REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR) Y ELECTROFORESIS

EN GEL DE AGAROSA
1 Programa de Biología, Departamento de Biología y Química, Facultad de Educación y
Ciencias, Universidad de Sucre, Colombia.
RESUMEN
El presente informe describe los resultados obtenidos en el laboratorio durante dos
prácticas: Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR), y electroforesis en gel de
agarosa, técnicas comúnmente utilizadas en biología molecular. Mediante la PCR
multiplex, se logró obtener suficiente ADN para su posterior análisis con la técnica de
electroforesis en gel de agarosa. Con ayuda del fotodocumentador se pudieron visualizar
y establecer los tamaños de banda: 621.053 pb, 510.744 pb, 356.120 pb, 147.571 pb,
434.418 pb y 558.317 para las muestras 1-6 indicativas de fragmentos de ADN de perro
(muestras 1 y 6), vaca (muestra 2), humano (muestra 3), cabra (muestra 4) y cerdo
(muestra 5).
Palabra clave: ADN, multiplex-PCR, Agarosa, electroforesis.
ABSTRACT
This report describes the results obtained in the laboratory during two practices:
Polymerase Chain Reaction (PCR), and agarose gel electrophoresis, techniques
commonly used in molecular biology. Using multiplex PCR, enough DNA was obtained
for further analysis with the agarose gel electrophoresis technique. With the help of the
photodocumenter, the band sizes could be visualized and established: 621.053 bp,
510.744 bp, 356.120 bp, 147.571 bp, 434.418 bp and 558.317 for samples 1-6 indicative
of dog DNA fragments (samples 1 and 6), cow (sample 2), human (sample 3), goat
(sample 4) and pig (sample 5).
INTRODUCCIÓN En general, el objetivo de la PCR es
producir suficiente ADN de la región
La reacción en cadena de la polimerasa
blanco para que pueda analizarse o
(PCR) es una técnica de laboratorio
usarse de alguna otra manera. Por
común utilizada para hacer muchas
ejemplo, el ADN amplificado por esta
copias de una región particular de ADN.
reacción se puede secuenciar, y
Esta región de ADN puede ser cualquier
visualizar por electroforesis en gel.
cosa que le interese al experimentador.
La PCR se utiliza en muchas áreas de la
Estandarizar y optimizar aplicaciones
biología y la medicina, como la
individuales de la PCR ha permitido
investigación en biología molecular, el
desarrollar variantes del método. En
diagnóstico médico e incluso algunas
este aspecto, toma gran interés, el
ramas de la ecología.
desarrollo de las denominadas PCR
múltiples (multiplex-PCR o mPCR), La ADN polimerasa que normalmente
reacciones que consiguen amplificar se utiliza en la PCR se llama Taq
simultáneamente en un único tubo (y polimerasa. Al igual que otras ADN
por ende una única reacción), diferentes polimerasas, la Taq polimerasa solo
secuencias diana. puede hacer ADN si hay un cebador,
una corta secuencia de nucleótidos que
proporciona un punto de partida para la mezcla en los seis (6) tubos de reacción.
síntesis de ADN. Los cebadores para El control negativo o blanco reactivo se
esta técnica son pedazos cortos de ADN realizó adicionando 3 μL de agua
de cadena sencilla, generalmente de estéril. Para la adición de las muestras
unos 20 nucleótidos de longitud. de ADN se transfirieron los tubos a la
zona de siembra de muestras y se
Por otro lado, la electroforesis en gel, es adicionó 3 μL de cada muestra a cada
una técnica en la que una corriente tubo. Por último, se adicionó 3 μL del
eléctrica impulsa fragmentos de ADN a control positivo de ADN al último tubo
través de una matriz de gel y estos se para el control positivo de la reacción.
separan según su tamaño. Típicamente Para la reacción de amplificación se
se incluye un estándar, o marcador de trasladaron los tubos al termociclador y
se corrió el perfil térmico consignado en
peso molecular, para que pueda
la tabla 2 (Anexos) el cual depende de
determinarse el tamaño de los
la polimerasa utilizada.
fragmentos en la muestra de PCR.
Considerando lo anterior, este informe Electroforesis: Preparación Del Gel
tendrá como objetivo determinar por De Agarosa
electroforesis el origen de ciertas Se adicionaron 0.75gr de agarosa a 50
muestras de ADN sanguíneo, ml de TBE con concentración 0.5x
previamente extraídas y amplificadas contenidos en un matraz. Se pasó a
mediante la técnica de PCR multiplex. calentar la solución hasta disolver la
MATERIALES Y MÉTODOS agarosa y se dejó enfriar para luego
adicionar 0.7 μL de gelstar.
Muestras Posteriormente se ensambló la cámara
Se trabajó con muestras de ADN de de electroforesis, y los respectivos
sangre periférica, extraídas en el peines para el gel de agarosa, este
Laboratorio de investigaciones último se dispensó en la cámara con los
biomédicas de la Universidad de Sucre peines y se dejó solidificar por 40
mediante el método de Salting out. minutos.

Ronda de Amplificación: Preparación Ya solidificado se colocó el plato con el

de la mezcla para PCR gel de agarosa en el tanque de
electroforesis con una solución de
Inicialmente se calculó la cantidad de la buffer TBE 0.5x previamente preparada
mezcla de PCR necesaria para el y seguidamente se retito con cuidado el
numero deseado de reacciones, cada una peine. Se prepararon las muestras de
con un volumen final de 25 micro litros. ADN en papel parafinado con 3 uL de
Se procedió a preparar los reactivos y buffer de carga (buffer Green) y 5 de la
materiales necesarios para el numero de muestra de ADN y se sembraron en
muestras procesadas, más un control cada pozo del gel de agarosa.
positivo y uno negativo. Las cantidades Los electrodos de la cámara de
utilizadas en la mezcla de PCR se electroforesis se conectaron a la fuente
muestran en la tabla 1 (anexos). de poder y se corrieron las muestras a
un voltaje de 90 V durante 35 minutos.
Posteriormente, se preparó la mezcla de Una vez transcurrido el tiempo, se
PCR de acuerdo a la cantidad y orden trasladó el gel al Foto documentador
de los reactivos consignados en la tabla para así visualizar los resultados finales
anterior. Se distribuyó 22 μl de la obtenidos.
 respectivamente. En el extremo
RESULTADOS izquierdo se ubica el marcador de peso
molecular (MPM), que no corrió
Se pudo realizar la amplificación de las
conforme a lo esperado, por lo cual se
muestras de ADN de manera
debió seleccionar los tamaños de banda
satisfactoria, mediante la técnica de
de forma manual. En el extremo
PCR multiplex. Se logró obtener
derecho se muestra el control negativo.
suficiente ADN para su posterior
Al contrastar estos resultados con los
análisis con la técnica de electroforesis
hallados en la literatura se pudo
en gel de agarosa. Con ayuda del
determinar el origen de las muestras de
fotodocumentador se pudieron
ADN analizadas, los cuales se
visualizar y establecer los siguientes
consignan en la tabla 3, de igual manera
tamaños de banda: 621.053 pb, 510.744
se presentan los resultados de la
pb, 356.120 pb, 147.571 pb, 434.418 pb
electroforesis en la Figura 1
y 558.317 para las muestras 1-6

Muestra Tamaño de Tamaño de Espécimen

fragmentos fragmentos
(Resultados) (Literatura)
1 621.053 pb 680 pb Perro
2 510.744 pb 561 pb Vaca
3 356.120 pb 334 pb Humano
4 147.571 pb 132 pb Cabra
5 434.418 pb 453 pb Cerdo
6 558.317 pb 680 pb Perro

Fig 1.Resultados electroforesis en gel de agarosa. Tabla 3. Resultados Tamaño de fragmentos de ADN

DISCUSION de rasgos hereditarios hasta estudios de

expresión del gen.
La reacción en cadena de la polimerasa
o PCR es una técnica fundamental para Existen muchas variantes de la PCR
la mayor parte de las aplicaciones de la convencional, como son la PCR en
biología molecular. Esta técnica ha sido tiempo real o PCR cuantitativa (que
ensayada con buenos resultados en una permite cuantificar la cantidad de
amplia gama de campos que abarcan producto amplificado) o la PCR por
desde la detección de agentes transcripción inversa (mediante la cual
etiológicos, pasando por se obtiene una copia de DNA
genotipificación, análisis de complementario, DNAc, utilizando
enfermedades genéticas y oncológicas, como molde ácido ribonucleico, RNA)
amplificación y modificación de (Higuchi, et al., 1993). Sin embargo, en
fragmentos de ADN, análisis de cuanto a estandarización y optimización
especímenes ambientales y de de aplicaciones individuales de esta
marcadores genéticos para aplicaciones técnica, ha tomado gran interés el
forenses, pruebas de paternidad, mapeo desarrollo de las denominadas PCR
múltiples (multiplex-PCR o mPCR) las
cuales son reacciones que consiguen técnicas que requieren el uso de la
amplificar simultáneamente en un único electroforesis, por cual esta es
tubo (y con una única reacción), considerada una parte importante del
diferentes secuencias diana. procedimiento sistemático del análisis
de los ácidos nucleicos y las proteínas.
Los pasos necesarios a seguir y repetir
En esta técnica se hace uso de la
por cada ciclo de la PCR son tres. Se les
agarosa y buffer TBE, debido a que
suele referir como desnaturalización,
estos permiten separar ácidos nucleicos
alineamiento y extensión. Es muy
por peso y su alta afinidad a los
importante que el molde de ADN se
compuestos. El primer pozo ubicado a
desnaturalice en el primer paso, ya que
la izquierda (Fig. 1) contiene un
así se puede iniciar la síntesis de una
marcador de peso molecular, el cual
nueva cadena complementaria de ADN,
funciona como un patrón para comparar
dicho proceso se obtiene a temperaturas
el resultado de los pares de base de las
de 94ºC por lo menos durante 1 min.
muestras y es ideal para determinar el
(Guevara, 2004). Con respecto a la
tamaño de los fragmentos de ADN, ya
etapa de alineamiento, la enzima que se
que posee un amplio rango de tamaño
utiliza en esta reacción necesita del
de unas 15 bandas distribuidas
grupo OH- libre en el extremo 3´ a
uniformemente de 50 pb a 2000 pb. Este
partir de donde iniciar la síntesis, punto
MPM también se suministra con un
que constituye el sitio de crecimiento de
tinte de carga 5x para cargar la muestra
la cadena complementaria. El
de ADN.
alineamiento específico de los
cebadores se produce a una temperatura CONCLUSIONES
determinada por composición de bases
- La reacción en cadena de
y oscila entre 40 y 70°C. Un aumento
polimerasa es una técnica
favorece la especificidad, ya que
fundamental en los estudios
disminuye uniones incorrectas de los
relacionados con la biología
cebadores con sitios apócrifos del ADN
molecular, presentando buenos
molde. (Rodríguez & Barrera, 2004)
resultados en campos que
En cuanto a la extensión, esta se debe abarcan la amplificación y
realizarse a una temperatura alta, que modificación de fragmentos de
debe coincidir con la máxima actividad ADN, análisis de especímenes
de la enzima para evitar alineamientos ambientales, entre otros.
inespecíficos. El tiempo depende del - Existen muchas variantes de la
tamaño de la amplificación, debiendo PCR convencional, entre ellos
estimar 1 min. para alargar 1000 las denominadas multiplex-PCR
nucleótidos. Es común que al finalizar que han mostrado muy buenos
todos los ciclos se realice un último resultados en cuanto a
alargamiento por 5 min. a 72ºC para estandarización y optimización
asegurarse que todos los productos de de aplicaciones individuales.
amplificación estén completamente - Para cada ciclo de PCR es
terminados y tengan exactamente la necesario que se sigan y repitan
misma longitud (Espinosa, 2007) tres pasos: desnaturalización,
alineamiento y extensión a una
Por otra parte, es sabido que, en
biología molecular, existen muchas
 temperatura y tiempo
determinado.
- La electroforesis proporciona un
importante método requerido en
una gran cantidad de técnicas
empleadas en la biología
molecular.
BIBLIOGRAFIA
- Higuchi, R.; Fockler, C.; Dollinger,
G.; Watson, R. (1993). Kinetic PCR
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amplification reactions.
Bio/Technology 11: 1026-1030.
- Guevara P. (2004) Identificación y
Diagnóstico Molecular de
Microorganismos. En: Manual de
laboratorio. Proyecto Iniciativa
Científica del Milenio. Red de
Innovación Tecnológica IDMM
editores. Venezuela; ; p1-102. 13.
- Rodríguez I, Barrera H. (2004) La
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dos décadas de su invención. Ciencia
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- Espinosa, L. (2007) Guía práctica
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L, Souza V, Aguirre X editores.
Ecología molecular. México: INE,
CONABIO y UNAM; p.520-36.
[Google Scholar]
 Anexos (Tablas)
 Tabla 1. Cantidades utilizadas en la mezcla de PCR
Reactivos Con. inicial Vol. inicial 2x
Agua filtrada estéril - - 10.35 μL
Buffer de PCR 5x 5.0 μL 10 μL
MgCl2 25mM 1.5 μL 3.0 μL
dNTP’s 10mM 0.5 μL 1 μL
P1 Human F 10mM 0.2 μL 0.4 μL
P2 Dog F 10mM 0.2 μL 0.4 μL
P3 Pig F 10mM 0.2 μL 0.4 μL
P4 Goat F 10mM 0.2 μL 0.4 μL
P5 Cow F 10mM 0.2 μL 0.4 μL
P6 R 10mM 0.2 μL 0.4 μL
GoTaq Polimerasa 5u/ul 1.25u 0.4 μL
ADN - 3 μL -

 Tabla 2. Perfil térmico para PCR en termociclador

Ciclos Etapas Temperatura (°C) Tiempo(min)
1 Desnaturalización 94 1
inicial
35 Desnaturalización 94 0.30
Alineación 58 1
Extensión 72 0.48
1 Extensión final 72 5

Anexos (Metodología)
 Preparación de la mezcla para PCR

Preparación de la mezcla de PCR de acuerdo a los cálculos realizados

Dist. de la mezcla en los 6 tubos de Rx Adición de la muestra de ADN

Reacción de amplificación en termociclador

 Electroforesis: Preparación Del Gel De Agarosa

Pesaje de la agarosa y TBE 0.5x. Calentamiento de solución

 Ensamblaje de cámara de electroforesis Distribución de agarosa en la cámara
y los peines

Retiración del peine Preparación las muestras de ADN en

papel parafinado y sembrado de muestras.