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complejo colorante-mordiente y permanecen de color violeta. En cambio, en las células Gram

negativas el alcohol altera la capa externa de lipopolisacárido y el complejo
colorante/mordiente se elimina de la capa delgada de peptidoglucano. Como consecuencia,
las células Gram negativas son incoloras hasta que se agrega el colorante de contraste rojo
(fucsina o safranina), después de lo cual aparecen de color rosado.

Figura 2.3. Tinción de Gram (http://www.mysvarela.nom.es/microbiologia/bacterias3.htm)

Coloración de Ziehl-Neelsen (tinción diferencial para bacterias ácido-alcohol

resistentes)
Se trata de un procedimiento de tinción diferencial, conocido como método de Ziehl-Neelsen,
que tiene gran relevancia por su aplicación clínica. Permite poder distinguir aquellos
microorganismos cuya coloración resiste la acción de alcoholes y ácidos suaves (ácido-alcohol
resistentes) de otros que no resisten la decoloración (ácido alcohol sensibles)
PROCEDIMIENTO
a) Sobre el preparado ya fijado se vierte la solución de fucsina de Ziehl sin diluir.
b) Se calienta hasta que empiecen a desprenderse vapores blancos, haciendo pasar por
debajo del portaobjetos la llama de un hisopo embebido en alcohol. Se repite tres veces el
procedimiento.
c) Dejar enfriar 5 min y lavar con agua.
d) Decolorar con una solución de ácido clorhídrico al 3% (V/V) en etanol de 95% (mezcla
alcohol-ácido), hasta la decoloración casi total del frotis.
e) Lavar con agua.
f) Cubrir unos minutos con solución de Azul de Metileno (según Loeffler).
g) Lavar con agua, secar y observar al microscopio con el objetivo de inmersión.
RESULTADO
Las bacterias ácido-alcohol resistentes (bacilos de la tuberculosis, lepra y otras Micobacterias)
se observan de color rojo sobre el contraste azul de otras células bacterianas o restos celulares
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pertenecientes a los organismos sensibles a esta decoloración ácida (Figura 2.4).

FUNDAMENTO
Ciertos microorganismos especialmente los del género Mycobacterium (M. tuberculosis, M.
leprae, etc.) y Nocardia tienen dificultades para colorearse con las tinciones simples y aún
con la de Gram, por lo cual se los denomina bacilos ácido-alcohol resistentes (BAAR).
Dichos microorganismos contienen una gran cantidad de ceras asociadas a la mureina de la
pared celular. Estas ceras (lípidos sólidos) contienen ácidos grasos de cadena muy larga
(ácidos micólicos) que serían la causa de la resistencia a los métodos habituales de tinción.
Por lo tanto, es necesario usar una alta concentración del colorante primario (fucsina de Ziehl
o carbolfucsina) y aplicar calor suave sobre la preparación (el calentamiento derrite la cera y
aumenta la penetración y la retención del colorante). A continuación el extendido se trata con
ácido-alcohol, un decolorante que elimina el color rojo de las bacterias que no son ácido-
alcohol resistentes. Los BAAR retienen el color rojo porque las ceras vuelven a solidificarse al
enfriarse y por lo tanto, no actúa el decolorante. Las células que no son ácido-alcohol
resistentes permanecerán incoloras hasta que se coloree el extendido con azul de metileno,
que actúa como colorante de contraste. Las bacterias que no son ácido-alcohol resistentes
aparecerán de color azul después de la aplicación del colorante de contraste.

Figura 2.4. Tinción de Ziehl-Neelsen

(http://es.wikipedia.org/wiki/Tinci%C3%B3n_de_Ziehl-Neelsen)

Coloración de endosporas (tinción diferencial)

Las endosporas bacterianas pueden distinguirse en las preparaciones microscópicas sin previa
coloración debido a la gran refringencia de su protoplasma, que las diferencia de las células
vegetativas. En las preparaciones teñidas por métodos comunes, las endosporas no se
colorean debido a la resistencia que ofrece su gruesa cubierta a la impregnación por los
colorantes habituales utilizados en la coloración de Gram y azul de metileno, permaneciendo
incolora rodeada por la parte coloreada (vegetativa) de la bacteria. No obstante, es posible
lograr la tinción de las endosporas por medio de métodos especiales en los que se emplea el
calor como mordiente.
Las endosporas, debido a las características de sus envolturas no se tiñen con procedimientos
habituales. El método más empleado es el de Schaeffer-Fulton donde la suspensión de
microorganismos se tiñe en caliente con el colorante verde de malaquita, un colorante soluble
en agua por cuya razón no se utiliza habitualmente en tinciones convencionales. El calor
modifica la permeabilidad de las endosporas y permite la entrada del colorante a través de
las capas externas. A continuación, el lavado con abundante agua produce la decoloración de
las formas vegetativas así como de los extremos de las bacterias esporuladas, que se tiñen
por último con un colorante de contraste, la safranina
PROCEDIMIENTO
a) Realizar un frotis colocando una capa fina del cultivo sobre el portaobjeto, dejar secar y
fijar con la mínima cantidad de calor.
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b) Cubrir la preparación con solución al 5% de verde de malaquita, calentar con hisopo hasta
la emisión de vapores y dejar enfriar durante 5 min.
c) Lavar con agua.
d) Colorear durante 30 s con solución acuosa de safranina al 0,5%.
e) Lavar con agua, secar con papel y observar con el objetivo de inmersión.

RESULTADOS:
Las endosporas se tiñen de verde y las células vegetativas de rojo a rosado (Figura 2.5).

Figura 2.5. Tinción de endosporas (http://es.wikipedia.org/wiki/Endospora)

Coloración de cápsulas bacterianas (tinción negativa)

Las cápsulas bacterianas no tienen la misma afinidad por los colorantes que otros
componentes de la misma, por lo que se emplean coloraciones especiales. Algunas, colorean
la célula y el fondo, pero no la cápsula, de manera que ésta se aprecia por contraste (método
de Anthony). Otras se basan en colorantes diferenciales cuando la cápsula toma un colorante
y la bacteria otro (método de Muir). Existe otro procedimiento que utiliza el principio de la
coloración negativa, en el cual las cápsulas se observan como un halo claro contra un fondo
oscuro (método de la tinta china).
PROCEDIMIENTO
a) Colocar sobre un portaobjetos una pequeña cantidad de solución fisiológica, agua o caldo,
con un ansa en anillo, dispersar en ella una pequeña cantidad del inóculo bacteriano joven.
b) Agregar con un ansa en anillo, una pequeña cantidad de tinta china, mezclar bien y cubrir
inmediatamente con un cubreobjetos, dejando que el líquido se extienda formando una
delgada película. Se debe evitar la formación de burbujas de aire en el preparado.
c) Examinar con el objetivo de inmersión.
FUNDAMENTO
La cápsula desplaza a las partículas de carbono coloidal de la tinta china, apareciendo un halo
claro alrededor del microorganismo (Figura 2.6.A).

Coloración de flagelos (tinción diferencial)

Los flagelos bacterianos son estructuras de locomoción demasiado finas para visualizarlos con
el microscopio óptico sin tinción. Para lograr su coloración se trata de engrosarlos aplicando
soluciones coloidales inestables de ácido tánico, que se depositan sobre estas estructuras
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engrosando el diámetro aparente de los mismos, de tal manera que se hacen visibles al
microscopio óptico con una tinción con fucsina básica (Figura 2.6.B). En la coloración de
flagelos requiere mucho cuidado la fijación de la bacteria en la confección del preparado, dado
la facilidad con que pueden desprenderse los flagelos por daños mecánicos.

Figura 2.6. A) Tinción de cápsula con tinta china, B) Tinción de flagelos

6. Bibliografía
Madigan MT, Martinko JM, Dunlap PV, Clark DP (2014). Un breve viaje por el mundo
microbiano. En: Brock Biología de los microorganismos. 12º Edición. Editorial
Pearson Educación, S.A., pág. 28–37.
Prescott LM, Harley JP, Klein DA (2002). The Study of Microbial Structure: Microscopy and
Specimen Preparation. En: Microbiology. Editorial McGraw Hill, United States.
Tortora GJ, Funke BR, Case CL (2007). Observación de los microorganismos a través del
microscopio. En: Introducción a la Microbiología. 9º Edición. Editorial Médica
Panamericana S.A. Buenos Aires.
Vázquez C, Martín A, Silóniz MI, Serrano S. (2010). Técnicas básicas de Microbiología.
Observación de bacterias. Reduca (Biología). Serie Microbiología. 3 (5): 15-38.
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TEÓRICO PRÁCTICO 2.
MICROSCOPÍA Y COLORACIONES

Ud. se presenta a una entrevista de trabajo a un laboratorio dedicado al diagnóstico

microbiológico. Para evaluar su desempeño en el laboratorio le dan 5 tubos de cultivos de
microorganismos puros y sólo le dicen que se trata de cultivos de bacterias, hongos
filamentosos o levaduras. Le piden que los identifique presuntivamente (tamaño, forma,
agrupaciones y comportamiento tintorial) utilizando microscopia y coloraciones, para lo cual
dispone de todos los reactivos necesarios y de un microscopio de campo claro, de campo
oscuro, de contraste de fases, de contraste por interferencia diferencial, de fluorescencia,
confocal y electrónico.
1) ¿Qué tipo de microscopio utilizaría, según lo que le piden? ¿Por qué?
2) ¿Qué procedimiento realizaría para determinar si los microorganismos presentes en los
tubos son bacterias, hongos filamentosos o levaduras? Fundamente su respuesta. (Ayuda:
tenga en cuenta el tamaño de una célula procariota y de una eucariota). ¿Qué podemos
evaluar en dichas preparaciones?
3) Luego de realizar el procedimiento del punto 2, decide seguir trabajando sólo con los
cultivos bacterianos. ¿Qué procedimiento realizaría para observar estos cultivos? Explique los
pasos para poder observar dichos cultivos. ¿Qué precauciones debería considerar para no
afectar la visualización de la muestra? ¿Qué podemos evaluar en dichas preparaciones?
(Ayuda: tenga en cuenta forma y agrupaciones bacterianas).
4) ¿Cuál es la primera coloración que debería realizar? ¿Cuál es el fundamento de la misma?
¿Qué información le da? ¿Cuál es la función que desempeña cada uno de los reactivos que
usa? ¿Qué paso de la coloración podría ser omitido sin alterar la diferenciación de las
bacterias? Explique.
5) Al realizar la coloración elegida en el punto 4, Ud. observa que uno de los cultivos presenta
“estructuras” refringentes, sin colorear y con diferentes ubicación en dichas bacterias. ¿Qué
estructuras podrían ser? ¿Qué coloración emplearía para determinar de qué estructuras se
tratan? Fundamente dicha coloración. ¿Observaría dichas estructuras refringentes si omite el
paso de calentamiento? ¿Observaría dichas estructuras si emplea azul de metileno en lugar
del último colorante? Justifique.
6) Luego de realizar las coloraciones del punto 4 y 5, aún no puede identificar el
microorganismo de uno de los tubos. Entonces, le dicen que el cultivo proviene de un esputo
de un paciente presuntamente infectado con Mycobacterium tuberculosis. ¿Por qué no pudo
teñirlos con los colorantes utilizados en el punto 4? Fundamente. ¿Cuál es el fundamento de
la coloración que debería utilizar? Si omite el paso de calentamiento, ¿de qué color se
observan dichas bacterias?
7) Ya casi termina, pero le dicen que dos cultivos presentan otras “estructuras facultativas”
que no pueden ser visualizadas con las coloraciones que ha utilizado hasta el momento. ¿De
qué estructuras pueden tratarse? ¿Cómo pueden ser puestas en evidencia dichas estructuras?
¿De qué dependerá el éxito de las coloraciones? Fundamente su respuesta.
8) Debido a que el laboratorio cuenta con diferentes microscopios, como última prueba le dan
distintos preparados para que elija qué tipo de microscopio utilizaría para observarlos. En
todos los casos, fundamente su respuesta.
a) Células bacterianas no teñidas, pequeñas y no necesita ver los detalles.
b) Tejidos viables no teñidos cuando se desea ver algunos detalles intracelulares.
c) Una muestra que emite luz cuando se la ilumina con luz UV
d) Detalles intracelulares de una célula de 1 µm de longitud.
e) Células vivas no teñidas en las cuales se observan estructuras intracelulares en color.
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LABORATORIO 1.
MICROSCOPIA Y COLORACIONES

OBJETIVOS
 Aprender el manejo y cuidado del microscopio óptico de campo claro.
 Aprender las técnicas de preparación de frescos, de fijación y coloraciones más utilizadas
en el estudio microscópico de cultivos bacterianos, obtenidos de medios sólidos y líquidos.
 Identificar las principales formas bacterianas y la importancia de las tinciones simples y
diferenciales en la caracterización morfológica de dichos microorganismos.
 Observar y caracterizar someramente, mediante observación macroscópica y
microscópica, la diversidad microbiana de un ambiente elegido por el estudiante.

DESARROLLO PRÁCTICO
Primer día:
a) Observación microscópica de preparados en fresco y coloreados que se brindarán al
estudiante para que determine: forma, agrupación y comportamiento tintorial de los
microorganismos, comparándolos con los efectuados por él mismo.
b) Observación de la diversidad microbiana: Llevar una placa de Petri cerrada conteniendo
agar nutritivo, con cuidado de que no se abra durante el transporte, al ambiente cuya
carga microbiológica se desee evaluar. Retirar la tapa y dejar la placa abierta, durante
aproximadamente 30 minutos. Pasado este tiempo, cerrar la placa e incubarla a
temperatura de 25-30º C, durante 2 a 5 días.

Segundo día:
Confección de preparados para observación en fresco
a) Observación de la presencia de microorganismos en preparados en fresco, de diferentes
materiales de origen natural o de cultivos provenientes de dichos materiales.
A partir de materiales líquidos: agua estancada, vinagre, suspensión de levaduras, leche.
Tomar directamente, o previa centrifugación, con el ansa en anillo, una gota del material
y depositarla sobre un portaobjetos desengrasado y limpio. Cubrir con un cubreobjetos y
observar al microscopio (40x).
A partir de material semisólido: pus, esputo, yogurt, etc.
Colocar 1 o 2 gotas de diluyente (agua, solución fisiológica, etc.) sobre un portaobjetos.
Tomar con el ansa en anillo el material en estudio y disgregar en la gota sobre el
portaobjetos. Colocar un cubreobjetos y observar al microscopio (40x).
A partir de un material sólido: alimentos, materia fecal, tierra u otros.
Colocar en un tubo de ensayo 2 a 4 gotas de solución diluyente. Agregar el material y
agitar hasta obtener una suspensión homogénea. Tomar el material contenido en el tubo
con el ansa (previamente esterilizada a la llama y enfriada al aire cerca del mechero), y
apoyarla sobre el portaobjetos, repetir las veces que sea necesario para obtener un
volumen adecuado. Dejar caer sobre la gota un cubreobjetos y observar al microscopio
óptico (40x).
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Confección de frotis para coloraciones

Se realizarán diferentes coloraciones, tales como, Azul de Metileno, Gram, Ziehl-Neelsen y
Schaeffer y Fulton (Verde de Malaquita) de extendidos realizados con materiales disponibles
y su posterior observación al microscopio óptico.
Sobre un portaobjetos limpio y desengrasado extender con el ansa el material en suspensión
adecuadamente. Dejar secar el extendido (puede acelerarse con calor suave). Fijar el
extendido pasándolo aproximadamente tres veces por la llama del mechero, dejar enfriar y
colorear según se indique.

Observación de la diversidad microbiana

Se observará diversos tipos de colonias en las placas expuestas el primer día de práctico. Se
anotarán las características más importantes de las colonias (Figura 2.7) y se realizará un
estudio microscópico de cada una de ellas, haciendo preparados en fresco, frotis y diferentes
coloraciones con la finalidad de observar comportamiento tintorial, forma, tamaño,
agrupaciones de las células, presencia y ubicación de las endosporas. En el caso de observar
colonias filamentosas se realizarán montajes en fresco y se evaluará presencia de micelio
cenocítico y/o tabicado y estructuras de reproducción.

Figura 2.7. Aspectos más comunes de las diversas colonias microbianas aisladas sobre medio
sólido tras la exposición de las placas a un ambiente particular.

RESULTADOS
Informar: forma, agrupación, tamaño relativo y comportamiento tintorial de cada uno de los
microorganismos y/o colonias observadas.

TRATAMIENTO DE LOS MATERIALES USADOS

 Una vez finalizado el trabajo de laboratorio, limpie adecuadamente las mesadas de trabajo
con alcohol al 70% o hipoclorito de sodio al 1%.
 Descarte los cubreobjetos y portaobjetos en un frasco con solución de hipoclorito de sodio
al 5% destinado para tal fin
 Descarte todo material contaminado en las bolsas para residuos patógenos.
 Lávese las manos con jabón.
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CAPÍTULO III. ESTERILIZACIÓN y PREPARACIÓN DE MEDIOS DE

CULTIVO

1. Introducción
Los microorganismos se encuentran en la naturaleza, como todos los seres vivos, inmersos en
un medio ambiente. El estado fisiológico y capacidad de desarrollo microbiano dependen de la
actividad metabólica, dirigida por numerosas enzimas y proteínas celulares codificadas por el
material genético, y por otra parte, condicionados por el medio ambiente. Los microorganismos
se encuentran bajo la influencia de factores físicos y químicos, los cuales ejercen en su
crecimiento y desarrollo un efecto decisivo, favorable o desfavorable. En la práctica médico-
quirúrgica de las enfermedades transmisibles, en el trabajo del laboratorio microbiológico y
en la higiene y saneamiento de locales, personas, animales y alimentos se destaca el rol de
todo procedimiento, técnica o producto que suprima o disminuya la viabilidad de los
microorganismos patógenos.
Los principios que rigen los mecanismos de acción de los agentes físicos, químicos o mecánicos
son herramientas utilizadas en el control del crecimiento microbiano y sirven de base a las
prácticas de esterilización, desinfección, antisepsia y sanitización.

•Es un método que logra la •Es un método que logra la

muerte o eliminación de muerte de
toda forma de vida microorganismos
microbiana, macroscópica patógenos mediante
y microscópica, patógena y agentes químicos o físicos.
saprófita, vegetativa y de No implica la destrucción o
resistencia. eliminación de toda forma
•Sólo se aplica a objetos microbiana.
inanimados. Esterlización Desinfección • Se aplica a objetos
inanimados

Sanitización Antisepsia
•Es una práctica •Es un método que provoca
estrechamente relacionada la muerte o inhibición de la
a la desinfección. multiplicación de
•La población microbiana se microorganismos
reduce a niveles que son patógenos, mediante
considerados seguros para sustancias químicas.
la salud pública. •Se aplica sobre tejidos
vivos

Los conceptos anteriormente descriptos suelen usarse con frecuencia incorrectamente o se

confunden cuando se habla del control microbiano, por ello es importante comprender cuál es el
alcance de cada uno de ellos. Hay sufijos que se pueden utilizar para denotar el efecto de un
agente físico o químico sobre los microorganismos. Un agente biocida o germicida “mata” a
los microbios, mientras que un agente bacteriostático o fungistático (statico=detener)
inhiben el crecimiento y multiplicación; una vez eliminado el mismo podría reanudarse el
crecimiento.
Microbiología I (2159) 22

La destrucción o inhibición del crecimiento microbiano por parte de un agente antimicrobiano es

afectada por diversos factores:

•A mayor cantidad de microorganismos mayor

Tamaño de la población tiempo insumirá su eliminación.

•Las células vegetativas y “jóvenes” son

Composición de la población eliminadas más rápidamente que las células
“viejas” o estructuras de resistencia.

•En la mayoría de los casos, a mayor intensidad o

Intensidad o concentración del concentración mayor tasa de muerte o reducción.
agente antimicrobiano

•A mayor exposición mayor tasa de muerte.

Duración de la exposición

•A menor pH es más rápida la tasa de muerte.

Influencias ambientales •A mayor concentración de materia orgánica se
necesita más tiempo para lograr la muerte.

Para microorganismos, el único criterio válido de muerte es la pérdida irreversible de la

capacidad para reproducirse. El mecanismo de los procesos de “muerte” difiere de acuerdo al
método empleado, alcanzando el mismo efecto: proteínas o macromoléculas esenciales de la
célula son inactivadas interfiriendo con el ciclo metabólico celular y bloqueando su capacidad de
desarrollo y reproducción.

2. ESTERILIZACIÓN
Dentro del concepto de esterilización, se analizarán cuáles son los diferentes métodos de
esterilización que se pueden aplicar y cuáles son sus utilidades prácticas. Existen diferentes
métodos:

ESTERILIZACIÓN

Métodos Métodos Métodos

Físicos Químicos Mecánicos

Agentes Filtración
Temperatura alquilantes

Radiaciones
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2.1. MÉTODOS FÍSICOS

TEMPERATURA
Los microorganismos viven dentro de rangos amplios de temperatura, variable para cada especie
microbiana, distinguiéndose dos límites (superior e inferior) denominados temperatura
máxima, y temperatura mínima, respectivamente. La actividad máxima de los sistemas
enzimáticos de los seres vivos se alcanza a una temperatura óptima que determina la velocidad
de crecimiento. La velocidad de crecimiento desciende bruscamente después del límite superior
de temperatura. El descenso rápido a temperatura elevada es debido a la desnaturalización
térmica de las proteínas enzimáticas y de las estructuras celulares con constituyentes proteicos
(membrana). Por ello, el calor es el agente letal más ampliamente utilizado en la esterilización.
Su acción esterilizante depende de su naturaleza, intensidad y tiempo de aplicación; del grado
de humedad y del pH del medio y de la susceptibilidad diferencial a la temperatura, de cada
microorganismo en particular.
Calor húmedo
El calor húmedo requiere menos tiempo como agente esterilizante con respecto al calor seco
debido a que el agua es un buen conductor del calor, de esta manera el calor penetra mejor y
se distribuye más uniformemente. Las proteínas enzimáticas y estructurales son estables en
parte, por puentes hidrógeno y enlaces disulfuro. En presencia de humedad se establecen
puentes H con las moléculas de agua. Se reorganizan las nuevas cadenas peptídicas con
formación de complejos proteicos no funcionales. De esta manera, el calor húmedo mata los
microorganismos por desnaturalización de las estructuras proteicas.
La esterilización confiable con calor húmedo requiere temperaturas superiores a la de la
ebullición del agua. Estas temperaturas elevadas se alcanzan con más frecuencia mediante vapor
de agua saturado a presión y su aplicación requiere de un aparato llamado AUTOCLAVE
(Figura 3.1).
Dicho aparato, consiste de un recipiente metálico de doble pared, con una tapa que ajusta a
presión por medio de tornillos, un manómetro que indica la presión a la que llega el vapor, una
espita que regula la salida del vapor, una válvula de seguridad, una rejilla de bronce donde se
coloca el material a esterilizar, un depósito de agua y una fuente de calor. La duración y
temperatura del tratamiento usado, para lograr una esterilización adecuada es: 121º C (1
atmósfera) durante 15 minutos o 115º C (3/4 atmósfera) durante 20 minutos.
Para lograr una correcta esterilización en autoclave es necesario cumplir con los siguientes
requisitos:
 Controlar el nivel de agua
 La espita debe permanecer abierta hasta lograr que salga un flujo constante de vapor,
lo cual indica que todo el aire ha sido sustituido por vapor de agua. Si queda atrapado
aire, la temperatura disminuirá, siendo inferior a la que se consigue con vapor saturado
a la misma presión. La presión no es la que causa la muerte de los microorganismos,
sino la temperatura del vapor a presión.
 El autoclave no debe cargarse excesivamente, ya que se forman bolsas de aire que
disminuyen la temperatura de esterilización.
 El tiempo de esterilización depende de la naturaleza del material, del recipiente que lo
contiene y del volumen a esterilizar.
 Los objetos voluminosos requieren un tiempo de tratamiento mayor para que el calor
penetre hasta el centro del material.
 Deberá leerse, siempre que sea posible, la temperatura y la presión.
Las principales fallas en la esterilización por autoclave se deben a:
 mal funcionamiento del equipo.
 selección de un programa inadecuado (tiempo de exposición o temperatura).