer universal ITS4. El primero de ellos es el primer CaInt2
específico para Colletotrichum acutatum (5’- GGGGAAGCCTCTCGCGG-3’) y el
segundo es el primer CgInt, específico para Colletotrichum gloeosporioides (5’-
GGCCTCCCGCCTCCGGGCGG-3’).

Se preparó una solución master mix para 41 reacciones, 20 de ellas con el primer CgInt y
las 21 restantes con el primer específico para C. acutatum CaInt2. A cada tubo para PCR
que contenía la solución máster se le adicionaron 2 µl de la solución con DNA, extraído a
partir de conidios de Colletotrichum sp. (Véase el Cuadro 4)

Cuadro 4. Solución máster mix para 41 reacciones de PCR

Reactivo 1 Reacción 41 reacciones

H2O (grado molecular) 19µl 779µl
Buffer + MgCl2 2.5µl 102.5µl
dNTPs 0.5µl 20.5µl
Primer ITS4 1 µl 41µl
Taq polymerasa 0.3µl 24.6
Primer CaInt2/CgInt 1µl 1 µl

Se realizó la PCR con el uso del termociclador SynGen de Biotech® y el programa

COLLEO1 propuesto por Torres (2005). (Véase el Cuadro 5)

Cuadro 5. Programa del termociclador COLLE01 utilizado para PCR

Pasos Temperatura Tiempo

Denaturación inicial 94 ºC 2 min
Denaturación por ciclo 94 ºC 30 seg
Anillamiento 57 ºC 30 seg
Extensión 72 ºC 30 seg
Amplificación Paso 2 al 4 30 ciclos
Extensión final 72 ºC 4 min
Finalización 4 ºC Necesario

Con el fin de visualizar los productos amplificados, se llevó a cabo la electroforesis de

ácidos nucleicos mediante la preparación de un gel de agarosa al 1.5% (45 mg de agarosa,
30 ml de buffer TBE 0.5X). Se utilizaron 5µl de un marcador de 100 pb de Bioline®, el
cual fue servido en el primer pozo del gel. En cada uno de los siguentes pozos se pusieron
10µl de una solución compuesta por: 2 µl de buffer de carga (BIORAD®) y 8µl de producto
de PCR. Los geles se sometieron a una carga eléctrica de 100 voltios durante 30 minutos en
una cámara horizontal de BIORAD®. Finalmente, se tiñeron bromuro de etidio (10 µg/ml,
SIGMA®) por 30 minutos y se lavaron 2 veces con agua destilada desionizada durante 15
minutos. Como control positivo, se sembró en uno de los pozos el producto de PCR del
aislamiento de Colletotrichum acutatum de tomate de árbol y, como control negativo, se
utilizó agua grado molecular.

Las bandas se visualizaron en un transiluminador (Transiluminator UVP) a una longitud de

onda de 254 nm y se analizó cada gel con el uso del software SynGen de Biotech®.

3.6 INSTRUMENTOS

Los instrumentos utilizados para el desarrollo del presente proyecto son los siguientes:

• Balanza Analítica

• Calibrador

• Micropipetas de 10, 100 y 1000 µl

• Cámara de Neubauer

• Microscopio

• Estereoscopio

• Cámara Digital

• Termociclador

• Cámara Horizontal de Electroforesis

• Transiluminador UV
3.7 TÉCNICAS DE RECOLECCIÓN Y ANÁLISIS DE DATOS

3.7.1 Evaluación de presencia de acérvulos en el follaje. Se tomaron datos de presencia

de acérvulos sobre el follaje asintomático de guanábana, durante siete meses de muestreo.
Para la toma de estos datos se diseñó una escala de seis niveles, la cual va desde cero hasta
cinco, siendo cero ausencia y, cinco, 100% de colonización. Los datos fueron analizados
mediante el programa SAS con análisis de varianza tipo GLM.

3.7.2 Evaluación del crecimiento de Colletotrichum sp. en diferentes medios de cultivo.

Las mediciones del diámetro de crecimiento de las colonias se realizaron con un calibrador
durante siete días. Se sembró cada colonia en medio PDA industrial y medio selectivo para
Colletotrichum sp., el diámetro de crecimiento se midió a partir de las 72 horas. Para
determinar la sensibilidad al fungicida benomyl, fue necesario comparar el crecimiento en
agar PDA y este mismo medio, suplementado con el fungicida. Se midió el diámetro de
crecimiento de cada colonia a partir de las 48 horas.
 4. RESULTADOS

4.1 ESTANDARIZACIÓN DE ENVEJECIMIENTO FOLIAR PARA DETECCIÓN

DE INFECCIONES LATENTES EN GUANÁBANA

La detección de infecciones latentes mediante el envejecimiento de las hojas de guanábana,

se basó en el protocolo propuesto por Biggs (1990), el cual fue modificado inicialmente por
Torres (2005), para las condiciones específicas de las hojas de tomate de árbol.

Para la estandarización en guanábana inicialmente se sumergieron las hojas en diferentes

soluciones del fungicida paraquat (2, 4 y 6 %) tanto hojas jóvenes como hojas viejas,
durante 30 minutos. Transcurrido dicho tiempo las hojas se retiraron de la solución y se
secaron a temperatura ambiente (17 más o menos 2), las hojas se establecieron en las
cámaras húmedas durante 5 días. La presencia de cuerpos fructíferos (acérvulos) se evaluó
bajo estereoscopio durante tres días (Véase el Cuadro 6).

Cuadro 6. Evaluación bajo estereoscopio del follaje tratado con paraquat

% de Hojas Evaluación Evaluación Evaluación

Concentración Día 5 Día 6 Día 7
Paraquat
2 Joven No se observó necrosis. Indicios de necrosis 20% de Necrosis
Crecimiento nulo de 0% crecimiento de 0% crecimiento de
Colletotrichum sp. Colletotrichum sp. Colletotrichum sp.

2 Vieja Necrosis mínima Necrosis media. 40% de Necrosis

0% crecimiento de Crecimiento de micelio Presencia de micelio
Colletotrichum sp. blanco blanco
4 Joven Inicio de necrosis Necrosis media Necrosis total
Crecimiento de micelio Presencia de pocos Acérvulos en gran
blanco acérvulos cantidad
4 Vieja Necrosis media Necrosis media Necrosis total
Crecimiento de micelio Micelio grisáceo y Micelio grisáceo y gran
blanco acérvulos cantidad de acérvulos
6 Joven Necrosis total Necrosis total Necrosis total
Ninguna estructura
visible
6 Vieja 100% de necrosis 100% de necrosis 100% de necrosis
Ninguna estructura
visible
Conforme a los resultados obtenidos a partir de los tratamientos planteados, se concluyó
que el tratamiento de las hojas asintomáticas de guanábana con paraquat a una
concentración de 4% y un período de incubación en cámaras húmedas de 7 días, fue la
combinación más indicada, pues se observó el necrosamiento total de la lámina foliar y el
crecimiento de acérvulos característicos de Colletotrichum sp. De esta forma, se eligió este
tratamiento como la mejor alternativa para la detección de infecciones latentes en el follaje
de guanábana.

Los tratamientos por choque térmico no dieron ningún resultado satisfactorio para el
envejecimiento del follaje y por ende no se observó la presencia de acérvulos; sólo se
confirmó el crecimiento de microorganismos saprófitos como Penicillium sp, Aspergillus
sp., entre otros, por lo cual se descartó esta metodología.

4.2 DETECCIÓN DE INFECCIONES LATENTES MEDIANTE LA PRESENCIA

DE ACÉRVULOS DE Colletotrichum sp.

Luego de haber elegido el mejor tratamiento con paraquat al 4% durante 30 minutos e

incubación por 7 días en cámaras húmedas, con el objetivo de inducir envejecimiento para
detectar infecciones latentes, se procedió a evaluar la presencia de acérvulos propios de
Colletotrichum sp., sobre cada una de las hojas, con ayuda de un estereoscopio.

Para lo anterior se tomó como referencia la descripción morfológica realizada por Sutton
(1992), en la cual afirma que acérvulos color rosado, salmón-rosado a naranja sin setas, son
característicos de Colletotrichum acutatum y, acérvulos grises o algunas veces naranja
pálido con setas, de Colletotrichum gloeosporioides. Ambos tipos de acérvulos fueron
observados sobre el envés de la lámina foliar, en mayor cantidad los que correspondían a
Colletotrichum acutatum. Se realizó un montaje de cada acérvulo en un portaobjetos y fue
observado bajo microscopio, para verificar los conidios de C. acutatum o C.
gloeosporioides (Véase la Figura 10).

4.3 CUANTIFICACIÓN CON ESCALA DE LAS INFECCIONES LATENTES EN

HOJAS ASINTOMÁTICAS DE GUANÁBANA

De acuerdo con la escala planteada para la evaluación de infecciones latentes en hojas no

sintomáticas de guanábana, se cuantificó en porcentaje la presencia de masas de conidios
agrupados en acérvulos y se ubicó este valor dentro de una de las divisiones (Véanse la
Figura 11 y el Cuadro 7)

Se evaluaron 160 hojas mensualmente y, los datos correspondientes a cada estrato se

tomaron y organizaron de acuerdo a un formato para el análisis de la distribución espacial
de Colletotrichum sp. sobre el follaje de guanábana mediante análisis de varianza y prueba
de Tukey (Véase el Cuadro 8).

Figura 10. Acérvulos característicos de Colletotrichum sp. observados sobre el envés

de hojas de guanábana

Se pueden observar: A) Acérvulos con masas de conidios color naranja B) Masas de

conidios color salmón C) Conidios en masas con coloración rosada

Figura 11. Envés de hoja de guanábana con más del 80% de infecciones latentes
(presencia de acérvulos) después del tratamiento con paraquat al 4%. Valor ubicado
en la división 5 de la escala
Cuadro 7. Porcentaje de infecciones latentes

División % de Infecciones
latentes
0 0
1 1-20
2 21-40
3 41-60
4 61-80
5 81-100

Cuadro 8. Modelo del formato para la toma de datos de infecciones latentes

FECHA LOTE ARBOL EDAD PROFUND. ORIENTA HOJA NIVEL

Feb-05 1 1 V E E 1 1
Feb-05 1 1 V E E 2 1
Feb-05 1 1 V E W 1 3
Feb-05 1 1 V E W 2 3
Feb-05 1 1 V I W 1 2
Feb-05 1 1 V I W 2 2
Feb-05 1 1 V I E 1 1
Feb-05 1 1 V I E 2 1
Feb-05 1 1 J E E 1 0
Feb-05 1 1 J E E 2 0
Feb-05 1 1 J E W 1 0
Feb-05 1 1 J E W 2 0
Feb-05 1 1 J I W 1 0
Feb-05 1 1 J I W 2 0
Feb-05 1 1 J I E 1 0
Feb-05 1 1 J I E 2 0

4.4 ANÁLISIS DE LA DISTRIBUCIÓN ESPACIAL DE Colletotrichum sp. EN EL

COPA DE Annona muricata L.

Desde febrero hasta agosto se realizaron 7 evaluaciones del porcentaje de infecciones

latentes en las hojas asintomáticas de guanábana, teniendo en cuenta los estratos
seleccionados para los muestreos.
Febrero. De acuerdo al análisis de varianza no se encontraron diferencias significativas de
la cantidad de infecciones latentes entre lotes, edad de las hojas o profundidad. Hubo
diferencias significativas entre árboles en cuanto a la presencia de acérvulos con un F de
0.0417, menor que el ∝ (0.05) planteado.

Al evaluar durante este mes el porcentaje de infecciones latentes, de acuerdo con la

orientación de las hojas muestreadas, estos resultados mostraron diferencias altamente
significativas (0.0057) en cuanto a la ubicación de Colletotrichum sp. entre oriente y
occidente, siendo ésta última la parte del copa donde se encontraron más acérvulos del
patógeno, lo cual se confirmó mediante la prueba de Tukey (P<0.05).

Marzo. Se observaron de nuevo diferencias altamente significativas (< 0.001) entre los
árboles muestreados por cada lote; cada uno de ellos presentó un porcentaje diferente de
infecciones latentes. Durante este mes, los resultados entre lote, edad u orientación no
mostraron diferencias. Por el contrario, sí se encontraron diferencias significativas (0.0249)
a nivel de profundidad, entre la parte interna y externa; según la prueba de Tukey la
ubicación de las infecciones latentes en la zona externa de la copa fue más representativa.
No se observó interacción entre las fuentes de variación durante marzo.

Abril. Los análisis realizados para los datos registrados de este mes muestran diferencias
altamente significativas de forma sucesiva a nivel de los lotes (< 0.001) y entre los árboles
muestreados (< 0.001). Según la prueba de Tukey, la mayor presencia del patógeno en
forma de infecciones latentes durante este mes, corresponde al lote 2.

Simultáneamente se observaron diferencias significativas (0.0193) entre las hojas jóvenes y

viejas, estrato que corresponde a la edad, de tal manera que de acuerdo a la prueba de
Tukey la mayor cantidad de acérvulos durante el mes de Abril se encontró en las hojas
jóvenes.

Se encontró interacción entre lote y edad de las hojas muestreadas con diferencias muy
significativas (0.0051).

Mayo. Los datos analizados mostraron nuevamente un comportamiento similar a los dos
meses anteriores a nivel de lotes, en el cual, la presencia del patógeno en forma de
infecciones latentes fue más evidente en el lote 2; por consiguiente hubo diferencias
altamente significativas (0.0005). Los resultados de la prueba de Tukey relacionados con el
estrato edad, mostraron que la presencia de acérvulos como evidencia de infecciones
latentes, fue superior en las hojas jóvenes que en las viejas (P< 0.001).
Según el análisis de varianza, se encontró interacción entre los lotes y las edades de las
hojas muestreadas por cada uno; los resultados mostraron diferencias altamente
significativas (0.0054).

Junio. El análisis estadístico de los datos mostró un comportamiento similar al mes de

febrero, en el cual hubo diferencias muy significativas (0.0002) entre los árboles, lo que
indica que la presencia de cuerpos fructíferos de Colletotrichum sp. (acérvulos), fue
diferente para cada uno.

En el estrato orientación, los resultados observados tuvieron diferencias altamente

significativas (< 0.001); la parte occidental del árbol, según Tukey, fue la zona con la
mayor presencia de infecciones latentes. Durante este mes no hubo interacción entre los
estratos edad, orientación y profundidad.

Julio. Según los datos analizados para el mes de julio, a nivel de lotes se encontraron una
vez más diferencias significativas (0.0376), el lote 2 presentó el mayor porcentaje de
infecciones latentes en las hojas, según los análisis de la prueba de Tukey.

Los resultados obtenidos del ANAVA y de la prueba de Tukey, mostraron diferencias muy
significativas entre árboles de cada lote (P< 0.001) y también en el estrato edad (P< 0.001).
En este último, la mayor cantidad de acérvulos del patógeno se halló en las hojas jóvenes.

En el estrato orientación se presentaron diferencias altamente significativas (P< 0.001)

entre las zonas occidental y oriental de la copa. La parte correspondiente a occidente resultó
el lugar donde se encontraron más infecciones latentes de Colletotrichum sp. confirmadas
por la presencia de acérvulos.

Durante este mes se presentó interacción entre el estrato correspondiente a la orientación

(zona occidental y oriental de la copa) y los lotes muestreados (1 y 3) con diferencias
significativas (0.0120) entre estas dos fuentes de variación.

Agosto. De acuerdo con el análisis estadístico para los datos correspondientes a Agosto, se
observaron diferencias significativas (0.0113), al igual que en los meses anteriores, a nivel
de lotes. El lote 2 resultó con la mayor presencia de infecciones latentes. por consiguiente,
diferencias altamente significativas (0.0021) fueron notables entre cada uno de los árboles.

Los datos analizados por medio de la prueba de Tukey para el estrato edad (hojas jóvenes y
viejas), mostraron diferencias muy significativas (P< 0.001); en las hojas jóvenes se
encontró la mayor cantidad de acérvulos de Colletotrichum sp. Igualmente, la orientación
también tuvo un comportamiento con diferencias estadísticamente muy significativas (P<
0.001); el occidente fue la zona con la cantidad de cuerpos fructíferos (acérvulos) más
representativa.

Hubo interacción entre los datos analizados a nivel de lotes y la edad de las hojas con
diferencias significativas (0.0308); el lote 2 y las hojas jóvenes tuvieron la mayor cantidad
de presencia de infecciones latentes. Se observó interacción entre lote y profundidad, las
diferencias fueron muy significativas (0.0028), el segundo lote y la zona externa tuvieron
alta presencia de acérvulos de Colletotrichum sp.

De nuevo hubo interacción entre lote y edad de las hojas, se encontraron diferencias
altamente significativas (0.0028) para los datos analizados; las hojas jóvenes del lote 2
mostraron el mayo porcentaje de infecciones latentes.

4.5 IDENTIFICACIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE SÍNTOMAS DE

ANTRACNOSIS EN DIFERENTES ÓRGANOS DE Annona muricata L.

Síntomas en hojas. Para llevar a cabo los aislamientos de Colletotrichum sp. a partir de
órganos sintomáticos de antracnosis, fue necesario realizar un muestreo de cada uno, con la
metodología correspondiente.

La lámina foliar y la nervadura de la hoja de guanábano presentaron 4 estados de síntomas

que se pueden diferenciar. El primero de ellos se caracterizó por tener una lesión muy
pequeña de borde definido, con un tamaño de 0.5 a 3.0 mm, acircular, de coloración café
oscuro, consistencia seca, textura lisa y con hundimiento (Véase la Figura 13). Cuando el
síntoma se presentó sobre la nervadura, tuvo una coloración más oscura con las demás
características similares a las de la lámina foliar (Véase la Figura 15). En este estado no se
presentó clorosis, fue más frecuente su aparición en los bordes de la lámina y resultó
óptimo para la recuperación de Colletotrichum sp (Véase la Figura 14).

En el segundo estado, la lesión mostró una coloración café menos oscuro, ovalada y no fue
uniforme; en el centro el tejido colapsó, fue seco, liso y con mayor hundimiento; el borde
estuvo más pronunciado y fue más oscuro que en la parte central. El tamaño de la lesión
osciló entre 0.5 y 1.0 cm. No se observó clorosis pero sí una proyección de la lesión a lo
largo y ancho de la lámina, lo cual indicó el estado inicial de la maduración del síntoma.

El estado tres se caracterizó por ser una lesión adulta, madura, se observó una mancha de
color marrón claro con el tejido completamente seco y roto en el centro. Cuando la lesión
se encontró en el borde se apreció enroscamiento de la lámina. El tamaño de la mancha
estuvo entre 1.0 y 2.0 cm, y fue de forma ovalada y con borde definido. Se observaron
algunos acérvulos sobre la lesión lo cual indicó la aparición de los primeros signos de la
enfermedad. Cuando el síntoma se presentó en la nervadura, se pudo identificar una
mancha de color pardo claro, con hundimiento, de forma ovalada, clorosis alrededor, la
cual se pronunció hacia la lámina, el tamaño alcanzó hasta 3.0 cm de longitud (Véase la
Figura 15).

El cuarto estado de la lesión en la lámina presentó una coloración café más clara que en los
estados anteriores, madura, tejido muy seco, el cual colapsó completamente y por esta
razón se pudo observar rompimiento del mismo en la parte del centro, el tamaño fue mayor
de 2.0 cm. Se observó una gran cantidad de acérvulos sobre toda la lesión y algunas veces
se agruparon en anillos concéntricos

Síntomas en botones y frutos. Los síntomas que se presentaron en estos órganos tuvieron
los cuatro estados similares a los de las hojas. En los botones, las lesiones siempre
presentaron borde definido y fueron más frecuentes hacia la base de los pétalos y sépalos y
algunas veces se unieron varias lesiones acelerando la pudrición de la flor; a medida que la
lesión fue madurando se adentró en el botón, cubrió la mayor parte de éste. En los últimos
estados, al igual que en hojas, se pudieron verificar los signos de Colletotrichum sp., con la
aparición de masas de esporas sobre el tejido que colapsó completamente.

En el fruto, se presentaron también los estados anteriores; las lesiones se observaron como
manchas de borde definido, color café oscuro, hundidas, similar a un chancro;
posteriormente, el tejido tomó una apariencia seca y se rompió. En los dos últimos estados
se afectó el interior del fruto y ocasionó daño en la pulpa; igualmente, en la corteza se
observaron los cuerpos fructíferos del patógeno.

4.6 COLECCIÓN DE ESTUDIO DE Colletotrichum sp.

Con el objeto de conformar la colección de estudio, todos los aislamientos fueron

caracterizados a nivel macroscópico mediante descripción morfológica. Para lo anterior, se
tuvo en cuenta que cada aislamiento presentara características propias del género
Colletotrichum sp. como: color de la colonia naranja o gris, colonias ralas o con micelio
aéreo, presencia de halos concéntricos, alto nivel de esporulación, cantidad de acérvulos y
velocidad de crecimiento en medio PDA (39g/L de PDA, MERCK ®). Se observaron los
conidios de todos los aislamientos de Colletotrichum sp. bajo microscopio (Véase la Figura
12), se midió 100 veces el tamaño (largo y ancho) de cada uno y se promedió. Se tuvo en
cuenta para la selección de los aislamientos, la forma de los extremos de los conidios,
acusados, redondos o, la combinación de ambos.
De todos los aislamientos obtenidos a partir de acérvulos naranjas presentes sobre las
láminas foliares y de síntomas iniciales en hojas, botones y frutos, los cuales fueron
identificados como Colletotrichum sp., se seleccionaron 5 de cada órgano de origen, para
conformar una colección de estudio de 20 aislamientos del patógeno.

Una vez purificados, se realizó cultivo monoconidial a todos los aislamientos, con el fin de
tener un individuo y a cada uno se le registraron las características macro y microscópicas
(Véanse los Cuadros 9 y 10). Adicionalmente, se le asignó el código de acuerdo al órgano
del cual se obtuvo el aislamiento y al número, por ejemplo: IL05, SF02, SB01, SH03, etc.

Figura 12. Medición de conidios de Colletotrichum sp. teñidos con azul de lactofenol

Figura 13. Secuencia de síntomas de la antracnosis en la lámina foliar de guanabana

Se pueden observar: A) Lesión en estado inicial sobre la hoja a 10X B) Lesión

característica en estado intermedio C) Síntoma típico en estado avanzado
Figura 14. Estados iniciales de la antracnosis en el borde de la lámina foliar de
guanabana

Se pueden observar: D) Estado inicial del síntoma en el borde de la hoja a 10X E) Síntoma
caracterizado por lesión madura del borde a 10X.

Figura 15. Secuencia de síntomas de la antracnosis en la nervadura de la lámina foliar

de guanabana

Se pueden observar: F) Lesión inicial sobre la nervadura a 10X G) Síntoma sobre nervadura
en estado intermedio H) Lesión avanzada, el tejido ha colapsado.
Cuadro 9. Caracterización morfológica macroscópica de la colección de estudio de
Colletotrichum sp

Cepa Color Anillos Tipo de Aspecto de la Nivel de Color de las masas

Colonia Concéntricos Micelio Colonia Esporulación de conidios

SB01 Blanco y Presentes Esponjoso Elevado con Medio Rosados y negro

gris borde definido
SB02 Blanco y Presentes Esponjoso de Elevado sin Alto Rosados y negro
gris color gris borde definido
SB03 Blanco Ausentes Algodonoso Plana de borde Alto Naranja
definido
SB04 Blanco y Presentes Algodonoso Plana sin borde Bajo Rosados
gris definido
SB05 Blanco Presentes Poco Plana de borde Medio Naranja
algodonoso definido
SF01 Naranja Presentes Mínimo de Plana de borde Alto Naranja
color blanco definido
SF02 Blanco Presentes Esponjoso gris Elevado de Alto Naranja
verdoso borde definido
SF03 Naranja Presentes Poco esponjoso Plana de borde Alto Naranja
definido
SF04 Gris Presentes No tiene Plana de borde Alto Naranja
definido
SF05 Blanco Presentes Esponjoso Elevado sin Alto Naranja
borde definido
SH01 Blanco y Presentes Esponjoso en Elevado con Alto Rosados
gris gran cantidad borde definido
SH02 Blanco y Ausentes Esponjoso Elevado sin Bajo Naranja
gris grisáceo borde definido
SH03 Blanco y Presentes Esponjoso en Elevado con Alto Rosados
gris gran cantidad borde definido
SH04 Blanco Ausentes Esponjoso Elevado sin Bajo Naranja
grisáceo borde definido
SH05 Blanco y Presentes Esponjoso en Elevado con Alto Naranja
gris gran cantidad borde definido
IL01 Blanco y Ausentes Esponjoso Plana de borde Alto Naranja
gris definido
IL02 Naranja Presentes Poco Plana de borde Alto Naranja
algodonoso definido
IL03 Blanco y Presentes Esponjoso y Plana de borde Alto Rosados y negro
gris abundante definido
IL04 Blanco y Ausentes Esponjoso Plana de borde Alto Rosados y negro
gris definido
IL05 Naranja Presentes Poco esponjoso Plana de borde Alto Naranja
definido

De acuerdo al estudio de la morfología de los cultivos de la colección de Colletotrichum sp.

fue posible identificar cuatro tipos de colonia con respecto al color: colonias blancas con
gris, blancas, naranja y gris (Véase la Gráfica 1).
Gráfica 1. Porcentaje de aislamientos de la colección de estudio que presentaron una
coloración blanco y gris, blanco, naranja y gris en medio PDA

5%
20%

50%

25%

Blanco y gris Blanco Naranja Gris

Con relación al color de las masas de los conidios de cada uno de los aislamientos, se
observaron dos colores que permiten agrupar las colonias: colonias con masas de conidios
rosadas y masas de conidios naranjas. El 65% de los asilamientos de la colección, presentó
colonias con masas naranjas y el 25% restante fueron masas rosadas (Véase la Gráfica 2).

Gráfica 2. Porcentaje de los aislamientos de la colección que produjeron masas de

conidias en dos coloraciones naranja y rosado

70 65%

60

50

40 35%

30

20

10

0
Naranjas Rosados
Cuadro 10. Caracterización microscópica de la colección de estudio de Colletotrichum
sp

Tamaño de los
Conidios Largo Ancho Forma de los
Cepa (µm) (µm) Conidios
SB01 16.80 4.50 Ovaladas con un extremo más angosto que
otro. Ambos extremos redondeados
SB02 16.20 4.20 Totalmente ovaladas con extremos
redondeados
SB03 16.35 4.05 Ovaladas un poco disminuidas en cada
extremo
SB04 16.60 4.35 Ovaladas y estrechas en el centro. Extremos
redondos
SB05 15.95 4.80 Ovaladas con extremos acusados

SF01 14.45 2.80 Fusiformes y estrechas con un extremo más

angosto.
SF02 14.50 2.95 Ovaladas y estrechas en el centro con uno
de los extremos acusados
SF03 15.38 3.65 Fusiformes con ambos extremos acusados

SF04 14.55 3.95 Totalmente ovaladas con extremos

redondeados
SF05 15.40 4.00 Ovaladas con un extremo acusado, rectas

SH01 16.35 4.75 Cilíndricas y alargadas con extremos

redondeados
SH02 17.05 5.85 Cilíndricas y grandes, la mayoría con
extremos redondeados
SH03 16.95 5.80 Cilíndricas con ambos extremos
redondeados
SH04 16.20 5.95 Fusiformes y muy grandes, la mayoría con
uno de los extremos acusados
SH05 13.35 3.70 Alargadas con extremos acusados

IL01 13.55 3.40 Rectas y pequeñas con ambos extremos

acusados
IL02 13.70 3.50 Fusiformes con ambos extremos acusados

IL03 16.50 3.55 Ovaladas y estrechas con extremos

redondos

IL04 16.85 3.85 Ovaladas un poco disminuidas en uno de

los extremos
IL05 13.75 3.45 Rectas y pequeñas con ambos extremos
acusados
4.7 CARACTERIZACIÓN BIOLÓGICA DE LOS AISLAMIENTOS DE LA
COLECCIÓN DE Colletotrichum sp

Se comparó la tasa diaria de crecimiento de cada aislamiento en agar PDA y PDA

suplementado con hidróxido de cobre, medio selectivo para Colletotrichum sp. propuesto
por Timmer (1998). Las mediciones del diámetro de la colonia se hicieron durante 7 días y
se tomó como referencia la evaluación a las 72 horas, para hacer la comparación entre la
velocidad de crecimiento en agar PDA y en el medio con hidróxido de cobre (Véase la
Figura 16 y el Cuadro 11). De acuerdo a estos resultados, 9 de los 20 aislamientos
presentaron mayor crecimiento a las 72 horas en medio selectivo para el género
Colletotrichum sp. (PDA e hidróxido de cobre); este resultado corresponde al 45% del total
de la colección (Véase la Gráfica 3).

Figura 16. Comparación del diámetro de crecimiento de la colonia SHO3 en medio

selectivo para Colletotrichum sp

Se pueden observar: A) Colonia SH03 con menor diámetro de crecimiento después de 72

horas B) Colonia SH03 que presentó mayor velocidad de crecimiento.

Gráfica 3. Porcentaje de los aislamientos que mostraron mayor y menor velocidad de

crecimiento en medio selectivo para Colletotrichum sp

Mayor
45%
Menor
55%
Cuadro 11. Comparación de diámetros de crecimiento de los aislamientos de la
colección en medio PDA y selectivo para Colletotrichum sp después de 72 horas de
incubación

Diámetro de PDA PDA + Cu(OH)

Crecimiento (cm) (cm)
Aislamiento
SB01 4.40 5.05*
SB02 4.90 5.25*
SB03 3.50 3.20
SB04 4.50 5.50*
SB05 3.35 3.05
SF01 3.75 3.40
SF02 3.80 3.35
SF03 3.55 3.30
SF04 5.05 5.50*
SF05 4.45 2.70
SH01 1.80 3.50*
SH02 4.65 5.15*
SH03 2.95 3.85*
SH04 5.00 4.50
SH05 5.75 4.80
IL01 4.95 4.10
IL02 3.7 3.10
IL03 3.65 5.45*
IL04 4.15 5.50*
IL05 3.30 3.05
* Aislamientos con mayor diámetro de crecimiento en medio selectivo (PDA con Hidróxido de
Cobre) que en PDA a las 72 horas

Simultáneamente, se evaluó la sensibilidad al fungicida benomyl, cada uno de los 20

aislamientos de la colección se sembró en medio PDA con dos concentraciones de benomyl
(1 µg/ml y 2µg/ml) y se evaluó el crecimiento en este medio durante 7 días de incubación,
pero se tomó como referencia el registro del diámetro de crecimiento correspondiente a las
48 horas (Véase el Cuadro 12).

De los resultados anteriores, 9 aislamientos de la colección fueron sensibles al fungicida, ya

que su diámetro de crecimiento en medio PDA con benomyl (2µg/ml ) no fue mayor a 0.5
cm después de 48 horas de incubación (Véase la Gráfica 4). Por el contrario, los 11
aislamientos restantes tienden a ser resistentes debido a que el diámetro de crecimiento a la
misma concentración fue mayor de 0.8 cm y alcanzó en algunas colonias una longitud de
1.4 cm. Como se puede verficar en el Cuadro 12, todos los aislamientos son resistentes al
fungicida benomyl a una concentración de 1µg/ml.

Cuadro 12. Medición de diámetros de crecimiento de los aislamientos de la colección

en medio PDA con benomyl a las 48 horas de incubación

Diámetro de crecimiento PDA Benomil Benomil

(cm) µg/ml)
(1µ µg/ml)
(2µ
Cepa (cm) (cm)
SB01 2.80 1.65 0.20*
SB02 3.50 1.25 0.50*
SB03 2.70 2.1 1.35
SB04 3.30 1.25 0.20*
SB05 2.15 2.4 1.45
SF01 2.55 2.6 1.40
SF02 2.90 2.65 1.50
SF03 2.95 1.9 1.00
SF04 4.00 1.2 0.5*
SF05 3.95 1.55 1.05
SH01 1.05 1.35 0.40*
SH02 3.95 1.3 0.35*
SH03 2.00 1.55 0.50*
SH04 3.80 1.95 0.90
SH05 4.65 1.80 0.85
IL01 4.15 1.7 1.20
IL02 3.05 1.9 1.05
IL03 2.85 1.50 0.45*
IL04 4.00 1.35 0.55*
IL05 2.20 1.85 1.35

* Aislamientos que presentaron sensibilidad al benomyl a una concentración de 2µg/ml,

después de 48 horas de incubación

Gráfica 4. Porcentaje de aislamientos resistentes y sensibles al benomyl (2µg/ml )

luego de 48 horas de incubación

Sensibles 45%

Resistentes 55%
4.8 CARACTERIZACIÓN MORFOLÓGICA DE LOS AISLAMIENTOS DE LA
COLECCIÓN

Colonias color blanco y gris El 50% de las colonias de la colección exhibió, en medio de
cultivo PDA, una coloración blanco y gris. Los 10 aislamientos correspondientes son: 3 de
síntomas en botones (SB01, SB02 y SB04), 4 de síntomas en hojas (SH01, SH02, SH03 y
SH05) y 3 de infecciones latentes (IL01, IL03 y IL04). Ninguna colonia de Colletotrichum
sp. de síntomas en fruto mostró esta coloración. 8 de estos aislamientos presentan una
característica que predomina en la forma de los conidios y es que éstos tiene los extremos
redondos. De forma general, la descripción realizada es que son alargados, grandes,
cilíndricos. La longitud de los conidios está entre 16.20 y 17.35 µm y el ancho va desde 3.5
y 5.8 µm. Los 2 aislamientos restantes corresponden a la colonia SH05 y IL01, los cuales
tienen una longitud y ancho diferente a los demás. El largo está entre 13.35 y 13.55 µm, el
ancho desde 3.40 a 3.70µm. la coloración de las masas de conidios siempre fue rosada.

Con relación al crecimiento en agar selectivo para Colletotrichum sp., 8 aislamientos

(SB01, SB02, SB04, SH01, SH02, SH03, IL03 y IL04) mostraron una alta velocidad de
crecimiento después de 72 horas cuando se comparó el diámetro diario de la colonia en
medio que contenía hidróxido de cobre con el crecimiento en PDA. Igualmente, estos
aislamientos fueron sensibles al benomyl, ya que su diámetro de crecimiento a las 48 horas
no sobrepasó los 0.5 cm. Contrario a los 2 aislamientos que fueron atípicos dentro de este
grupo de colonias color blanco y gris, las cuales tuvieron conidios en masas de color
naranja, fueron resistentes al fungicida y tuvieron un crecimiento lento en medio selectivo
para el género Colletotrichum sp (Véase la Figura 17).

Colonias blancas. Dentro de este grupo están 2 aislamientos de síntomas en botón (SB03 y
SB05), 2 aislamientos de síntomas en frutos (SF02 y SF05) y 1 colonia de síntomas en
hojas (SH 04). Estas colonias tuvieron una baja velocidad de crecimiento en agar PDA con
hidróxido de cobre y fueron resistentes al benomyl. Los grupos de conidios exhibieron una
coloración naranja. La medición del largo de estos conidios estuvo entre 14.50 y 17.20 µm
y el ancho de 2.95 a 5.95 µm, la forma de estos se caracterizó por tener por lo menos uno
de los extremos acusados.

Colonias naranja y colonias grises. Cuatro aislamientos presentaron una coloración

naranja al igual que las masas de los conidios. Estas colonias tuvieron una baja velocidad
de crecimiento en medio selectivo (PDA + Cu (OH)) y fueron resistentes al benomyl. El
largo de los conidios estuvo entre 13.70 y 15.38 µm y el ancho fue de 2.8 a 3.5 µm. La
forma de la mayoría de los conidios estuvo caracterizada por tener ambos extremos
acusados. Solo un aislamiento mostró una coloración gris, las masas de los conidios fue
naranja, tuvo una alta velocidad de crecimiento en medio selectivo para Colletotrichum sp.
y fue resistente al benomyl. Los conidios tenían forma ovalada con ambos extremos
redondos, el largo de éstos fue de 14.55µm y el ancho de 3.95 µm (Véase la Figura 18).
Figura 17. Comparación del crecimiento de la colonia SB04 en diferentes medios de
cultivo

Aislamiento SB04 en a) medio PDA b) medio selectivo para Colletotrichum sp. c) PDA
con Benomyl 1µg/ml d) PDA con Benomyl 2 µg/ml (colonia sensible), después de 7 días
de incubación.

Figura 18. Colonias de Colletotrichum sp. de coloración blanco, gris y naranja de la

colección de estudio
A B
Izquierda: Colonia con coloración blanco y gris, masas de conidios rosadas en medio PDA
y derecha: Colonia color naranja en medio PDA.

4.9 CARACTERIZACIÓN MOLECULAR DE LOS AISLAMIENTOS DE LA

COLECCIÓN

La extracción del ADN de cada uno de los 20 aislamientos se llevó a cabo con el kit
UltraClean DNA Soil (MoBio®). Para comprobar la existencia del ADN extraído fue
necesario hacer una electroforesis de sólo ácidos nucléicos, la cual mostró la eficiencia del
kit.

La amplificación de los ácidos nucléicos de los aislamientos de Colletotrichum sp. se

realizó mediante PCR convencional, utilizando primers específicos tipo ITS para este
género, acoplados con el primer universal ITS4. La identificación de Colletotrichum
gloeosporioides se logró con el primer CgInt y la de Colletotrichum acutatum con el
CaInt2.

El ADN de 9 aislamientos de Colletotrichum sp. fue amplificado con el primer específico

para Colletotrichum gloeosporioides (CgInt) y el primer universal ITS4; mediante
electroforesis se visualizó un fragmento aproximadamente de 450 pares de bases.

El primer específico CaInt2 para Colletotrichum acutatum conjuntamente con el primer

universal ITS4 amplificó un fragmento de 490 pares de bases de DNA de los 9 asilamientos
restantes de la colección.

Cuadro 13. Grupos de aislamientos de guanábana caracterizados como Colletotrichum

gloeosporioides y Colletotrichum acutatum

Colletotrichum gloeosporioides Colletotrichum acutatum

SB01 SF04 SH03 SB03 SF03 SH05

SB02 SH01 IL03 SF01 SF05 IL02
SB04 SH02 IL04 SF02 SH04 IL05

De los 20 aislamientos no fue posible caracterizar molecularmente 2 colonias: SB05 y

IL01.
Figura 19. Amplificación de fragmentos específicos de DNA de los aislamientos
seleccionados de Colletotrichum sp. utilizando los primers CgInt, CaInt2 e ITS4

Amplificación de fragmentos específicos de DNA de los aislamientos seleccionados de

Colletotrichum sp. utilizando los primers CaInt2 e ITS4 (1 y 7) y los primers CgInt e ITS4
(4,6,10,12 y 14).

Figura 20. Amplificación de fragmentos específicos de DNA de los aislamientos

seleccionados de Colletotrichum sp. utilizando los primers CgInt, CaInt2 e ITS4

Amplificación de fragmentos específicos de DNA de los aislamientos seleccionados de

Colletotrichum sp. utilizando los primers CaInt2 e ITS4 (1, 7, 10 y 14) y los primers CgInt
e ITS4 (4, 6 y 13).
Figura 21. Amplificación de fragmentos específicos de DNA de los aislamientos
seleccionados de Colletotrichum sp. utilizando los primers CaInt2, CgInt e ITS4

Amplificación de fragmentos específicos de DNA de los aislamientos seleccionados de

Colletotrichum sp. utilizando los primers CaInt2 e ITS4 (2, 8 Y 13) y los primers CgInt e
ITS4 (1, 5, 7 Y 12).
Cuadro 14. Caracterización morfológica y molecular de los 20 aislamientos de la colección

Aislamiento Color PDA Color Diámetro Reacción Tamaño conidios Extremos PCR
PDA+Cu Colonia en Benomyl Conidios
Cu
Largo Ancho CaInt2 CgInt
(µm) (µm)
SB01 Blanco y gris Gris 5.05* Sensible 16.80 4.50 Redondos - +
SB02 Blanco y gris Gris 5.25* Sensible 16.20 4.20 Redondos - +
SB03 Blanco Gris opaco 3.20 Tolerante 16.35 4.05 Acusados + -
SB04 Blanco y gris Gris 5.50* Sensible 16.60 4.35 Redondos - +
SB05
Blanco Gris opaco 3.05 Tolerante 15.95 4.80 Acusados + -
SF01 Naranja Marrón 3.40 Tolerante 14.45 2.80 Fusiformes - -
SF02 Blanco Gris opaco 3.35 Tolerante 14.50 2.95 Extremo acusado + -
SF03 Naranja Marrón 3.30 Tolerante 15.38 3.65 Acusados + -
SF04 Gris Verde 5.50* Sensible 14.55 3.95 Redondos - +
SF05 Blanco Gris opaco 2.70 Tolerante 15.40 4.00 Extremo acusado + -
SH01 Blanco y gris Gris 3.50* Sensible 16.35 4.75 Redondos - +
SH02 Blanco y gris Gris 5.15* Sensible 17.05 5.85 Redondos - +
SH03 Blanco y gris Gris 3.85* Sensible 16.95 5.80 Redondos - +
SH04 Blanco Gris opaco 4.50 Tolerante 16.20 5.95 Fusiformes + -
SH05 Blanco y gris Gris 4.80 Tolerante 13.35 3.70 Acusados + -
IL01
Blanco y gris Gris 4.10 Tolerante 13.55 3.40 Acusados - -
IL02 Naranja Marrón 3.10 Tolerante 13.70 3.50 Fusiformes + -
IL03 Blanco y gris Gris 5.45* Sensible 16.50 3.55 Redondos - +
IL04 Blanco y gris Gris 5.50* Sensible 16.85 3.85 Redondos - +
IL05 Naranja Marrón 3.05 Tolerante 13.75 3.45 Acusados + -
* Colonias con mayor diámetro de crecimiento en medio selectivo para Colletotrichum sp.

Aislamientos negativos para las pruebas moleculares
 5. DISCUSIONES

Las infecciones latentes producidas por patógenos en plantas, han sido previamente
reportadas (Verhoeff, 1974; Prusky, 1996; Peres, et al., 2005) y son consideradas de los
más altos niveles de parasitismo, desde que el parásito y el hospedero coexisten sin daño a
este último. Verhoeff afirma que una verdadera infección latente debe involucrar una
relación parasítica que eventualmente induce síntomas. De acuerdo con los resultados en
guanábana, se encontró que Colletotrichum gloeosporioides y C. acutatum producen
infecciones latentes, ya que fue evidente la presencia de estructuras reproductivas, mediante
la estimulación de envejecimiento del follaje asintomático con paraquat.

Biggs (1995) detectó la presencia de infecciones latentes en frutos asintomáticos de

manzana con paraquat y, determinó el uso potencial de este herbicida como medida rápida
para cuantificación del patógeno; aproximadamente el 13% de las manzanas tratadas con
paraquat desarrollaron acérvulos de Colletotrichum acutatum. Torres (2005) encontró
infecciones latentes en el follaje asintomático del tomate de árbol, a partir de la
metodología propuesta por Biggs (1995), las cuales se confirmaron por el crecimiento de
cuerpos fructíferos sobre la lámina foliar de Solanum betacea, luego de haber sido tratadas
con paraquat e incubadas en cámaras húmedas durante una semana. Asímismo, el género
Colletotrichum sp. es conocido por ocasionar infecciones latentes en mango (Dods et al.,
1991) y en otros cultivos (Cerkauskas, 1988).

Mertely y Legard (2004) también utilizaron paraquat y choque térmico para el

envejecimiento de pecíolos de fresa, los cuales fueron incubados durante 5 y 7 días
respectivamente bajo condiciones de temperatura (23 a 25°C) y luz permanente; la
presencia de acérvulos se verificó por la aparición de masas de conidias color naranja. La
observación de acérvulos de Colletotrichum sp. sobre la lámina foliar de guanábana
confirmó la presencia de infecciones latentes en follaje asintomático después de que fuera
sometido a contacto con paraquat y posteriormente ubicado en cámaras húmedas durante 7
días de incubación. En soya, Hartam et al (1986) también detectó infecciones latentes en
hojas después de que fueron tratadas con paraquat, las cuales se evidenciaron por la
aparición de grupos de acérvulos característicos del género Colletotrichum sp. Sinclair
(1991) determinó que después de un período de incubación apropiado el crecimiento del
hongo se puede examinar, usualmente bajo estereoscopio, por la presencia de estructuras
fructíferas (acérvulos) de Colletotrichum sp.

Aunque la mayoría de los estudios sobre infecciones latentes causadas por Colletotrichum
sp., se han llevado a cabo en frutos, en este, se planteó la hipótesis sobre la presencia de las
infecciones latentes en follaje asintomático de guanábana y se confirmó. Referente a las
investigaciones de este tipo de infecciones, en aguacate por ejemplo, se ha descrito el rol
que desempeñan los componentes preformados en la latencia y resistencia (Prusky et al.,
1982, 1985, 1988). Se identificó inicialmente un dieno antifúngico (cis, cis-1-acetoxy-2-
hixroxy-4-oxo-heneicosa-12, 15-dieno) en la corteza de frutos inmaduros de aguacate en
concentraciones altas, las cuales fueron requeridas in vitro para inhibir el crecimiento de C.
gloeosporioides y luego éstas concentraciones se redujeron cuando el fruto maduró. Esto
puede sugerir el hecho de que existan componentes en los tejidos de guanábana que
permitan, en un determinado momento, retardar el desarrollo del patógeno y producir las
infecciones latentes.

Con relación a la evaluación de presencia de infecciones latentes en los árboles de

guanábana durante los siete meses de muestreo, a nivel de los dos lotes no hubo diferencias
significativas. Los resultados mostraron tres meses con los más altos porcentajes. El primer
mes de muestreo (Febrero), tuvo un porcentaje de 63.75% de presencia de infecciones
latentes sobre follaje asintomático de guanábana; se supone que este resultado tiene
relación con el estado climatológico que prevaleció en el sitio de estudio, debido a que al
inicio del año existe una notable disminución de la precipitación. Esto permite una
humedad relativa muy baja y por lo que se ha reportado, los conidios de Colletotrichum sp.
requieren un microclima adecuado para su germinación, dado por alta humedad relativa y
altas temperaturas (King et al., 1997). Se presume que las condiciones ambientales durante
este mes no fueron propicias para que la antracnosis incidiera en el cultivo, por lo tanto,
Colletotrichum sp. permaneció de forma latente en el follaje, sin presentar síntomas
visibles.

Los dos meses restantes en los que los árboles tuvieron alta presencia de infecciones
latentes, fueron Junio con 71.25% y Julio con 65%. Estos dos meses corresponden a un
período de completa sequía en el sitio de estudio y por ende, se presenta déficit hídrico; los
intervalos de temperatura durante estos meses fueron: temperatura mínima de 22°C,
máxima de 29°C y humedad relativa de 64%. Se sospecha que una de estas condiciones no
es favorable para la germinación de Colletotrichum sp, por lo que probablemente haya
permanecido como infección latente. Zárate (1988) afirma que la incidencia de la
antracnosis en guanábana se ve favorecida por condiciones ambientales de alta humedad
relativa (> 80%) y lluvias periódicas, lo cual podría insinuar que estas condiciones
favorecen la germinación de los conidios, el establecimiento de Colletotrichum sp. y,
finalmente, el desarrollo de la enfermedad.

De los siete meses de muestreo, Marzo, Abril, Mayo y Agosto, todos los árboles mostraron
baja presencia de infecciones latentes; los porcentajes respectivos fueron 49.5%, 53.8%,
30.7 y 53.8%. Marzo es el inicio del primer período de lluvia en la zona de La Mesa y
finaliza a comienzos de Junio, en el que se alcanza una humedad relativa mayor del 80%,
condición óptima para la germinación de los conidios de Colletotrichum sp. y, la activación
de infecciones latentes. Durante este mes se observó una alta incidencia de la antracnosis en
el cultivo de guanábana; frutos, botones florales y hojas, presentaron síntomas típicos de la
enfermedad. Se podría afirmar que bajo estas condiciones ambientales, las infecciones
latentes son mínimas por la activación de la antracnosis. El porcentaje más bajo de
infecciones latentes se presentó durante Mayo con un 30.7%, este mes se caracterizó por
tener precipitaciones continuas durante todos los días, temperaturas altas después de
mediodía y una humedad relativa superior al 85%. A partir de lo anterior, se podría sugerir
que estas condiciones climáticas favorecieron la incidencia de la enfermedad y tal vez sea
la razón de la baja presencia de acérvulos en las hojas evaluadas durante este mes.

González (1977) afirma que Colletotrichum sp. forma sus conidios en masas
mucilaginosas, razón por la que necesita de lluvia seguida de alta humedad relativa y de
una capa de agua que persista sobre el follaje y sobre los frutos, para la producción,
diseminación y penetración del patógeno. Los resultados obtenidos en las evaluaciones de
estos meses, sugieren que las condiciones anteriormente descritas propiciaron la
germinación de los conidios, activaron las infecciones que después fueron evidentes por la
aparición de síntomas y, finalmente, la presencia de acérvulos en las láminas foliares
analizadas fue muy baja.

La presencia de infecciones latentes en el follaje asintomático de guanábana fue evidente

tanto en hojas maduras como en jóvenes, de acuerdo con las evaluaciones realizadas
durante los siete meses de muestreo. En cítricos, el apresorio es esencial sobre tejidos
maduros para la supervivencia del patógeno; Colletotrichum sp. sobrevive como
infecciones latentes sobre hojas maduras, debido a que las flores son los órganos más
susceptibles a la enfermedad y sólo aparecen temporalmente. (Agostini, et al., 1992). Con
relación a estudios realizados en almendra (Adaskaveg y Förster, 2000), los conidios se
dispersan a tejidos maduros, los cuales no son susceptibles a la infección. Así que se
sospecha que el inóculo de Colletotrichum sp. se encuentra en las hojas maduras de
guanábana, ya que se evidenciaron infecciones latentes en éstas durante todos los meses
evaluados.

No obstante, la mayor cantidad de infecciones latentes en guanábana se presentó en hojas

jóvenes; éstas podrían estar dadas por la inducción de la senescencia de las hojas mediante
el uso del paraquat, que estimularía la activación de la germinación de los conidios, es
decir, se incitaría al inicio del ciclo de la enfermedad sin que necesariamente fueran
verdaderas infecciones latentes. Se podría pensar que tanto hojas jóvenes como maduras
serían fuentes de inóculo. Por el estado avanzado de desarrollo de las hojas maduras, éstas
podrían ser más fácilmente colonizadas y luego mostrarían signos de la enfermedad, como
por ejemplo acérvulos, los cuales por acción del viento o del agua, serían diseminados a
otras hojas. Peres et al (2005) afirma que las infecciones latentes pueden desarrollarse,
resultar luego en colonización del tejido de la hoja una vez que ésta envejece y finalmente,
se origina la producción de acérvulos.

De acuerdo con el análisis de varianza, hubo diferencias significativas en cuanto a la

orientación de las hojas que fueron muestreadas y posteriormente tratadas, para detectar
infecciones latentes. Se encontró en 4 de los 7 meses evaluados, la mayor cantidad de estas
infecciones en la parte occidental de la copa. En esta zona, la humedad relativa es más baja,
la temperatura es un poco más alta que en el oriente y hay mayor desecamiento. Torres
(2005) afirma, que el estado de latencia de los microorganismos se debe a tres razones:
prevenir el desecamiento, protección de los rayos ultravioleta y de otros microorganismos.
De acuerdo a lo anterior, se sospecha que en la zona occidental del árbol las condiciones de
temperatura y humedad no son las adecuadas para la germinación de los conidios de
Colletotrichum sp. y tal vez sea la causa del establecimiento del patógeno como infección
latente.

Los resultados obtenidos en el estudio de la dinámica de la fuente de inóculo en el árbol de

guanábana, demostraron que Colletotrichum sp. reside como infección latente tanto en el
follaje joven y madur,o sin presentar síntomas visibles de la antracnosis, además, este tipo
de infecciones fue más frecuentes, en la zona occidental de la copa del árbol. Lo anterior
sugiere que si se presentan las condiciones ambientales apropiadas, todas las hojas de la
zona occidental de la copa del árbol, sin importar el estado desarrollo, serían la potencial
fuente de inóculo de Colletotrichum sp.

Las infecciones latentes sobre el follaje asintomático de Annona muricata L. y los órganos
con síntomas de la enfermedad, permitieron recuperar el patógeno a partir del aislamiento
de los acérvulos que emergieron sobre la lámina foliar. Zulfiqar et al (1996), afirma que
cuando los tejidos se vuelven senescentes, Colletotrichum sp. coloniza el tejido y produce
abundantes acérvulos bajo condiciones de humedad. Como medida de evaluación de los
acérvulos aislados, se requirió una observación microscópica detallada de cada uno y se
pudo confirmar que de acuerdo con la descripción de Sutton (1992), la estructura
correspondiente a Colletotrichum gloeosporioides tiene un aspecto seco, con setas y los
conidios están agrupadas en masas, aunque no siempre son de coloración salmón pálido.
Los acérvulos de Colletotrichum acutatum se observaron como estructuras de aspecto
cremoso, no presentaron setas y las agrupaciones de conidios tenían coloración naranja.
Teniendo en cuenta la descripción morfológica de los acérvulos, fue posible aislar, en
teoría, acérvulos de ambas especies.

Inicialmente se planteó en varias investigaciones, que una característica casi definitiva de

identificación de C. acutatum, era la forma de los conidios fusiformes y con uno a ambos
extremos acusados. Peres et al (2005), afirma que los conidios de C. acutatum usualmente
son elipsoides y fusiformes, por lo menos en uno de los dos extremos, algunas veces es
típico que tengan ambos extremos redondos como C. gloeosporioides. En todos los
acérvulos evaluados del follaje de guanábana, que se presumían eran de C. acutatum, los
conidios tenían uno o ambos extremos acusados. Agostini (1992) también encontró que
para los conidios de C. acutatum, todos tenían por lo menos uno de los dos extremos
fusiformes.
Timmer (1994) plantea que los conidios de C. gloeosporioides generalmente tienen tanto el
ápice como la base redondos. Igualmente, Agostini (1992) también notó que el 90% de los
conidios de C. gloeosporioides tenían los ápices redondos. Las observaciones de los
probables conidios de C. gloeosporioides obtenidos de los acérvulos en hojas de
guanábana, permitieron concluir que en la mayoría la descripción reportada concordó con
lo que se apreció bajo el microscopio. Esta no es una característica definitiva de
diferenciación entre las dos especies. Wharton y Diéguez-Uribeondo (2004) afiman que
tanto C. gloeosporioides como C. acutatum son morfológicamente muy similares y,
muestran características microscópicas casi idénticas.

A partir de las infecciones latentes, síntomas en botones florales, flores y hojas, se

estableció la colección de estudio del patógeno. Los aislamientos de Colletotrichum sp. de
síntomas en cada uno de los órganos muestreados presentaron diferentes características
morfológicas; a simple vista no se pudo afirmar a qué especie pertenecían. Talhinhas
(2002) afirma que la amplia variación de Colletotrichum sp. en cultivo, junto con la
existencia de aislamientos que exhiben características intermedias o mezcladas, hacen que
algunos parámetros no sean definitivos para la diferenciación entre estas dos especies. Sin
embargo, se puede afirmar que las características morfológicas son una parte importante
para la identificación del agente causal de la antracnosis y, sólo con pruebas consecutivas
confirmatorias, se determinó la especie del posible patógeno.

Las especies de Colletotrichum sp. han sido identificadas a partir de características

morfológicas como forma y tamaño de los conidios, ausencia o presencia de setas, color de
la colonia, producción de pigmentos, presencia de halos concéntricos, tasa de crecimiento y
sensibilidad al benomyl (Adaskaveg y Hartin, 1997; Peres et al, 2005). Según los resultados
obtenidos de la caracterización morfológica, las colonias pertenecientes a la colección de
estudio fueron homogéneas en medio de cultivo; de acuerdo al color se pudieron reunir en
cuatro grupos: blancas con gris, blancas, naranjas y grises.

Las colonias blancas con gris tuvieron acérvulos de color rosado, una tasa alta de
crecimiento en medio selectivo para Colletotrichum sp. (Timmer et al, 1998) y fueron
sensibles al benomyl. Sutton (1992) describe las colonias de Colletotrichum
gloeosporioides de color grisáceo blanco y, conidios formados en masas de color salmón
pálido. Agostini y Timmer (1994) también reconocieron dentro de un grupo de tres especies
de Colletotrichum sp., patógenos de cítricos, una cepa que tenía una alta velocidad de
crecimiento, de color gris, a la que denominaron FGG, colonia gris de rápido crecimiento y
la atribuyeron a Colletotrichum gloeosporioides. Estos resultados permiten sugerir que este
grupo de características sería un buen indicio de que estas colonias pertenecen al género C.
gloeosporioides.

Las colonias blancas, naranjas y grises presentaron conidios agrupados en masas de color
naranja y tuvieron una baja velocidad de crecimiento en medio selectivo. Timmer (1994),
Gunnell y Gubler (1992), afirman que las colonias correspondientes a Colletotrichum
acutatum en cítricos, presentan un lento crecimiento y producen micelio blanco con masas
naranjas de pequeños conidios fusiformes. A partir de lo anterior, se podría inferir que estas
colonias forman parte del género C. acutatum, aunque una prueba que permitiría contribuir
a la diferenciación de las especies sería, la tolerancia al benomyl.

El benomyl es uno de los fungicidas más efectivos para el control de la antracnosis (Peres
et al, 2002) y ha sido utilizado en medio de cultivo, para diferenciar Colletotrichum
gloeosporioides de Colletotrichum acutatum, ya que este último muestra cierta tolerancia al
benomyl. Todos los aislamientos de Colletotrichum sp. de guanábana mostraron tolerancia
a 1µg/ml; esto podría indicar que, a bajas concentraciones, el fungicida no tiene efecto
sobre el crecimiento del patógeno, debido a que con una concentración de 2µg/ml se
inhibió el crecimiento de algunos aislamientos de la colección.

Albertini y Leroux (1999) y también Yarden y Katan (1993), realizaron análisis de la

secuencia del gen de la ß-tubulina en hongos tolerantes al benomyl, los cuales revelaron
que esta resistencia se debía a una mutación de un nucleótido que permite el cambio de un
aminoácido en el codón 198 o 200. Así, se podría sugerir que los hongos tolerantes al
benomyl han sufrido estas mutaciones en alguno de sus aminoácidos del codón
anteriormente mencionado, lo cual le confiere la insensibilidad al fungicida.

Se sugiere que las pruebas de caracterización morfológica no diferencian a Colletotrichum

gloeosporioides de C. acutatum, debido a la alta variabilidad que pueden presentar los
aislamientos en medios de cultivo. Freeman (1997) también afirma que debido a influencias
ambientales sobre la estabilidad de rasgos morfológicos y, la existencia de formas
intermedias, estos criterios no siempre son adecuados para una diferenciación confiable de
las especies del género Colletotrichum sp. Los criterios morfotaxonómicos no son lo
suficientemente precisos para discriminar entre especies del género Colletotrichum sp.
(Freeman et al, 2000).

Las herramientas moleculares son una parte esencial en la caracterización e identificación

de los patógenos, para conocer con precisión la identidad de las especies que causan
antracnosis en guanábana. Se utilizaron una serie de pruebas consecutivas que fueron desde
la caracterización morfológica y taxonómica convencional, hasta la aplicación de pruebas
moleculares. Mills et al (1994) determinó la secuencia de nucleótidos de las regiones
intergénicas (ITS), específicamente de la región 1 de varias especies de Colletotrichum y,
con base en esta información, se desarrollaron primers específicos que al ser acoplados con
el primer universal ITS 4 y un primer específico (CgInt) permitió la identificación de C.
gloeosporioides. C. acutatum fue detectado e identificado mediante la combinación de los
primers ITS4 y CaInt2.
El DNA de nueve aislamientos de la colección fue amplificado con el primer CgInt, el cual
fue extraído de 8 colonias de coloración blanco con gris y, la única que exhibió color gris,
las cuales tuvieron características morfológicas similares y comportamientos parecidos en
el medio selectivo con hidróxido de cobre y con benomyl. El fragmento amplificado
presentó un peso aproximado de 450pb, lo cual concuerda con fragmentos previamente
publicados por Mills (1994) y Parikka y Lemmetty (2004).

Simultáneamente, se pudieron evidenciar productos de PCR de otras nueve colonias con el

primer específico CaInt2 para Colletotrichum acutatum, ya que fue posible observar un
fragmento de aproximadamente 490 pares de bases, el cual corresponde al descrito para C.
acutatum. Estas colonias corresponden a 5 aislamientos blancos y 4 de coloración naranja,
los cuales tuvieron una baja tasa de crecimiento en medio selectivo y fueron tolerantes al
benomyl en ambas concentraciones; adicionalmente, tuvieron conidios pequeños con
extremos acusados en por lo menos uno de sus extremos, lo cual sugiere que este grupo
pertenece a la especie Colletotrichum acutatum.

Dentro de los aislamientos de la colección, dos de ellos no amplificaron con ninguno de los
primers, uno de síntomas en botón y el otro de infecciones latentes (SB05 y IL01). Estas
colonias presentaron diferentes características frente a los demás aislamientos, aunque
ambas fueron tolerantes al benomyl y con conidios fusiformes. Se podría pensar que se
trata de Colletotrichum acutatum, aunque la prueba molecular resultó negativa y por lo
tanto, la identidad del aislamiento no pudo ser definida. La alta variabilidad genética del
género Colletotrichum sp. puede ser una de las razones por las cuales no todos los
aislamientos fueron positivos para las pruebas moleculares. Para otras investigaciones, sería
conveniente trabajar con otras regiones intergénicas, como ITS2 o ITS3.
 6. CONCLUSIONES

La detección de infecciones latentes originadas por Colletotrichum gloeosporioides y

Colletotrichum acutatum en el follaje asintomático de Annona muricata fue posible con el
uso del paraquat, a una concentración del 4%, durante un período de 30 minutos.

La presencia de infecciones latentes de Colletotrichum sp., se evidenció tanto en hojas

maduras como jóvenes y fue más frecuente en la zona occidental de la copa de Annona
muricata.

Con el diseño de una escala de medición de la presencia de estructuras reproductivas de

Colletotrichum sp., se cuantificaron las infecciones latentes en el follaje asintomático de
guanábana.

Las pruebas biológicas y moleculares permitieron la identificación de Colletotrichum

gloeosporioides y C. acutatum, aislado a partir de infecciones latentes en follaje
asintomático y síntomas de la enfermedad.
 7. RECOMENDACIONES

Rediseñar la escala de cuantificación de infecciones latentes, la cual podría sugerirse con

más niveles y menor rango de valor para cada nivel, con el objetivo de perfeccionar la
evaluación de la presencia de cuerpos fructíferos de Colletotrichum sp. en el follaje.

El tiempo de muestreo podría ser mayor, así que sería conveniente en próximos estudios,
analizar la dinámica de la fuente de inóculo de Colletotrichum sp. durante doce meses, con
el propósito de incluir todos los períodos secos y lluviosos que inciden en el ciclo de la
enfermedad.

Para tener mayor exactitud con los resultados moleculares, se propone secuenciar los
productos de PCR y comparar estas secuencias con las bases de datos internacionales.
También sería de gran información amplificar nuevamente el ADN de los aislamientos que
no fue posible caracterizar y, posteriormente, secuenciar estas amplificaciones con el fin de
conocer su identidad.

Diseñar pruebas de campo y laboratorio para conocer la forma en que interactúan

Colletotrichum gloeosporioides y C. acutatum, como responsables de las antracnosis en
guanábana.

Realizar pruebas de patogenicidad exhaustivas, para determinar cuáles de los cuatro grupos
de colonias son realmente patogénicos en guanábana.
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