UNIVERSIDAD NACIONAL DE CHIMBORAZO

FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD

CARRERA DE LABORATORIO CLÍNICO E
HISTOPATOLÓGICO

INFORME DE PRÁCTICA DE LABORATORIO

PERÍODO ACADÉMICO OCTUBRE 2018 - MARZO 2019
ASIGNATURA PRÁCTICAS PRE- SEMESTRE: 8 PARALELO: A
PROFESIONALES II
NOMBRE DEL DOCENTE ANA CAROLINA GONZÁLEZ R
FECHA 17/10/2019
NÚMERO DE PRÁCTICA 1 HORA: 18:00-21:00H DURACIÓN: 3H
NOMBRE DE LOS GRUPO 2
ESTUDIANTES. Alexander Segundo
Sagñay Tapia
LUGAR DE LA PRÁCTICA LABORATORIO E-301
TÍTULO DE LA UNIDAD DIAGNÓSTICO DE ENFERMEDADES INFECCIOSAS
TEMA DE LA PRÁCTICA PRINCIPIOS DIAGNÓSTICOS DE LAS ENFERMEDADES INFECCIOSAS.
RESULTADO DE APRENDIZAJE.
Identifica bacterias de fluidos corporales con técnicas y protocolos para el adecuado diagnóstico de
los patógenos causantes de infecciones bacterianas
OBJETIVO GENERAL Introducir al estudiante en la aplicación de conocimientos técnico-
científicos para el diagnóstico microbiológico de las enfermedades
infecciosas.
Objetivos específicos 1.-Describir la importancia clínica y microbiológica de las diferentes
etapas que conforman el procesamiento microbiológico de una
muestra clínica y su relación con el éxito o fracaso en el diagnóstico de
las enfermedades infecciosas.
2.- Reforzar las destrezas prácticas adquiridas, en cuanto a la
realización de técnicas de susceptibilidad. Lectura interpretada del
antibiograma.

FUNDAMENTO TEÓRICO:
PRINCIPIOS DIAGNÓSTICOS DE LAS ENFERMEDADES INFECCIOSAS.
El diagnóstico de las enfermedades infecciosas se realiza sobre la base de los signos y
síntomas clínicos que presenta el paciente, los datos epidemiológicos y la demostración del
agente causal o las huellas que éste ha dejado en el sistema inmunológico del individuo.
El papel del laboratorio de microbiología clínica consiste en determinar la presencia de
patógenos potenciales en los tejidos, los líquidos corporales o las secreciones de los
pacientes, e identificarlos en caso de que estén presentes. Este servicio es indispensable para
el médico tratante, porque la información acerca de la identidad del patógeno es de
importancia primordial para predecir el curso de la infección y orientar o decidir la conducta
terapéutica más apropiada. Esta información puede obtenerse por medio de cuatro formas
posibles:
El cultivo y la identificación de los microorganismos a partir de muestras clínicas.
El examen microscópico de la muestra clínica.
La medición o cuantificación de la respuesta inmune específica para el patógeno en el
paciente.
La detección de moléculas específicas de los patógenos en las muestras de los
pacientes.
NORMAS BÁSICAS PARA LA RECOLECCIÓN CORRECTA DE MUESTRAS BIOLÓGICAS
1. La muestra para cultivo debe proceder, de ser posible, del verdadero sitio de la
infección y deberá recogerse con un mínimo de contaminación de tejidos, órganos o
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secreciones adyacentes.
2. Se establecerán los períodos óptimos para la recolección de las muestras de acuerdo
al proceso natural de la enfermedad y del microorganismo posiblemente involucrado. Esto se
realiza con la finalidad de aumentar las posibilidades de recuperar y aislar el agente
etiológico.
3. Obtener la suficiente cantidad de muestra para llevar a cabo todas las pruebas y
técnicas de cultivo solicitadas.
4. Utilizar dispositivos de recolección, recipientes para las muestras y medios de
transporte adecuados para asegurar el óptimo aislamiento de los microorganismos.
5. Siempre que sea posible, se deberán obtener las muestras clínicas antes de la
administración de antibióticos.
6. El envase o los dispositivos de recolección de muestras clínicas deberán estar
correctamente rotulados y fechados.
FACTORES QUE INFLUYEN EN EL AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS
Localización del proceso infeccioso.
Técnica y material utilizado para colectar la muestra.
Medio de transporte en el cual la muestra es colocada.
Tiempo transcurrido entre la toma de muestra y su procesamiento en el laboratorio.
TRANSPORTE DE MUESTRAS BIOLÓGICAS
El principal objetivo del transporte de muestras clínicas dentro y fuera de un hospital, es la
preservación del material biológico lo más semejante a su estado original, con un mínimo de
deterioro y sin riesgos de contaminación para quien manipula estas muestras.
Sistemas de transporte y condiciones de almacenamiento de muestras
Los medios para el transporte de muestras más utilizados y que permiten la viabilidad de la
mayoría de los patógenos son: el medio de Stuart, Cary-Blair y el de Amies. Estos medios
semisólidos tienen un pH regulado y son esencialmente una mezcla de sustancias
tamponadas que carecen de factores de crecimiento.
AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN BACTERIANA POR MÉTODOS CONVENCIONALES
El crecimiento e identificación del agente etiológico in vitro casi siempre es el recurso
diagnóstico más sensible y específico, y por eso es el método más usual. Casi todas las
bacterias de importancia médica pueden cultivarse fuera del hospedador, en medios
artificiales de cultivo.
Es posible cultivar la mayoría de las especies de bacterias y hongos de importancia clínica en
medios artificiales, pero no existe un medio de cultivo universal que permita el crecimiento
de todas ellas, y hay algunas especies que sólo pueden cultivarse en animales de
experimentación (Mycobacterium leprae y Treponema pallidum). Otras bacterias son
imposibles de cultivarlas en medios artificiales (Chlamydia sp. y Rickettsia sp.) pero se
desarrollan muy bien en líneas celulares.
Una vez que se detecta el crecimiento bacteriano en un medio de cultivo para aislamiento
inicial o primario, debe determinarse la importancia real de la bacteria que se ha aislado.
Luego, se continuará con el proceso de obtener cultivos puros a partir de colonias aisladas y la
aplicación de pruebas diseñadas para la caracterización e identificación definitiva de la
bacteria. Las pruebas exactas y la estrategia metodológica a seguir varían con los distintos
grupos bacterianos, y el nivel taxonómico (género, especie o subespecie) de identificación
requerido estará en relación con la utilidad o importancia clínica que se le dé a esa
información.
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Los métodos convencionales para la identificación de los microorganismos se fundamentan

principalmente en:
1.Pruebas bioquímicas: evalúan la capacidad metabólica de un microorganismo relacionado
con:
Los sustratos que puede utilizar la bacteria para crecer (hidratos de carbono,
aminoácidos, entre otros).
Las enzimas que posee la bacteria (descarboxilasas, ureasas, peroxidasas, entre otras).
Los productos metabólicos producidos por las bacterias (ácido fórmico, succínico,
butírico, entre otros).
La capacidad para metabolizar azúcares por oxidación o fermentación.
La capacidad de reducir ciertos iones (ferroso a férrico).
La capacidad de movilidad por la presencia de flagelos.
La producción o no de hemolisinas.
El crecimiento o no de ciertos factores especiales para el crecimiento bacteriano
(vitamina K, isovitalex, factor V y/o X, entre otros).
La producción o no de algunas toxinas con capacidad virulenta.
Existen métodos que utilizando los fundamentos del diagnóstico convencional se han
diseñado para proporcionar resultados rápidos. Entre los más conocidos tenemos:
Sistema API
Sistema VITEK
Sistema MicroScan
Lectura interpretada del antibiograma
El análisis de los resultados de sensibilidad es un aspecto esencial para una adecuada
información del antibiograma y tiene una gran trascendencia clínica. En este sentido, la
lectura interpretada del antibiograma analiza los fenotipos de sensibilidad y permite deducir
posibles mecanismos de resistencia. Además, este proceso permite inferir la sensibilidad de
antibióticos no estudiados en el antibiograma y la corrección, en su caso, de falsas
sensibilidades observadas in vitro, como ocurre en el caso del antibiograma de una
enterobacteria con una BLEE, en el que no siempre aparecen como resistentes todas las
cefalosporinas, si bien, en la práctica debe evitarse su uso. Asimismo, favorece la adecuación
del tratamiento, el control de las políticas de antimicrobianos, la detección de nuevos
mecanismos de resistencia y el conocimiento de su epidemiología
Concentración mínima inhibitoria (CMI): es la dilución más baja de antimicrobiano en la que
no se observa crecimiento bacteriano.
MARCO TEORICO.
PRINCIPIOS DIAGNÓSTICOS DE LAS ENFERMEDADES INFECCIOSAS.
El diagnóstico de una infección microbiana empieza con una evaluación de las características
clínicas y epidemiológicas, lo que conduce a la formulación de una hipótesis diagnóstica. Por
lo general, se incluye la localización anatómica de la infección con la ayuda de los hallazgos
físicos y radiológicos. Este diagnóstico clínico sugiere cierto número de agentes etiológicos
posibles con base en el conocimiento de los síndromes infecciosos y sus cursos. Se requiere
de una combinación de arte y ciencia por parte tanto del clínico como del laboratorista: el
clínico debe seleccionar los exámenes y muestras biológicas adecuadas a procesarse y, en
caso apropiado, sugerir los agentes etiológicos sospechados al laboratorio. El laboratorista
debe utilizar los métodos que demuestren los agentes probables y estar preparado para
explorar las otras posibilidades que sugieran la situación clínica o los hallazgos de las pruebas
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de laboratorio. Los mejores resultados se obtienen cuando la comunicación entre el clínico y

el laboratorista se encuentra maximizada.

Los métodos generales para el diagnóstico de laboratorio varían con diferentes

microorganismos y enfermedades infecciosas. La microscopia, los cultivos y la detección de
antígenos y anticuerpos son métodos clásicos.

Cultivo de los microorganismos

Por lo general, una muestra contiene muy pocos microorganismos para que se puedan ver
con el microscopio o se puedan identificar usando otras pruebas. Por lo tanto, habitualmente
se intenta aumentar el número de microorganismos (cultivándolos) en el laboratorio hasta
que son suficientes como para poder identificarlos. Se toma una muestra de la zona de la
infección que pueda contener el microorganismo. Las muestras pueden incluir

Sangre

Esputo

Orina

Heces

Tejido

Líquido cerebroespinal

Moco de la nariz, la garganta o el área genital

La muestra se deposita en una placa o en un tubo de ensayo para cultivo que contiene
nutrientes específicos que favorecen el crecimiento de los microorganismos. Se utilizan
diferentes nutrientes dependiendo del microorganismo que se sospeche. A menudo, se
añaden determinadas sustancias químicas a la placa o al tubo de ensayo para detener el
crecimiento de aquellos microorganismos que no causan la enfermedad que se sospecha que
sufre el paciente.

Muchos microorganismos, como por ejemplo las bacterias que causan infecciones de las vías
urinarias o en el caso de la faringoamigdalitis estreptocócica, se pueden cultivar con facilidad.
Algunas bacterias, tales como las bacterias que causan la sífilis, no se pueden cultivar. Otras
bacterias, como las que causan la tuberculosis, aunque se pueden cultivar, tardan varias
semanas en crecer. Algunos virus se pueden cultivar, pero muchos no.

Pruebas de la sensibilidad de un microorganismo a los fármacos antimicrobianos

Es necesario realizar pruebas de sensibilidad para determinar la eficacia de diferentes

fármacos antimicrobianos contra el microorganismo concreto que está ocasionando la
infección en el paciente. Esta prueba ayuda a decidir qué medicamento se debe utilizar para
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combatir dicha infección.

Las pruebas de sensibilidad se llevan a cabo sobre los cultivos. Una vez que el
microorganismo crece en un cultivo, se añaden diferentes antimicrobianos para ver cuáles
consiguen destruir a los microorganismos. También permiten determinar cómo de sensible es
el microorganismo a un fármaco concreto, es decir, si se necesita una dosis pequeña o grande
del antimicrobiano para matar al microorganismo. En general, no se emplea un fármaco si en
la prueba de laboratorio son necesarias dosis muy grandes de este para destruir al
microorganismo.

A veces se utilizan pruebas genéticas para detectar qué genes del microorganismo son los
que causan resistencia a ciertos fármacos antimicrobianos. Por ejemplo, se puede
identificar Staphylococcus aureus resistente a meticilina (SARM) mediante pruebas que
detectan el gen mecA.

Las pruebas de sensibilidad se realizan en el laboratorio, por tanto su resultado no siempre

reproduce lo que ocurre en el organismo de la persona cuando se le administra un fármaco.
Diversos factores relacionados con el paciente pueden influir en la eficacia del fármaco. Se
incluyen los siguientes:

El buen funcionamiento del sistema inmunitario de la persona afectada

La edad de la persona

Si se sufren otros trastornos

Cómo absorbe y procesa el fármaco el organismo de la persona

Muestras:

Sangre.- En el paciente febril, con o sin síntomas o signos de localización, el hemocultivo es

la prueba más útil para demostrar la presencia de infección sistémica. En las personas
sanas, los cultivos de sangre obtenidos correctamente permanecen estériles. Aunque
ocasionalmente pueden ingresar en la sangre microorganismos de la flora microbiana
normal, son eliminados rápidamente por el sistema reticuloendotelial el aislamiento de un
microorganismo en un hemocultivo es un hecho de gran valor clínico, siempre y cuando se
haya descartado la posibilidad de un error técnico. Los siguientes criterios pueden ayudar a
determinar la significación de los microorganismos diferentes:

 Desarrollo del mismo tipo de microorganismo en cultivos repetidos: bacteriana.

 Pequeño número de varios microorganismos diferentes: sugestivo de contaminación.
 Aparición en un solo de varios hemocultivos, de gérmenes de la flora normal de la
piel (estafilococos, corinebacterias) :sugestivo de contaminación.
 Los microorganismos relacionados con determinado cuadro clínico son muy factibles
de tener significación etiológica (por ejemplo, estreptococos viridans y endocarditis).
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Para el examen adecuado de la sangre se deberán seguir los siguientes pasos:

 Recolección apropiada de la muestra.

 Cultivo.

Recolección apropiada de la muestra

Extracción de 10 ml de sangre con jeringuilla estéril y seca, previa limpieza y desinfectación

de la piel. Desinfección con yodo y flameado de la superficie de la tapa perforable de un
frasco con 100 ml de caldo infusión de corazón. El objetivo es obtener una relación sangre –
medio de cultivo de 1:10 a fin de diluir las sustancias con actividad antimicrobiana presentes
normal o artificialmente en la sangre. Introducir la sangre extraída en el frasco con caldo y
mezclar suavemente. Cuando no pueda llevarse el frasco inoculado inmediatamente al
laboratorio o dejarse a temperatura ambiente.

Cultivo

El frasco se colocará en una incubadora a 37 oC. Se hará observación macroscópica diaria y

resiembra inmediata a placa de agar sangre cuando se observe turbidez, resiembra al tercer y
décimo día aún en ausencia de signos macroscópicos de positividad. Se identifican los
crecimientos que se obtengan en las placas de medios de cultivo y se realiza antibiograma a
los gérmenes patógenos. En casos especiales, como cuando se sospecha brucelosis, se utilizan
medios de cultivos específicos (Ruiz - Castañeda) y la incubación puede prolongarse hasta 30
días.

Líquido cefalorraquídeo

El diagnóstico rápido y preciso de meningitis tiene gran importancia por sus implicaciones
en el tratamiento y pronóstico de la enfermedad. Es muy urgente la diferenciación entre la
meningitis bacteriana purulenta y la meningitis no bacteriana. La decisión inmediata se
basa en el examen citoquímico del LCR (número y tipo de células, contenido en glucosa) y
en la búsqueda microscópica de microorganismos. Las bacterias que más frecuentemente
causan meningitis son el neumococo, el meningococo y el Haemophilus influenzae, esta
última sobre todo en niño.

Recolección de la muestra

Se recogerá el LCR mediante punción lumbar practicada con precauciones de asepsia. Se

recogerá un tubo estéril, teniendo cuidado de evitar el humedecimiento de los tapones si son
de algodón. La muestra deberá procesarse de inmediato, las que sean tomadas fuera del
horario de trabajo del laboratorio serán conservadas a 37 oC. Todas las muestras serán
centrifugadas y decantadas.

Cultivo
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El sedimiento se siembra en una placa de agar chocolate que se incuba a 37 oC en una

atmósfera de – 10 % de CO2. Se identifican los crecimientos obtenidos y se realiza
antibiograma a los gérmenes patógenos.

Orina

El examen bacteriológico de orina se hace cuando hay signos o síntomas de infección de

vías urinarias, insuficiencia renal o hipertensión de vías urinarias. La orina excrementada
por el riñón y la de la vejiga son estériles. Sin embargo, la uretra contiene una flora
microbiana normal que contamina la orina a su paso, de tal manera que la orina por
micción espontánea contiene un pequeño número de bacterias. Debido a que es necesario
distinguir los contaminantes de los organismos etiológicamente importantes, sólo el
examen cuantitativo de orina puede dar resultados significativos.

Recolección de la muestra

Debido al peligro de introducir microorganismos en el interior de la vejiga, la

caracterización debe evitarse siempre que sea posible. Se pueden obtener muestras
satisfactorias por micción natural, limpiando los genitales con agua y jabón, y colectando la
orina a la mitad de la micción en un recipiente estéril. Debe preocuparse recoger la primera
orina de la mañana, a fin de que los microorganismos hayan tenido tiempo de multiplicarse
en la vejiga. Si la muestra no se puede enviarse de inmediato al laboratorio o su transporte
va a demorarse, se deberá conservar la orina en refrigeración.

Urocultivo cuantitativo

Se siembra una cantidad medida de orina en la superficie de una placa de agar sangre y el
número de colonias que aparezcan se cuentan para obtener el número de bacterias por ml,
después de multiplicarse por el factor de dilución. Se acepta que la presencia de más de 100
000 microorganismos por ml a partir de una muestra de orina colectada correctamente,
constituye una fuerte evidencia de menos bacterias, se considera dudoso el examen y está
indicado repetirlo. Cuando se encuentran menos de 10 000 bacterias, ya que se considera
que proviene de la flora normal o son contaminantes
MATERIALES Y MÉTODOS
Equipos Materiales Reactivos
Microscopios, mecheros Placas con agar Mueller Hinton patrón 0.5 del estándar de
Estufa. Solución salina estéril, pinzas, Asa de platinoMcFarland
,discos de antibióticos, regla
milimetrada, tablas de los criterios
estandarizados del CLSI., hisopos estériles

PROCEDIMIENTO / TÉCNICA:
Prueba para la detección de Beta-Lactamasas de espectro extendido (BLEE)
La detección de cepas productoras de BLEE se realiza mediante el método de doble disco.
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Se procede a preparar un inóculo de cada cepa y a colocarlos en placas con agar Mueller
Hinton (MH), de la misma manera que para el método de difusión en disco.
Luego se colocaron los discos de antibióticos y se incubaron las placas a 35-37ºC durante 18-
24 horas.
La producción de BLEE se evidencia por un incremento de la zona de inhibición entre los
discos de cefalosporinas de tercera generación y monobactáicos y el disco de
amoxacilina/ácido clavulánico.
Modificación de las PBP (gen mecA)
Se determina mediante la prueba de difusión en agar, siguiendo las recomendaciones
descritas por el Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). Utilizando el disco de
cefoxitin (FOX) 30 μg. Utilizando los puntos de corte recomendados para Staphylococcus spp.
por el CLSI.
Determinación de fenotipos de resistencia a macrólidos, lincosaminas estreptograminas.
Se realiza mediante el test de inducción con discos de eritromicina (15 mg) y clindamicina (2
mg) separados 20 mm entre sí, en medio de Müller-Hinton. Se determinan cuatro fenotipos
posibles de acuerdo con los resultados del test: a) fenotipo S (eritromicina y clindamicina
sensibles), b) fenotipo M (eritromicina resistente y clindamicina sensible sin achatamiento del
halo de inhibición de la clindamicina), c) fenotipo MLSB inducible
(MLSBi: eritromicina resistente y clindamicina sensible con achatamiento del halo de
inhibición de la clindamicina), y d) fenotipo MLSB constitutivo (MLSBc: eritromicina y
clindamicina resistentes).
RESULTADO (Gráficos, cálculos, etc.)

ANEXO N° 1

Preparación de los materiales para la práctica

ANEXO N° 2
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Preparar un inóculo de cada cepa y a colocarlos en placas con

agar Mueller Hinton (MH),

ANEXO N

Método de difusión en disco.

ANEXO N° 4

RESULTADO
Colocar los discos de antibióticos y se incuba las placas de 35-37ºC
durante 18-24 horas. Y observar los resultados

OBSERVACIONES
En la realizacion de la práctica se pudo determinar que los discos de susceptibilidad que fueron
colocados en la placa petri el disco OX presenta sensibilidad es decir que la misma va estar mediada
por el gen Mec A
En el disco de Eritromicina y Clyndamicina presenta sensibilidad es decir al fenotipo de MLSc con un D
test positivo
CONCLUSIONES
Los métodos de detección de enterobacterias productoras de BLEE deben comenzar por una
adecuada interpretación de los perfiles de sensibilidad con los criterios habituales de lectura
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interpretada del antibiograma.

Se deben elegir métodos de confirmación basados en la inhibición del enzima por los inhibidores
de ß-lactamasa, generalmente utilizando ácido clavulánico. Deben emplearse varios substratos,
esencialmente ceftazidima y cefotaxima o ceftriaxona, para permitir la detección de enzimas con
baja capacidad hidrolítica para alguno de los substratos. En el caso de las enterobacterias
productoras de AmpC, la cefepima constituye el substrato que mejor detecta la presencia de estas
enzimas. La adecuada detección de los microorganismos productores de BLEE es esencial para
conocer la verdadera dimensión del problema que representan, limitar su diseminación y adecuar
las escasas opciones terapéuticas.
Mediante clases teóricas se compartió por parte del docente al estudiante, conocimientos acerca
del tema a tratar en la aplicación del conocimiento tecno-científicos para el diagnóstico
microbiológico de las enfermedades infecciosas
En el laboratorio se describió en qué consiste y cuál es la importancia clínica y microbiológica de
las diferentes etapas que conforman el procesamiento microbiológico de una muestra clínica y
su importancia del buen procesamiento para evitar tipos de errores y contaminaciones de la
muestra que tendrá su relación con el éxito o fracaso en el diagnóstico de las enfermedades
infecciosas
Mediante actividades de laboratorio y teóricas, junto con el docente y estudiantes se pudo llevar a
cabo mediante la práctica el desarrollo de destrezas en cuanto a la realización de técnicas de
susceptibilidad, y lectura interpretada del antibiograma, todo esto se la podrá lograr, mediante
prácticas que se realicen para poder familiarizarse en qué consiste cada uno de los, cual es la
importancia de los métodos que aplican para llevar a cabo un buen proceso de la muestra

RECOMENDACIONES
Se requiere la utilización de, al menos, los discos de cefotaxima (o cefriaxona) y ceftazidima
para detectar con mayor eficiencia la presencia de BLEE.
Cuando no se confirma la presencia de BLEE, utilizar los puntos de corte generales para
enterobacterias, independientemente del género aislado.
Cuando se confirme fenotípicamente la presencia de BLEE, deberán informarse resistentes a
todas las penicilinas, cefalosporinas y aztreonam
Los resultados de sensibilidad deben considerarse en su conjunto y deben analizarse grupos
de antibióticos pertenecientes a una misma familia o de diferentes familias, pero relacionados
por un mismo mecanismo de resistencia.
Para la determinación y preparación de pruebas de susceptibilidad se debe preparar el
inoculo basados en la escala de mack farla, en el caso que este demasiado turbia agregar
solución salina y en la caso de que no se encuentre a la escala deseada agregar más cantidad
de colonias.
Para la lectura de los discos de susceptibilidad se debe guiar en la última actualización del
libro guía NCCLS

BIBLIOGRAFÍA
Microbiologia en Práctica de Jawets, Melnick y Adelberg E. Alche Editorial Atlante s.r.l
Microbiologia Fuerst Nueva Editorial Interamericana

DOCENTE RESPONSABLE DEL LABORATORIO

DIRECTOR/A DE CARRERA