Practica TDT TMT

MCROBIOLOGÍA DE ALIMENTOS II
PRACTICA 5: DETERMINACIÓN DEL TIEMPO DE DESTRUCCIÓN TÉRMICA

(TDT) Y DEL PUNTO DE MUERTE TÉRMICA (PMT) EN
MICROORGANISMOS
I. INTRODUCCIÓN
Los microorganismos pueden ser eliminados parcial o totalmente por

tratamiento térmico; el tiempo y la temperatura aplicados para obtener el resultado
deseado, son dependientes del tipo y número de microorganismos.
El tiempo de destrucción térmica (TDT) es el tiempo necesario para destruir un

número dado de microorganismos a una temperatura determinada. Mediante este
método, la temperatura se mantiene constante y se determina el tiempo necesario
para destruir todas las células microbianas. El punto de muerte térmica (PMT), es
la temperatura necesaria para destruir un número dado de microorganismos en un
tiempo determinado, generalmente 10 minutos.
II. OBJETIVO
Que el alumno aplique un método que le permita conocer el tiempo y la

temperatura mínimos necesarios para eliminar a los microorganismos presentes en
una suspensión.
III. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA
En general, la termorresistencia de los microorganismos está relacionada con

su temperatura óptima de crecimiento. Los microrganismos psicrófilos son los más
termo sensibles. Las bacterias esporógenas son las más termorresistentes.
Respecto a la reacción de Gram, las bacterias gram (+) tienden a ser más
resistentes, especialmente los cocos. Las levaduras y los mohos tienden a ser
medianamente sensibles al calor.
Existen diversos factores que influyen en la termorresistencia de los

microorganismos:
1. Agua. La termorresistencia de las células microbianas aumenta al disminuir

el contenido de agua o la humedad de un alimento.
2. Grasa. En presencia de grasa hay un aumento general de la
termorresistencia de algunos microorganismos.
3. Sales. La influencia de las sales en la termorresistencia de los
microorganismos es variable y depende de la clase de sal, así como de la
concentración empleada, entre otros factores.
4. Carbohidratos. La presencia de azúcares en el alimento con el que se
realiza la suspensión origina un aumento en la termorresistencia de los
microorganismos.
5. pH. Los microorganismos son más resistentes al calor a su pH óptimo de
crecimiento.
6. Proteínas y otras sustancias. Durante el calentamiento del alimento las
proteínas del mismo tienen un efecto protector de los microorganismos.
7. Número de microorganismos. A mayor es el número de microorganismos,
mayor es el grado de termorresistencia.
8. Edad de los microorganismos. Las células bacterianas tienden a ser más
resistentes al calor mientras se encuentran en la fase estacionaria de crecimiento
y menos resistentes durante la fase logarítmica.
9. Sustancias inhibidoras. Cuando el calentamiento tiene lugar en presencia
de antibióticos, de SO2 y de otros inhibidores microbianos, la termorresistencia de
la mayoría de los microorganismos disminuye.
Cada vez que se desea sacar un nuevo producto en conserva al mercado es

necesario precisar las condiciones del proceso en procura de garantizar el
aseguramiento de la calidad y seguridad del alimento, así como para optimizar el
proceso térmico, debido a que la esterilización aplicada durante la elaboración de
conservas ocasiona la destrucción entre un tercio hasta la mitad de ciertas
vitaminas y minerales, sin embargo, una vez en su envase, las pérdidas adicionales
de estas vitaminas no son significativas. También, hay que decir que los alimentos
en conserva proporcionan muchos de los mismos nutrientes y minerales que los
alimentos frescos, debido a que estos alimentos se procesan inmediatamente
después de la cosecha minimizando el tiempo de pérdidas iniciales de nutrientes,
cosa que no sucede durante el tiempo de exhibición de un alimento en fresco,
durante el cual se pierden nutrientes.
Las semillas leguminosas son las que generalmente se someten a métodos
de conservación como la congelación o la esterilización ya que la preferencia es
consumirlas después de su transformación tecnológica o culinaria. Además, como
se ha visto en la literatura la arveja procesada correcta e inmediatamente después
de la cosecha puede ser tan nutritiva como la que se consume en fresco después
de pasar exhibida en mercados. Por otra parte, los alimentos en conserva no son
perecederos, razón por la cual no se pierde dinero como puede suceder con los
productos frescos. Durante el procesamiento de alimentos de baja acidez (pH >
4,7).
IV. MATERIALES Y METODOS
POR EQUIPO POR GRUPO
44 Tubos con tapón de rosca de 16x150 mm 1 Probeta de 1 L

2 Mecheros Fisher 1 Mechero Fisher
8 Pipetas de 1 ml 1 Recipiente para hervir agua
8 Cajas petri de vidrio o desechables (estériles) 1 Soporte universal

de 100x15 mm
1 Asa microbiológica 3 Baños con temperatura controlada
Cinta adhesiva (Masking tape) Agua destilada
2 Gradillas 2 Vasos de precipitados de 1 l
1 Cilindro para esterilizar pipetas 2 Agitadores magnéticos
1 Piseta con agua destilada 1 Espátula
1 Piseta con etanol Tela de asbesto
1 Propipeta para volúmenes de 0.1 – 2.0 ml 3 Termómetros
1 Propipeta para volúmenes de 5.0 – 10.0 ml 2 Matraces Erlenmeyer 1l
1 Conexión T de vidrio con manguera de latex
1 Plumón rotulador indeleble
1 Tijeras
Cronometro
Medios de cultivo y reactivos
Agar nutritivo (AN) Pseudomonas fragi Lactobacillus bulgaricus
Caldo nutritivo (CN) Escherichia coli Bacillus subtilis
METODOLOGÍA
PUNTO DE MUERTE TÉRMICA (PMT)
Preparación de los microorganismos
1. Partir del cultivo inicial de 24 h en caldo nutritivo de E.coli, y L. bulgaricus.

1.1. Preparar 5 tubos estériles con 5 ml de caldo nutritivo para cada uno de los
microorganismos (10 tubos en total).
1.2. Colocar 0.1 ml de uno de los cultivos en cada uno de los 5 tubos rotulados
y previamente precalentados a la temperatura a la cual se hará la prueba con el
caldo nutritivo a cada temperatura a evaluar.
1.3. Reservar los cultivos iniciales en refrigeración hasta su uso como control
de los tratamientos. Repetir el procedimiento 1.4 para los otros tres
microorganismos. Utilizar una pipeta estéril para cada cultivo.
2. Determinación del punto de muerte térmica

2.1. Dejar cada tubo de la suspensión de cada cultivo en baño maría con las
temperaturas establecidas durante 15 min: 55°, 65°, 75°C y ebullición.
2.2. Someter un tubo de cada del cultivo a esterilización en autoclave a 121
lb/pulg2 durante 15 min.
2.3. Una vez transcurrido el tiempo de cada tratamiento, colocar los tubos en
agua fría con hielo.
3. Determinación de sobrevivencia
3.1. Tomar una placa y dividirla en 6 partes iguales con la ayuda de un
marcador indeleble: una para el cultivo testigo y 5 para las temperaturas probadas.
Con la ayuda de un asa, aplicar la muestra por estría simple. Inocular la primera
sección con el cultivo original, reservado en el refrigerador. Cada uno de los cultivos
restantes será inoculado sobre la sección correspondiente de la placa, en
condiciones estériles.
3.2. Repetir el procedimiento para cada cultivo.
3.3. Incubar las placas invertidas a 37°C por 24 h
3.4. Transcurrido el tiempo de incubación, examinar las secciones de la placa
y compararla con el testigo.
3.5. Observar y anotar cuidadosamente los resultados para poder establecer
en que temperaturas se ubica el PMT para cada uno de los microorganismos
probados.
Tabla 1. Resultados del experimento del Punto de Muerte Térmica (PMT)
Cepas Testigo* 55°C 65°C 75°C ebullición Esterilización**
E. coli
L. bulgáricus
*Cultivo sin tratamiento. ** Calentamiento en autoclave por 15 min.
Tiempo de Destrucción Térmica (TDT)
4. Preparación de los microorganismos

4.1. Partir de un cultivo en caldo nutritivo de los diferentes microorganismos con
24 h de incubación incubados a su temperatura óptima de crecimiento.
4.2. Preparar 4 tubos estériles con 5 ml de caldo nutritivo para cada uno de los
cultivos (8 tubos en total) y colocarlos 5 min. a 75°C.
4.3. Colocar 0.1 ml de uno de los cultivos en cada uno de los cuatro tubos con
el caldo nutritivo, etiquetados con los tiempos de incubación: 0, 10, 20, 30 min.
Reservar cultivos en refrigeración hasta su uso en el control de los tratamientos.
Repetir el procedimiento para los otros tres microorganismos. Utilizar una pipeta
estéril para cada cultivo.
5. Determinación del punto de muerte térmica

5.1. Dejar los tubos en baño maría a 75°C durante cada uno de los tiempos
estipulados.
5.2. Una vez transcurrido el tiempo, sacar los tubos y colocarlos en agua fría
(con hielo).
6. Determinación de sobrevivencia
6.1. Probar la sobrevivencia de las bacterias sobre placas de agar nutritivo.
Para ello tomar una placa y dividirla en 4 partes iguales, con la ayuda de un
marcador indeleble: una para el testigo y 3 para los tiempos probadas. Con la ayuda
de un asa, aplicar la muestra por estría simple.
6.2. La primera sección se inocula con el cultivo original, el cual no ha sido
expuesto a elevadas temperaturas. Cada uno de los cultivos restantes serán
inoculados sobre la sección correspondiente de la placa en condiciones estériles.
6.3. Repetir el procedimiento para cada cultivo.
6.4. Incubar las placas invertidas a 37°C por 24 h
6.5. Una vez transcurrido el tiempo de incubación, examinar las placas. Las
bacterias presentes en la placa indican la sobrevivencia comparadas al control no
expuesto. Observar cuidadosamente los resultados para poder establecer en qué
tiempo se ubica el TDT para cada uno de los microorganismos probados.
Tabla 2. Resultados del experimento del Tiempo de Destrucción Térmica (TDT)
Cepas Testigo* 10 min 20 min 30 min

E. coli
L. bulgáricus
*Cultivo sin tratamiento`

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PRACTICA 5: DETERMINACIÓN DEL TIEMPO DE DESTRUCCIÓN TÉRMICA

Los microorganismos pueden ser eliminados parcial o totalmente por

El tiempo de destrucción térmica (TDT) es el tiempo necesario para destruir un

Que el alumno aplique un método que le permita conocer el tiempo y la

III. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA

En general, la termorresistencia de los microorganismos está relacionada con

Existen diversos factores que influyen en la termorresistencia de los

1. Agua. La termorresistencia de las células microbianas aumenta al disminuir

Cada vez que se desea sacar un nuevo producto en conserva al mercado es

IV. MATERIALES Y METODOS

POR EQUIPO POR GRUPO

44 Tubos con tapón de rosca de 16x150 mm 1 Probeta de 1 L

8 Pipetas de 1 ml 1 Recipiente para hervir agua

8 Cajas petri de vidrio o desechables (estériles) 1 Soporte universal

Cinta adhesiva (Masking tape) Agua destilada

2 Gradillas 2 Vasos de precipitados de 1 l

1 Cilindro para esterilizar pipetas 2 Agitadores magnéticos

1 Piseta con agua destilada 1 Espátula

1 Piseta con etanol Tela de asbesto

1 Propipeta para volúmenes de 0.1 – 2.0 ml 3 Termómetros

1 Propipeta para volúmenes de 5.0 – 10.0 ml 2 Matraces Erlenmeyer 1l

1 Conexión T de vidrio con manguera de latex

1 Plumón rotulador indeleble

Medios de cultivo y reactivos

Agar nutritivo (AN) Pseudomonas fragi Lactobacillus bulgaricus

Caldo nutritivo (CN) Escherichia coli Bacillus subtilis

PUNTO DE MUERTE TÉRMICA (PMT)

Preparación de los microorganismos

1. Partir del cultivo inicial de 24 h en caldo nutritivo de E.coli, y L. bulgaricus.

2. Determinación del punto de muerte térmica

*Cultivo sin tratamiento. ** Calentamiento en autoclave por 15 min.

Tiempo de Destrucción Térmica (TDT)

4. Preparación de los microorganismos

5. Determinación del punto de muerte térmica

Tabla 2. Resultados del experimento del Tiempo de Destrucción Térmica (TDT)

Cepas Testigo* 10 min 20 min 30 min

*Cultivo sin tratamiento`

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