TECNOLÓGICO DE ESTUDIOS SUPERIORES DE JOCOTITLÁN

DIVISIÓN DE INGENIERÍA QUÍMICA

METODOS DE OBTENCION DE ALCOHOL A PARTIR DE LA MATERIA

PRIMA CELULOSA

1.- HIDRÓLISIS ENZIMÁTICA

2.- FERMENTACIÓN

3.- HIDRÓLISIS ÁCIDA

ASIGNATURA: FUENTES DE ENERGÍA RENOVABLES

DOCENTE:

MTRO. MOISES ALVARADO SOLIS

ALUMNO:

RUBEN ALEJANDRO PACHECO PERALES

GRUPO: IF-802

Jocotitlán, México, a 2 de Abril del 2020

 OBTENCIÓN DE BIETANOL A PARTIR DE LA CELULOSA PRESENTE EN
CASCARILLA DE ARROZ Y ASERRÍN DE ALGARROBO

(HIDRÓLISIS ENZIMÁTICA)

Objetivo

Obtener bioetanol a partir de la celulosa presente en a cascarilla de arroz y aserrín

de algarrobo mediante el método de hidrólisis enzimática.

Objetivos Específicos

 Obtener la celulosa de la materia prima

 Obtener la biomasa mediante el método de hidrólisis enzimática
 Identificar el proceso de fermentación adecuado para la obtención de
bioetanol.

MARCO TEORICO

CELULOSA

La Celulosa es la principal componente de las paredes celulares de los árboles y

otras plantas. Es una fibra vegetal que al ser observada en el microscopio es
similar a un cabello humano, cuya longitud y espesor varía según el tipo de árbol o
planta. Las fibras de algodón, por ejemplo, tienen una longitud de 20-25 mm., las
de Pino 2-3 mm. y las de Eucalipto 0,6-0,8 mm. De igual manera, el contenido de
celulosa varía según el tipo de árbol o planta que se considere. La celulosa está
constituida por una larga cadena de carbohidratos polisacáridos. La estructura de
la celulosa se forma por la unión de moléculas de ß-glucosa a través de enlaces ß-
1,4-glucosídico, lo que hace que sea insoluble en agua. La celulosa tiene una
estructura lineal o fibrosa, en la que se establecen múltiples puentes de hidrógeno
entre los grupos hidroxilo de distintas cadenas yuxtapuestas de glucosa,
haciéndolas muy resistentes e insolubles al agua. De esta manera, se originan
fibras compactas que constituyen la pared celular de las células vegetales,
dándoles así la necesaria rigidez. La celulosa constituye una fuente de glucosa
prácticamente inagotable que se renueva de forma continua mediante la
fotosíntesis. La celulosa se encuentra en las frutas, las hortalizas y los cereales
como constituyente estructural de las paredes celulares, y también la producen
ciertos microorganismos. Es parte de la fibra cruda, por lo que se elimina en las
heces sin haber sido aprovechada. En el arroz, el maíz y el trigo se localiza en el
pericarpio, y en el germen junto con las hemicelulosas y la lignina, representando
1.0, 2.5 y 2.0% del grano, respectivamente.
LIGNINA

Lignina Después de la celulosa es el polímero más abundante en el mundo

vegetal y su función es asegurar protección contra la humedad y los agentes
atmosféricos además de actuar como elemento aglomerante de las fibras. Es un
componente característico de las plantas superiores (gimnospermas y
angiospermas), aparecen típicamente en los tejidos vasculares, especializados en
el transporte de líquido y en dar resistencia mecánica (Fengel y Wegener, 1984).
Químicamente la lignina es un polímero tridimensional amorfo constituido a partir
de unnidades fenilpropano que se unen entre sí por enlaces tipo alquil-aril-éter o
carbono-carbono (Fiechter, 1983; García, et al., 1984).

La estructura y composición, así como su contenido relativo en el lignocelulósico,

dependen de las diferentes especies. Así las coníferas presentan generalmente un
contenido más elevado en lignina que las frondosas. Además las ligninas
provenientes de los dos tipos de material presentan también algunas diferencias
estructurales. El peso molecular de la lignina es más difícil de determinar que el de
la celulosa debido principalmente a las fuertes modificaciones que experimenta su
estructura en los tratamientos de separación, a su baja solubilidad y a la tendencia
a formar agregados en la mayoría de los disolventes (Fengel y Wegener, 1984;
Hon y Shiraishi, 1991; Tarchevsky y Marchenko, 1991)

Desde el punto de vista de la morfología de la pared celular, la lignina es una

sustancia amorfa de estructura muy variable localizada en la lámina mediana y en
la pared secundaria. La asociación entre la lignina y los polisacáridos es la que
determina la rigidez y la resistencia estructural del material. Durante el desarrollo
de las células se incorpora como el último componente de la pared celular,
interpenetrando las fibrillas y en consecuencia reforzando la pared celular. Sin
embargo, la lignina no se encuentra únicamente depositada sobre las fibras
celulósicas sino que también existen enlaces covalentes entre la lignina y los
carbohidratos como es el caso de la galactosa, la arabinosa o el ácido 4-O-
metilglucorónico mecánica (Fengel y Wegener, 1984; Glasser, 1990).

MATERIALES Y MÉTODOS

 Materias Primas e insumos

Cascarilla de arroz, variedad epagri. Esta se muele con un molinillo de discos de
100W de potencia y 280g de capacidad. La cascarilla se almacena en un
recipiente cerrado a temperatura ambiente hasta su utilización.
El aserrín de algarrobo. La muestra se lava exhaustivamente para eliminar el
exceso de sustancias solubles en agua destilada a temperatura de ebullición
con agitación durante 2 minutos. El aserrín lavado se filtra, se seca a 60ºC durante
12h, y por último, se almacena en un recipiente cerrado a temperatura ambiente
hasta su utilización. El aserrín de algarrobo no requiere de molienda dado que
este presenta el tamaño ideal para su posterior procesamiento, a modo de
homogenización se toman muestras de tamaño de partícula entre 40 y 100 mesh.
Se utilizan enzimas comerciales, celulasas de Trichoderma reesei y celobiasas de
Aspergillus niger. Se determina su actividad enzimática en FPU/ml (Unidades de
Papel de Filtro) siguiendo el procedimiento detallado en International Union of
Pure and Applied Chemistry (IUPAC) (Gost, 1982).. Finalmente, en la etapa de
fermentación se emplean levaduras comerciales de saccharomices cerevisiae.

 Caracterización de Materias Primas y Productos de reacción.

La toma y preparación de las muestras antes del análisis de cenizas, extractivos,
carbohidratos y lignina soluble e insoluble en ácido se lleva a cabo siguiendo el
procedimiento “Preparación de muestras para análisis de composición”, NREL/TP-
510-42620 (Hames et al., 2005). La determinación de sólidos totales y humedad
se realiza según el NREL/TP-510-42621 (Sluiter et al., 2008), utilizando el método
de horno a convección. Se evalúan los componentes extraíbles en agua y alcohol
etílico, según lo especificado en NREL/TP-510-42619 (Sluiter et al., 2005). A partir
de la muestra sólida libre de extractivos se determina la composición de cenizas,
según procedimiento especificado por NREL/TP-510-42622 (Sluiter et al., 2005).
La determinación de carbohidratos estructurales y lignina en biomasa se lleva a
cabo según procedimiento NREL/TP-510-42618 (Sluiter et al., 2008). Los
carbohidratos estructurales y los azúcares luego de la hidrólisis se cuantifican por
medio de cromatografía liquida de alta resolución (Waters HPLC System), con una
columna Aminex-HPX87H (BIO-RAD) con las siguientes condiciones
cromatográficas: H2SO4 4mM como eluyente, 0,6ml/min, 35°C y detectores de
índice de refracción y arreglo de diodos. La concentración de bioetanol producido
se analiza por cromatografía de gases (GC) y detector de ionización de llama
(FID). Las condiciones cromatográficas fueron: aire a 60kPa como gas portador,
temperatura del horno 30°C, temperatura del inyector 180°C y la temperatura del
detector 250°C. Los patrones de etanol se prepararon utilizando etanol de grado
comercial (marca Porta) y metilisobutilcetona (marca Cicarelli) como patrón
interno.

 Pre tratamiento.
La cascarilla de arroz y el aserrín de algarrobo fueron pretratados con
soluciones de ácido sulfúrico de 0,3 y 1%p/v, respectivamente; con la
aplicación de vapor a 152ºC (5atm) según procesos optimizados para cascarilla de
arroz (Dagnino, et al. 2013a) y aserrín de algarrobo (Dagnino, et al. 2013b). El
proceso consistió básicamente en la mezcla de la materia prima con la solución
ácida de concentración correspondiente en una proporción del 5% de sólidos y
esta se colocó en el reactor y se calentó con vapor a 152ºC. Posteriormente se
separó el líquido del sólido mediante filtración al vacío, el sólido pretratado se lavó
repetidas veces con agua destilada para retirar la solución ácida remanente y se lo
refrigeró a 4°C, ya que este no debe ser secado para evitar el colapso de la
estructura y con ello, disminuir el rendimiento de la hidrólisis enzimática.

 Hidrólisis enzimática
Posteriormente se realiza la hidrólisis enzimática de los sólidos pre tratados, de
humedad conocida. Se pesa una muestra de biomasa igual al equivalente al 1%
de celulosa y se coloca en un reactor de 200ml, se agrega 50ml del buffer, la
cantidad de agua destilada necesaria para alcanzar el volumen total de 100ml,
considerando la densidad del material sólido de 1g/ml (Selig et al., 2008) y
teniendo en cuenta la cantidad de enzimas que serían adicionadas luego de
alcanzar las condiciones de reacción. Se agrega 0,3ml de azida de sodio, para
evitar el crecimiento de organismos durante la digestión y se adicionó Tween 80
como surfactante en una concentración de 0,1g/l. Se colocan los tubos en baño
termostático a 50ºC con agitación 06.02 y, finalmente, se adicionan las
enzimas comerciales Sigma-Aldrich, celulasas de Trichoderma reesei y
celobiasas de Aspergillus niger, en una concentración de 40FPU/g de celulosa.
Se evalua la producción de azúcares durante 72 horas.

 Fermentación biológica.
Se usan levaduras comerciales a razón de 1% p/v.

Se adicionan nutrientes: (NH4)2SO4, KH2PO4, K2HPO4, MgSO4.7H2O, CaCl2,

CuSO4.5H2O, MnCl2, ZnSO4 y CoCl2. La fermentación se llevó a cabo a pH 4,7
en estufa de cultivo a 25°C durante 48h. La evaluación de esta etapa se realizó
por cromatografía gaseosa del etanol producido.

CONCLUSIONES

 El pre tratamiento del material lignocelulósico es una etapa muy importante

en el procesamiento de la biomasa para una mejor calidad de ésta.
 El método de hidrolisis enzimática es el mejor método para la obtención de
bioetanol
REFERENCIAS.

 https://www.researchgate.net/publication/273976342_OBTENCION_DE_BI
ETANOL_A_PARTIR_DE_LA_CELULOSA_PRESENTE_EN_CASCARILLA
_DE_ARROZ_Y_ASERRIN_DE_ALGARROBO.
 Cellulose and its derivatives: Chemistry, Biochemistry and Applications.
Publicado por Ellis Horwood Ltd. Publishers. Chichester, Reino Unido
(1985).
 Evaluation of Pretreatments of Biomass for Enzymatic Hydrolysis of
Celiulose. Publicado por Solar Energy Research Institute, SERI/ TR-231-
2183 (1985),
 OBTENCION DE ETANOL POR FERMENTACION ALCOHÓLICA DE LICOR
OBTENIDO DE CAÑA BRAVA

Objetivo

El objetivo de esta práctica es la producción de etanol mediante la utilización de

compuesto lignocelulósico,en este caso se utilizó caña brava.

OBJETIVOS ESPECIFICOS

-Analizar los perfiles de fermentación de las cepas seleccionadas bajo pruebas

preliminares de fermentación.

- Establecer el desempeño de la caña brava seleccionada con el mejor perfil

fermentativo para la preparación de un licor.

INTRODUCCIÓN.

El alcohol etílico es el producto químico orgánico sintético más empleado por los

hombres a nivel industrial, es obtenido a partir de los azucares vegetales. Los
azucares simples son fermentados directamente utilizando Saccharomtces
cerevissive; la cual transforma los azucares en etanol las levaduras presentan
mayor actividad metabólica debido a su crecimiento rápido, aunque su poder
fermentativo depende de sus características genéticas.

El etanol también conocido bajo el nombre de alcohol etílico, es un líquido

incoloro, bastante inflamable que posee un punto de ebullición entorno a 78ºc, su
fórmula es CH3- CH2-CH tratándose del principal producto que forma parte de la
composición de las bebidas, alcohólicas, incluyendo el licor. Con un porcentaje de
alrededor de un 13% pero puede separarse el 50% en numerosos tipos de licores,
esta materia es importante para la síntesis, presenta activación con algunos
solventes y derivados de celulosa y forma zoo tropos binarios y terciarios con el
agua y los principales acetatos facilitando procesos de impresión y pintado,
también es de gran aplicación en la industria por su bajo contenido de humedad y
se utiliza como materia prima en procesos de síntesis orgánica en industria
química. 
METODOLOGÍA

Etanol paso a paso riego tecnificado, aprovechando el bagazo, residuo industrial

renovable que se extrae de la caña de azúcar.

Consta de una caldera que genera 100 t/h de vapor de agua a 42 bar de presión.

A diferencia de la producción y utilización de combustibles fósiles a base de

petróleo, que generan la contaminación y el calentamiento global, el etanol es un
combustible alternativo de uso en los automóviles. En agosto del 2009, la fábrica
de etanol de Caña Brava se convirtió en la primera planta del Perú, en producir
este combustible renovable y ecológico. El vapor de esta caldera mueve dos
turbinas conectadas a generadores que Casa de en conjunto Fuerza producen 12
Mw de potencia. Cuchilla industrial 

1. RECEPCIÓN DE LA CAÑA La caña de azúcar llega del campo en camiones

que es descargada en la mesa de recepción, para iniciar el proceso de extracción.

2. PREPARACIÓN DE LA CAÑA En esta etapa la caña es Del proceso del difusor

se obtiene, desfibrada a través de además del jugo de caña, el bagazo cuchillas y
un molino de caña (residuo de la extracción) martillos para facilitar la que sirve
para la generación de extracción del jugo. energía eléctrica.

3. DIFUSOR MOLINO Equipo donde a la caña desfibrada Seca el bagazo al 50%

se le extrae el jugo a través de la de humedad para una buena combustión en
dilución en agua caliente logrando deshidratación una extracción del 97.5% de la
caldera azúcar. El jugo de caña obtenido La humedad restante es retirada y Jugo
de continúa su proceso para obtener se eleva finalmente el alcohol de caña el aun
grado de alcohol 99.70% de pureza. En esta etapa final se usa resina zeolita que
retiene el agua.

4. EVAPORACIÓN Se evapora el excedente de agua del jugo de caña ya extraído

se estandariza almacenamiento sus niveles de azúcar. El alcohol producido en el
proceso es almacenado en tres tanques de 5’000,000 litros de capacidad cada
uno para su distribución y venta respectiva. 

5. DESTILACIÓN Y RECTIFICACIÓN etanol de Caña Brava se destina a la

demanda nacional de gasohol; en este proceso se eleva la temperatura en los
vehículos; mientras que Torres de enfriamiento permiten licor. De esta manera, se
evapora el alcohol y enfriar los procesos con agua en los excedentes se exportan.
recirculación para reducir se logra separar del agua.
6. FERMENTACIÓN: La fermentación se conoce como un proceso de oxidación y
reducción donde la energía se produce por fosforilación del sustrato empleado a
través de diversas transformaciones moleculares donde el producto obtenido es
un compuesto orgánico más energía.

De acuerdo con la literatura existen dos tipos de fermentación, la fermentación

oxidativa que se clasifica en: acética, oxálica, cítrica y fumárica entre otras, en la
cual actúa la presencia del oxígeno y fermentación anoxidativa que se clasifica en:
alcohólica, láctica, propiónica y butírica en la cual no hay presencia de éste y en
su lugar actúan compuestos orgánicos como los aldehídos.

Por otro lado, el producto obtenido del proceso de fermentación depende del
sustrato que se emplee en ésta, de si se lleva a cabo en condiciones aerobias o
anaerobias, es decir con o sin la presencia del oxígeno y de otros factores
externos involucrados a lo largo de dicho proceso.

FERMENTACIÓN ALCOHÓLICA

En el caso de la elaboración de cerveza el tipo de fermentación involucrada se

denomina fermentación alcohólica en la cual, ocurre un proceso de transformación
bioquímica para la obtención de energía (ATP), dicho proceso se lleva a cabo en
ausencia de oxígeno, esto hace referencia a condiciones anaerobias, empleando
como sustrato azúcares que se puedan fermentar con facilidad, es decir azúcares
de cadenas cortas y simples llamados monosacáridos ya que las levaduras
carecen de la enzima diastasa (amilasa) y por esto no podrían llegar a fermentar
moléculas de alta complejidad como por ejemplo los almidones los cuales se
deben reducir para ser metabolizados por estas, es por esta razón que en el
proceso de elaboración de licor.

7. DISTRIBUCIÓN Aquí interviene la levadura encargada del etanol de alta calidad

sirve para la generación del Combustible proceso de fermentación que convierte el
Ecológico: el gasohol, el cual se obtiene a partir de la combinación de 7,8 % de
azúcar del jugo de caña en alcohol etanol, etanol con 92,2 % de gasolina.

* Tanque obteniéndose un producto llamado Licor.

Fermentación alcohólica del Licor.

Se midieron 300 ml del licor en un matraz Erlenmeyer de 500ml y se

ajustó su pH entre4.5 y 5.5 con NaOH al 40%. Se adicionaron los 50 ml del inoculo
de Saccharomyces cerevisiae activado. Después se selló el matraz con un
tapón para mantener las condiciones anaerobias y se incubó el matraz a
30°C durante48 horas. Se llevó a cabo un monitoreo del proceso de
fermentación mediante la medición de pH, azúcares reductores y grados Brix a las
0, 4,16, 24 y 48 horas. Finalizada la fermentación, se filtra con tela de lino p
gasas superpuestas y posteriormente en un embudo Büchner con papel
Whatman No.1 para eliminar la biomasa.

Pruebas para monitorear el proceso de fermentación. Medición de pH. Se

realizó la medición de pH mediante el uso de un potenciómetro previamente
calibrado con soluciones buffer de pH 10 y pH 4. Determinación de grados Brix. Se
hizo uso de un refractómetro manual el cual se calibró previamente a 0 con
agua destilada y a 10 con una solución de sacarosa al 10%. Se colocó una gota
de la muestra y se realizó la lectura. Determinación de azúcares reductores. Se
tomaron por duplicado muestras de 0.5 ml a las 0. 4. 16. 24y 48 h. El resto del
método se llevó a cabo en la sesión 2 y será explicado más adelante.

Se adicionaron 0.5 ml del reactivo DNS al 1% a cada tubo (incluyendo las

muestras de 0.5 ml que se tomaron por duplicado). Después se agitaron
todos los tubos en un vórtex y se pusieron a ebullición durante 5 minutos
en baño maría. Después se dejaron reposar 15 minutos a temperatura ambiente y
se leyó su absorbancia a 540 nm en un espectrofotómetro UV-VIS.

CONCLUSIÓN.

Se logró cumplir con el objetivo marcado por la práctica del laboratorio, el cual
era la obtención de etanol a partir de la fermentación alcohólica de residuos
lignocelulósicos. El porcentaje de etanol esperado debía estar entre el 0 y el 10%,
el porcentaje obtenido por la fermentación de la muestra (caña brava) fue de
5.06%de etanol, por lo que podemos decir que los resultados fueron los
deseados obteniendo el licor de caña brava.

REFERENCIAS

Cuervo L, Floch JL, Quiroz RE. (2009).Lignocelulosa Como Fuente de

Azúcares Parala Producción de Etanol., de Centro deInvestigación en
Biotecnología, UAEM.Instituto de Biotecnología, UNAM. Av.Universidad
2001 Col. Chamilpa, Cuernavaca,Mor. 62209, México. Sitio
web:http://www.smbb.com.mx/revista/Revista_2009_3/Lignocelulosa.pdf
Acosta C. (2012). EVALUACIÓN DE LAFERMENTACIÓN ALCOHÓLICA
PARA LAPRODUCCIÓN DE HIDROMIEL., de Universidad Nacional de
Colombia. Facultad deIngeniería, Departamento de Ingeniería Química y
Ambiental Bogotá, Colombia Sitioweb:
http://www.bdigital.unal.edu.co/9933/1/300060.2012.pdf
 METODO DE OBTENCIÓN DE ALCOHOL A PARTIR DE LA CELULOSA
DERIVADA DE RESIDUOS AGRICOLAS (HIDROLISIS ACIDA)

Objetivo

Establecer una metodología para la obtención de alcohol a través de la celulosa

obtenida a partir de los residuos del corte del césped.

Objetivos Específicos

 Separar la celulosa proveniente de los residuos agrícolas

 Generar una metodología de hidrólisis para la obtención de glucosa a partir
de celulosa aislada de los residuos agrícolas.
 Identificar el proceso de fermentación para la obtención de bioetanol.

MARCO TEORICO

Constituyentes de los materiales lignocelulósicos

Los materiales lignocelulósicos o materiales vegetales secos se pueden

considerar como complejos macromoleculares de celulosa, hemicelulosas y
ligninas que se encuentran asociados uno con el otro formando una única matriz
sólida que estructura las paredes de las células vegetales. La obtención de etanol
a partir de estos materiales involucra un proceso extenso debido a la complejidad
de las estructuras moleculares de sus polímeros constituyentes.

La composición de los materiales lignocelulósicos se clasifica en componentes

estructurales y componentes secundarios. Los componentes estructurales son la
lignina y la holocelulosa (unión entre la celulosa y las hemicelulosas).
Conformando más del 70% de la estructura de los materiales lignocelulósicos. Los
componentes secundarios son las sustancias extraíbles, materias minerales que
en los análisis químicos se estiman como la humedad y cenizas que son el residuo
obtenido por incineración del material a ensayar y representan la fracción mineral
en el mismo.

Lignina

La lignina es el constituyente intercelular incrustante o cementante de las células

vegetales, siendo un polímero amorfo de elevado peso molecular que resulta del
acoplamiento aleatorio de varios ácidos y alcoholes fenilpropílicos (cumarílico,
coniferílico y sinapílico) originando polímeros amorfos y heterogéneos por lo cual
no es posible describir una estructura definida, dentro de sus funciones cabe
destacar que protege a la celulosa de los ataques microbianos, le confiere
resistencia e impermeabilidad al material vegetal y mantiene unidas a las fibras.
Según la definición estructural de lignina dada por Brauns -que es generalmente la
más aceptadalas ligninas tienen las siguientes características:

 Son polímeros vegetales construidos a base de unidades de

fenilpropanoides.
 Presentan la mayor parte de los grupos metoxilo contenidos en la madera.
 Son resistentes a la hidrólisis ácida, fácilmente oxidables, solubles en
bisulfito o álcalis caliente, y fácilmente condensables con fenoles o tioles.
 Cuando se hace reaccionar con nitrobenceno en una solución alcalina
caliente, las ligninas producen principalmente vainillina, siringaldehído y p-
hidroxibenzaldehído en función del origen de las ligninas

Hemicelulosa

Las hemicelulosas son heteropolisacáridos (polisacárido compuesto por más de

un tipo de monómero) de cadenas largas formados por una gran variedad de
pentosas y hexosas (fundamentalmente xilosa, arabinosa, galactosa, manosa,
glucosa y ácido glucurónico), que establecen una cadena lineal ramificada; sirve
de conexión entre la lignina y las fibras de celulosa y le proporciona mayor rigidez
a la matriz celulosa - hemicelulosa – lignina.

Sus cadenas ramificadas son de menor grado de polimerización comparadas con

las de la celulosa y por lo tanto no presentan zonas cristalinas, además los
puentes de hidrógeno son menos eficaces, haciéndolas más accesibles al ataque
de reactivos químicos provocando que las reacciones de oxidación e hidrólisis
afectan mucho más la estructura de las hemicelulosa que la estructura de la
celulosa.

Celulosa

La celulosa (que en términos de estructura es un poco menos compleja que la

lignina y la hemicelulosa) es un homopolisacarido lineal compuesto
exclusivamente de moléculas de β-glucosa unidas por medio de enlaces 1,4- β
-gucosídicos que se forman por medio de unión del grupo –OH hemiacetálico del
carbono 1 de la β-D-glucopiranosa con el grupo –OH del carbono 4 de otra β-
Dglucopiranosa.

Uno de los extremos de cada cadena presenta en el carbono 1 un grupo aldehído

de carácter reductor. La conformación piranosa, donde los carbonos son
tetraédricos y la forma más estable es la de silla (figura 4), presenta los grupos –
CH2OH, -OH y los enlaces glucosidicos en posición ecuatorial y los hidrógenos en
posición axial. Este hecho de que los grupos –OH salgan lateralmente permite a la
celulosa formar uniones inter e intramoleculares por puentes de hidrógeno.
DESCRIPCIÓN DEL MÉTODO

Por su abundancia y naturaleza lignocelulósica, dicha especie proveniente del

pasto constituye una reserva energética importante al representar una fuente de
materia prima renovable para la producción de alcohol obtenido a través de la
celulosa

El proceso para su obtención de forma general son cinco etapas secuenciales:

 Preparación de la muestra
 Remoción de ligninas
 Remoción de hemicelulosas(obtención de celulosa)
 Hidrólisis de la celulosa
 Fermentación de glucosa (obtención de etanol)

PREPARACIÓN DE LA MUESTRA

Para preparación de la muestra se realiza una reducción mecánica del tamaño

de partícula se utilizan 100 g de pasto debidamente seleccionado y lavado que se
muele en agua utilizando un molino de cuchillas.

Se toman de a 10g de pasto y se introducen dentro del molino con 500mL de

agua, se aplican dos intervalos de molido de diez segundos cada uno, el residuo
es filtrado y lavado en un filtro de tela para eliminar toda la coloración verde
posible. Posteriormente el filtrado se lleva a un horno a 105°C hasta que alcance
una humedad constante para finalmente pasarlo por un tamiz de número de malla
35.

REMOCIÓN DE LIGNINAS CON PERÓXIDO DE HIDRÓGENO ALCALINO

Esta metodología consiste de manera general en disponer en un Beacker una

muestra de pasto cruda y verter una solución alcalina de H2O2 al 2% con pH 11,5
(dicho pH se ajusta con hidróxido de sodio) manteniendo una relación [g de
H2O2 / g de muestra] de 1, la duración del proceso es de 8 horas a temperatura
ambiente con agitación magnética a 800 rpm.

Transcurrido este tiempo, las muestras se filtran utilizando un equipo de filtración

al vacío y los residuos sólidos se lavan con abundante agua destilada hasta
alcanzar pH neutro. Finalmente se secan en un horno precalentado a 103ºC por
intervalos de 2 horas hasta alcanzar peso constante.

Con los datos de peso de la muestra inicial y el peso final tras desecado se calcula
el porcentaje de material solubilizado.
REMOCIÓN DE HEMICELULOSAS

Para remover las hemicelulosas presentes en el material no solubilizado que se

obtiene tras la eliminación de lignina por las metodologías propuestas por Azzam
se sigue a realizar la metodología propuesta en la norma NTC 697.

Para la holocelulosa blanqueada se toman por separado tres Beacker de 1000 mL,
en cada uno se agrega 7g de holocelulosa blanqueada, simultáneamente, en dos
Beacker de 1000 ml se agrega por separado 9 g del residuo obtenido por el
método propuesto por Azzam a pH 11.5, se trabaja a temperatura ambiente;
posteriormente se agrega NaOH al 17.5% en volúmenes de 175.5 ml a cada
Beacker para las muestras.

Transcurridos los 10 minutos a partir del momento en que se agregó la primera

porción de NaOH la mezcla se deja reposar durante 30 minutos en baño a 20°C.
Cumplido el periodo de reposo se agrega agua destilada en volúmenes de 264.2
mL con agitación suave y luego se dejaron en reposo durante 30 minutos más.

Los beacker y residuos se lavan con 50 mL de NaOH al 8,3% y se filtran utilizando

un montaje de filtración al vacío, seguido a esto se realiza cinco lavados con agua
destilada a cada residuo, a continuación se desconecta la succión y se llena cada
crisol con solución 2N de CH3COOH y se deja humedecer los residuos, pasados
5 minutos se elimina el ácido aplicando succión y cada residuo es lavado con agua
destilada hasta que se compruebe la eliminación de la acidez con papel indicador.

Los residuos son secados en horno a 105°C hasta que alcancen una masa
constante.

El filtrado corresponde a celulosa α en porcentajes que se determina dividiendo la

masa final de cada muestra tratada sin humedad en las masas iniciales sin
humedad y multiplicando por cien.

HIDRÓLISIS DE LA CELULOSA

Se realizan pruebas piloto de carácter cualitativo tratando por separado 3.5g de

residuo de pre tratamiento con peróxido alcalino y 3.5g de papel con 86.3ml de
solución de ZnCl2 al 42% en peso, la relación [ZnCl2/muestra] fue de 18, la
concentración de HCl fue de 0.5M, la temperatura se mantiene en el rango de [60-
70]°C y el tiempo de reacción es de 2 horas.

También como prueba piloto se pesan por separado 3 gramos de holocelulosa

blanqueada y 3 gramos de muestra Azzam pH 11.5, tanto la relación
[ZnCl2/muestra] como la concentración de HCl se mantiene iguale, mientras que
el rango de temperatura pasó a ser de [70-80°C] y el tiempo de reacción de 4
horas.

En dos beackers de 1000 mL se agregan por separado 15 g de celulosa obtenida,

se agrega 15 ml de agua para humedecer. Simultáneamente se calentaron dos
volúmenes de 312.6 ml de solución de ZnCl2 al 45% en peso hasta que alcance
una temperatura de 70° C, hecho esto, cada solución se vierte sobre las muestras
de celulosa y se ponen en agitación magnética a 200 rpm durante 10 minutos.
Transcurrido este tiempo se agregan 13.5 mL de HCl hasta que alcanze una
concentración de 0.5M.

La presencia de ácido es indispensable para que tenga lugar la hidrólisis. El

sistema se mantiene en agitación magnética a 200 rpm, la temperatura de trabajo
debe estar entre los 70° C y 80° C y el tiempo de duración es de 18 horas.

El curso de la hidrólisis se realiza a partir de la hora 13 y hasta la hora 18 tomando

alícuotas de 0.5 ml cada hora, estas son precipitadas con 1.5 ml de solución de
Na2CO3 al 2M, se centrifugan y luego se leen a 490 nm por el método de Miller
para determinar el tiempo en el que se alcanzó la concentración máxima de
azúcares.

Separación del hidrolizado destinado a la fermentación

La separación del hidrolizado se refiere la precipitación de los iones Zn2+, esto se

lleva a cabo sobre los volúmenes obtenidos, se divide en 10 alícuotas de 32.6 ml
que son agregadas gradualmente en volúmenes de 102.6 ml Na2CO3 al 2M,
observándose la formación de un precipitado blanco que corresponde a ZnCO3.
Completada cada precipitación, se centrifuga en tubos falcon de 15 ml a 5500 rpm
durante 7 minutos. Los sobrenadantes se someten a filtración al vacío, y luego se
recuperan y almacenan en frascos ámbar limpios para su posterior fermentación.

Cuantificación de azucares reductores por el método de Miller

En un tubo de ensayo se mezclan 0.5 ml de la solución problema con 0.5 ml de

DNS y se agitan con vortex, se colocan a ebullición en un baño maría durante 5
minutos, luego se sumergen en un baño de hielo para detener la reacción, se
agregan 5 ml de agua destilada, se agita con vortex, y se deja en reposo durante
15 minutos y se lee a una longitud de onda de 490 nm en un espectrofotómetro.
FERMENTACIÓN Y CARACTERIZACIÓN DEL ETANOL

Concentración de los hidrolizados

Los volúmenes obtenidos del proceso de hidrólisis realizado sobre las muestras
obtenidas se concentran por evaporación durante 24 horas a 95°C hasta un
volumen final de 100 ml, luego se mezclan con el objetivo de tener la mayor
cantidad de azúcar posible obteniendo un volumen final de 200 ml de hidrolizado
con una concentración aproximada de azúcar de 32.46 g/L determinada por el
método de Miller.

Preparación del inóculo

Se disuelven por duplicado 1.3 g de Caldo Nutritivo en 100 ml de agua destilada,

cada litro de solución debe contener un extracto de levadura [2g/L]; peptona [5g/L]
y cloruro de sodio [5g/L].

Las soluciones se preparan en un matraz Erlenmeyer de 100 mL, el pH se ajusta a

4.5 utilizando una solución 0.5 M de HCl, luego se selladan utilizando un tapón
gasa-algodón y papel Kraft y se esterilizaron en autoclave a 121°C durante 15
minutos.

Se deja enfriar hasta temperatura ambiente y en cada una se siembra 1 g de

levadura cervecera deshidratada, los frascos son sellados y se llevan a un horno
convencional en donde se incuban a 37°C durante 48 h en presencia de agua para
proporcionar un ambiente húmedo, el crecimiento de la población se monitorea
cada 24 horas utilizando un microscopio óptico.

Fermentación alcohólica

En dos Erlenmeyer de 250 ml se agregan por separado 200 ml del hidrolizado

previamente concentrado hasta 32.46 g/L y 200 mL de una solución patrón de
glucosa a la misma concentración, se sellan utilizando un tapón gasa-algodón y
papel Kraft para ser esterilizados en autoclave a 121°C durante 15 minutos, las
soluciones se dejan enfriar hasta temperatura ambiente y en cada una se agrega
con pipeta autoclavada 10 ml del inóculo.

Los Erlenmeyer se sellan y son colocados por separado en agitación magnética a

200 rpm en planchas de calentamiento con temperatura de 37°C la duración del
proceso es de 24 horas y el final de la reacción se determina por el resultado
negativo de la reacción de Benedict para azúcares reductores.
Centrifugación y destilación de los productos de fermentación

Los residuos de fermentación, tanto para la muestra problema como para la

solución patrón, son centrifugados por separado en tubos Falcon de 15 mL limpios
y secos utilizando una centrífuga.

Los sobrenadantes fueron filtrados al vacío, recuperados en balones de destilación

de 250 mL y sometidos a un proceso de destilación simple a 78°C para aislar el
etanol producido durante la fermentación alcohólica

CARACTERIZACIÓN DEL BIOETANOL OBTENIDO

Se realiza una caracterización cualitativa con la prueba de oxidación de alcoholes

utilizando dicromato de potasio y ácido sulfúrico concentrado. Se toman dos tubos
de ensayo y se agrega a cada uno 1,5 mL de solución al 10% p/v deK2Cr2O7 y 4
gotas de H2SO4 concentrado, posteriormente se rotulan y se agregan 0,5mL de la
solución destilada proveniente al hidrolizado y 0,5mL de la solución destilada
proveniente de la fermentación patrón en cada tubo, las soluciones resultantes se
agitan cuidadosamente y se dejan reaccionar en un baño de maría a ebullición
durante unos minutos.

Los alcoholes primarios y secundarios reaccionan rápidamente con ácido crómico

para dar una suspensión verdosa debido a la formación de Cr (III), además de que
desprenden un olor dulce característico.

CONCLUSIONES

 Es posible obtener etanol a través de la celulosa obtenida de los residuos

del corte del césped a partir de las metodologías de pretratamiento,
hidrólisis y fermentación.
 El pretratamiento de peróxido alcalino es más eficiente para
concentraciones de sustrato de hasta 2 g / 100 ml con una concentración
de H2O2de 2%, manejando un pH de 11,5 con agitación magnética de
mínimo 200rpm a temperatura ambiente durante ocho horas.

REFERENCIAS

 Barroso Casillas, M. (2010). Pretratamiento De Biomasa Celulosica Para La

Obtención De Bioetanol En El Marco De Una Biorefinería. Universidad
Politécnica de Madrid
 Acid hydrolysis of cellulose in zinc chloride solution. (P. U. Department of
Food Science, Ed.) Applied Biochemistry and Biotechnology.

 Dacosta, H. V. (2007). Fermentación alcohólica: Una opción para la

producción de energía.INGENIERÍA Investigación y Tecnología

 Diaz , D. (1991). produccion de biomasa de hongos celulóticos para la

degradacion de residuos celulosicos. Universidad Complutense de Madrid