Complejo de Nitrato Reductasa de ​Escherichia coli

K-12:
Participación de Formiato Deshidrogenasa Específico
y Citocromo b1, Componentes en
Reducción de Nitrato

JOSE RUIZ-HERRERA' AND J. A. DEMOSS

Department of Biology, University of California, San Diego, La Jolla, California 92037
Recibido para publicación el 9 de junio de 1969

Se estudió la participación de distintos deshidrogenasas de formiato y componentes de

citocromo en la reducción de nitrato por Escherichia coli. La actividad de formiato
deshidrogenasa presente en los extractos preparados a partir de células inducidas por nitrato
de la cepa HfrH fue activa con varios aceptores de electrones, incluyendo azul de metileno,
metosulfato de fenazina y viológeno de bencilo. Ciertos mutantes que no pueden reducir el
nitrato tenían niveles bajos o indetectables de actividad de formiato deshidrogenasa ensayados
con azul de metileno o metosulfato de fenazina como aceptor de electrones. De nueve de estos
mutantes, cinco produjeron gas cuando se cultivaron anaeróbicamente sin nitrato y poseían
una actividad de formiato deshidrogenasa unida a bencil viológeno, lo que sugiere que distintos
formiato deshidrogenasas participan en los sistemas de nitrato reductasa y deshidrogenasa de
formiato. Los otros cuatro mutantes formaron poco gas cuando se cultivaron anaeróbicamente
en ausencia de nitrato y carecían de la deshidrogenasa de formiato unida a bencil viológeno,
así como de la actividad unida a azul de metileno o metosulfato de fenazina. El citocromo b1
presente en las células inducidas por nitrato se distinguió por sus propiedades espectrales y su
control genético de los principales componentes del citocromo b1 de las células aeróbicas y de
las células cultivadas anaeróbicamente en ausencia de nitrato. El citocromo bk específico de
nitrato se redujo completa y rápidamente en 1 mm de formiato, pero no se redujo en 1 mm
redujo el dinucleótido de nicotinamida y adenina; El ascorbato redujo sólo una parte del
citocromo b1 que fue reducido por el formiato. Cuando se añadió nitrato, el citocromo b1
reducido en formiato se oxidó con cinética bifásica, pero el citocromo b1 reducido en ascorbato
se oxidó con cinética monofásica. Los efectos inhibitorios del n-heptil hidroxiquinolina-N-óxido
en la oxidación del citocromo b1 por nitrato proporcionaron evidencia de que el citocromo
específico de nitrato está compuesto por dos componentes que tienen potenciales redox
diferentes pero propiedades espectrales idénticas. Concluimos de estos estudios que la
reducción de nitrato en E. coli está mediada por la operación secuencial de un formiato
deshidrogenasa específico, dos componentes específicos del citocromo b y la reductasa de
nitrato.
Una serie de observaciones indican que la reducción de nitrato en Escherichia coli ocurre
principalmente por una vía que involucra formiato deshidrogenasa, citocromo b1l y nitrato
reductasa. Entre los diversos sustratos que son metabolizados por E. coli, el formiato es el
donante de electrones más efectivo para la reducción de nitrato en células cultivadas
anaeróbicamente en presencia de nitrato (2, 23). En tales células, la formiato deshidrogenasa,
el citocromo b1 y la nitrato reductasa se inducen a niveles relativamente altos en comparación
con los de las células cultivadas en ausencia de nitrato (2, 17, 23). Estos tres componentes
están presentes en las fracciones de membrana (6) y se han purificado parcialmente como una
unidad de extractos celulares (8). Finalmente, los mutantes de E. coli que no pueden producir
nitrito a partir de nitrato (mutantes NR7) carecen de formiato deshidrogenasa o nitrato
reductasa o combinaciones de estas actividades y citocromo b & (1, 16,17, 22).
La propuesta de que el formiato deshidrogenasa y el citocromo bi son componentes específicos
del sistema de reducción de nitrato plantea algunas preguntas importantes sobre la relación de
esta vía con otras vías de transporte de electrones en E. coli. La formiato deshidrogenasa
también debe ser un componente del sistema hidrogenilasa (15), así como de la formiato
oxidasa. Estas funciones múltiples de la formiato deshidrogenasa han sido previamente
reconocidas, y se ha sugerido que al menos dos formiato deshidrogenasas distintas,
particuladas y solubles, están formadas por E. coli (4, 5).
La participación del citocromo b en la reducción de nitrato crea una situación aún más
compleja, ya que el citocromo b1 es uno de los principales citocromos presentes en las células
aeróbicas y anaerobias de E. coli y, por lo tanto, debe funcionar en otros sistemas de transporte
de electrones (3, 10, 18) En la actualidad no se sabe si distintos componentes del citocromo b1
están involucrados en diferentes vías de electrones o en qué grado interactúan tales vías.
Para definir los componentes del complejo de nitrato reductasa y su relación con otras vías
metabólicas, estudiamos los eventos bioquímicos involucrados en la reducción de nitrato en el
E. coli de tipo salvaje y en una serie de mutantes NR. Se presenta evidencia de que un formiato
deshidrogenasa específica, dos componentes distintos del citocromo b1 y la nitrato reductasa
son componentes obligatorios de un complejo de nitrato reductasa en E. coli.

MATERIALES Y MÉTODOS

Las cepas de E. coli utilizadas en estos estudios, HfrH y AB2102, y los mutantes NR- derivados
de ellos se describieron previamente (17). Todas las cepas se cultivaron en un medio completo
que contenía una base de sal (20), clorhidrato de tiamina (5, g / ml), 0,4% de caldo nutritivo
(Difco) y 1% de glucosa (esterilizada por separado). Cuando se indicó, el medio se suplementó
con nitrato de potasio al 1% y formiato de sodio al 0,5%.
Para medir las actividades, los cultivos se cultivaron en matraces con brazos laterales de tubo
Klett a 37 ° C en un baño de agua con agitación. Para condiciones aeróbicas, el medio se roció
vigorosamente con aire estéril. Para condiciones anaeróbicas, el medio se roció con una
mezcla estéril de 95% de N2 más 5% de CO2. Los cultivos se inocularon con un inóculo de 2 a
5% a partir de un cultivo nocturno crecido en medio similar y se les permitió crecer hasta la
mitad de la fase exponencial. Las células se recogieron por centrifugación, se lavaron dos
veces con tampón de fosfato de potasio 0,05 M (pH 6,8 o 7,3) y se resuspendieron en el mismo
tampón. Esta suspensión se usó como tal (células enteras) o se congeló durante la noche a -15
° C antes de su uso (células congeladas y descongeladas). Los extractos sin células se
prepararon mediante tres tratamientos de 15 segundos cada uno en un Branson Sonifier de 10
kc, seguido de centrifugación a 3.000 X g durante 10 minutos para eliminar células enteras.
La deshidrogenasa de formiato se midió con diferentes aceptores de electrones utilizando un
radioensayo o un ensayo espectrofotométrico descrito anteriormente (17), o mediante el
siguiente procedimiento manométrico utilizando un aparato Warburg. En el compartimento
principal se colocaron 0,2 ml de células o extracto, 10 umoles de aceptor de electrones y
tampón de fosfato de potasio 0,05 / M (pH 6,8) en un volumen total de 2,7 ml; 30, se colocaron
umoles de formiato en el brazo lateral. Los matraces y los manómetros se enjuagaron con N2 y
se equilibraron a 37 ° C antes de volcar el formiato en el compartimento principal. La actividad
se expresó como microlitros de CO2 desprendido por minuto por miligramo de proteína. No se
produjo CO2 en ausencia de aceptores de electrones añadidos.
En algunos experimentos, se midió la deshidrogenasa de formiato específica de viológeno de
bencilo mediante el siguiente procedimiento cualitativo. En tubos Thunberg, se mezclaron 140
umoles de tampón de fosfato de potasio (pH 6,8), 1,0, smoles de bencil viológeno, 60; umoles
de formato de sodio y células o extracto en un volumen final de 5,0 ml. Los tubos se lavaron
con N2, y la reducción del viológeno de bencilo fue seguida por el uso de un colorímetro Klett
con un filtro de 660 nm. El desarrollo del color no fue lineal y, por lo tanto, los resultados se
expresaron cualitativamente.
La hidrogenilasa fórmica se ensayó manométricamente siguiendo la evolución de hidrógeno a
partir del formiato (15). La producción de gas por cultivos en crecimiento se evaluó observando
la acumulación de gas en viales invertidos sumergidos en tubos del medio de cultivo.
La nitrato reductasa se analizó con formiato o metil viológeno reducido como donadores de
electrones, como se describió anteriormente (17). Con otros donantes de electrones se siguió
el procedimiento utilizado con formiato, sustituyendo el donante de electrones por formiato.
Los espectros de absorción de los citocromos se determinaron con un espectrofotómetro de
grabación de un solo haz construido y amablemente puesto a disposición por Warren Butler en
la Universidad de California en San Diego. La luz monocromática de 1,0 nm de ancho de banda
medio fue proporcionada por un monocromador de rejilla Bausch & Lomb. La salida del
fotómetro y un potenciómetro orientado al tambor de longitud de onda proporcionó las señales
de entrada a un grabador X-Y Moseley 7000 AM. Para la medición de espectros reducidos
absolutos a temperatura de nitrógeno líquido, se colocó una muestra de 1,0 ml en una celda de
absorción de metal, se redujo con ditionito de sodio sólido, se mezcló con 500 mg de Al203 (1,
diámetro um), se congeló en N2 líquido. y se coloca en un matraz Dewar que contiene N2 en el
compartimento celular del instrumento. Para la medición de espectros reducidos absolutos a
temperatura ambiente, se siguió el mismo procedimiento general, omitiendo el líquido N2. Para
determinar los espectros diferenciales, se utilizó un accesorio que proporcionaba un haz
dividido. En este caso, se colocaron muestras idénticas de 3.0 ml en células de absorción de
vidrio (trayectoria de luz de 10 nm). El contenido de una cubeta se oxidó enjuagando con aire
durante 30 segundos, y la otra se redujo con ditionito sódico sólido para obtener el espectro
reducido menos oxidado.
Los niveles de citocromo se calcularon de la siguiente manera. Se dibujó una línea basal entre
540 y 570 nm, y la altura del pico de la banda a se midió a partir de esta línea base. Se
calcularon las unidades de densidad óptica, y el nivel de citocromo se expresa como unidades
de densidad óptica por miligramo de proteína. La cinética de reducción y oxidación del
citocromo b1 se siguió con un espectrofotómetro de doble longitud de onda Aminco-Chance a
35 ° C o temperatura ambiente. La proteína se determinó mediante el procedimiento de Lowry
et al. (12)

RESULTADOS

Las propiedades generales del sistema de reducción de nitrato presente en las cepas de tipo
salvaje utilizadas en estos estudios correspondieron a las reportadas previamente (2, 6, 8). En
las células de cepas HfrH inducidas por nitrato, el formiato fue un donante de electrones más
eficaz para la reducción de nitrato que la glucosa (Tabla 1). En células congeladas y
descongeladas o en extractos celulares, varios reactivos actúan como donadores de electrones
o reducción de nitrato (Tabla 1). El viológeno de metilo reducido, que transfiere electrones
directamente a la nitrato reductasa (21), fue el donante de electrones más efectivo, pero el
formiato fue del 30 al 40% tan activo como el viológeno de metilo reducido en las células
congeladas. La reducción de nitrato con formiato como donante de electrones se inhibió por
completo con 0.01 mM n-heptil hidroxiquinolina-N-óxido (HOQNO), mientras que un aumento
de 100 veces en la concentración del inhibidor no afectó la reducción de nitrato con viológeno o
ascorbato de metilo reducido como el donador de electrones.
La formiato deshidrogenasa presente en las células inducidas por nitrato de la cepa HfrH utilizó
varios aceptores de electrones (Tabla 2). El azul de metileno y el metosulfato de fenazina
fueron los aceptadores más efectivos, mientras que el ferricianuro de potasio, el viológeno de
bencilo y el cloruro de trifeniltetrazolio fueron mucho menos efectivos. Hemos medido
rutinariamente la formiato deshidrogenasa siguiendo la reducción del diclorofenol indofenol
(DCPIP) en presencia de cantidades catalíticas de metosulfato de fenazina (17). Aunque
DCPIP solo se reduce lentamente mediante una mezcla de extracto crudo y formiato, en
presencia de pequeñas cantidades de metosulfato de fenazina se reduce a una velocidad que
corresponde a la velocidad observada con azul de metileno. Este ensayo no implica un flujo
indirecto de electrones a través del citocromo b1, ya que el citocromo bi reducido no es oxidado
por el metosulfato de fenazina en nuestras preparaciones y el deshidrogenasa de formiato
puede analizarse mediante mutantes que carecen de citocromo b1.
TABLA 1. Reducción de nitrato con varios donantes de electrones

● Las células inducidas por nitrato se cultivaron y trataron como se describe. La reducción
de nitrato se analizó como se describe, con los siguientes niveles de donantes de
electrones en un volumen final de 2.5 ml: 48 umoles de glucosa, 48 umoles de formiato,
0.25, umoles de metil viológeno (reducido), 2.8, umoles de ditionito de sodio, 10 umoles
de ascorbato, 6 umoles de formiato.
● Expresado como micromoles de nitrato por minuto por miligramo de proteína.
 TABLA 2. Actividad de formiato deshidrogenasa con varios aceptores de electrones.

● La concentración de aceptores de electrones utilizada fue de 3,1 jsmoles / ml (excepto

para aire).
● Las células de HfrH inducidas por nitrato se cultivaron y se rompieron en un Branson
Sonifier, y el extracto se preparó como se indica en Materiales y Métodos, pero se
congeló antes de usar. La deshidrogenasa de formato se analizó mediante la liberación
de CO2 radioactivo a partir del formato '4C, y se calcularon nanomoles de CO2 a partir
de la actividad específica del formato (8.230 recuentos por minuto por mol) utilizado. Los
resultados mostrados se expresan como nanomoles de CO2 por minuto por miligramo
de proteína.

La disponibilidad de una serie de mutantes que carecen de formiato deshidrogenasa en las

células inducidas por nitrato (17) nos permitió probar directamente la posibilidad de que
distintas deshidrogenasas de formiato estén involucradas en el metabolismo de E. coli. Aunque
la actividad de la deshidrogenasa de formiato que utiliza azul de metileno o metosulfato de
fenazina como aceptores de electrones no pudo detectarse o era muy baja en dichos mutantes,
algunos de los mutantes todavía formaron gas cuando se cultivaron en condiciones que
condujeron a la formación del sistema de hidrogenasa enzimática en la naturaleza cepa de tipo
(Tabla 3). Cuando se utilizó el viológeno de bencilo como aceptor de electrones, la evolución
del CO2 a partir del formiato o la reducción del colorante en presencia de formiato no fue lineal
con el tiempo y, por lo tanto, se expresa cualitativamente.
Estos resultados apoyan la hipótesis de que dos deshidrogenasas de formiato bioquímicamente
distintas están involucradas en la reducción de nitrato y la formación de hidrógeno en E. coli.
Sin embargo, las formiato deshidrogenasas pueden no ser genéticamente distintas ya que, en
algunos de los mutantes NR-, se pierden tanto el formiato deshidrogenasa específica de nitrato
como el formiato deshidrogenasa involucrados en el sistema de hidrogenilasa formica (Tabla 3)
como resultado de mutaciones que aparecen para ser único, mutaciones puntuales sobre la
base de las tasas de reversión (17).
TABLA 3. Formación de gas y actividad de deshidrogenasa de formiato en HfrH y mutantes NR
seleccionados.

● La formación de gas se evaluó en cultivos que crecen anaeróbicamente en medio

completo sin nitrato en tubos que contienen viales invertidos para atrapar gas. Los
cultivos se dejaron incubar al menos 5 días y se consideraron positivos (+) si formaban
más del 10% del gas observado en el tipo salvaje.
● El ensayo de formiato deshidrogenasa con bencil viológeno fue cualitativo. Todos los
ensayos se realizaron con extractos celulares frescos preparados a partir de células
cultivadas anaeróbicamente en medio completo (ensayo de viológeno de bencilo) o en
medio completo suplementado con nitrato (radioensayo y ensayo colorimétrico). Los
resultados se expresan como micromoles de CO2 por minuto por miligramo de proteína;
Los resultados para el viológeno de bencilo se expresan cualitativamente.
● La actividad con azul de metileno se calculó como micromoles de CO2 liberado del
formiato (actividad específica, 22.800 recuentos por minuto por mol).

Cuando E. coli se cultiva anaeróbicamente, la adición de nitrato provoca un aumento en el nivel

de citocromo b1 (17, 23). El siguiente análisis espectral demuestra que los componentes del
citocromo b1 formados en presencia y ausencia de nitrato también son cualitativamente
distintos. Los espectros absolutos de células congeladas-descongeladas reducidas con ditionito
se muestran en la Fig. 1. Las células cultivadas en presencia de nitrato exhibieron solo dos
picos principales entre 500 y 600 nm. Estos fueron 526 nm (3 bandas) y 555 nm (una banda) a
temperaturas de nitrógeno líquido y 528 y 558 nm a temperatura ambiente. Por otro lado, las
células cultivadas en ausencia de nitrato exhibieron picos importantes a 528 y 558 nm, un
hombro a 549 nm (citocromo c) a temperatura de nitrógeno líquido y picos a 530 y 560 nm a
temperatura ambiente. La distinción entre estos componentes b55a y b558 (identificados por
sus picos de banda a temperatura de nitrógeno líquido) fue clara en algunos mutantes NR- que
tenían niveles reducidos de citocromo b1. Cuando dichos mutantes se cultivaron en
condiciones anaeróbicas en presencia de nitrato, ambos componentes fueron evidentes en los
espectros reducidos (Fig. 2, mutante TW-15). Además, un segundo tipo de mutante, que no
formó ningún componente detectable del citocromo b555 cuando se cultivó anaeróbicamente
con nitrato (Fig. 2, cepa RB-12), formó niveles normales de los componentes de b558 cuando
se cultivó anaeróbicamente en ausencia de nitrato (no mostrado, cf. espectro no inducido de
tipo salvaje, Fig. 1).
Cuando las cepas de tipo salvaje se cultivaron aeróbicamente, las bandas de los principales
componentes del citocromo b estaban a 555 y 562 nm (a temperatura de nitrógeno líquido).
Sobre la base de las siguientes observaciones con mutantes NR-, los componentes b555
encontrados en las células anaerobias inducidas por nitrato parecerían ser distintos del
componente b5a5 en las células aeróbicas. Los mutantes NR-, que tienen niveles alterados del
componente b555 cuando se cultivan anaeróbicamente con nitrato, forman una distribución
normal de los componentes del citocromo, incluido un componente b555, cuando se cultivan en
condiciones aeróbicas (Fig. 2). Los espectros absolutos mostrados para las células aeróbicas
son idénticos a los encontrados en las células aeróbicas de tipo salvaje cultivadas en estas
condiciones, que muestran picos a 555 y 562 nm.
Por lo tanto, el componente principal del citocromo b que se encuentra en las células cultivadas
anaeróbicamente en presencia de nitrato parece ser fisiológica y genéticamente diferente de
los componentes del citocromo b que se encuentran en otras condiciones de crecimiento. Las
siguientes observaciones implican directamente al componente b555 en el sistema de
reducción de nitrato y proporcionan evidencia de que está compuesto por dos citocromos
distintos que poseen características espectrales idénticas.
Fig. 1. Espectro absoluto reducido con ditionito de la cepa HfrH cultivada con y sin nitrato. Las
células se cultivaron anaeróbicamente en medio completo con (células inducidas) y sin (células
no inducidas) nitrato de potasio y se trataron como se indica. Se usaron suspensiones de
células congeladas y descongeladas a una concentración de proteína de 3.08 mg / ml para las
células no inducidas y 1.74 mg / ml para las células inducidas. Los espectros se determinaron a
temperatura de N2 líquido (A) y temperatura ambiente (B). Las barras en el centro de la figura
muestran la escala de unidades de densidad óptica para cada una de las curvas.

Cuando se siguió la cinética de reducción y oxidación del citocromo b1 en un espectrofotómetro

de registro de doble longitud de onda Aminco-Chance, se descubrió que las adiciones repetidas
de 1 mm de nicotinamida adenina dinucleótido reducido (NADH) no causaban la reducción del
componente del citocromo b1 presente en congelados preparadas descongeladas de células
inducidas por nitrato (Fig. 3). Al aumentar la concentración de NADH a 100 mM, fue posible
efectuar una reducción del citocromo bi, pero consideramos esto como un nivel no fisiológico
de NADH. Se obtuvieron resultados similares usando extractos crudos. Cuando se añadió
formiato de 1 mm, se produjo una reducción inmediata del citocromo b. La posterior adición de
nitrato causó la oxidación completa del citocromo, pero con peculiar cinética (Fig. 3). Solo una
parte del citocromo se oxidó de inmediato, el resto se oxidó después de un intervalo de tiempo
definido. Con cierto retraso, el ascorbato también causó la reducción del citocromo b1. Sin
embargo, en este caso, el citocromo reducido se oxidó por completo en un solo paso tras la
adición de nitrato (Fig. 4A). Aparentemente, solo una parte del citocromo b1 se redujo, ya que
la posterior adición de formiato causó la reducción de más citocromo, y en este caso se
observó la cinética bifásica para la oxidación por nitrato. Esta diferencia en la extensión de la
reducción del componente citocromo causada por el formiato y el ascorbato se verificó
mediante el experimento que se muestra en la figura 4B, en el que la adición de formiato
inmediatamente después del ascorbato causó un incremento adicional de la reducción del
citocromo. Estos resultados sugirieron que dos componentes del citocromo b se redujeron con
formiato, uno de los cuales se redujo con ascorbato, y que el nitrato oxidó ambos componentes
del citocromo, pero uno de ellos solo después de un intervalo de tiempo definido.

Fig. 2. Espectros de citocromo de dos mutantes NR- cultivados en diferentes condiciones. Los
espectros se determinaron a temperatura de N2 líquido en suspensiones
congeladas-descongeladas de células cultivadas y preparadas como se describe. Las
concentraciones de proteína fueron 6.25 mg / ml para RB-12 (anaeróbico), 4.32 mg / ml para
RB-12 (aeróbico), 6.82 mg / ml para TW-IS (anaeróbico) y 5.72 mg / ml para TW-1S (aeróbico) .
Los efectos de HOQNO sobre la oxidación del componente citocromo bi proporcionaron
evidencia adicional de que dos citocromos distinguibles se estaban reduciendo y oxidando en
estos experimentos. Cuando se añadió 0,01 mm de HOQNO después de la reducción completa
del citocromo (Fig. 4B), solo una parte del citocromo se reoxidó con nitrato y la oxidación tuvo
lugar inmediatamente en un solo paso. Se obtuvieron resultados idénticos cuando el citocromo
se redujo solo con formiato, es decir, el segundo paso de la cinética bifásica fue completamente
inhibido por HOQNO. Además, HOQNO evitó la reducción nuevamente del citocromo oxidado
por el formiato (Fig. 4B). En contraste, la porción de citocromo b1 que fue reducida por el
ascorbato no fue impedida por el HOQNO de ser oxidada por nitrato (Fig. 4C). La adición de
más nitrato no tuvo más efecto y, en este caso, HOQNO no impidió que el formiato redujera al
menos parte del citocromo.
Para demostrar que estos resultados se debieron específicamente al comportamiento del
citocromo b555, se llevó a cabo un conjunto similar de experimentos en los que los espectros
se determinaron a temperatura ambiente con el accesorio de haz dividido para el
espectrofotómetro (Fig. 5A). El citocromo b reducido en formato mostró una banda ca, a 558
nm a temperatura ambiente, que corresponde al componente b555 (ver Fig. IB). El nitrato
reoxidó completamente el citocromo, pero cuando se agregó HOQNO a la preparación reducida
en formiato, el nitrato causó la oxidación de solo una parte del citocromo, dejando un citocromo
reducido con un máximo de absorción idéntico. Los resultados presentados en la Fig. SB
también confirmaron los resultados obtenidos con ascorbato como donador de electrones y
demostraron que está involucrado un citocromo con una absorción máxima de 558 nm a
temperatura ambiente. Los cambios cinéticos observados, por lo tanto, reflejan cambios que
ocurren específicamente en los componentes del citocromo b555.

Fig. 3. Reducción del citocromo b1 y su reoxidación por nitrato. Los cambios en el estado del
citocromo se siguieron como la diferencia en transmitancia entre λ1 (560 nm) y λ2 (540 nm) a
35 C. La escala de la izquierda muestra la escala de cambio de transmitancia observada. Las
células de HfrH se cultivaron anaeróbicamente en medio completo con nitrato de potasio al 1%,
se lavaron y se resuspendieron como se describe. La suspensión congelada-descongelada
(1,74 mg de proteína) se mezcló con tampón de fosfato de potasio 0,05 M, pH 6,8, en un
volumen final de 2,8 ml. Donde se indicó, se añadieron 3,8 umoles de NADH (0,01 ml) y 10
umoles de nitrato de potasio (0,01 ml).
Fig. 4. Reducción y oxidación del citocromo b1 y efecto del HOQNO. Las células se prepararon
y las condiciones fueron las de la Fig. 3, excepto que la suspensión de células congeladas y
descongeladas se trató con desoxirribonucleasa (2,5 µg / ml) para reducir la viscosidad. Se
añadieron formiato de sodio y ascorbato de sodio (ácido ascórbico ajustado a pH 7,0 con
hidróxido de sodio) como 0,01 ml de soluciones 1,0 M a 4,0 ml de suspensión celular (4,8 mg /
ml).

Fig. 5. Espectros diferenciales de citocromo b1 reducidos por formiato y ascorbato y oxidados

por nitrato en presencia de HOQNO. Las células de HfrH se cultivaron anaeróbicamente en
medio completo suplementado con nitrato de potasio al 1% y se usaron como suspensión
congelada-descongelada. En este caso, se añadieron 10 gg de desoxirribonucleasa por ml de
suspensión para reducir la viscosidad. Los espectros diferenciales se obtuvieron con el
espectrofotómetro de haz dividido a temperatura ambiente. Se añadió una muestra de
suspensión celular (3,0 ml que contenía 2,0 mg de proteína por ml) a cada cubeta. A la cubeta
de referencia, se añadieron 0,05 ml de nitrato de potasio I M para oxidar el citocromo b1. En las
cubetas reducidas, se añadieron 0,05 ml de formiato 0,06 M o ácido ascórbico sólido.
Estos resultados pueden explicarse suponiendo la participación en la reducción de nitrato de
dos citocromos con espectros idénticos que difieren solo en sus potenciales redox (ver Fig. 7).
Se obtuvo evidencia adicional para tal hipótesis mediante el análisis de la autooxidación del
citocromo b1 en células inducidas por nitrato (Fig. 6). El formato a una concentración de 8.3 X
103 M redujo rápidamente el citocromo bi (curva a). Después de burbujear aire a través de la
suspensión celular durante 1 minuto, el citocromo se oxidó completamente (curva b). Cuando
se añadieron 8,3 X 10 M de HOQNO, el burbujeo con aire durante 1 minuto causó la oxidación
rápida de solo la mitad del citocromo, y el resto del citocromo reducido no se oxidó, incluso
después de 8 minutos de burbujeo continuo con aire (curva c). Cuando la concentración de
formiato fue menor (5 X 10-4 M), HOQNO no inhibió la oxidación del citocromo (curvas d, e, f).
Una vez más, estos resultados pueden interpretarse suponiendo la existencia de dos
citocromos en las células inducidas por nitrato que pueden reducirse con formiato e oxidarse
con oxígeno (Fig. 7). La presencia de HOQNO inhibiría el flujo de electrones entre ambos
citocromos, permitiendo que solo un citocromo se oxidara rápidamente en presencia de exceso
de formato, ya que el formato continuaría reduciendo el citocromo antes del bloqueo. El hecho
de que HOQNO no tuvo efecto sobre la oxidación de los citocromos cuando se usó un bajo
nivel de formiato sugiere que ambos citocromos son autooxidables.

Fig. 6. Autooxidación del citocromo b1 y efecto de HOQNO. Las células se prepararon como en
la Fig. 4 y se usaron a una concentración de proteína de 2,3 mg / ml. Los espectros de
diferencia se determinaron a temperatura ambiente con el espectrofotómetro de haz dividido.
La suspensión celular de referencia se oxidó burbujeando con aire a través de una pipeta
pasteur. (a) Suspensión celular más 8,3 pmoles de formiato de sodio por ml; (b) suspensión (a)
burbujeó con aire durante 1 min; (c) suspensión (a) más 8.3 X 10-M HOQNO, burbujeado con
aire durante 8 min; (d) suspensión celular más 0,5 umoles de formiato de sodio por ml; (e)
suspensión (d) burbujeada con aire durante 1 min: (f) suspensión (d) más 8.3 X 103 M
HOQNO, burbujeada con aire durante 1 min.
 Fig. 7. Esquema sugerido para el complejo de nitrato reductasa de Escherichia coli.

DISCUSIÓN
Varios investigadores han propuesto la participación de formiato deshidrogenasa, citocromo b1
y nitrato reductasa en la reducción de nitrato por E. coli (6, 8, 17, 23). Los resultados
presentados aquí, junto con los resultados de los estudios sobre mutantes NR (17), indican que
distintas formas de estos componentes están involucradas en el sistema de reducción de
nitrato y que existe poca interacción con otras cadenas de transporte de electrones, es decir, se
produce la reducción de nitrato principalmente por la operación secuencial de formiato
deshidrogenasa, citocromo b555 y nitrato reductasa. Los investigadores de Severla han
demostrado que NADH puede servir como donante de electrones para la reducción de nitrato
en extractos de E. coli sin células (2, 5, 6, 13). Sin embargo, los mutantes NR- que carecen de
formiato deshidrogenasa pero poseen nitrato reductasa no forman nitrito ni eliminan nitrato del
medio durante el crecimiento (datos no publicados). Sin embargo, cuando tales mutantes
alcanzan la fase estacionaria, el nitrito comienza a acumularse, lo que sugiere que NADH
puede servir como un donante de electrones para la reducción de nitrato solo en las células de
fase estacionaria. Por el contrario, el progenitor de tipo salvaje acumula grandes cantidades de
nitrito durante el crecimiento en las mismas condiciones, y esta acumulación continúa durante
la fase estacionaria. En ninguno de estos casos, el nitrito se reduce aún más, presumiblemente
porque utilizamos nitrato al 1%, una condición que suprime la formación del sistema de nitrito
reductasa en E. coli (2). El papel específico de la actividad de nitrato reductasa ligada a NADH
y su relación con la actividad de nitrato reductasa asociada con la formiato deshidrogenasa es,
actualmente, desconocida.
La formiato deshidrogenasa involucrada en la reducción de nitrato parece ser distinta de la
formiato deshidrogenasa involucrada en el sistema de formiato deshidrogenasa. Esta distinción
se basa en parte en la especificidad del aceptor de electrones de la formiato deshidrogenasa
asociada con estos dos sistemas (5), pero está más claramente demostrado por la existencia
de un sistema de formiato deshidrogenasa funcional y una formato deshidrogenasa específica
de viológenos bencílicos en mutantes NR que carecen de el formiato deshidrogenasa
específica de metano sulfatos de fenazina asociada con la reducción de nitrato. El hecho de
que algunos mutantes NR- carezcan de estas dos deshidrogenasas de formiato, como se
muestra aquí y por otros (14, 22), sugiere que ambas actividades dependen de un elemento
genético común, quizás el gen estructural de la deshidrogenasa de formiato. Si ambos están
especificados por el mismo gen, las variaciones genéticas y fisiológicas observadas para las
dos deshidrogenasas de formiato deben ser el resultado de una interacción y asociación del
producto génico con distintos componentes de transporte de electrones. Una interpretación
alternativa es que ambas actividades se pierden como resultado de alguna alteración
pleiotrópica que afecta los componentes de la membrana de la célula (1). En cualquier caso,
una comprensión clara de las variaciones genéticas observadas para las formiato
deshidrogenasas requerirá un análisis genético y bioquímico detallado de esta enzima y su
participación en distintas vías.
El esquema de la Fig. 7 se propone para explicar la interacción del citocromo b específico de
nitrato, con los diferentes donantes de electrones, su oxidación por nitrato y los efectos del
inhibidor HOQNO en estos procesos. Varios de los hechos presentados aquí sugieren que dos
componentes distintos del citocromo b555 se oxidan con nitrato. (i) El nitrato provoca una
oxidación bifásica del citocromo b555 reducido en formiato. (ii) El ascorbato, un donante de
electrones de potencial redox moderadamente alto, redujo solo una parte (aproximadamente
50%) del citocromo b555 específico de nitrato que reduce el ditionito o el formiato. (iii) HOQNO
inhibe la oxidación de solo una parte (aproximadamente 50%) del citocromo b555 reducido en
formiato por nitrato, pero no inhibe la oxidación del citocromo b555 reducido por ascorbato por
nitrato. Estas observaciones, junto con el hecho de que HOQNO inhibe completamente la
reducción de nitrato por el formiato, se explican más fácilmente por la propuesta en la Fig. 7 de
que dos componentes del citocromo b555 con diferentes potenciales de oxidación-reducción
funcionan secuencialmente en la transferencia de electrones del formiato a nitrato. Mientras
que el ditionito y el formiato (a través del formiato deshidrogenasa) reducirían ambos
componentes, el ascorbato reduciría solo el segundo componente del citocromo.
Los efectos selectivos de HOQNO resultarían de su inhibición de la transferencia de electrones
entre los dos componentes del citocromo. La cinética bifásica de la oxidación por nitrato se
debería a la capacidad del formato, siempre que esté presente, para mantener el citocromo I
reducido incluso en presencia de citocromo II oxidado.
Tal modelo podría explicar por qué muchos mutantes NR que carecen de nitrato reductasa o
formiato deshidrogenasa también exhiben niveles disminuidos pero intermedios del citocromo
b555 (17); yo. e., uno u otro de los dos componentes del citocromo podrían no formarse.
Además, los informes de que el citocromo b1 está asociado tanto con la formiato
deshidrogenasa (7, 11) como con la nitrato reductasa (9) después de que estas enzimas se
hayan resuelto una de otra pueden explicarse suponiendo que un componente del citocromo b1
permanece asociado con la formiato deshidrogenasa y el otro con nitrato reductasa durante los
procedimientos de purificación.
Está claro que los componentes del citocromo b555 específicos de nitrato son distintos del
componente del citocromo b555 formado en condiciones aeróbicas, ya que los mutantes NR
que carecen del citocromo b555 inducido por nitrato todavía forman componentes normales del
citocromo b1 en condiciones aeróbicas. Estas observaciones no establecen si ese es el mismo
citocromo b1 asociado con diferentes componentes o si E. coli especifica una serie de
componentes distintos del citocromo b1 para varios sistemas de transporte de electrones. En
cualquier caso, la formación de componentes del citocromo debe estar específicamente
regulada por los otros componentes catalíticos con los que están normalmente asociados.
Esa reducción de nitrato es catalizada por un complejo de enzimas físicamente asociado que
solo puede establecerse mediante el aislamiento de la unidad catalítica. Sin embargo, la
asociación de la membrana de los componentes, la existencia de mutaciones pleiotrópicas que
afectan las actividades y la aparente falta de interacción de este sistema con otras cadenas de
transporte de electrones argumentan la existencia de dicho complejo.

Bibliografia

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