UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA

LABORATORIO DE PRINCIPIOS DE QUÍMICA ORGÁNICA

GUÍA 5. CROMATOGRAFÍA

Oscar Javier Patiño Ladino

Profesor asistente
Departamento de Química

1. INTRODUCCIÓN

Cromatografía es un método de fraccionamiento y separación de los componentes de mezclas, basado en la migración

diferencial de los componentes transportados en una fase móvil que migra a través de una fase estacionaria. Las separaciones
cromatográficas se producen por fenómenos de adsorción, de reparto, de intercambio iónico, filtración en gel, o por exclusión
por tamaños. Con base en lo anterior, la cromatografía se clasifica en cromatografía de adsorción, de reparto, de intercambio
iónico, de filtración en gel o de exclusión por tamaños.
Debido al alto grado de repetición de los procesos a través de la fase estacionaria, los métodos cromatográficos permiten
obtener separaciones que no se logran por otros métodos, aún cuando se trate de sustancias que presenten pequeñas
diferencias en sus propiedades. Algunos autores consideran conveniente comparar una columna cromatográfica con una
columna de destilación fraccionada, compuesta de muchos platos teóricos, cuya eficiencia aumenta con el número de estos. En
cromatografía se consigue una alta eficiencia, debido al alto número de platos teóricos en una longitud relativamente corta de
fase estacionaria.

DEBES CONSULTAR Y RESUMIR EL CAPÍTULO 27 y 28 DE Zubrick, James (2008). “The organic Chem lab Survival
Manual” (3 hojas sin figuras) para CCD

DEBES CONSULTAR Y RESUMIR EL CAPÍTULO 129 DE Zubrick, James (2008). “The organic Chem lab Survival
Manual” (3 hojas sin figuras) para CC

2. ACTIVIDADES DE CONSULTA

2.1. Investigue sobre la importancia y aplicaciones de la cromatografía en su formación profesional

2.2. Defina los siguientes términos comúnmente empleados en cromatografía: Cromatografía, fase estacionaria, fase móvil,
fase normal, fase reversa, adsorción, adsorción fase normal, adsorción fase reversa, reparto, elución, retención polaridad,
capilaridad, serie eluotrópica y revelador.
2.3. Investigue sobre las generalidades, estructura química y aplicaciones de las siguientes fases estacionarias: silica gel, RP-18,
alúmina, celulosa, sephadex y resinas de intercambio iónico.
2.4. La mayoría de los sorbentes o fases estacionarias (FE) poseen aditivos dependiendo del tipo de análisis y del tipo de
sustancias a analizar. Qué significan cada una de las siguientes convenciones:
a) F b) F254 c) F254+366 d) G e) H F) R G) E
2.5. Investigue sobre cómo se clasifican los solventes de acuerdo a su fuerza de elución. A que se le llama elución isocrática y
elución por gradiente. En el cuaderno consigné la tabla de la serie eluotrópica.
2.6. Investigue sobre los principales métodos de análisis cromatográfico: por desarrollo, por elución, frontal y por
desplazamiento.
2.7. Investigue sobre las generalidades y aplicaciones de los siguientes reveladores: Yodo, Luz UV, ácido sulfúrico, ácido
fosfomolibdico.
2.8. Indique cuales son los tipos de cromatografía de acuerdo al tipo de interacción química entre los componentes de la
mezcla con la fase móvil y fase estacionaria. Describa cada tipo de cromatografía (generalidades, fases estacionarias y
fases móviles comunes, esquema del proceso).
2.9. Mencione cuales son los tipo de cromatografía que existen de acuerdo al estado físico de la fase móvil y de la fase
estacionaria.
2.10. Mencione cuales son los tipo de cromatografía que existen de acuerdo al tipo de soporte empleado.
2.11. Referente a la cromatografía de adsorción en capa delgada o capa fina (CCD o CCF), investigue:
a) Qué es la CCD y sus aplicaciones.
 b) Cuáles son las etapas que se deben seguir en la realización de una CCD. Describa cada una de ellas.
c) Indique cual es la fase estacionaria mas empleada en cromatografía de adsorción por CCD. De la fase estacionaria
mencione generalidades, estructura, fenómeno de separación que predomina al utilizarla, tamaño de partícula que se
emplea y los tipos de compuestos respecto a la polaridad que nos permite separar.
d) Investigue cuales son los implementos que se necesitan para utilizar la técnica de CCD. Dibuje cada implemento e indique
su uso.
e) Investigue que es el factor de retención (Rf). De manera ilustrativa indique como se calcula. Mencione para que se utiliza
y que parámetros afectan su valor.
f) Describa cuales son la precauciones que se deben tener al realizan una CCD como debe hacerse el revelado en CCD de
muestras no coloreadas.

2.12. Cromatografía en columna (CC):

a) Qué es la CC y sus aplicaciones.
b) Cuáles son las etapas que se deben seguir en la realización de una CC. Describa cada una de ellas.
c) Que característica tiene la fase estacionaria que se utiliza para CC. Cuál es la diferencia de la fase estacionaria utilizada
por CCD.
d) Investigue cuales son los implementos que se necesitan para utilizar la técnica de CC. Dibuje cada implemento e indique
su uso.
e) Mencione cuáles son la precauciones que se deben tener al realizan una CC.

2.13. indique el orden de aparición de las siguientes series de compuestos en la placa cromatográfica utilizando cromatografía
de adsorción y cromatografía de partición en fase reversa. De cada tipo de cromatografía proponga la fase estacionaria y
la fase móvil que utilizaría:
a. Ácido oleico, ácido butírico, ácido margárico, ácido glutarico.
b. Ácido indol-3-acetico, naftaleno, 1-naftol, difenil éter.
c. Quercetina, resveratrol, β-caroteno, β-sitosterol.

3. MATERIALES Y REACTIVOS

Para el desarrollo de la práctica, cada estudiante debe llevar al laboratorio los siguientes implementos:

Guía de laboratorio, cuaderno exclusivo de laboratorio, preinforme completo, bata de laboratorio, gafas de seguridad, guantes,
calculadora, capilares para cromatografía, 2 frascos de vidrio transparentes (5 mL), 2 frascos de vidrio con tapa rosca de color
ámbar (10 mL) y toallas de papel. Al inicio de la práctica se revisaran por parte de los docentes estos implementos.

Realice los siguientes dibujos:

a) Aplicación de la muestra en CCD
b) Desarrollo de una placa en CCD
c) Ejemplo de cálculo de Rf
d) Montaje experimental de una columna cromatográfica
e) Ejemplo de elución en CC.

Adicionalmente no olvide sacar la lista de materiales y reactivos a utilizar en la práctica, para que sean solicitados lo más rápido
posible al inicio de la práctica. No se le olvide realizar la ficha de seguridad para los solventes a utilizar en la práctica.

4. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL

En esta práctica cada grupo trabajara con dos muestras, el producto de arrastre con vapor y el sólido problema entregado al
principio del curso. Cada grupo debe proponer como realizaría el proceso de separación de los constituyentes presentes en la
mezcla utilizando métodos cromatográficos. A continuación se describen unas metodologías generales de cómo se realiza una
cromatografía en capa delgada y cromatografía en columna. A partir de esto deben planear sus diagramas de flujo que ilustren
claramente cómo van a realizar la separación cromatográfica. (NOTA: Se deben usar todos los implementos de seguridad
personal durante la práctica).

4.1. Preparación de la muestra

 Haga esto en caso de que no tenga producto de arrastre:
Pese en un vidrio de reloj 5 g (aprox. 1 rama) de material vegetal, tritúrelo con la mano y transfiéralo completamente a un
mortero y realice dos extracciones, cada una con 10 mL de éter de petróleo o diclorometano. Separe el extracto del material
vegetal por filtración y reúna los volúmenes colectados en un vaso de precipitado Luego al baño maría evapore el solvente
hasta una cuarta parte del volumen original (este procedimiento lo debe hacer en una cabina de extracción) y guarde
cuidadosamente el extracto en uno de los frascos ámbar.

4.2. Selección de fase móvil por CCD

Trate de buscar la fase móvil más adecuada para la separación de los componentes de la muestra problema. En primer lugar
desarrolle unas placas en tres solventes de diferente fuerza de elución (baja, media y alta) de acuerdo a la serie eluotropica. De
acuerdo a los resultados desarrolle otras placas cromatográficas con mezclas de solventes para buscar la mejor separación de
los componentes de la mezcla. En el laboratorio va a disponer de los siguientes disolventes: Éter de petróleo, tolueno, acetato
de isopropilo y metanol.

El mejor sistema de elución va a ser donde los componentes de la mezcla presenten un Rf medio entre 0,3 y 0,6, y donde la
diferencia de Rf entre la mayoría de los componentes va a ser de por lo menos 0,2 unidades. El solvente con el que mejor
separación obtenga, va a ser el que se utilizara para separar los componentes de la mezcla por CC.

Dibuje en su cuaderno cada una de las placas luego de ser desarrolladas, indique con qué solvente fueron corridas y los valores
de Rf de cada una de las sustancias separadas. A continuación se dan unas recomendaciones para la realización de
cromatografía en capa delgada.

 Aplicación de la muestra: En la superficie de la fase estacionaria, señalar con un lápiz tantos puntos como muestras se vayan
a aplicar. Los puntos deben estar a la misma altura desde la base de la placa (1 cm aproximadamente). Hacer los puntos
suavemente, teniendo cuidado de no levantar la FE. Utilizando un capilar de vidrio, depositar una alícuota de la solución que
desea separar. Para ello, apoye ligeramente el capilar con la disolución sobre la FE, deje evaporar el solvente, y repita esta
operación alrededor de 5 veces con la precaución de aplicar la muestra siempre en el mismo sitio, hasta ver claramente el punto
de aplicación.
 Desarrollo de las placas: Añadir la fase móvil en la cámara cromatográfica y dejarla saturar por aproximadamente 5 min. El
nivel del disolvente debe quedar por debajo de la línea en la que se ha depositado la muestra, de manera que no toque la
mancha de la sustancia aplicada. Introducir la placa cromatográfica en posición vertical en la cámara, que durante la elución
debe permanecer tapada para evitar la evaporación del disolvente. El solvente ascenderá por capilaridad. Cuando el frente
llegue a poca distancia del borde superior de la placa, abrir la cámara, sacar la placa y señalar con un lápiz la distancia recorrida
por el disolvente antes de que éste se evapore, con el objeto de poder realizar el cálculo del Rf. Determine la distancia recorrida
por cada una de las sustancias de la mezcla y la distancia recorrida por el solvente, y proceda a calcular los valores de Rf.

4.3. Cromatografía en Columna

 Preparación de la columna: Sujetar la columna a un soporte utilizando dos pinzas. Colocar en una pequeña cantidad de
algodón compactado cerca a la llave de la columna para evitar la salida del adsorbente. La cantidad de algodón debe ser
mínima, pues debe retener la fase estacionaria sin dificultar el paso del disolvente.
 Relleno de la columna: Prepara una suspensión con la FE y la FM (la que seleccionó por CCD) Añada un poco de FM a la
columna y luego vierta la suspensión en el interior de ésta. Golpee ligeramente la columna con una manguera flexible para
compactar el adsorbente sin formación de burbujas, a la vez que se abre la llave para permitir la salida del disolvente. NO DEJE
SECAR LA FASE ESTACIONARIA, YA QUE ESTO DA ORIGEN A LA APARICIÓN DE GRIETAS Y BURBUJAS DE AIRE, QUE DAÑARAN LA
SEPARACIÓN.
 Sembrado de la muestra: Disolver la mezcla a separar en la mínima cantidad de FE posible. Cierre la llave de la columna y
deposite con ayuda de una pipeta la disolución sobre la FE, dejando resbalar la solución por las paredes de la columna. Abra la
llave de la columna para que la disolución quede adsorbida en la FE. Cierre nuevamente la llave de la columna. Lave las paredes
de la columna con la FM. Abra la llave nuevamente para permitir la entrada de la sustancia que había quedado en las paredes.
 Elución de las fracciones: Cierre la llave de la columna. Añada la FM con cuidado por las paredes de la columna hasta
llenarla. Abra la llave de la columna. El volumen inicial que se recolecta corresponde al volumen muerto de la columna y no
contendrá ninguna sustancia de interés, por lo que puede despreciarse. Cuando vea que la primera sustancia que eluye está a
punto de salir de la columna, cambie el recipiente colector y espere hasta que termine de salir esa sustancia. Cuando termine de
salir la sustancia 1, cambie de nuevo el recipiente colector. Cuando vea que la segunda sustancia está a punto de salir de la
columna, cambie el recipiente y espere hasta que termine de salir la sustancia 2. Repita el procedimiento anterior las veces que
sea necesario hasta que terminen de eluir los componentes detectados en CCD. Cuando termine de salir la última sustancia,
cierre la columna. RECUERDE QUE LA FASE ESTACIONARIA NUNCA DEBE SECARSE Y QUE LOS COMPUESTOS ELUYEN EN ORDEN
DE POLARIDAD CRECIENTE.

 Análisis de las fracciones colectadas: Las fracciones recogidas deberán analizarse por estudio en CCD, con el objetivo de
determinar cómo se llevo a cabo la separación por CC. Las placas las debe desarrollar en el solvente en el que obtuvo la mejor
separación.

5. RECOMENDACIONES PARA EL INFORME

A continuación se dan algunas observaciones que se deben tener en cuenta para la elaboración del informe.

 Dibuje los cromatogramas (placas) obtenidos en la selección de la fase móvil y haga una tabla con los datos de Rf.
 Indique el número de fracciones que colectó en la CC.
 Dibuje los cromatogramas que obtuvo al hacer el análisis de las fracciones colectadas.
 Analice cada uno de los cromatogramas obtenidos con cada una de las fases móviles empleadas. Indique si hubo
separación de los componentes de la mezcla o no. Explique cada caso.
 Explique por qué seleccionó la fase móvil que empleo para CC.
 Explique claramente si se logro o no la separación, aislamiento e identificación de los componentes de la mezcla. Analice
los resultados.
 Indique cuáles son los pigmentos u otros compuestos que extrajo y separó en cada uno de los extractos (apoyándose en la
búsqueda bibliográfica).

6. BIBLIOGRAFÍA

 Martínez, M. A. y Csákÿ, A. G. (2001). Técnicas Experimentales en Química Orgánica. Editorial Síntesis, España, 1ª Edición.
p.p. 131-151.
 Pavia, L., Lampman, M., Kriz, S. (1988). “Introduction to Organic Laboratory Techniques”. Saunders College, Fort Worth.
 Torres de Young, S. (1994). Introducción a la cromatografía. Editorial Universidad Nacional de Colombia, Bogotá, Colombia.
 Ocampo, R., Ríos, L. A., Betancourt, D. M., Ocampo, D. M. (2008). Curso práctico de química orgánica: enfocado a biología
y alimentos. Primera Edición, Editorial Universidad de Caldas, Manizales, Colombia. Pag 73-90.